Summary
Onze studie richt zich op de effecten van leptine signalering in carotis lichaam (CB) op de hypoxische-ventilatoire respons (HVR). We uitgevoerd ' verlies van functie ' experimenten meten van het effect van leptine op HVR na CB denervatie en ' winst van functie ' experimenten meten HVR na overexpressie van de leptine receptor in CB.
Abstract
Een adipocyte-geproduceerde hormoon leptine is een krachtige respiratoire stimulerende middelen, die een belangrijke rol kunnen spelen bij het verdedigen van de ademhalingsfunctie bij obesitas. De carotis lichamen (CB), een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, uitdrukken de lange functionele isovorm van leptine receptor (leprb) maar de rol van leptine signalering in de controle van de ademhaling is niet volledig opgehelderd. We onderzochten de hypoxische ventilatorrespons (HVR) (1) in C57BL/6J-muizen voor en na leptine-infusie bij baseline en na de denervatie van CB; (2) in Leprb-deficiënte zwaarlijvige db/DB muizen bij baseline en na Leprb overexpressie in CBs. In C57BL/6J muizen, leptine verhoogd HVR en effecten van leptine op HVR werden afgeschaft door CB denervation. In db/DB -muizen verhoogde de leprb -expressie in CB de HVR. Daarom concluderen we dat leptine in CB werkt om reacties op hypoxie te vergroten.
Introduction
Een adipocyte geproduceerd hormoon leptine handelt in de hypothalamus te onderdrukken van voedselinname en verhoging van de stofwisseling. Studies uitgevoerd in ons laboratorium1,2 en door andere onderzoekers3,4 toonde aan dat leptine verhoogt de hypercapnic ventilatoire respons (HVR) voorkomen van obesitas hypoventilatie in leptine gebrekkige obesitas. Echter, een meerderheid van zwaarlijvige individuen hebben hoge plasma leptine niveaus en demonstreren weerstand tegen de metabole en respiratoire effecten van het hormoon5,6,7,8. Resistentie tegen leptine is multifactoriële, maar beperkte permeabiliteit van de bloed-hersen barrière (BBB) aan leptine speelt een belangrijke rol. Wij stellen voor dat leptine handelt onder BBB in een belangrijk orgaan van perifere hypoxische gevoeligheid, de carotis lichamen (CB), om de ademhaling in zwaarlijvige individuen te verdedigen. CBs Express de lange functionele isovorm van leptine receptor, leprb, maar de rol van CB in de Ademhalings effecten van leptine is niet voldoende opgehelderd9,10.
Het doel van onze methode was om het effect van leptine signalering in de CB op HVR te onderzoeken. Onze redenering was het uitvoeren van (a) verlies van functie-experimenten die leptine in muizen met intact carotis lichamen en denervated carotis lichamen gevolgd door HVR metingen; b) winst van functie-experimenten in db/DB -Muizen zonder leprb, waarin we de HVR op baseline en na uitdrukking van LEPRb uitsluitend in CB hebben gemeten. Het voordeel van onze technieken was dat we al onze experimenten uitgevoerd in ongefixeerde unanesthetized muizen tijdens de slaap en wakkerheid. Vorige onderzoekers ofwel uitgevoerd hun experimenten onder anesthesie9 of niet meten van de effecten van leptine tijdens de slaap10. Daarnaast is onze studie de eerste die gebruik maakt van een unieke winst van functie benadering met selectieve LepRb -expressie in CB zoals hierboven beschreven.
In de brede context, onze aanpak kan worden gegeneraliseerd naar andere receptoren uitgedrukt in CB en hun rol in hypoxische gevoeligheid. Onderzoekers kunnen een ligand aan een receptor van belang en meet de HVR op baseline en na CB denervation. Als een complementaire aanpak kan een receptor van belang worden overuitgedrukt in CB en HVR metingen kunnen worden uitgevoerd voor en na overexpressie met behulp van onze technologie beschreven in dit manuscript.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (MO18M211).
