Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ett arbetsflöde för dataintegrering för att identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine I - Division of Oncology, Comprehensive Cancer Center, Medical University of Vienna, 2Department of Nephrology, Medical University of Vienna, 3Department of Internal Medicine IV, Medical University Innsbruck

Summary

Stora genetiska skärmar i modellorganismer har lett till identifiering av negativa genetiska interaktioner. Här beskriver vi ett arbetsflöde för dataintegration med data från genetiska skärmar i modellorganismer för att avgränsa läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner vid cancer.

Abstract

En syntetisk dödlig interaktion mellan två gener ges när knock-out av någon av de två generna inte påverkar cellens livskraft men knock-out av båda syntetiska dödliga interactorer leder till förlust av cell livskraft eller celldöd. Den bäst studerade syntetiska dödliga interaktionen är mellan BRCA1/2 och PARP1, där PARP1-hämmare används i klinisk praxis för att behandla patienter med MUTERADE BRCA1/2-tumörer. Stora genetiska skärmar i modellorganismer men också i haploid mänskliga cellinjer har lett till identifiering av många ytterligare syntetiska dödliga interaktionspar, som alla är potentiella mål av intresse för utvecklingen av nya tumörterapier. Ett tillvägagångssätt är att terapeutiskt rikta gener med en syntetisk dödlig interactor som muteras eller avsevärt nedregleras i intressetumören. Ett andra tillvägagångssätt är att formulera läkemedelskombinationer som behandlar syntetiska dödliga interaktioner. I den här artikeln beskriver vi ett arbetsflöde för dataintegration för att utvärdera och identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig till syntetiska dödliga interaktioner. Vi använder tillgängliga datamängder om syntetiska dödliga interaktionspar, homologikartläggningsresurser, läkemedelsmållänkar från dedikerade databaser samt information om läkemedel som undersöks i kliniska prövningar inom sjukdomsområdet av intresse. Vi lyfter ytterligare fram viktiga resultat av två nyligen genomförda studier av vår grupp om läkemedelskombinationsbedömning i samband med äggstockscancer och bröstcancer.

Introduction

Syntetisk dödlighet definierar en association av två gener, där förlust av en gen inte påverkar livskraften, men förlust av båda generna leder till celldöd. Det beskrevs först 1946 av Dobzhansky medan analysera olika fenotyper av drosophila genom att odla homozygous mutanter1. Mutanter som inte gav livskraftiga avkommor, även om de själva var livskraftiga, uppvisade dödliga fenotyper när de korsades med vissa andra mutanter, vilket satte mark för upprättandet av teorin om syntetisk dödlighet. Hartwell och kollegor föreslog att detta koncept kan vara tillämpligt för cancerbehandling hos människor2. Farmakologiskt provocerade syntetiska dödlighet kan förlita sig på bara en mutation, med tanke på att muterade genens syntetiska dödliga partner är målbar av en farmakologisk förening. Det första genparet som möjliggör farmakologisk induktion av syntetisk dödlighet var BRCA(1/2) och PARP1. PARP1 fungerar som en sensor för DNA-skador och är knuten till platser med dubbla och enstaka DNA-strandbrytningar, superspolar och crossovers3. BRCA1 och 2 spelar viktiga roller vid reparation av DNA dubbelsträngsbrott genom homolog rekombination4. Jordbrukare och kollegor publicerade resultaten att celler som inte hade brist på BRCA1/2 var mottagliga för PARP-hämning, medan ingen cytotoxicitet observerades i BRCA vilda celler5. I slutändan godkändes PARP-hämmare för behandling av BRCA-bristfällig bröst- och äggstockscancer6,7. Vidare är syntetiska dödligheten genpar som leder till kliniskt godkännande av farmakologiska föreningar mycket efterlängtade och ett stort område av de senaste cancerforskningsinsatserna8.

Syntetiska dödliga geninteraktioner modellerades i flera organismer inklusive fruktflugor, C. elegans och jäst2. Med hjälp av olika tillvägagångssätt inklusive RNA-interferens- och CRISPR / CAS-bibliotek knockouts upptäcktes nya syntetiska dödliga genpar under de senasteåren 9,10,11. Ett protokoll om RNAi experimentella procedurer i kombination med CRISPR/CAS publicerades nyligen av Housden och kollegor12. Under tiden genomförde forskare också stora skärmar i haploida mänskliga celler för att identifiera syntetiska dödliga interaktioner13,14. I silico metoder som biologisk nätverksanalys och maskininlärning har också visat löfte i upptäckten av syntetiska dödliga interaktioner15,16.

Konceptionellt är ett tillvägagångssätt för att använda syntetiska dödliga interaktioner i samband med antitumörbehandling att identifiera muterade eller icke-funktionella proteiner i tumörceller, vilket gör deras syntetiska dödliga interaktionspartner lovande läkemedelsmål för terapeutisk intervention. På grund av de flesta tumörtypers heterogenitet har forskare påbörjat sökandet efter så kallade syntetiska dödliga navproteiner. Dessa syntetiska dödliga nav har ett antal syntetiska dödliga interaktionspartners som antingen muteras och därför inte fungerar eller avsevärt nedregleras i tumörprover. Att ta itu med sådana syntetiska dödliga nav lovar att öka läkemedelseffektiviteten eller övervinna läkemedelsresistens, vilket kan visas till exempel i samband med vinkrisinresistent neuroblastom17. Ett andra tillvägagångssätt för att förbättra läkemedelsbehandlingen med hjälp av begreppet syntetiska dödliga interaktioner är att identifiera läkemedelskombinationer som är inriktade på syntetiska dödliga interaktioner. Detta kan leda till nya kombinationer av redan godkända enstaka anti-tumör terapier och till ompositionering av läkemedel från andra sjukdom områden till området onkologi.

