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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un flusso di lavoro di integrazione dei dati per identificare le combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine I - Division of Oncology, Comprehensive Cancer Center, Medical University of Vienna, 2Department of Nephrology, Medical University of Vienna, 3Department of Internal Medicine IV, Medical University Innsbruck

Summary

Grandi schermi genetici negli organismi modello hanno portato all'identificazione di interazioni genetiche negative. Qui descriviamo un flusso di lavoro di integrazione dei dati utilizzando i dati degli schermi genetici negli organismi modello per delineare combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche nel cancro.

Abstract

Un'interazione letale sintetica tra due geni viene data quando il knock-out di uno dei due geni non influisce sulla vitalità cellulare, ma il knock-out di entrambi gli interattori letali sintetici porta alla perdita della vitalità cellulare o alla morte cellulare. La migliore interazione letale sintetica studiata è tra BRCA1/2 e PARP1, con inibitori PARP1 utilizzati nella pratica clinica per trattare pazienti con tumori mutati BRCA1/2. Grandi schermi genetici negli organismi modello ma anche nelle linee cellulari umane aploidi hanno portato all'identificazione di numerose coppie di interazione letale sintetica aggiuntive, tutte potenziali bersagli di interesse nello sviluppo di nuove terapie tumorali. Un approccio è quello di indirizzare terapeuticamente geni con un interatore letale sintetico che è mutato o significativamente deregolamentato nel tumore di interesse. Un secondo approccio è quello di formulare combinazioni di farmaci che affrontino le interazioni letali sintetiche. In questo articolo viene delineato un flusso di lavoro di integrazione dei dati per valutare e identificare le combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche. Utilizziamo set di dati disponibili sulle coppie di interazioni letali sintetiche, risorse di mappatura dell'omologia, collegamenti a destinazione farmacologica da database dedicati e informazioni sui farmaci studiati negli studi clinici nell'area di interesse della malattia. Sottolineiamo inoltre i risultati chiave di due recenti studi del nostro gruppo sulla valutazione della combinazione di farmaci nel contesto del cancro alle ovaie e al seno.

Introduction

La letalità sintetica definisce un'associazione di due geni, in cui la perdita di un gene non influisce sulla vitalità, ma la perdita di entrambi i geni porta alla morte cellulare. Fu descritto per la prima volta nel 1946 da Dobzhansky mentre analizzava vari fenotipi di drosofilia allevando mutanti omozigoti1. I mutanti che non producevano prole vitale, sebbene vitali da soli, mostravano fenotipi letali quando incrociati con alcuni altri mutanti, dando il terreno per l'istituzione della teoria della letalità sintetica. Hartwell e colleghi hanno suggerito che questo concetto potrebbe essere applicabile per la terapia del cancro nell'uomo2. La letalità sintetica provocata farmacologicamente potrebbe basarsi su una sola mutazione, dato che il partner letale sintetico del gene mutato è bersaglio di un composto farmacologico. La prima coppia genica a consentire l'induzione farmacologica della letalità sintetica è stata BRCA(1/2) e PARP1. PARP1 funziona come un sensore per danni al DNA ed è legato a siti di rotture di filamenti di DNA doppi e singoli, supercoil e crossover3. BRCA1 e 2 svolgono un ruolo importante nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la ricombinazione omologa4. Agricoltori e colleghi hanno pubblicato i risultati che le cellule carenti di BRCA1/2 erano suscettibili all'inibizione parp, mentre nessuna citotossicità è stata osservata nelle cellule di tipo selvatico BRCA5. In definitiva, gli inibitori del PARP sono stati approvati per il trattamento del cancro al seno e alle ovaie carente di BRCA6,7. Inoltre, le coppie geniche di letalità sintetica che portano all'approvazione clinica dei composti farmacologici sono molto attese e una delle principali aree dei recenti sforzi di ricerca sul cancro8.

Le interazioni geniche letali sintetiche sono state modellate in più organismi tra cui moscerini della frutta, C. elegans elievito 2. Utilizzando vari approcci tra cui knockout di RNA-interferenza e CRISPR / CAS- libreria, negli ultimi anni sono state scoperte nuove coppie di geni letalisintetici 9,10,11. Housden e colleghi12hanno recentemente pubblicato un protocollo sulle procedure sperimentali di RNAi in combinazione con CRISPR/CAS. Nel frattempo, i ricercatori hanno anche condotto grandi schermi in cellule umane aploidi per identificare le interazioni letalisintetiche 13,14. In silico metodi come l'analisi biologica della rete e l'apprendimento automatico hanno anche mostrato promesse nella scoperta delle interazioni letalisintetiche 15,16.