1. leptine infusie
Opmerking: Om het effect van leptine op de ademhaling te onderzoeken, hebben we leptine subcutaan geïnfundeerd in Lean C57BL/6J muizen door een osmotische pomp om circulerende leptine niveaus te verhogen tot die waargenomen bij zwaarlijvige muizen.
-
Osmotische pomp voorbereiding
- Weeg de lege pomp af om het nettogewicht van de geladen oplossing te controleren.
- Voeg leptine (5 mg/mL) toe aan de osmotische pomp (1 μL/h gedurende 3 dagen). Vul de pomp met een kleine spuit (1 mL). Na het vullen, sluit de pomp met de meegeleverde botte getipt 27 gauge vulbuis.
Opmerking: De spuit en de bijgevoegde buis moeten vrij zijn van luchtbellen. - Weeg de pomp na het vullen opnieuw af om het nettogewicht van de oplossing te controleren.
-
Plaats de leptine pomp subcutaan in het interscapulaire gebied.
Opmerking: als u de infusie onmiddellijk wilt starten, inbroed dan de voorgevulde pomp in de steriele zoutoplossing bij 37 °c gedurende ten minste 4 tot 6 uur (bij voorkeur 's nachts).
2. hypoxische Ventilatorrespons (HVR)
Opmerking: Thermoneutrale voorwaarden elimineren stressvolle factoren opgelegd door koele omgevingstemperatuur en aanzienlijk wijzigen metabolisme in muizen. Daarom moeten alle Ademhalings metingen worden uitgevoerd aan de thermoneutrale condities (t = 30 °C) met behulp van een neonatale incubator12 (Figuur 1a). Het hele lichaam plethysmografie kamer (WBP) is gebruikt voor alle metingen. Alle dieren moeten worden geacclimeerd aan de barometrische plethysmografie kamer en aan een Sham nek kraag voor daaropvolgende Pulse oximetrie opname voor 3-5 dagen voorafgaand aan de HVR metingen. HVR wordt geregistreerd tussen 10 uur en 5 uur. HVR wordt onderdrukt tijdens de slaap, daarom kan het afzonderlijk worden gemeten tijdens de slaap en rustige wakkerheid13. Om de specifieke slaap-waak fase van het dier tijdens de HVR-meting te waarborgen, moeten de EEG/EMG-elektroden worden geïmplanteerd als een EEG/EMG-Head zoals eerder beschreven14. Dieren moeten worden toegestaan om ten minste 72 uur na de hoofdsteun te herstellen. Slaap fasering moet worden uitgevoerd in 5 s tijdperken. NREM slaap wordt herkend door de langzame Golf EEG activiteit bezetten groter dan 50% van het tijdperk. Stille wakkerheid manifesteert zich door de alpha EEG activiteit in de afwezigheid van bewegingen. REM-slaap wordt geïdentificeerd door de overheersende Alfa-en theta EEG-activiteit in de aanwezigheid van een verminderde spierspanning op EMG. Normaalgesproken wordt REM-slaap niet waargenomen tijdens de HVR-gasuitdagingen.
- Het HVR-opname Protocol
- Gebruik de WBP-kamer van de volgende maat: inwendige diameter van 80 mm, hoogte van 50,5 mm en volume van 0,4 L. De WBP kamer bestaat uit twee kamers, verzegelde en referentie kamers, en een cirkelvormig platform om de muis14 (Figuur 1B) te plaatsen. Instroom en uitstroom in de kamer worden gecontroleerd door positieve en negatieve druk bronnen die de atmosferische druk behouden. Dit besturingselement creëert een gestage bias flow in de kamer en voorkomt CO2 retentie. Voor meer informatie over de WBP-set-up, zie Hernandez en collega's15.
- Meet de temperatuur binnen de kamer en de relatieve vochtigheid in de ruimte voordat u de muis in de WBP plaatst.
- Meet het lichaamsgewicht en de rectale temperatuur.
- Plaats de Oximeter kraag rond de nek van de muis (het gebied moet eerder geschoren zijn).