I den här artikeln presenterar vi ett steg-för-steg-förfarande för att ge en lista över läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktionspar. I detta arbetsflöde använder vi (i) data om syntetiska dödliga interaktioner från BioGRID och (ii) information om homologa gener från Ensembl, (iii) hämtar läkemedelsmålspar från DrugBank, (iv) bygger sjukdomsläkemedelsassociationer från ClinicalTrials.gov och (v) genererar därför en uppsättning läkemedelskombinationer som behandlar syntetiska dödliga interaktioner. Slutligen tillhandahåller vi läkemedelskombinationer i samband med äggstocks- och bröstcancer i avsnittet representativa resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hämta syntetiska dödliga genpar

  1. Datahämtning från BioGrid.
    1. Ladda ner den senaste BioGRID-interaktionsfilen i tab2-format från https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip antingen med en webbläsare eller direkt från Linux-kommandoraden med curl eller wget18.

      ##download och packa upp den senaste BioGRID-interaktionsfilen
      #download senaste BioGRID-interaktionsfilen med curl
      curl -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack den nedladdade datafilen
      packa upp biogrid_latest.zip
      BG="BIOGRID-ALL-3.5.171.tab2.txt"
       
    2. När zip-arkivet har hämtats måste uppackningsarkivet och notera namnet på den faktiska datauppsättningsfilen (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) för efterföljande steg. BioGRID-datafilen innehåller interaktioner av olika typer som ska filtreras i nästa steg.
      OBS: Det finns andra källor (t.ex. DRYGIN, SynlethDB) som innehar syntetiska dödliga interaktioner, vilket beskrivs i diskussionen.
  2. Filter för syntetisk dödlighet och negativa genetiska interaktioner (experimental system).
    1. Använd information i kolumnen "Experimentellt system" (kolumnnummer 12) som anger typen av stödjande bevis för en interaktion för att identifiera syntetiska dödliga interaktioner.
    2. Begränsa datauppsättningen till poster med värdet negativ genetisk eller syntetisk dödlighet. I samma steg filtrerar du kolumner och behåller bara kolumner som är relevanta för efterföljande analyssteg enligt tabell 1 nedan.

      ##restrict biogridinteraktionsfilen till relevanta kolumner och behåller endast interaktioner som klassificeras som negativ genetisk och syntetisk dödlighet
      klippt -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      om(NR == 1){
      skriv ut $0
      }else if($4 == "Negative Genetic" || $4 == "Syntetisk dödlighet"){
      skriv ut $0
      }
      Jag är > bg_synlet.txt

      OBS: I kodfragmenten används ^I för att representera vågräta flikar. Ytterligare BioGRID-kategorier såsom syntetisk tillväxtdefekt kan inkluderas. Andra kolumner som är relevanta för det här arbetsflödet visas i tabell 1. BioGRID behåller också poängen för enskilda interaktioner. Cutoffs kan användas för att identifiera starka/höga konfidensinteraktioner.
Kolumnnummer Namn på kolumnrubrik
3 Gennamn
12 art
13 Drog-ID

Tabell 1: Relevanta kolumner i BioGRID-datafilen.

  1. Identifiera arter för vilka syntetiska dödliga interaktioner rapporterades.
    1. Bestäm antalet syntetiska dödliga interaktionspartnerskatte-ID för att få en uppskattning av antalet syntetiska dödliga interaktioner som är tillgängliga per organism.

      ##count antalet utseenden av varje skatte-ID i de tidigare extraherade syntetiska dödliga interaktionerna
      klipp -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | svans -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | sortera | uniq -c | sortera -r -g

      OBS: Som ett resultat av steg 1, en lista över syntetiska dödliga interaktioner med gensymboler från organismer där interaktionerna bestämdes. Majoriteten av syntetiska dödliga interaktioner har fastställts i modellorganismer. När du läser in filer i ett kalkylbladsprogram (t.ex. Excel) bör du undvika att förstöragensymbolerna 19,20.

2. Översättning av syntetiska dödliga genpar till mänskliga ortologer

  1. Hämta mänskliga orthologer för relevanta modellorganismer som identifieras i steg 1.3.
    1. Hämta mänskliga ortologer från Ensembl BioMart21 genom att länka respektive modellorganismgendatauppsättning med den mänskliga gendatauppsättningen. Använd gensymbolerna som betecknar genen i modellorganismen och ortologiska mänskliga gener för denna uppgift. Använd webbtjänsten Ensembl BioMart för att automatisera hämtningsprocessen och skicka frågan direkt till BioMart RESTful-åtkomst för att hämta de ortopografiska genparen (se exempel nedan och Ensembl BioMart Help & Documentation för mer information).

      ##retrieve human ortolog för Saccharomyces Cerevisiae från Ensembl BioMart genom att använda curl för att skicka BioMart-frågan direkt till BioMart RESTful-åtkomsttjänsten
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=











      " "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"

      För att hämta de ortologiska mänskliga generna för andra modellorganismer, ersätt värdet av namnattributet för det första Dataset-elementet med namnet på respektive Ensembl-datauppsättning och kör frågan igen.