Dal punto di vista concepibile, un approccio per utilizzare interazioni letali sintetiche nel contesto della terapia antitumorale è identificare proteine mutate o non funzionali nelle cellule tumorali, rendendo i loro partner di interazione letale sintetica promettenti obiettivi farmacologici per l'intervento terapeutico. A causa dell'eterogeneità della maggior parte dei tipi di tumore, i ricercatori hanno iniziato la ricerca delle cosiddette proteine sintetiche del mozzo letale. Questi mozzi letali sintetici hanno una serie di partner di interazione letale sintetica che sono mutati e quindi non funzionali o significativamente deregolamentati nei campioni di tumore. Affrontare tali mozzi letali sintetici promette di aumentare l'efficacia del farmaco o superare la resistenza ai farmaci come potrebbe essere mostrato ad esempio nel contesto del neuroblastoma resistente alla vincristina17. Un secondo approccio per migliorare il trattamento farmacologico facendo uso del concetto di interazioni letali sintetiche è quello di identificare combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche. Ciò potrebbe portare a nuove combinazioni di terapie antitumorali singole già approvate e al riposizionamento di farmaci da altre aree di malattia al campo dell'oncologia.

In questo articolo, presentiamo una procedura passo-passo per produrre un elenco di combinazioni di farmaci che si rivolgono a coppie di interazioni letali sintetiche. In questo flusso di lavoro, utilizziamo i dati sulle interazioni letali sintetiche da BioGRID e (ii) le informazioni sui geni omologhi di Ensembl, (iii) recuperiamo coppie farmaco-bersaglio da DrugBank, (iv) costruiamo associazioni di farmaci malattia da ClinicalTrials.gov e (v) generiamo quindi una serie di combinazioni di farmaci che affrontano interazioni letali sintetiche. Infine, forniamo combinazioni di farmaci nel contesto del cancro alle ovaie e al seno nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Protocol

1. Recupero di coppie geniche letali sintetiche

  1. Recupero dati da BioGrid.
    1. Scaricare l'ultimo file di interazione BioGRID in formato tab2 da https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip utilizzando un browser Web o direttamente dalla riga di comando Linux utilizzando curl o wget18.

      ##download e decomprimere l'ultimo file di interazione BioGRID
      #download ultimo file di interazione BioGRID utilizzando curl
      curl -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack il file di dati scaricato
      decomprimere biogrid_latest.zip
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
    2. Dopo aver scaricato l'archivio zip, decomprimere l'archivio deve e annotare il nome del file di set di dati effettivo (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) per i passaggi successivi. Il file di dati BioGRID contiene interazioni di diversi tipi che verranno filtrate nel passaggio successivo.
      NOTA: Esistono altre fonti (ad esempio DRYGIN, SynlethDB) che trattenere interazioni letali sintetiche, come delineato nella discussione.
  2. Filtro per letalità sintetica e interazioni genetiche negative (Sistema Sperimentale).
    1. Utilizzare le informazioni nella colonna "Sistema sperimentale" (colonna numero 12) che indica la natura delle prove a supporto di un'interazione per identificare le interazioni letali sintetiche.
    2. Limitare il set di dati alle voci con valore Ditalità genetica negativa o sintetica. Nello stesso passaggio, filtrare le colonne e mantenere solo le colonne rilevanti per i passaggi di analisi successivi elencati nella tabella 1 seguente.

      ##restrict il file di interazione BioGRID alle colonne pertinenti e mantenere solo le interazioni classificate come letalità genetica e sintetica negativa
      cut -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      stampa $0
      }else if($4 == "Negative Genetic" || $4 == "Letalità sintetica"){
      stampa $0
      }
      L'> bg_synlet.txt

      NOTA: nei frammenti di codice ^I viene utilizzato per rappresentare schede orizzontali. Ulteriori categorie BioGRID come il difetto di crescita sintetico possono essere incluse. Altre colonne rilevanti per questo flusso di lavoro sono elencate nella tabella 1. BioGRID conserva anche i punteggi per le interazioni individuali. I tagli possono essere usati per identificare interazioni con una maggiore sicurezza.
Numero di colonna Nome intestazione di colonna
3 Nome gene
12 specie
13 ID farmaci

Tabella 1: Colonne pertinenti del file di dati BioGRID.

  1. Identificare le specie per le quali sono state riportate interazioni letali sintetiche.
    1. Determinare il numero di ID fiscali del partner di interazione letale sintetica per ottenere una stima del numero di interazioni letali sintetiche disponibili per organismo.

      ##count il numero di presenze di ogni codice fiscale nelle interazioni letali sintetiche estratte in precedenza
      cut -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | coda -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | ordinare | Uniq -c | ordinamento -r -g

      NOTA: Come risultato del passaggio 1, un elenco di interazioni letali sintetiche con simboli genici da organismi in cui sono state determinate le interazioni. La maggior parte delle interazioni letali sintetiche sono state determinate negli organismi modello. Quando si caricano file in un programma foglio di calcolo (ad esempio Excel) evitare di rovinare i simboligenetici 19,20.