- Plaats de muis in de WBP en zorg ervoor dat de kamer volledig is afgesloten om luchtlekkage te voorkomen.
- Wacht ongeveer 30 minuten totdat de muis stil is en de kamer zich op een constant volume bevindt.
- Normoxia: na 30 min, als de muis stil is, beginnen met het opnemen van de Ademhalings signalen en perifere zuurstofverzadiging (SpO2) bij normoxia fase (21% fio2 bij 1 ATM van druk) gedurende 20 min, met behulp van labchart 7 Pro (versie 7,2).
- Hypoxie: na 20 min van rustige normoxia, beginnen met het opnemen van de eerste cyclus van acute hypoxie en SpO2. Voor hypoxie fase, bloot de dieren aan een constante gemengde gasstroom samengesteld door 10% O2 en 3% co2 voor 5 min.
- Tijdens de eerste 30 sec van hypoxie stroomt het gemengde gas door de kamer via 2 kleine zijpoorten aan de basis waardoor de FiO2 kan dalen van 21% (bij 1 ATM van druk) tot 10%.
- Na de eerste 30 s sluit u een van de kleine zijpoorten van de WBP-kamer en houdt u de opname bij de constante hypoxie bij 10% FiO2 gedurende 5 minuten.
Opmerking: het mengsel van 10% O2 en 3% co2 bij hypoxie wordt gebruikt om eucapnea11te handhaven.
- Na de 5 min van hypoxie, de muis weer blootstellen aan kamerlucht (21% fio2 bij 1 ATM van druk) door het omschakelen van de instroom bron.
- Wacht ten minste 30 minuten tot de volgende normoxia-opname om te herstellen van de vorige hypoxische blootstelling om te voorkomen dat de ventilatoren roll-off fenomeen (dat wil zeggen, centrale onderdrukking van de ademhaling tijdens hypoxie16).
Opmerking: Herhaal normoxie/hypoxie cycli driemaal in elke muis om de reproduceerbaarheid van de metingen te verzekeren. In onze ervaring, extra (meer dan 3 keer op een bepaalde dag) hypoxische blootstellingen moeten worden vermeden, vanwege de beemingsadaptatie (de roll-off fenomeen). - Kalibreer aan het einde van het experiment de WBP-kamer (met de muis is nog steeds binnen) door 1 mL kamerlucht 3 keer te injecteren met een injectiespuit die is aangesloten op een van de kleine zijpoorten aan de basis van de kamer.
- Meet de temperatuur in de kamer opnieuw met het dier erin.
- Open de kamer en meet de rectale temperatuur van de muis voordat u deze terugplaatst in de huis kooi.
- HVR-berekening
- Digitaliseer alle signalen voor HVR-berekening op 1.000 Hz (bemonsteringsfrequentie per kanaal).
Opmerking: WBP Tidal volume analyse wordt uitgevoerd in Lab Chart 7 op basis van Drorbaugh en Fenn vergelijking17. De vereiste variabelen bestaan uit de rectale temperatuur van de muis en de kamertemperatuur (voor en na de HVR-meting), de relatieve vochtigheid en de gasconstante van de kamer. Deze constante wordt verkregen uit de WBP druk afbuiging na de 1 mL lucht injecties in de kalibratie fase. Voor meer informatie, zie Hernandez en collega's15. - Na het berekenen van de vergelijking Drorbaugh en Fenn, vermenigvuldigt u het kamer kanaal van het getijden volume (VT) met de constante.
-
Selectie van opnames voor de analyse
- Normoxia: Selecteer alleen gedeelten van gestage ademhaling met constant getijden volume. Vermijd secties in de nabijheid van muisbewegingen.
- Hypoxie: gooi de eerste 30 s weg wanneer O2 niveaus afnemen van 21% naar 10%, selecteer secties van 30 s tot 2 min van 10% O2 blootstelling (een 90 s interval). Selecteer binnen dit interval alleen secties met constante ademhaling met constant getijden volume. Vermijd secties in de nabijheid van muisbewegingen. De analyse is betrouwbaar als ten minste 10 s van hypoxie is geselecteerd in elke cyclus.