      OBS: Processen med ortopingmappning är väldokumenterad i Ensembl BioMart Help & Documentation (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
    1. Få tillgång till ett exempel på BioMart-frågan för mänskliga orthologer för Saccharomyces cerevisiae, den översta arten som identifieras i steg 1.3, via URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      OBS: Andra källor (t.ex. roundup, oma browser, HomoloGene, inparanoid) för homologi mappning finns, som beskrivs i diskussionsavsnittet i detta manuskript.
  2. Lägg till mänskliga ortologer till extraherade syntetiska dödliga interaktioner.
    1. Gå med i syntetiska dödliga interaktioner baserade på organismens skatte-ID och gensymbol med de ortologösa par som hämtas i steg 2.1. För mänskliga syntetiska dödliga interaktionspar antingen skapa konstgjorda ortologa par för varje mänsklig gen som finns i datauppsättningen eller se till att mänskliga syntetiska dödliga interaktioner inte kasseras medan de sammanfogar och överför de mänskliga gensymbolerna till de nyligen tillagda kolumnerna.

      ##collect orthologmappningar i en enda fil och gå med i syntetisk dödlig interaktionsfil
      #create en målfil med rubriker för insamling av ortopingmappningar
      eko "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" > mappning.txt

      #repeat detta steg för varje modellorganism, var noga med att anpassa indatafilens namn och skatte-ID
      #adds för varje orthologpar i s_cerevisiae.txt en ny post i mappningen.txt: Gensymbolen föregås av skatte-ID för att underlätta efterföljande anslutning till filen syntetiska dödliga interaktioner
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      om($1 != "" & $2 != ""){
      skriv org_tax_id"/"$1, $2
      }
      Jag s_cerevisiae.txt >> kartläggning.txt

      #create artificiella kartläggningsposter för mänskliga gener
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      om($5 == human_tax_id){
      skriv ut $5"/"$2, $2
      }
      om($6 == human_tax_id){
      skriv ut $6"/"$3, $3
      }
      Jag är bg_synlet.txt | sortera -u >> mappning.txt

      #add nödvändiga kopplingsnycklar (skatte-ID/Gensymbol) till syntetiska dödliga interaktioner
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      om(NR == 1){
      skriva ut $0, "Key Interactor A", "Key Interactor B"
      Annars är det bara att...
      skriv ut $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      Jag är bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt

      #join syntetiska dödliga interaktioner med ortologa par
      sammanfoga tmp_bg_synlet_w_keys.txt mappning.txt 7 1 > tmp.txt
      sammanfoga tmp.txt mappning.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt

      Kommandot merge som används i det här exemplet är inte ett standardkommando för Unix. Implementeringen med hjälp av GNU Core Utilities sorterar och ansluter sig dock enkelt. Kommandot har introducerats för att dölja komplexiteten i att sortera filerna innan de kan anslutas till kommandokopplingen. En implementering av sammanslagning finns på https://github.com/aheinzel/merge-sh.
    1. Användning av någon genidentifierare som unikt identifierar genen i ett visst namnområde för bästa möjliga resultat.
      OBS: Steg 2 resulterar i en lista över syntetiska dödliga interaktioner från flera organismer mappade till mänskliga gener.

3. Kartläggning av syntetiska dödliga interaktionspartners till droger

  1. Hämta knarkmålspar från DrugBank.
    1. Ladda ner DrugBank-data från nedladdningsavsnittet i DrugBank och skapa ett konto först om det inte redan har skapats22. Använd CSV-filen med läkemedelsmålidentifierare (proteinidentifieraravsnitt: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) och DrugBank-ordförrådet (öppet dataavsnitt: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) med DrugBank-identifierare och namn. Du kan också extrahera nödvändig information från XML-databasdumpen.

      ##restrict DrugBank-läkemedelsmålfilen till relevanta kolumner och behåller endast poster för mänskliga molekylära enheter
      DB_TARGETS="alla.csv"
      DB_NAMES="drugbank vokabulär.csv"

      #extract relevanta kolumner och formatera om för att använda fliken som kolumnseperator
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt

      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      om(NR == 1 || $2 == "Människor"){
      skriv ut $1, $3
      }
      Jag är target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt

      OBS: DrugBank-data tillhandahålls i två huvudformat. Den kompletta databasen är tillgänglig som XML-fil. Dessutom görs majoriteten av uppgifterna tillgängliga i en serie CSV-filer (comma separated value).
    1. Var medveten om att DrugBank också registrerar icke-mänskliga narkotikamål. Artkolonnen (kolumnnummer 12) kan användas för att extrahera mänskliga narkotikamål.
      OBS: För bättre läsbarhet finns namn på de extraherade kolumnerna i tabell 2. Det finns andra källor (t.ex. den terapeutiska måldatabasen eller Chembl) som har länkar till narkotikamål, vilket beskrivs i diskussionsavsnittet.
Kolumnnummer Namn på kolumnrubrik
3 Gennamn
12 art
13 Drog-ID
  1. Lägg till drognamn till drogmål.
    1. Eftersom läkemedelsnamn och information om narkotikamål tillhandahålls i två separata CSV-filer, slå samman informationen från de två filerna för att därefter lägga till namn på droger som riktar sig till en syntetisk dödlig interaktionspartner till syntetiska dödliga interaktioner. Gå med i de två datamängderna med hjälp av den vanliga DrugBank-drug-ID-kolumnen. Normalisera läkemedelsmålsdatauppsättningen först att den bara innehåller ett enda DrugBank-drug-ID per rad, eftersom den ursprungliga filen kan innehålla flera DrugBank-läkemedels-ID i rad om ett protein är riktat mot flera läkemedel.