2. Tradurre coppie geniche letali sintetiche in ortologi umani

  1. Recuperare gli ortologi umani per gli organismi modello pertinenti identificati nel passaggio 1.3.
    1. Recupera gli ortologi umani da Ensembl BioMart21 collegando il rispettivo set di dati genetici dell'organismo modello con il set di dati genetici umani. Usa i simboli genetici che denotano il gene nell'organismo modello e i geni umani ortologi per questo compito. Utilizzare il servizio web Ensembl BioMart per automatizzare il processo di recupero e inviare la query direttamente all'accesso RESTful BioMart per il recupero delle coppie di geni ortologi (vedere l'esempio seguente e Ensembl BioMart Help & Documentation per ulteriori dettagli).

      ##retrieve ortologo umano per Saccharomyces Cerevisiae di Ensembl BioMart utilizzando curl per inviare la query BioMart direttamente al servizio di accesso RESTful BioMart
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=











      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"

      Per recuperare i geni umani ortologi per altri organismi modello, sostituire il valore dell'attributo name del primo elemento Dataset con il nome del rispettivo set di dati Ensembl ed eseguire nuovamente la query.

      NOTA: Il processo di mappatura ortologa è ben documentato in Ensembl BioMart Help & Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
    1. Accedere a una query BioMart di esempio per gli ortologi umani per Saccharomyces cerevisiae, la specie superiore identificata nel passaggio 1.3, tramite l'URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      NOTA: Esistono altre fonti (ad esempio carrellata, browser oma, HomoloGene, inparanoide) per la mappatura dell'omologia, come delineato nella sezione di discussione di questo manoscritto.
  2. Aggiungi ortologi umani alle interazioni letali sintetiche estratte.
    1. Unire le interazioni letali sintetiche basate sul tax-ID dell'organismo e sul simbolo genico con le coppie ortologhe recuperate nel passaggio 2.1. Per le coppie di interazione letale sintetica umana creare coppie ortologhe artificiali per ogni gene umano presente nel set di dati o assicurarsi che le interazioni letali sintetiche umane non siano scartate durante l'unione e il trasferimento dei simboli genetici umani nelle colonne appena aggiunte.

      ##collect mapping ortologi in un unico file e unirsi a file di interazione letale sintetico
      #create file di destinazione con intestazioni per la raccolta di mapping ortologi
      mappatura > eco "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol.txt

      #repeat questo passaggio per ogni organismo modello, fare attenzione ad adattare il nome del file di input e il codice fiscale
      #adds per ogni coppia di ortologi in s_cerevisiae.txt una nuova voce nella mappatura.txt: il simbolo genico è preceduto dal codice fiscale per facilitare la successiva unione con il file di interazioni letali sintetiche
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if($1 != "" && $2 != ""){
      stampa org_tax_id"/"$1, $2
      }
      Mapping s_cerevisiae.txt >> }'.txt

      #create di mappatura artificiale per i geni umani
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      if($5 == human_tax_id){
      stampa $5"/"$2, $2
      }
      if($6 == human_tax_id){
      stampa $6"/"$3, $3
      }
      La commissione per la prima bg_synlet.txt | mapping di ordinamento -u >>.txt

      #add chiavi di join richieste (id fiscale/simbolo gene) alle interazioni letali sintetiche
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      stampa $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      }else{
      stampa $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      La commissione per la pesca e lo sviluppo bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt

      #join interazioni letali sintetiche con coppie ortologhe
      unire tmp_bg_synlet_w_keys.txt mapping.txt 7 1 > tmp.txt
      unire il mapping .txt tmp.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt

      NOTA: il comando di unione utilizzato in questo esempio non è un comando Unix standard. Tuttavia, la sua implementazione con l'aiuto dell'ordinamento e del join gnu core utilities è semplice. Il comando è stato introdotto per nascondere la complessità dell'ordinamento dei file prima che possano essere uniti al join di comando. Un'implementazione dell'unione è disponibile all'https://github.com/aheinzel/merge-sh.
    1. Uso di qualsiasi identificatore genico che identifichi in modo univoco il gene in un determinato spazio dei nomi per ottenere i migliori risultati possibili.
      NOTA: Il passaggio 2 si traduce in un elenco di interazioni letali sintetiche da più organismi mappati ai geni umani.

3. Mappatura dei partner di interazione letale sintetica alle droghe

  1. Recupera coppie di droga-bersaglio da DrugBank.
    1. Scaricare i dati di DrugBank dalla sezione download di DrugBank e creare prima un account se non è già stato creato22. Utilizzare il file CSV con identificatori di destinazione del farmaco (sezione identificatori proteici: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) e il vocabolario DrugBank (sezione open data: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) con identificatori e nomi DrugBank. In alternativa, estrarre le informazioni necessarie dal dump del database XML.