Opmerking: De perifere component van chemoreflex, bestuurd door CB, overheerst tijdens de eerste 1-2 min van blootstelling16,18,19. Tijdens de tweede fase, tussen 2 min en 5 min hypoxische blootstelling, spelen zowel het perifere als het centrale onderdeel een rol. Ten slotte wordt de derde fase, > 5 min, gekenmerkt door hypoventilatie (het roll-off fenomeen), voornamelijk bestuurd door centrale chemoreceptors. Onze ervaring leert dat muizen vaak wakker zijn tijdens hypoxische expositie vanwege de handmatige schakelopties in de luchtstroom bron.
- Bereken na de selectie de gemiddelde minuten ventilatie (Ve) bij normoxic en hypoxische condities met behulp van de formule Ve = ademhalingsfrequentie X getijden volume.
- Bereken het gemiddelde SpO2 bij normoxia en hypoxie condities.
- Bereken de HVR handmatig met behulp van de formule HVR = (Ve (10% o2)-ve (21% o2))/(SPO2 (10% o2) – SPO2 (21%o 2)).
Opmerking: In C57BL/6J muizen, de osmotische pomp voor leptine infusie kan afbreuk doen aan de nauwkeurige SpO2 signaaldetectie door de nek kraag. In dit geval wordt HVR berekend op basis van de FiO2 -waarden bij normoxic en hypoxische condities als HVR = ΔvE /δfio211.
- Digitaliseer alle signalen voor HVR-berekening op 1.000 Hz (bemonsteringsfrequentie per kanaal).
3. carotis Body Denervatie of carotis sinus zenuw dissectie (CSND)
Opmerking: We voerden gecombineerde chirurgische en chemische denervatie een week uit elkaar, omdat chirurgische denervatie alleen niet de hypoxische chemoreflex afschaffen.
-
Chirurgische voorbereiding
- Voer alle procedures uit voor volwassen mannelijke C57BL/6J-muizen. Steriliseer alle chirurgische instrumenten. Gebruik steriele chirurgische handschoenen, spuiten en met katoen getipt applicators.
- Anesthetize mannelijk C57BL/6j muizen met 1-2% Isofluraan met behulp van een neuskegel en plaats een warme deken om hypothermie te voorkomen. Isofluraan wordt zorgvuldig getitreerd om de ademhalingsfrequentie bij 1 Hz (60 ademhalingen/min) te handhaven. De toereikendheid van de anesthesie voorafgaand aan het starten van operaties zal worden beoordeeld door de ademhaling frequentie, de afwezigheid van bewegingen en hoorbare geluiden, de afwezigheid van reactie op tactiele stimuli en de forelimb of hindledemaat pedaal terugtrekking reflex.
- Dien buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal toe om pijn ongemak te voorkomen. Verwijder het haar in het ventrale gebied van de nek en Desinfecteer het gebied met Betadine en alcohol.
- Ter voorkoming van corneale uitdroging, smeer de ogen van de muizen met steriele oftalmische zalf tijdens de anesthesie.
-
CSND-procedures
Fase 1: chirurgische denervatie- Na middenlijn incisie, bloot de bifurcatie van de gemeenschappelijke carotis slagaders door het verwijderen van bindweefsel en vetweefsel.
- Identificeer de hypoglossale zenuw, die meestal zeer prominent, en til het omhoog om de glossopharyngeale zenuw onmiddellijk eronder bloot. Dissect carotis sinus zenuwen bilateraal met behulp van micro veer schaar.
- Sluit de incisie met 6-0 zijde hecht.
- Dien 1 mL normale zoutoplossing subcutaan toe om uitdroging te voorkomen.
- Huis de muizen in een herstel kamer en bewaak hun gedrag elke 15 minuten voor de eerste 1 uur totdat de muizen opnieuw bewustzijn krijgen om borstbeen recumbency te handhaven. Keer de muizen terug naar hun huis kooien nadat ze volledig zijn hersteld. Houd de muizen twee keer per dag in de gaten voor de volgende 3 dagen. Geef extra buprenorfine als muizen tekenen van pijn vertonen (bijv. verminderde eetlust, rusteloosheid).