      ##generate en enda fil som innehåller läkemedelsmålgensymbol, DrugBank drog-ID och drognamn
      #normalize datauppsättningen för narkotikamål
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      om(NR == 1){
      skriv ut $0
      }else if($1 != "" & $2 != ""){
      split($2, drug_targets, ";")
      for(i i drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      skriv ut $1, drug_target | "sortera -u"
      }
      }
      Jag är human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt

      #extract relevanta kolumner och formatera om för att använda fliken som kolumnavgränsare
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt

      slå samman human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 21 > db_human_drug_targets.txt

      OBS: Kolumn ett och tre i drugbank vokabulär.csv filen innehåller DrugBank drog-ID och respektive namn.
  1. Lägg till läkemedel som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktionspartners till syntetiskt dödlig interaktionsdataset.
    1. Gå med i den syntetiska dödliga interaktionsdatauppsättningen med läkemedelsmålfilen som genererades i föregående steg med hjälp av gensymbolkolumnerna för att lägga till droger till syntetiska dödliga interaktioner. Var noga med att lägga till läkemedelsnamn för båda partnerna i varje syntetisk dödlig interaktion.
       
      ##enhance syntetiska dödliga interaktionsfilen genom att lägga till droger som riktar sig till partnerna för varje syntetisk dödlig interaktion
      slå bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      slå samman tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt

      OBS: Steg 3 resulterar i syntetisk dödlig interaktion från flera organismer med deras ortopo mänskliga gener och läkemedel riktade mot dessa gener.

4. Fastställande av uppsättningen för närvarande testade läkemedelskombinationer i kliniska prövningar

  1. Få tillgång till ClinicalTrials.gov data.
    1. Hämta information om kliniska prövningar i XML-format från ClinicalTrials.gov på antingen (i) enskilda prövningar, (ii) prövningar som härrör från en sökfråga eller (iii) alla studier i databasen. Alternativt kan du använda de resurser som tillhandahålls av initiativet för omvandling av kliniska prövningar, som också är värd för all data från ClinicalTrials.gov i en relationsdatabas. Se steg 4.4 för mer information.
      Ett gratis konto krävs för att komma åt den molnbaserade databasinstansen som är värd för det kliniska prövnings omvandlingsinitiativet. Dessutom krävs en plsql-klient.
  2. Fokusera på interventionella försök.
  3. Filter för försök som är specifika för indikation av intresse.
    OBS: ClinicalTrials.gov tillhandahåller sjukdomsnamn från NCBI Medical Subject Headings (MeSH) kontrollerade ordförråd. I motsats till vad som lämnats in till sjukdomsnamn gör det kontrollerade ordförrådet det möjligt att effektivt identifiera försök för indikation på intresse. Man måste dock komma ihåg att NCBI MeSH-kontrollerad vokabulär är en synonymordlista. Kontrollera därför MeSH Browser (https://meshb.nlm.nih.gov) om den allmänna intresseindikationen har några underordnade/smalare villkor och inkludera dem om det är lämpligt.
  4. Hämta de identifierade försöken tillsammans med de läkemedel som testats i dessa prövningar. En fråga om försök i den allmänna indikationen på äggstockscancer ges nedan.

    ##retrieve interventionella prövningar för den allmänna indikationen äggstockscancer från det kliniska prövningstransformationsinitiativet var värd för relationsdatabas som innehåller ClinicalTrials.gov data
    katt <\pset sidfot av
    VÄLJ DISTINKT s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type, i.name
    FRÅN studier s
    INRE KOPPLING browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
    INRE JOIN-ingrepp i ON(s.nct_id = i.nct_id)
    VAR s.study_type = "Interventionell"
    OCH c.mesh_term IN (
    "Äggstockstumörer".
    "Carcinom, äggstocksepitelet".
    "Granulosa celltumör".
    "Ärftligt bröst- och äggstockscancersyndrom".
    "Luteoma".
    "Meigs syndrom".
    "Sertoli-Leydig celltumör".
    "Komen"
    )
    BESTÄLL EFTER s.nct_id, i.intervention_type;
    Eof
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact
  1. Extrahera drognamn och mappa till DrugBank namn.
    OBS: Även om det är frestande att direkt använda de läkemedelsnamn som hämtats från kliniska prövningar av intresse måste man vara medveten om att interventionsnamn i ClinicalTrials.gov anges av insändarsändaren som fri text. Som en följd av detta är namnen inte standardiserade, varumärken kan användas i stället för det vanliga sammansatta namnet och det finns ingen garanti för korrekt datanormalisering (t.ex. flera läkemedelsnamn i en post). Dessutom är det vanligt att droger lämnas in med en annan interventionstyp, som skiljer sig från drogen. Därför utförs kartläggning av de hämtade interventionsnamnen till DrugBanks läkemedelsnamn bäst manuellt.