      ##restrict il file di destinazione del farmaco DrugBank alle colonne pertinenti e conservare solo le voci per le entità molecolari umane
      DB_TARGETS="all.csv"
      DB_NAMES="vocabolario della banca dei farmaci.csv"

      #extract colonne pertinenti e riformattare per utilizzare la scheda come seperatore di colonne
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt

      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "Humans"){
      stampa $1, $3
      }
      L'target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt

      NOTA: i dati di DrugBank sono forniti in due formati principali. Il database completo è disponibile come file XML. Inoltre, la maggior parte dei dati viene resa disponibile in una serie di file con valori separati da virgole (CSV).
    1. Tenere presente che DrugBank registra anche obiettivi di droga non umani. La colonna della specie (colonna numero 12) può essere utilizzata per estrarre bersagli di droga umana.
      NOTA: per una migliore leggibilità, i nomi delle colonne estratte sono forniti nella tabella 2. Esistono altre fonti (ad esempio il Database del bersaglio terapeutico o Chembl) che mantenere collegamenti di destinazione del farmaco, come indicato nella sezione di discussione.
Numero di colonna Nome intestazione di colonna
3 Nome gene
12 specie
13 ID farmaci
  1. Aggiungi nomi di droga ai bersagli farmacologici.
    1. Poiché il nome del farmaco e le informazioni sul bersaglio del farmaco sono forniti in due file CSV separati, unire le informazioni dai due file per aggiungere successivamente nomi di droghe rivolte a un partner di interazione letale sintetico alle interazioni letali sintetiche. Unire i due set di dati utilizzando la colonna DrugBank-drug-ID comune. Normalizzare prima il set di dati di destinazione del farmaco che contiene solo un singolo DrugBank-drug-ID per riga, poiché il file iniziale può contenere più ID farmaco DrugBank di seguito se una proteina è presa di mira da più farmaci.

      ##generate singolo file contenente il simbolo genetico target del farmaco, l'ID del farmaco DrugBank e il nome del farmaco
      #normalize set di dati sul bersaglio del farmaco
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      stampa $0
      }else if($1 != "" && $2 != ""){
      split($2, drug_targets, ";")
      per(i in drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      stampa $1, drug_target | "ordina -u"
      }
      }
      L'human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt

      #extract colonne pertinenti e riformattare per utilizzare la scheda come separatore di colonna
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt

      unisci human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt

      NOTA: Colonna uno e tre nel vocabolario della banca .csv file contiene l'ID farmaco DrugBank e il rispettivo nome.
  1. Aggiungi farmaci mirati ai partner di interazione letale sintetica al set di dati di interazione letale sintetica.
    1. Unisciti al set di dati sintetico sull'interazione letale con il file del nome del farmaco bersaglio del farmaco generato nel passaggio precedente utilizzando le colonne dei simboli genetici per aggiungere farmaci alle interazioni letali sintetiche. Fai attenzione ad aggiungere nomi di farmaci per entrambi i partner di ogni interazione letale sintetica.
       
      ##enhance file di interazione letale sintetica aggiungendo farmaci rivolti ai partner di ogni interazione letale sintetica
      unire bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      unire tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt

      NOTA: Il passaggio 3 si traduce in un'interazione letale sintetica da più organismi con i loro geni umani ortologi e farmaci mirati a questi geni.

4. Stabilire l'insieme delle combinazioni di farmaci attualmente testate negli studi clinici

  1. Ottenere l'accesso ClinicalTrials.gov dati.
    1. Recuperare informazioni sulle sperimentazioni cliniche in formato XML da ClinicalTrials.gov su (i) singoli studi, (ii) prove risultanti da una query di ricerca o (iii) su tutte le prove nel database. In alternativa utilizzare le risorse fornite dall'iniziativa di trasformazione degli studi clinici che ospita anche tutti i dati ClinicalTrials.gov in un database relazionale. Per ulteriori dettagli, vedere il passaggio 4.4.
      NOTA: è necessario un account gratuito per accedere all'istanza del database ospitata nel cloud ospitata dall'iniziativa di trasformazione degli studi clinici. Inoltre, è necessario un client plsql.
  2. Focus sulle prove interventise.
  3. Filtrare per le prove specifiche per l'indicazione dell'interesse.
    NOTA: ClinicalTrials.gov fornisce nomi di malattie dal vocabolario controllato NCBI Medical Subject Headings (MeSH). Contrariamente ai nomi delle malattie fornite dal presentatore, il vocabolario controllato consente di identificare in modo efficiente le prove per l'indicazione di interesse. Tuttavia, bisogna tenere presente che il vocabolario controllato da NCBI MeSH è un thesaurus. Pertanto, controlla il browser MeSH (https://meshb.nlm.nih.gov) se l'indicazione generale di interesse ha termini minori / più stretti e includili se appropriato.
  4. Recupera gli studi identificati insieme ai farmaci testati in questi studi. Di seguito è riportata una domanda per le prove sull'indicazione generale del cancro alle ovaie.