Fase 2: chemische denervatie - Een week na de operatie, verf de halsslagader met een oplossing van 2% fenol verdund in ethanol op de punten van vertakkingen van de glossopharyngeale zenuw naar de schedel stok van de CB. Dezelfde postoperatieve verzorging moet worden gegeven na de chemische denervatie zoals hierboven beschreven in de chirurgische denervatie sectie.
Opmerking: voor een Sham chirurgie groep, dezelfde procedures worden uitgevoerd met uitzondering van de carotis sinus zenuw dissectie. - Laat de dieren herstellen voor 5-7 dagen vóór HVR metingen.
4. expressie van LepRb in het CB met behulp van een adenovirale vector (ad-leprb) versus controle (ad-lacz)
-
Ad-LepRb en ad-lacz schorsing
- Transfect de muizen met adenovirus (ad-LepRb-GFP, 2-5X1010 Pfu/ml voor overexpressie, ad-lacz, 1 x 1010 Pfu/ml voor controle) naar het CB-gebied.
- Ontdooi de Matrigel matrix door de injectieflacon in ijs in een koelkast van 4 °C 's nachts in te voegen.
- Onderbreek adenovirus voorzichtig in vloeibare Matrigel matrix bij 1:5 (1 μL Matrigel matrix en 4 μL adenovirus bilateraal toegepast).
- Houd virale suspensie altijd op ijs totdat deze in de CB wordt aangebracht.
-
Chirurgische voorbereiding
- Gebruik dezelfde chirurgische instrumenten als het CSND-protocol.
- Anesthetize leprb-deficiënte db/DB muizen met 2-2.5% Isofluraan met behulp van een neuskegel en plaats de dieren op een warme deken om hypothermie te voorkomen. Isofluraan wordt zorgvuldig getitreerd om de ademhalingsfrequentie bij 1 Hz (60 ademhalingen/min) te handhaven. De toereikendheid van de anesthesie zal worden beoordeeld door de ademhaling frequentie, de afwezigheid van bewegingen en hoorbare geluiden, de afwezigheid van reactie op tactiele stimuli en de forelimb of hindledemaat pedaal terugtrekking reflex.
- Toediening van buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal.
- Verwijder het haar in het ventrale gebied van de nek en Desinfecteer het gebied met Betadine en alcohol zoals in het CSND-protocol.
- Ter voorkoming van corneale uitdroging, smeer de ogen van de muizen met steriele oftalmische zalf tijdens de anesthesie.
-
Adenovirus behandeling van de CB
- Stel CBs bloot zoals beschreven in het CSND-protocol en breng 5 μL van de virale suspensie op bilateraal wijze aan op het CB-gebied.
- Wacht 2-3 min tot de Liquid Matrigel matrix een gel wordt. Na te hebben bevestigd dat de virale suspensie was gecongealed, sluit de incisie met 6,0 zijde hecht.
-
Na de operatie
- Huis de muizen in een herstel kamer en bewaak hun gedrag elke 15 minuten voor de eerste 1 uur totdat de muizen opnieuw bewustzijn krijgen om borstbeen recumbency te handhaven. Keer de muizen terug naar hun huis kooien nadat ze volledig zijn hersteld. Houd de muizen twee keer per dag in de gaten voor de volgende 3 dagen. Geef extra buprenorfine als muizen tekenen van pijn vertonen (bijv. verminderde eetlust, rusteloosheid).
- Dien buprenorfine (0,05 mg/kg) intraperitoneaal toe om pijn ongemak te voorkomen tijdens de postoperatieve periode.
- Meet HVR 9 dagen na de adenovirus transfection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Continue infusie van leptine significant toegenomen HVR in Lean C57BL/6J muizen van 0,23 tot 0,31 mL/min/g/ΔFiO2 (P < 0,001, Figuur 2)11. CSND afgeschaft de leptine-geïnduceerde toename in HVR (Figuur 2), terwijl geen verzachtende effecten van csnd op HVR werden waargenomen in Sham chirurgie groep na leptine infusie.