      ##Obtain en lista över interventioner som använts i den tidigare hämtade uppsättningen kliniska prövningar.
    klipp -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | svans -n +2 | sortera -u

    OBS: Kolumnerna tre respektive fyra innehåller typ av interventions- respektive interventionsnamn.

  1. Komplettera med läkemedel som redan används kliniskt från riktlinjer
    OBS: Steg 4 resulterar i en lista över läkemedel som utvärderas/används för att ange intresse.

5. Identifiering av läkemedelskombinationer som är inriktade på syntetiska dödliga interaktioner

  1. Sök efter syntetiska dödliga interaktioner som är riktade mot två droger av intresse. Begränsa datauppsättningen från steg 3 till läkemedel av intresse genom att filtrera bort linjer i filen som innehåller både läkemedel A och läkemedel B.

    ##only behåller poster för syntetiska dödliga interaktioner och droger som utlöser dem där båda partnerna är riktade mot de två droger av intresse (drug_a och drug_b)
    awk -F "\t" '{
    om( ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b & $14 == drug_a) ) {
    skriv ut $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. Se till att inget av de två läkemedlen ensam riktar sig mot båda syntetiska dödliga interaktionspartners. Kontrollera läkemedelsmålen för varje identifierat läkemedel i datauppsättningen från steg 3.2 och utvärdera om båda identifierade syntetiska dödliga partner är mål för det specifika läkemedlet.

    ##find alla drogmålsposter för ett visst drognamn
    awk -F "\t" '{
    om($3 == läkemedel){
    skriv ut $0
    }
    }' drug="XXX" db_human_drug_targets.txt

    OBS: Ett läkemedel som skulle rikta in sig på båda syntetiska dödliga interaktionsvägar skulle vara giftigt för någon cell, så teoretiskt sett är det inte ett värdefullt multimålmedel. Det är anledningen till att denna möjlighet utesluts i detta steg av algoritmen.
     

6. Testa utvalda nya läkemedelskombinationer in vitro

  1. Behandla mänskliga bröstcancer cellinjer och mänskliga godartade bröst epitelceller odlas i standard in vitro odlingsmetoder i en fuktad 37 °C atmosfär med 5% CO2 med olika läkemedelskombinationer.
  2. Använd media kompletterat med fetala nötkreatur serum och penicillin samt streptomycin sulfat för att hindra bakteriell infektion.
  3. Späd ut läkemedel i lösningsmedel som DMSO eller fosfatbuffrad saltlösning i minst fyra olika koncentrationer baserat på deras tidigare etablerade IC50 (hämmande koncentration) och använd dem i kombination eller ensam för behandling av celler.
  4. Utför cellviabilitetsanalyser och apoptosanalyser såsom AnnexinV/7-AAD-färgningar för att bestämma cytotoxiska effekter orsakade av behandlingar.
  5. Övervaka farmakologisk hämning av misstänkta molekylära mål med hjälp av västerländska blots.
  6. Urskilja syntetisk dödlighet från rent additiva effekter som beräknar det kombinatoriska indexet (CI) enligt Chou ochandras 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår grupp har nyligen publicerat två studier som tillämpar arbetsflödet som avbildas i detta manuskript för att identifiera läkemedelskombinationer riktade mot syntetiska dödliga interaktioner i samband med äggstocks- och bröstcancer24,25. I den första studien utvärderade vi läkemedelskombinationer som för närvarande testas i kliniska prövningar i sent skede (fas III och IV) eller som redan används i klinisk praxis för att behandla äggstockscancerpatienter avseende deras inverkan på syntetiska dödliga interaktioner. Dessutom identifierade vi läkemedelskombinationer som för närvarande inte testas i kliniska prövningar men ger en motivering ur perspektivet att rikta in sig på syntetiska dödliga interaktioner. Vi utvärderade därför alla möjliga läkemedelskombinationer välja läkemedel från poolen av alla föreningar i sent skede äggstockscancer prövningar. Vi identifierade en unik uppsättning av 61 läkemedelskombinationer som hade undersökts i 68 sena äggstockscancerförsök. Tolv av dessa 61 läkemedelskombinationer tog upp minst en syntetisk dödlig interaktion. Ytterligare läkemedelskombinationer föreslogs för att ta itu med syntetiska dödliga interaktioner utan att undersökas i kliniska prövningar fram till detta datum. 21 unika läkemedel bidrog till de 84 identifierade läkemedelskombinationerna riktade mot en uppsättning av 39 syntetiska dödliga interagerare enligt figur 1.