    ##retrieve studi interventisali per l'indicazione generale del cancro ovarico dall'iniziativa di trasformazione degli studi clinici ospitata database relazionale contenente ClinicalTrials.gov dati
    cat <\pset piè di pagina disattivato
    SELEZIONARE S.NCT_ID, s.brief_title, i.intervention_type, i.name
    STUDI FROM
    INNER JOIN browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
    INTERVENTI INNER JOIN i ON(s.nct_id = i.nct_id)
    DOVE s.study_type = 'Interventismo'
    E c.mesh_term IN (
    'Neoplasie ovariane',
    'Carcinoma, Epiteliale Ovarico',
    'Tumore della cellula granulosa',
    "Sindrome ereditaria del cancro al seno e alle ovaie",
    'Luteoma',
    'Sindrome di Meigs',
    'Tumore cellulare Sertoli-Leydig',
    'Thecoma'
    )
    ORDINE DI s.nct_id, i.intervention_type;
    Eof
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact
  1. Estrarre i nomi dei farmaci e mappare i nomi di DrugBank.
    NOTA: Mentre si è tentati di utilizzare direttamente i nomi dei farmaci recuperati dagli studi clinici di interesse, si deve essere consapevoli del fatto che i nomi degli interventi in ClinicalTrials.gov sono inseriti dal presentatore come testo libero. Di conseguenza, i nomi non sono standardizzati, i marchi possono essere utilizzati al posto del nome composto comune e non vi è alcuna garanzia per una corretta normalizzazione dei dati (ad esempio più nomi di farmaci in una voce). Inoltre, è comune che i farmaci siano presentati con un diverso tipo di intervento, diverso dal farmaco. Pertanto, la mappatura dei nomi di intervento recuperati ai nomi dei farmaci DrugBank viene eseguita al meglio manualmente.

      ##Obtain un elenco di interventi utilizzati nell'insieme di studi clinici precedentemente recuperati.
    cut -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | coda -n +2 | ordinamento -u

    NOTA: le colonne tre e quattro contengono rispettivamente il tipo di intervento e il nome dell'intervento.

  1. Completare con farmaci già in uso clinico dalle linee guida
    NOTA: La fase 4 risulta in un elenco di farmaci in fase di valutazione/uso per l'indicazione di interesse.

5. Identificazione delle combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche

  1. Ricerca di interazioni letali sintetiche prese di mira da due farmaci di interesse. Limitare il set di dati dal passaggio 3 ai farmaci di interesse filtrando le righe nel file che contiene sia il farmaco A che il farmaco B.

    ##only le iscrizioni per interazioni letali sintetiche e droghe che li innescano dove entrambi i partner sono presi di mira dalle due droghe di interesse (drug_a e drug_b)
    awk -F "\t" '{
    if( ($12 == drug_a & $14 == drug_b) || ($12 == drug_b & $14 == drug_a) {
    stampa $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="AAAA" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. Assicurarsi che nessuna delle due droghe da sola si rivolge a entrambi i partner di interazione letale sintetica. Controllare gli obiettivi farmacologici di ogni farmaco identificato nel set di dati del passaggio 3.2 e valutare se entrambi i partner letali sintetici identificati sono obiettivi del farmaco specifico.

    ##find tutte le voci di destinazione del farmaco per un determinato nome di farmaco
    awk -F "\t" '{
    if($3 == drug){
    stampa $0
    }
    }' drug="XXX" db_human_drug_targets.txt

    NOTA: Un farmaco che prenderebbe di mira entrambe le vie di interazione letale sintetiche sarebbe tossico per qualsiasi cellula, quindi teoricamente non è un prezioso agente multi-bersaglio. Questo è il motivo per cui questa possibilità è esclusa in questa fase dell'algoritmo.
     

6. Test di nuove combinazioni di farmaci selezionate in vitro

  1. Trattare le linee cellulari del cancro al seno umano e le cellule epiteliali mammarie benigne umane coltivate con metodi di coltivazione in vitro standard in un'atmosfera umidificata di 37 °C con 5% di CO2 con varie combinazioni di farmaci.
  2. Utilizzare mezzi integrati con siero bovino fetale e penicillina, nonché solfato di streptomicina per ostacolare l'infezione batterica.
  3. Diluire i farmaci in solventi come dmso o soluzione salina tamponata da fosfati in almeno quattro diverse concentrazioni in base al loro IC50 precedentemente stabilito (concentrazione inibitoria) e utilizzarli in combinazione o da soli per il trattamento delle cellule.
  4. Eseguire saggi di vitalità cellulare e saggi di apoptosi come le colorazioni AnnexinV/7-AAD per determinare gli effetti citotossici causati dai trattamenti.
  5. Monitorare l'inibizione farmacologica di sospetti bersagli molecolari usando macchie occidentali.
  6. Distinguere la letalità sintetica dagli effetti puramente additivi che calcolano l'indice combinatorio (CI) descritto da Chou e altri23.