LepRb -expressie in de CB van leprb-deficiënte zwaarlijvige db/DB muizen induceerde een significante toename van HVR van 0,05 tot 0,06 ml/min/g/δspo2 (Figuur 3). Bij dieren die met Control ad-LacZ in CB zijn getransfeerd, is HVR niet veranderd.
Afbeelding 1: HVR-metingen. Experimenten dienen te worden uitgevoerd onder thermoneutrale omstandigheden met behulpvan a eenneonatale incubator op 30 °c en worden geregistreerd in een (B) hele lichaam plethysmografie kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: leptine verhoogde de hypoxische-ventilatorrespons (HVR) en de effecten werden afgeschaft door de zenuw dissectie (CSND) van de carotis sinus in C57BL/6J-muizen. Dit cijfer is gewijzigd van Caballero-Eraso et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: LepRb -expressie in de carotis lichamen (CB) van leprb-deficiënte db/DB -muizen verhoogde de hypoxische ventilatorrespons (HVR). Dit cijfer is gewijzigd van Caballero-Eraso et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste focus van onze studie was het onderzoeken van respiratoire effecten van leptine signalering in de CB. Verschillende protocollen zijn ontwikkeld om de rol van leptine op een mechanistische manier te beoordelen. Eerste, specifieke bijdrage van CB aan de HVR werd geanalyseerd door zorgvuldige kwantificering van de HVR tijdens de eerste 2 min van hypoxische blootstelling. Ten tweede, de relevantie van CB in leptine-gemedieerde up-regulering van de controle van de ademhaling werd onderzocht door twee complementaire benaderingen. In mager wild-type muizen met lage leptine niveaus, de HVR werd gemeten bij baseline en na continue infusie van leptine; het experiment werd herhaald na CB denervation. Bij Leprb-deficiënte db/DB -muizen werd de HVR gemeten bij baseline en na leprb -expressie in de CB.
Er zijn verschillende protocollen gebruikt om HVR bij knaagdieren te meten en de dieren bloot te stellen aan hypoxische gassen. We hebben een HVR-protocol ontwikkeld om de rol van CB in de perifere chemoreflex en de effecten van leptine in CB op de controle van de ademhaling te onderzoeken. CB chemoreflex heeft een relatief korte tijddomein. De eerste 1-2 min van hypoxie worden gekenmerkt door een acute vergroting van de respons van de ventilatoren, gevolgd door een langzame terugkeer naar Baseline ventilatie na 2 min van de zenuwstimulatie van de halsslagader sinus16,18,19. Zo worden in ons HVR-protocol de analyses uitgevoerd binnen een interval van 90 s tussen de eerste 30 s van hypoxie en 2 min. 10% O2 blootstelling, overeenkomend met de overheersing van perifere chemoreflex bestuurd door CB. Deze korte-tijd analyse vermijdt de hypoxische ventilatordepressie bij de dieren. In ons HVR-protocol gebruikten we ook een vaste 3% co2 -spanning in hypoxie om de komen veroorzaakt door hyperventilatie te omzeilen tijdens acute hypoxische blootstelling11. Tot slot hebben we het HVR-protocol ontwikkeld onder constante thermoneutrale omstandigheden, waarbij de muizen op een temperatuur van ongeveer 30 °C blijven. Onze ervaring leert dat korte blootstellingen aan hypoxie de rectale temperatuur bij muizen kunnen verlagen als de blootstelling bij kamertemperatuur11is, terwijl hypoxie bij thermoneutraliteit geen significante metabole veranderingen veroorzaakt12.