Figure 1
Figur 1: Nätverk av föreslagna nya läkemedelskombinationer i samband med äggstockscancer. Figur 1 visar syntetiska dödliga interaktioner där interactorer behandlas med två läkemedel som för närvarande inte testas i kliniska prövningar. Synletinteraktioner visas i rött, medan läkemedelsmållänkar indikeras av grå kanter. Prickade linjer representerar syntetiska dödliga interaktioner som behandlas av andra läkemedelskombinationer i kliniska prövningar av äggstockscancer i sent skede. Dessa undersökta läkemedelskombinationer indikeras med en asterisk (*), var och en i kombination med paklitaxel med den ytterligare undersökta kombinationen av cediranib och olaparib som indikeras av en cirkel (o) [anpassad från 25]. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Med samma arbetsflöde i en andra studie identifierade vi 243 lovande läkemedelskombinationer riktade mot 166 syntetiska dödliga genpar i samband med bröstcancer. Vi testade experimentellt utvalda läkemedelskombinationer avseende deras inverkan på cellens livskraft och apoptos i två bröstcancer cellinjer. I synnerhet visade den föreslagna kombinationen av lågtoxicitetsläkemedel av celecoxib och zoledronsyra cytotoxicitet utöver additiva effekter i bröstcancercelllinjer som bestäms av deras kombinatoriska index. Resultat av livskraft och apoptosanalyser för denna läkemedelskombination visas i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Inverkan av celecoxib och zoledronsyra på livskraft och apoptos i SKBR-3-celler. A)Lönsamhetsanalysresultat för celecoxib (CEL), zoledronsyra (ZOL) och kombinationen av zoledronsyra och celecoxib (ZOL + CEL) i SKBR- 3 bröstcancer cellinjer. Låga och höga CEL-koncentrationer som användes var 50 μM och 75 μM. Låga och höga ZOL-koncentrationer som användes var 500 μM och 750 μM. Läkemedelskombinationen hade en signifikant synergistisk effekt på cellens livskraft (** p < 0,001). B, C) Annexin V (ANXA5) och 7-AAD färgningar av SKBR-3 celler behandlas med CEL, ZOL, och läkemedelskombinationen ZOL + CEL. Andelen celler med 7 AADpos/ANXA5pos ökades efter behandling med läkemedelskombinationen ZOL + CEL [anpassad från 24]. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har skisserat ett arbetsflöde för att identifiera läkemedelskombinationer som påverkar syntetiska dödliga interaktioner. Detta arbetsflöde använder sig av i) uppgifter om syntetiska dödliga interaktioner från modellorganismer, ii) information om humana ortologer, iii) information om läkemedelsmålsassociationer, iv) läkemedelsinformation om kliniska prövningar i samband med cancer samt v) om information om läkemedelssjukdomar och släktorganisationer för gensjukdomar som extraherats från vetenskaplig litteratur. Den konsoliderade informationen kan användas för att utvärdera effekten av en given läkemedelskombination som under utredning är på syntetiska dödliga genpar. Dessutom kan konsoliderade data användas för att utvärdera en uppsättning läkemedel som för närvarande undersöks eller testas i kliniska prövningar i samband med cancer för att hitta kombinationer som riktar sig till de mest relevanta syntetiska dödliga interaktionerna, vilket har en högre chans att påverka tumörcellens överlevnad. Slutligen kan de data som genereras användas för att screena för läkemedelskombinationer som består av läkemedel som ursprungligen inte utvecklats för tumörbehandling, vilket ger ett sätt för ett beräkningsdrivet läkemedelspositioneringsfall.

För varje steg i arbetsflödet för dataintegrering presenterar vi viktiga datakällor för att slutföra hela dataarbetsflödet, men påpekar att arbetsflödet kan förbättras ytterligare i olika skeden genom att använda ytterligare datakällor. I vårt arbetsflöde extraherade vi syntetiska dödliga interaktionspar från BioGRID-databasen18. Vi fokuserade specifikt på interaktioner mellan experimenttyper "syntetisk dödlighet" och "negativ genetisk". Information i BioGRID om syntetiska dödliga interaktioner innehåller datamängder från stor genetisk skärm som till exempel en datauppsättning publicerad av Costanzo och kollegor26, som också finns i DRYGIN-databasen27, samt data om enstaka syntetiska dödliga interaktioner som beskrivs i enskilda experiment i vetenskaplig litteratur. Det finns ytterligare datakällor som samlar in och lagrar syntetiska dödliga interaktioner, som till exempel SynLethDB28. På ortologikartläggningsnivå finns det dessutom ett stort antal olika verktyg och databaser. Vi presenterar ett sätt att använda Ensembl biomart för att kartlägga syntetiska dödliga interaktionspartners som identifierats i modellorganismer till deras motsvarande mänskliga ortologer. Andra ortologiska databaser och tjänster inkluderar NCBI: s HomoloGene databas29, OMA ortologi databas från Swiss Institute of Bioinformatics30, eller InParanoid ortholog grupper databas som upprätthålls av Stockholm Bioinformatics Center31. I vårt arbetsflöde fokuserade vi på syntetiska dödliga interaktioner från flera modellorganismer, med det största antalet syntetiska dödliga interaktioner som kommer från jäst. Man kan överväga att begränsa indatauppsättningen för ortologimappningen till data från endast mus och råtta, som är evolutionära närmare människor. Ett ytterligare sätt att definiera indatauppsättningen av syntetiska dödliga interaktioner är att bara fokusera på syntetiska dödliga interaktioner som bevaras i flera arter, vilket ökar risken för att den syntetiska dödliga interaktionen verkligen är positiv. Detta å andra sidan kan minska uppsättningen syntetiska dödliga interaktioner dramatiskt, eftersom det redan finns en stor skillnad i de identifierade syntetiska dödliga interaktionerna mellan S. cerevisiae och S. pombe. Ett annat tillvägagångssätt är att inte vara för strikt i början och att till och med utöka uppsättningen experimentella syntetiska dödliga interaktioner med maskininlärningsalgoritmer som vi gjorde i de två studierna som anges i avsnittet representativa resultat. Kort sagt användes en slumpmässig skogsmodell för att förutsäga syntetiska dödliga interaktioner för mänskliga gener för vilka inga ortologiska gener fanns i jäst. Den slumpmässiga skogsmodellen tränades på uppsättningen syntetiska dödliga interaktionspar från jäst och deras ortologiska mänskliga gener med hjälp av data om vägföreningar, Gen ontologi uppdrag samt sjukdom och läkemedelsassociationer som beskrivitstidigare 24,25. Detta gjorde det möjligt för oss att överväga mänskliga gener för vilka ingen orthologmappningsinformation fanns tillgänglig i vårt integrationsarbetsflöde. En allmänt använd databas som lagrar information om läkemedelsmålsföreningar är DrugBank, som också är den främsta källan till interaktioner i arbetsflödet. Andra databaser som i viss utsträckning innehåller kompletterande information om läkemedelsmål är Den terapeutiska måldatabasen (TTD)32 eller ChEMBL33. Viktiga komponenter i arbetsflödet ingår också i e.valuation-plattformen från emergentec och SynLethDB, som har utvecklats av forskare från Nanyang Technological University. Den senaste uppdateringen av SynLethDB 2015 baserades dock på datamängderna som lagras i nedladdningsavsnittet på deras respektive webbsida28.