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Representative Results

Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato due studi che applicano il flusso di lavoro descritto in questo manoscritto per identificare combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche nel contesto del cancro alle ovaie e alseno 24,25. Nel primo studio, abbiamo valutato combinazioni di farmaci che sono attualmente testate in studi clinici in fase avanzata (fase III e IV) o già utilizzate nella pratica clinica per trattare i pazienti con cancro alle ovaie per quanto riguarda il loro impatto sulle interazioni letali sintetiche. Inoltre, abbiamo identificato combinazioni di farmaci che attualmente non sono in fase di test negli studi clinici, ma forniscono una logica dal punto di vista del targeting delle interazioni letali sintetiche. Abbiamo quindi valutato tutte le possibili combinazioni di farmaci scegliendo farmaci dal pool di tutti i composti negli studi sul cancro ovarico in fase avanzata. Abbiamo identificato un set unico di 61 combinazioni di farmaci che erano state studiate in 68 studi sul cancro ovarico in fase avanzata. Dodici di queste 61 combinazioni di farmaci hanno affrontato almeno un'interazione letale sintetica. Sono state proposte altre 84 combinazioni di farmaci per affrontare le interazioni letali sintetiche senza essere studiate in studi clinici fino ad oggi. 21 farmaci unici hanno contribuito alle 84 combinazioni di farmaci identificate mirate a una serie di 39 interattori letali sintetici, come indicato nella figura 1.

Figure 1
Figura 1: Rete di nuove combinazioni di farmaci proposte nel contesto del cancro alle ovaie. La figura 1 mostra le interazioni letali sintetiche in cui gli interattori sono affrontati da due farmaci attualmente non testati negli studi clinici. Le interazioni synlet sono visualizzate in rosso, mentre i link di destinazione del farmaco sono indicati dai bordi grigi. Le linee tratteggiate rappresentano interazioni letali sintetiche affrontate da altre combinazioni di farmaci negli studi clinici sul cancro ovarico in fase avanzata. Queste combinazioni di farmaci studiate sono indicate con un asterisco (*), ognuna in combinazione con paclitaxel con l'ulteriore combinazione studiata di cediranib e olaparib indicata da un cerchio (o) [adattato da 25]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Utilizzando lo stesso flusso di lavoro in un secondo studio, abbiamo identificato 243 promettenti combinazioni di farmaci mirate a 166 coppie di geni letali sintetici nel contesto del cancro al seno. Abbiamo testato sperimentalmente combinazioni di farmaci selezionati per quanto riguarda il loro impatto sulla vitalità cellulare e l'apoptosi in due linee cellulari per il cancro al seno. In particolare, la combinazione di farmaci a bassa tossicità proposta di celecoxib e acido zoledronico ha mostrato citotossicità oltre gli effetti additivi nelle linee cellulari del cancro al seno, come determinato dal loro indice combinatorio. I risultati dei test di vitalità e apoptosi per questa combinazione di farmaci sono visualizzati nella figura 2.

Figure 2
Figura 2: Impatto del celecoxib e dell'acido zoledronico sulla vitalità e sull'apoptosi nelle cellule SKBR-3. (A) Risultati del saggio di vitalità per celecoxib (CEL), acido zoledronico (ZOL) e combinazione di acido zoledronico e celecoxib (ZOL + CEL) nelle linee cellulari per il cancro al seno SKBR-3. Le basse e alte concentrazioni di CEL utilizzate sono state di 50μM e 75μM. Le concentrazioni di ZOL basse e alte utilizzate sono state di 500μM e 750μM. La combinazione di farmaci ha avuto un significativo effetto sinergico sulla vitalità cellulare (** p < 0,001). (B, C) Annexin V (ANXA5) e colorazioni 7-AAD di cellule SKBR-3 trattate con CEL, ZOL e la combinazione di farmaci ZOL + CEL. La percentuale di cellule 7-AADpos/ANXA5pos è stata aumentata dopo il trattamento con la combinazione di farmaci ZOL + CEL [adattato da 24]. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo delineato un flusso di lavoro per identificare le combinazioni di farmaci che hanno un impatto sulle interazioni letali sintetiche. Questo flusso di lavoro si avvale di (i) dati sulle interazioni letali sintetiche da organismi modello, (ii) informazioni di ortologi umani, (iii) informazioni sulle associazioni di destinazione dei farmaci, (iv) informazioni sui farmaci sugli studi clinici nel contesto del cancro, nonché (v) informazioni sulle associazioni farmaco-malattie e gene-disease estratte dalla letteratura scientifica. Le informazioni consolidate possono essere utilizzate per valutare l'impatto di una data combinazione di farmaci in esame sulle coppie geniche letali sintetiche. Inoltre, i dati consolidati possono essere utilizzati per valutare una serie di farmaci attualmente in fase di studio o test in studi clinici nel contesto del cancro per trovare combinazioni mirate alle interazioni letali sintetiche più rilevanti, avendo quindi maggiori possibilità di influire sulla sopravvivenza delle cellule tumorali. Infine, i dati generati possono essere utilizzati per lo schermo per combinazioni di farmaci costituiti da farmaci non inizialmente sviluppati per il trattamento del tumore, fornendo così un modo per un caso di riposizionamento dei farmaci guidato computazally.