CSND bij muizen is technisch uitdagend, vanwege de geringe omvang van de dieren en hun CBs. We hebben een consequent succesvolle aanpak ontwikkeld met bijna 100% overlevingspercentage door strikte naleving van ons protocol. Gecontroleerde omstandigheden in ons protocol omvatten thermoneutrale omgeving, zorgvuldig gecontroleerde anesthesie en standaard steriele microchirurgische technieken met visualisatie van de glossopharyngeale zenuw als waakzaam postoperatieve Management met pijn Controle. Onze ervaring leert dat chirurgische denervatie alleen de hypoxische chemoreflex niet afschaffen. De tweede stap, chemische denervatie, wordt ook gevolgd door een zorgvuldige postoperatieve behandeling om de overleving te verbeteren.
Onze meest innovatieve techniek is selectieve genoverexpressie in het CB-gebied. Deze aanpak is niet eerder geïmplementeerd, vanwege de geringe omvang van de CBs en het ontbreken van specifieke bestuurders waardoor een gen van belang in een bepaald celtype te uiten. Eigenlijk, type I CB cellen zijn zeer vergelijkbaar met sympathische neuronen of cellen van de bijnier medulla, terwijl type II cellen vergelijkbaar zijn met astrocyten20,21. We maakten gebruik van db/DB -muizen, die niet het leprb -gen hebben, ons vermogen om adenovirale suspensie bijna uitsluitend toe te passen op het CB-gebied en eigenschappen van de matrigel-matrix, die snel stolt bij 37 °c. Onze nieuwe aanpak kan in de toekomst worden gebruikt om een rol te bestuderen van een gen uitgedrukt in CB met behulp van muizen met het hele lichaam Tyrosine hydroxylase specifiek (type I cellen) of GFAP specifieke (type II cellen) knockouts.
Onze protocollen hebben verschillende beperkingen. Eerst gebruikten we 3% CO2 om de HVR te bepalen en de vraag blijft open als de Fractie van de HVR daadwerkelijk kan worden toegeschreven aan de hypercapnic-respons. Om deze beperking aan te pakken, kunnen onderzoekers tegelijkertijd de responsen meten tot 3% CO2 gebalanceerd in hyperoxisch gas, waardoor de CB zou worden uitgeschakeld. Ten tweede kan HVR niet volledig worden geëlimineerd door CSND22. Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan Neuroplasticiteit, die bijzonder prominent bij muizen. Daarom is het belangrijk om HVR zo snel mogelijk na CSND te bestuderen en altijd gebruik te maken van Sham Surgery controle. Ten derde ontbrak onze CB genexpressie benadering celtype en orgaan specificiteit. Moleculaire technieken met het toekomstig gebruik van meer selectieve promotors kunnen helpen om deze beperking tegen te gaan.
Concluderend, ondanks de hierboven beschreven beperkingen, maken onze protocollen in combinatie het mogelijk om de rol van specifieke CB-genen in fysiologische reacties op hypoxie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen of openbaarmakingen.
Acknowledgments
R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Insulin Syringes | BD Biosciences | 309311 | |
| 1x PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | 500 ml |
| Ad-Lacz | Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago) | 1 x 1010 pfu/mL | |
| Ad-LepRb-GFP | Vector Biolabs | ADV-263380 | 2-5 x 1010 pfu/mL |
| Anesthetic cart | Atlantic Biomedical | ||
| Betadine | Purdue Products Ltd. | 12496-0757-5 | |
| Buprenorphine (Buprenex) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | 0.3 mg/mL |
| C57Bl/6J | Jackson laboratory | 000664 | Mice Strain |
| Cotton Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-362-178 | |
| db/db | Jackson laboratory | 000697 | Mice Strain |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Isoflurane | Vetone | 502017 | |
| Lab Chart | Data Science International (DSI) | Software | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| Micro Spring Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 14124 | |
| Mouse Ox Plus | STARR Life Sciences Corp. | Software | |
| Mouse Ox Plus Collar Sensor | STARR Life Sciences Corp. | 015022-2 | Medium Collar Clip Special 7” |
| Mouse Whole Body Plethysmography Chamber | Data Science International (DSI) | PLY3211 | |
| Ohio Care Plus Incubator | Ohmeda | HCHD000173 | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments (WPI) | 501753-G | Straight |
| Osmotic Pump | Alzet | 1003D | 1 μL/h, 3 days |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P4557 | |
| Recombinant Mouse Leptin protein | R&D systems | 498-OB-05M | 5 mg |
| Saline | RICCA Chemical | 7210-16 | 0.9% Sodium Chloride |
| Sterile Surgical Suture | DemeTech | DT-639-1 | Silk, size 6-0 |
| Thermometer | Innovative Calibration Solutions (INNOCAL) | EW 20250-91 |
References
- O'donnell, C. P., et al.
- Polotsky, V. Y., et al. Female gender exacerbates respiratory depression in leptin-deficient obesity. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, 1470-1475 (2001).
- Bassi, M., et al. Central leptin replacement enhances chemorespiratory responses in leptin-deficient mice independent of changes in body weight. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 145-153 (2012).
- Inyushkina, E. M., Merkulova, N. A., Inyushkin, A. N. Mechanisms of the respiratory activity of leptin at the level of the solitary tract nucleus. Neuroscience and Behavioral Physiology. 40, 707-713 (2010).
- Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. New England Journal of Medicine. 334, 292-295 (1996).
- Maffei, M., et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).
- Phipps, P. R., Starritt, E., Caterson, I., Grunstein, R. R. Association of serum leptin with hypoventilation in human obesity. Thorax. 57, 75-76 (2002).
- Berger, S., Polotsky, V. Y. Leptin and Leptin Resistance in the Pathogenesis of Obstructive Sleep Apnea: A Possible Link to Oxidative Stress and Cardiovascular Complications. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 5137947 (2018).
- Ribeiro, M. J., et al. High fat diet blunts the effects of leptin on ventilation and on carotid body activity. The Journal of Physiology. 96, 3187-3199 (2018).
- Yuan, F., et al. Leptin signaling in the carotid body regulates a hypoxic ventilatory response through altering TASK channel expression. Frontiers in Physiology. 9, 249 (2018).
- Caballero-Eraso, C., et al. Leptin acts in the carotid bodies to increase minute ventilation during wakefulness and sleep and augment the hypoxic ventilatory response. The Journal of Physiology. 591, 151-172 (2018).
- Jun, J. C., Shin, M. K., Yao, Q., Devera, R., Fonti-Bevans, S., Polotsky, V. Y. Thermoneutrality modifies the impact of hypoxia on lipid metabolism. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 304, 424-435 (2012).
- Polotsky, V. Y., et al. Impact of interrupted leptin pathways on ventilatory control. Journal of Applied Physiology. 96, 991-998 (2004).
- Pho, H., et al. The effect of leptin replacement on sleep-disordered breathing in the leptin-deficient ob/ob mouse. Journal of Applied Physiology. 120, 78-86 (2016).
- Hernandez, A. B., et al. Novel whole body plethysmography system for the continuous characterization of sleep and breathing in a mouse. Journal of Applied Physiology. 112, 671-680 (2012).
- Powell, F. L., Milsom, W. K., Mitchell, G. S. Time domains of the hypoxic ventilatory response. Respiration Physiology. 112, 123-134 (1998).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16, 81-87 (1955).
- Duffin, J. Measuring the ventilatory response to hypoxia. The Journal of Physiology. 587, 285-293 (2007).
- Teppema, L. J., Dahan, A. The Ventilatory Response to Hypoxia in Mammals: Mechanisms, Measurement, and Analysis. Physiological Reviews. 90, 675-754 (2010).
- Nurse, C. A., Fearon, I. M. Carotid body chemoreceptors in dissociated cell culture. Microscopy Research and Technique. 59, 249-255 (2002).
- Kumar, P., Prabhakar, N. R. Peripheral chemoreceptors: function and plasticity of the carotid body. Comprehensive Physiology. 2, 141-219 (2012).
- Roux, J. C., Peyronnet, J., Pascual, O., Dalmaz, Y., Pequignot, J. M. Ventilatory and central neurochemical reorganisation of O2 chemoreflex after carotid sinus nerve transection in rat. The Journal of Physiology. 522, 493-501 (2000).