Ett sätt att rangordna identifierade läkemedelskombinationer och riktade syntetiska dödliga interaktionspar är att använda associationen av syntetiska dödliga partners och/ eller droger med sjukdomen av intresse via litteratur mining metoder. I vårt arbete med utvärdering av läkemedelskombinationer i samband med äggstockscancer rankade vi nya föreslagna läkemedelskombinationer baserat på antalet publikationer om äggstockscancer som nämner någon av de två syntetiska dödliga interagerarna i en respektive läkemedelskombination. MeSH-anteckning i Pubmed kan användas för att identifiera publikationer för en viss sjukdom med hjälp av de exakta sjukdomstermerna som anges i den stora MeSH-grenen C. Information om gener i de identifierade publikationerna kan extraheras med NCBI: s gene2pubmed kartläggningsfil enligt beskrivningen på annat håll34. Vidare finns det dedikerade databaser som innehåller gensjukdoms- och/eller läkemedelssjukdomslänkar som Comparative Toxicogenomics Database35, DisGeNET36eller e.valuation software platform. Rangordning av läkemedelskombinationer baserade på sjukdomsassociationer är ett sätt att stödja det slutliga urvalet av läkemedelskombinationer för experimentell testning. Ytterligare aspekter måste beaktas vid val av läkemedelskombinationer för vidare testning, till exempel individuella toxicitetsprofiler för läkemedlen eller uttrycksstatus för syntetiska dödliga interagerare i respektive målorgan.

I avsnittet representativa resultat presenterar vi data för läkemedelskombinationen av celecoxib och zoledronsyra, som identifierades efter arbetsflödet för att identifiera läkemedelskombinationer i samband med bröstcancer. Denna särskilda läkemedelskombination valdes ut för experimentell testning på grund av de låga toxicitetsprofilerna hos båda föreningarna. Vi använde olika koncentrationer i in vitro-experiment för att utvärdera effekten av läkemedelskombinationen på cellens livskraft och apoptos. Helst, läkemedelskoncentrationer kan sänkas avsevärt för enskilda läkemedel för att minimera biverkningar samtidigt maximera effekten genom att kombinera två läkemedel. Att se inverkan på livskraften vid lägre doser är ännu mer meningsfullt, eftersom läkemedelskoncentrationer som används för in vitro-testning kan kritiseras för att vara överstatliga, som inte uppnås i in vivo-modeller. Koncentrationerna valdes dock baserat på cellkulturexperiment med dessa givna droger i litteraturen. Läkemedelsdosering kan ytterligare påverka vilka mål som främst påverkas, eftersom de flesta föreningar har mer än ett läkemedelsmål, vilket potentiellt påverkar en stor uppsättning kända och okända nedströmsmolekyler också. Läkemedelskombinationer som visar synergistiska effekter på cellens livskraft i in vitro-cellkultursystem bör därför undersökas ytterligare i 3D- eller in vivo-modeller.

Sammanfattningsvis presenterar vi ett arbetsflöde som integrerar information från olika datakällor för att utvärdera och föreslå läkemedelskombinationer riktade mot syntetiska dödliga interaktioner. Hittills kommer den största informationen om syntetiska dödliga interaktioner fortfarande från modellorganismer, vilket kräver ett obligatoriskt ortologikartläggningssteg till det mänskliga genomet. Första skärmar i mänskliga haploidceller har lett till identifiering av syntetiska dödliga interaktioner i mänskliga celler. Dessutom har CRISPR/CAS-tekniken öppnat nya sätt att studera syntetiska dödliga interaktioner på cellnivå. Med mer högkvalitativa biologiska syntetiska dödliga interaktionsdata som blir tillgängliga föreslår vi att dataintegrationsinsatser som vår kommer att omvandla klinisk cancerbehandling i framtiden, genom att upptäcka nya och kliniskt meningsfulla syntetiska dödliga genpar bortsett från BRCA(1/2)/PARP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