Per ogni passaggio del flusso di lavoro di integrazione dei dati presentiamo le origini dati chiave per completare l'intero flusso di lavoro dei dati, ma sottosemortiamo che il flusso di lavoro può essere ulteriormente migliorato in varie fasi utilizzando origini dati aggiuntive. Nel nostro flusso di lavoro abbiamo estratto coppie di interazione letale sintetica dal database BioGRID18. Ci siamo concentrati specificamente sulle interazioni dei tipi di esperimento "letalità sintetica" e "genetica negativa". Le informazioni in BioGRID sulle interazioni letali sintetiche contengono set di dati da grande schermo genetico come ad esempio un set di dati pubblicato da Costanzo e colleghi26, disponibile anche nel database DRYGIN27, nonché dati su singole interazioni letali sintetiche come descritto nei singoli esperimenti nella letteratura scientifica. Esistono origini dati aggiuntive che raccolgono e memorizzano interazioni letali sintetiche, come ad esempio SynLethDB28. Inoltre, a livello di mappatura ortografica, esiste un gran numero di strumenti e database diversi. Presentiamo un modo per utilizzare il biomart Ensembl per mappare i partner di interazione letale sintetica identificati negli organismi modello ai loro corrispondenti ortologi umani. Altre banche dati e servizi di ortologia includono la banca dati HomoloGene29di NCBI, la banca dati di ortologia OMA dell'Istituto svizzero di bioinformatica30o la banca dati dei gruppi ortologici InParanoid gestita dallo Stockholm Bioinformatics Center31. Nel nostro flusso di lavoro, ci siamo concentrati sulle interazioni letali sintetiche da più organismi modello, con il maggior numero di interazioni letali sintetiche provenienti dal lievito. Si potrebbe prendere in considerazione la possibilità di limitare il set di input per la mappatura dell'ortografia ai dati solo da mouse e ratti, che sono evolutivi più vicini agli esseri umani. Un ulteriore modo per definire l'insieme di input delle interazioni letali sintetiche è quello di concentrarsi solo sulle interazioni letali sintetiche conservate in più specie, aumentando così le possibilità che l'interazione letale sintetica sia veramente positiva. Questo d'altra parte potrebbe ridurre drasticamente l'insieme delle interazioni letali sintetiche, poiché c'è già una grande differenza nelle interazioni letali sintetiche identificate tra S. cerevisiae e S. pombe. Un altro approccio è quello di non essere troppo rigorosi all'inizio e persino di estendere l'insieme di interazioni letali sintetiche sperimentali da parte di algoritmi di machine learning come abbiamo fatto nei due studi elencati nella sezione dei risultati rappresentativi. In breve, è stato utilizzato un modello forestale casuale per prevedere interazioni letali sintetiche per geni umani per i quali non esistevano geni ortologi nel lievito. Il modello di foresta casuale è stato addestrato sull'insieme di coppie di interazione letale sintetica dal lievito e dai loro geni umani ortologi utilizzando dati sulle associazioni di percorsi, assegnazione di ontologia genica e associazioni di malattie e farmacicome descritto in precedenza 24,25. Questo ci ha permesso di considerare i geni umani per i quali non erano disponibili informazioni di mappatura ortologa nel nostro flusso di lavoro di integrazione. Un database ampiamente utilizzato che memorizza informazioni sulle associazioni di destinazione del farmaco è DrugBank, che è anche la fonte primaria di interazioni nel flusso di lavoro. Altre banche dati che contenutei in una certa misura su obiettivi farmacologici sono la banca dati ttd (Therapeutic Target Database)32 o ChEMBL33. Le principali componenti del flusso di lavoro sono anche incorporate nella piattaforma di valutazione di emergentec e SynLethDB, che è stata sviluppata dai ricercatori dell'Università tecnologica di Nanyang. L'ultimo aggiornamento di SynLethDB nel 2015, tuttavia, si è basato sui set di dati memorizzati nella sezione download sulla rispettiva pagina Web28.

Un modo per classificare le combinazioni di farmaci identificate e le coppie mirate di interazione letale sintetica è l'uso dell'associazione di partner letali sintetici e / o farmaci con la malattia di interesse attraverso metodi di estrazione della letteratura. Nel nostro lavoro sulla valutazione delle combinazioni di farmaci nel contesto del cancro alle ovaie, abbiamo classificato nuove combinazioni di farmaci proposte in base al numero di pubblicazioni sul cancro alle ovaie che menzionano uno dei due interattori letali sintetici di una rispettiva combinazione di farmaci. L'annotazione MeSH in Pubmed può essere utilizzata per identificare pubblicazioni per una malattia specifica utilizzando i termini esatti della malattia come indicato nel principale ramo MeSH C. Le informazioni sui geni nelle pubblicazioni identificate possono essere estratte utilizzando il file di mappatura gene2pubmed di NCBI come descritto altrove34. Inoltre, esistono banche dati dedicate che ing tengono collegamenti tra malattie geniche e/o malattie farmacologiche come il Comparative Toxicogenomics Database35, DisGeNET36o la piattaforma software di valutazione elettronica. La classificazione delle combinazioni di farmaci basate su associazioni di malattie è un modo per supportare la selezione finale di combinazioni di farmaci per i test sperimentali. Ulteriori aspetti devono essere presi in considerazione quando si selezionano combinazioni di farmaci per ulteriori test, come ad esempio i profili di tossicità individuali dei farmaci o lo stato di espressione degli interattori letali sintetici nel rispettivo organo bersaglio.

Nella sezione risultati rappresentativi, presentiamo i dati per la combinazione di farmaci di celecoxib e acido zoledronico, che è stata identificata seguendo il flusso di lavoro per identificare le combinazioni di farmaci nel contesto del cancro al seno. Questa particolare combinazione di farmaci è stata selezionata per le prove sperimentali a causa dei bassi profili di tossicità di entrambi i composti. Abbiamo usato varie concentrazioni in esperimenti in vitro per valutare l'impatto della combinazione di farmaci sulla vitalità cellulare e sull'apoptosi. Idealmente, le concentrazioni di farmaci potrebbero essere significativamente abbassate per i singoli farmaci per ridurre al minimo gli effetti collaterali e allo stesso tempo massimizzare l'efficacia combinando due farmaci. Vedere l'impatto sulla vitalità a dosi più basse è ancora più significativo, poiché le concentrazioni di farmaci utilizzate per i test in vitro potrebbero essere criticate come sovraterapeutiche, che non vengono raggiunte in modelli in vivo. Tuttavia, le concentrazioni sono state scelte sulla base di esperimenti di coltura cellulare con questi farmaci somministrati in letteratura. Il dosamento di farmaci può influenzare ulteriormente quali obiettivi sono principalmente colpiti, poiché la maggior parte dei composti ha più di un bersaglio farmacologico, potenzialmente influenzando anche un ampio set di molecole a valle conosciute e sconosciute. Le combinazioni di farmaci che mostrano effetti sinergici sulla vitalità cellulare nei sistemi di coltura cellulare in vitro dovrebbero pertanto essere ulteriormente studiate in modelli 3D o in vivo.

Riassumendo, presentiamo un flusso di lavoro che integra informazioni provenienti da diverse fonti di dati per valutare e proporre combinazioni di farmaci mirate alle interazioni letali sintetiche. Ad oggi, le maggiori informazioni sulle interazioni letali sintetiche provengono ancora da organismi modello, che richiedono una fase di mappatura ortografica obbligatoria al genoma umano. I primi schermi nelle cellule aploidi umane hanno portato all'identificazione di interazioni letali sintetiche nelle cellule umane. Inoltre, la tecnologia CRISPR/CAS ha aperto nuovi modi di studiare le interazioni letali sintetiche a livello cellulare. Con la adozione di dati di interazione letale sintetica biologica di alta qualità, proponiamo che gli sforzi di integrazione dei dati come il nostro trasformeranno il trattamento clinico del cancro in futuro, scoprendo nuove e clinicamente significative coppie di geni letali sintetici a parte BRCA(1/2)/PARP1.

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Disclosures

AH e PP erano dipendenti di emergentec biodevelopment GmbH al momento dell'esecuzione delle analisi che hanno portato ai risultati presentati nella sezione risultati rappresentativi. MM e MK non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

I finanziamenti per lo sviluppo del flusso di lavoro sull'integrazione dei dati sono stati ottenuti dal settimo programma quadro della Comunità europea nell'ambito della sovvenzione nu. 279113 (OCTIPS). L'adattamento dei dati all'interno di questa pubblicazione è stato gentilmente approvato dalla Public Library of Sciences Publications and Impact Journals, LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

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References

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