AH och PP var anställda vid emergentec biodevelopment GmbH vid tidpunkten för utförandet av de analyser som ledde till de resultat som presenterades i avsnittet representativa resultat. MM och MK har inget att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering för att utveckla arbetsflödet för dataintegration erhölls från Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram inom ramen för bidragsavtalet nu. 279113 (OCTIPS). Anpassning av data inom denna publikation godkändes vänligen av Public Library of Sciences Publications and Impact Journals, LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobzhansky, T. Genetics of natural populations; recombination and variability in populations of Drosophila pseudoobscura. Genetics. 31, 269-290 (1946).
  2. Hartwell, L. H., Szankasi, P., Roberts, C. J., Murray, A. W., Friend, S. H. Integrating genetic approaches into the discovery of anticancer drugs. Science. 278 (5340), New York, N.Y. 1064-1068 (1997).
  3. D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. The Biochemical Journal. 342 (2), 249-268 (1999).
  4. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  5. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  6. McCann, K. E., Hurvitz, S. A. Advances in the use of PARP inhibitor therapy for breast cancer. Drugs in Context. 7, 212540 (2018).
  7. Franzese, E., et al. PARP inhibitors in ovarian cancer. Cancer Treatment Reviews. 73, 1-9 (2019).
  8. Ashworth, A., Lord, C. J. Synthetic lethal therapies for cancer: what’s next after PARP inhibitors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (9), 564-576 (2018).
  9. Yu, B., Luo, J. Synthetic lethal genetic screens in Ras mutant cancers. The Enzymes. 34, Pt B 201-219 (2013).
  10. Thompson, J. M., Nguyen, Q. H., Singh, M., Razorenova, O. V. Approaches to identifying synthetic lethal interactions in cancer. The Yale Journal of Biology and Medicine. 88 (2), 145-155 (2015).
  11. Ruiz, S., et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Molecular Cell. 62 (2), 307-313 (2016).
  12. Housden, B. E., Nicholson, H. E., Perrimon, N. Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells. Bio-Protocol. 7 (3), (2017).
  13. Blomen, V. A., et al. Gene essentiality and synthetic lethality in haploid human cells. Science. 350 (6264), New York, N.Y. 1092-1096 (2015).
  14. Forment, J. V., et al. Genome-wide genetic screening with chemically mutagenized haploid embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 13 (1), 12-14 (2017).
  15. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Systems. 1 (6), 383-395 (2015).
  16. Madhukar, N. S., Elemento, O., Pandey, G. Prediction of Genetic Interactions Using Machine Learning and Network Properties. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 172 (2015).
  17. Fechete, R., et al. Synthetic lethal hubs associated with vincristine resistant neuroblastoma. Molecular BioSystems. 7 (1), 200-214 (2011).
  18. Oughtred, R., et al. The BioGRID interaction database: 2019 update. Nucleic Acids Research. 47, D1 529-541 (2019).
  19. Zeeberg, B. R., et al. Mistaken identifiers: gene name errors can be introduced inadvertently when using Excel in bioinformatics. BMC bioinformatics. 5, 80 (2004).
  20. Ziemann, M., Eren, Y., Gene El-Osta, A. name errors are widespread in the scientific literature. Genome Biology. 17 (1), 177 (2016).
  21. Kersey, P. J., et al. Ensembl Genomes 2018: an integrated omics infrastructure for non-vertebrate species. Nucleic Acids Research. 46, D1 802-808 (2018).
  22. Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46, D1 1074-1082 (2018).
  23. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  24. Marhold, M., et al. Synthetic lethal combinations of low-toxicity drugs for breast cancer identified in silico by genetic screens in yeast. Oncotarget. 9 (91), 36379-36391 (2018).
  25. Heinzel, A., et al. Synthetic lethality guiding selection of drug combinations in ovarian cancer. PloS One. 14 (1), 0210859 (2019).
  26. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
  27. Koh, J. L. Y., et al. DRYGIN: a database of quantitative genetic interaction networks in yeast. Nucleic Acids Research. 38, 502-507 (2010).
  28. Guo, J., Liu, H., Zheng, J. SynLethDB: synthetic lethality database toward discovery of selective and sensitive anticancer drug targets. Nucleic Acids Research. 44, 1011-1017 (2016).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
  30. Altenhoff, A. M., et al. The OMA orthology database in 2018: retrieving evolutionary relationships among all domains of life through richer web and programmatic interfaces. Nucleic Acids Research. 46 (1), 477-485 (2018).
  31. Sonnhammer, E. L. L., Östlund, G. InParanoid 8: orthology analysis between 273 proteomes, mostly eukaryotic. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 234-239 (2015).
  32. Li, Y. H., et al. Therapeutic target database update 2018: enriched resource for facilitating bench-to-clinic research of targeted therapeutics. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1121 (2018).
  33. Gaulton, A., et al. The ChEMBL database in 2017. Nucleic Acids Research. 45 (1), 945-954 (2017).
  34. Heinzel, A., Mühlberger, I., Fechete, R., Mayer, B., Perco, P. Functional molecular units for guiding biomarker panel design. Methods in Molecular Biology. 1159 (12), 109-133 (2014).
  35. Davis, A. P., et al. The Comparative Toxicogenomics Database: update 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 948-954 (2019).
  36. Piñero, J., et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants. Nucleic acids research. 45 (1), 833-839 (2017).

Tags

Cancerforskning Utgåva 171 syntetisk dödlighet genetiska skärmar dataintegration homologikartläggning läkemedelskombinationer bröstcancer behandling cellkraftsanalys
Ett arbetsflöde för dataintegrering för att identifiera läkemedelskombinationer som riktar sig mot syntetiska dödliga interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant,… More

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant, A., Perco, P., Krainer, M. A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions. J. Vis. Exp. (171), e60328, doi:10.3791/60328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter