Summary
I denne protokol beskriver vi procedurer til kvalitativt og kvantitativt at analysere udviklingsfænotyper hos mus forbundet med medfødte hjertefejl.
Abstract
Medfødte hjertefejl (CHD) er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker, der påvirker op til 1% af alle levendefødte. De underliggende årsager til CHD er dog stadig dårligt forstået. Den udviklende mus er en værdifuld model for studiet af CHD, fordi hjerteudviklingsprogrammer mellem mus og mennesker er stærkt bevaret. Protokollen beskriver i detaljer, hvordan man producerer museembryoner af den ønskede svangerskabsfase, metoder til at isolere og bevare hjertet til downstream-behandling, kvantitative metoder til at identificere almindelige typer chd ved histologi (f.eks. ventrikulær septal defekter, atrieflimren septal defekter, patent ductus arteriosus), og kvantitative histomorphometri metoder til at måle fælles muskulære komprimere fænotyper. Disse metoder formulerer alle de trin, der er involveret i forberedelse, indsamling og analyse af prøver, så forskerne kan måle CHD korrekt og reproducerbart.
Introduction
CHD'er er den mest almindelige form for fødselsdefekt hos mennesker og er den hyppigste årsag til dødsfald som følge af fødselsdefekter1,2,3,4,5,6. Selv om omkring 90% af nyfødte børn overlever CHD, er det ofte forbundet med betydelig sygelighed og medicinske indgreb i årenes løb, pålægge en tung byrde for patienternes liv og sundhedssystemet7,8,9,10. Uden for rent genetiske faktorer, årsagerne til CHD er dårligt forstået4. Uidentificerede årsager tegner sig for ~ 56-66 % af alle CHD-tilfælde ifølge American Heart Association og andre kilder2,3,4,11. Velkendte faktorer omfatter genetiske mutationer, CNVs, de novo enkelt nukleotid varianter, og aneuploidi. Der er mistanke om, at miljø- og kostfaktorer også er vigtige kilder, der bidrager til CHD, som foreslået af epidemiologiske undersøgelser, der forbinder mødres livsstil2,12, økonomisk afsavn og race13og ved forskning i kosten faktorer såsom folinsyre11,14 og den bioaktive lipid retinsyre15,16. Det er vigtigt at undersøge mekanismerne og årsagerne til CHD og andre kardiovaskulære defekter for at udvikle forebyggende strategier og nye terapeutiske løsningsmodeller1,4,17,18,19.
Den udviklende mus er en hjørnesten model for at studere CHD i pattedyr. Men nogle af de anvendte metoder og analyser, såsom dissektioner bevare hjertemorfologi, analyse af udviklingsmæssige faser, og identifikation af CHD-relaterede defekter, kan være skræmmende for forskere, der er nye til analyse af murine hjerter. Målet med de metoder, der er beskrevet i denne protokol, er at tilbyde kvalitative og kvantitative retningslinjer for disse processer. Således forklarer vi i denne protokol, hvordan man udfører tidsvist parring er at producere embryoner af den ønskede svangerskabsuge fase, dissekere drægtige kvinder til intakt hjerte opsving (herunder tilhørende væv såsom udstrømning tarmkanalen), hjerte fiksering og forberedelse til kryot skæring, grundlæggende histologi metoder, kvantitative analyser af fælles hjertefejl, og kvalitativ analyse af hjertemusklen komprimering, en fælles forløber fænotype til nogle typer af CHD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der anvendes i de forsøg, der henvises til i dette papir blev behandlet ved hjælp af dyrepleje retningslinjer for Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Tidsford parring af C57BL6/J mus til embryonproduktion
- Når musene har nået ynglealderen (6-8 uger), sættes de sammen i haremavlsformat (dvs. to hunner pr. han). Sæt dem op til avl engang om eftermiddagen eller aftenen.
BEMÆRK: Mus yngler ofte inden for 1 time, efter at lyset er blevet slukket i deres boliganlæg. Hunnerne skal pensioneres fra avl efter ca. 6-8 måneder, og hannerne skal anvendes senest 12 måneder. - Hvis du bruger indvejningsmetoden til at bestemme befrugtningen, skal mus i store grupper opdrættes, fordi indvejningsmetoden medfører, at tidsbestemt parring fortsætter i et langsommere tempo end metoder, hvor kun copulationspropper overvåges.
- Den næste morgen, kontrollere for copulation stik engang mellem 08:00 til 12 PM. Sørg for, at dette sker på de rigtige tidspunkter. Hvis stikket assay udføres tidligere end 08:00, er der en risiko for, at stikket er for dybt i vaginal kanalen til at blive observeret. Hvis stikanalysen udføres senere end kl.
- Grib hunnen ved bunden af halen og undersøg åbningen til vaginalkanalen med brug af en mikropipettespids. En copulation plug vil ligne en slimhindebarriere (Figur 1A), som kan være en smule svært at se i nogle tilfælde. Crustiness også er en indikation af, at en copulation stik er eller var til stede. Hvis der ikke er nogen slimhindebarriere (figur 1B), så hunnen sandsynligvis ikke har parret eller copulation stikket kunne allerede faldet ud.
- Henvis til morgenen for samleje som e0,5.
BEMÆRK: Med C57BL6/J-mus kan det være svært at identificere copulationspropper. Derfor parrede musene sig nogle gange, selvom der ikke blev observeret noget stik. Copulation fører ikke altid til undfangelse. Dette er ofte mere sandsynligt i C57BL6/J mus. Derfor skal du overvåge vægtprogression en bekræftelse af graviditet (se trin 1.4). Den vejer ins kan hjælpe med at identificere kvinder, der er gravide og bekræfte, at stik førte til undfangelse. Vær forsigtig, når parring hunner for på hinanden følgende nætter. Hvis en bestemt mand er observeret for at være god til at producere en copulation stik, at mandlige kan have tillid til at parre sig til hinanden følgende nætter med den samme kvinde. - Husk, at chancerne for graviditet er højere med mus, der er bevist opdrættere, som de med succes er blevet opdrættet før. For at øge chancerne for at få bevist opdrættere, hannerne anvendes bør ikke være for gammel.
- Efter stikket assay, vejes hunnerne. Denne vejning bør følges op 7-10 dage senere. Hvis vægtøgning overstiger 1,73 g, så musen er sandsynligvis gravid20. Hvis vægtøgning er under 1,73 g, er det sandsynligt, ikke relateret til graviditet, og musen bør genindføres til ynglepopulationen.
BEMÆRK: C57BL6/J mus producerer små kuld (fem til seks embryoner i gennemsnit). Vejes i metoder til at bestemme graviditet er korrekte for de fleste. Ved hjælp af denne metode giver en 12,8% falsk positiv sats og vil udelukke 3% af kvinder, der rent faktisk er gravide20. Hvis forskeren er bekymret for, at den ønskede svangerskabsuge tid er senere, gå videre til trin 1,5 - Valgfrit: Den dag, hvor dissektion vil finde sted, sikre, at graviditeten har udviklet sig ved fysisk inspektion. Grib hunnen ved bunden af halen og stræk kroppen ud. Dette er lettest at gøre ved at placere musen på håndleddet og forsigtigt trække i bunden af halen. Hvis hunnen er gravid, så er der sandsynligvis vil være vægtøgning specifikt i den nederste torso, og det vil fremstå som små klumper.
BEMÆRK: Graviditet kan være håndgribelig så tidligt som e12.5 og vil være håndgribelig med e14.5 i de fleste tilfælde. C57BL6/J mus har små kuldstørrelser, derfor kan hunnen være gravid, selv om der ikke er nogen fysiske tegn.
2. Dissektion af hunner og embryoner med henblik på hjertehelbredelse
- Før dissektion påbegyndes, skal følgende opløsninger klartiles ved stuetemperatur.
- Ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) opløses i fosfatbufferet saltvand (PBS) ved en koncentration på 0,5 mM.
BEMÆRK: Når opløsningen er klar, er den at holde den på is og kun bruge den ved 4 °C. Hvis kontaminering giver anledning til bekymring, skal den autoklameres før brug. - Paraformaldehyd (PFA) opløses i PBS ved en koncentration på 4 %.
BEMÆRK: Når opløsningen er klar, er den at holde den på is og kun bruge den ved 4 °C. Opbevares ved 4 °C eller koldere til langtidsopbevaring. Koncentrationen af PFA-opløsningen kan variere afhængigt af vævsprøvernes downstream-anvendelse. Denne procentdel bruges til hæmatoxylin og eosin farvning, immunhistokemi, og immunfluorescerende farvning.
- Ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) opløses i fosfatbufferet saltvand (PBS) ved en koncentration på 0,5 mM.
- Når hunnen har nået det ønskede svangerskabsstadium, bør musen aflives på det korrekte tidspunkt på dagen i henhold til de godkendte retningslinjer for brug af dyr. Hvis der er tider på den halve dag (f.eks. e15.5), bør de ofres tæt på kl. Hvis der er tider på hele dage (f.eks. e15.0), bør de ofres tæt på kl.
BEMÆRK: Undfangelsen antages at finde sted nær midnat i løbet af natten musene er parret. Men det er vanskeligt at bestemme det nøjagtige tidspunkt for undfangelsen. På grund af dette, er timing en anslået, ikke nøjagtig. - Efter pinning de fire lemmer ned, omhyggeligt lave en I-formet snit langs torso, startende fra omkring urinrøret op mod brystbenet.
- Livmoderen vil sandsynligvis blive placeret lige over bækkenregionen. Muselivmoderen er Y-formet; derfor vil det sandsynligvis være meget lang og viklet rundt om torsoen. Fjern den ved forsigtigt at løfte den. Gør dette ved hjælp af siderne af fine pincet i en scooping bevægelse. Den overfladiske væv i livmoderen kan gribes meget omhyggeligt af spidsen af de fine pincet, når de oprindeligt trækker livmoderen ud. Brug en saks til at skære livmoderen fra kroppen.
BEMÆRK: Under hensyntagen til den usædvanlige Y-formet af livmoderen, skal du sørge for hele livmoderen er fjernet. - Læg livmoderen i blød i iskold PBS. Pin den ene ende af livmoderen ned og strække det ud i en enkelt linje.
- Skær livmoderen i sektioner, hver sektion, der indeholder et separat foster. Skræl forsigtigt fosteret ud med fine pincet. Dette er lettest at gøre med et par pincet i hver hånd. Når embryonet er fjernet, anbringes det straks i en ny petriskål fyldt med PBS-EDTA-opløsning ved 4 °C.
BEMÆRK: Normal PBS-opløsning kan også anvendes, men EDTA forhindrer koagulation i prøverne. - Stage embryonerne ved hjælp af Theiler Staging21. Fordi iscenesættelse kan variere mellem embryoner inden for et enkelt kuld, iscenesætte hvert enkelt foster.
BEMÆRK: Dette kan også give fremsyn i de mulige medfødte hjertefejl i embryonerne. Typisk kan symptomer på en medfødt hjertefejl observeres i embryonalmorfologien. Andre store defekter ofte forbundet med visse hjertesygdomme kan være til stede. - Hjertet kan fjernes på forskellige måder afhængigt af fosterets alder.
BEMÆRK: Hvis det er uklart, om udstrømningskanalen vil forblive intakt under fjernelse, enten fjerne mere væv end udelukkende hjertet (holde udstrømningskanalen intakt og minimere den direkte kontakt mellem hjertet og pincet) eller analysere hele fosteret.- Brug en dissektion omfang og to par fine pincet, placere fosteret på ryggen og stabilisere adgangen til brystet. Dette kan gøres ved enten at fastgøre armene ned med tangen eller fjerne armene og holde torsoen på plads.
- Brug det skarpe punkt i et andet par fine pincet til at foretage et snit langs brystbenet af fosteret og udvide mellem kravebenet til navlen. Start med at gøre meget fine og overfladiske snit, mens gradvist arbejder mod indersiden af brysthulen. Hjertet skal næsten ikke blive synligt. Kontakt den ikke med pincetunder disse overfladiske snit.
- Skræl brystkassen åben ved hjælp af det første par pincet til forsigtigt at presse på overkroppen af fosteret, lidt caudal til brystkassen. Hjertet skal poppe ud eller blive synlige. Hjertet kan kræve nogle blide lokke at komme ud. Brug den side af pincet, og sørg for, at det punkt af pincet aldrig kommer i kontakt med hjertet. For at holde arbejdsområdet og pincetrene rene skal du holde en fnugfri sletning i nærheden.
- Tag forsigtigt fat i de pulmonale blodkar med siderne af pincet, og sørg for ikke at afskære vævet, og træk hjertet ud af brysthulen. Så rengør hjertet.
BEMÆRK: For embryoner e13.5 og yngre er hjertet dækket af hjertesækken. Dette skal fjernes for at nå hjertet.
- Brug et stereoskop til at tage et billede af hjertet til senere brug.
- Skyl hjerterne i PBS-EDTA opløsning i 1-2 min, og læg dem derefter i 4% PFA-opløsning i ca. 45-60 min. Hvis analysen af hele fosteret ønskes, lægges i blød natten over. Mængden af PFA-opløsningen skal være 5-6 x mængden af det væv, der fastsættes.
BEMÆRK: Denne inkubationstid kan variere afhængigt af de senere undersøgelser. Denne inkubationstid bruges til hæmatoxylin og eosin farvning, immunhistokemi, og immunofluorescerende farvning. - Vask 5-10 min med PBS-glycin 3x og læg tilbage i PBS. Natriumazid eller penicillin/streptomycin kan også tilsættes for at minimere bakterievækst og bevare intakt væv. Hjerterne kan nu opbevares på kort sigt ved 4 °C.
3. Vævsforberedelse
BEMÆRK: Væv kan enten fremstilles ved hjælp af OLT (optimal skæretemperatur) indlejring eller paraffinindlejring. Der er fordele og ulemper ved begge metoder, og målet med analysen bør overvejes, når det besluttes, hvilken indlejringsmetode der skal anvendes.
- OLT-integrering
BEMÆRK: Denne metode kan være at foretrække frem for formalin/paraffinindlejring, fordi kryosektioner bevarer antigenreaktivitet, stadig kan anvendes til hæmatoxylin- og eosinfarvning og producerer skiver hurtigere.- Der fremstilles en opløsning af saccharose opløst i PBS ved en koncentration på 30 % (w/v).
- Vævet overføres til et nyt konisk 15 ml rør eller 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende PBS-30% saccharose. I første omgang vil vævet flyde.
- Den anbringes ved 4 °C i køleskabet. Vævet vil være klar til OLT indlejring, når det synker til bunden af røret, normalt i 24-40 h.
BEMÆRK: Muskelvæv lider betydeligt under fryse / tø cykler og mister deres indfødte morfologi. Saccharose absorberes af vævet og fungerer som et kryokonserveringsmiddel, der giver mulighed for bedre bevarelse af morfologien. Sørg for, at der er tilstrækkelig opløsning i røret til, at det flydende væv kan overvåges tilstrækkeligt. PBS-saccharose er let forurenet med bakterier, så tjek opløsningen ofte for uklarhed, hvilket indikerer enten svampe eller bakteriel overvækst. For at minimere risikoen for kontaminering kan der tilsættes enten penicillin/streptomycin eller natriumazid til PBS-saccharoseopløsningen. - Fjern hjerter med en Pasteur pipette, sørg for åbningen af pipetten er bred nok til ikke at rive vævet. Skær pipette med en saks, hvis det er nødvendigt. Hvis der arbejdes med hele embryoner, skal du bruge pincet til at udtage prøven.
BEMÆRK: Gør dette forsigtigt. Selv om pipettens åbning er bred nok til at hente hjerterne, kan kanterne af pipetten stadig rive væv. Pincet kan indrykke vævsprøver, hvis de anvendes for aggressivt. - Lad kortvarigt vævet lufttørre på en fnugfri klud. Prøven anbringes i en OLT-form i den ønskede position til skæring (dvs. sagittal, tværgående, koronal). OLT-forbindelsen tilsættes, indtil prøven er helt nedsænket, og sørg for, at der ikke er bobler i kontakt med vævet.
- Placer formen på -20 °C natten over eller flere dage og derefter flytte formen til -80 °C. Efter 24 timer formen er klar til kryosektion. Væv i dette format kan opbevares på lang sigt.
- Integrering af paraffin
- Brug ethanol, dehydrere væv i denne rækkefølge: 50% ethanol i 10 min, 70% ethanol i 10 min, 80% ethanol i 10 min, 95% ethanol i 10 min, 100% ethanol i 10 min (gør dette 3x).
- Læg vævene i blød i en serie ethanol/xylenopløsning i denne rækkefølge: 2:1 ethanol/xylenopløsning i 10-15 min. 1 ethanol/xylenopløsning i 10-15 min. 1:2 ethanol/xylenopløsning i 10-15 min. 100% xylen i 10-15 min. (gør dette 3x).
- For at erstatte xylen med paraffin iblødsætning af væv i en vakuumovn (sat mellem 54-58 °C) i denne rækkefølge: 2:1 xylen/paraffinopløsning i 30 min, 1:1 xylen/paraffinopløsning i 30 min, 1:2 xylen/paraffinopløsning i 30 min. 100% paraffin i 1-2 timer, 100% paraffin i 1-2 timer eller natten over.
BEMÆRK: Opvarmning af væv ud over 60 °C i længere tid vil få paraffinpolymererne til at nedbrydes, og vævet bliver skørt. - Brug frisk paraffin, indlejre væv i den ønskede position.
4. Cryostat skæring for OLT indlejret væv
- Ved kryoten anbringes alle prøver inde i mindst 1 time, hvis prøverne tidligere er opbevaret i fryseren -80 °C. De bør blive der, indtil alle afsnit er indsamlet.
- Sørg for, at kryoaten er indstillet til de korrekte temperaturindstillinger. Den miljømæssige temperatur inde i kryodekammeret skal være på omkring -20 °C og armen af kryoaten skal være på omkring -24 °C.
BEMÆRK: Denne temperatur kan variere afhængigt af, hvordan blokken reagerer på udskæring. Hvis inkonsekvent udskæring er et problem, kan temperaturen i miljøet sænkes. - Fjern OLT blok fra sin mug ved at trække på kanterne af den åbne side af formen til at løsne det og derefter klemme blokken i den lukkede ende, hvor formen indsnævrer.
- For at montere OLT-blokken skal du placere rumtemperaturen OLT på borepatronen, startende fra midten og arbejde til kanten. Hele chuck behøver ikke at være dækket.
- Placer OLT-blokken (se trin 3.1) på formen. Kanten af blokken, der var mod den lukkede side af formen skal vende op på chuck. Lad OLT på borepatronen fryse, indtil den er uigennemsigtig hvid, ca. 5-10 min.
- Placer chuck på armen i yderligere 5-10 min for blokken til at komme til arm temperaturen. For at få en parallel skive, justere armen, indtil kanten af blokken er parallel med scenen, og der er en jævn afstand mellem scenen og den nederste kant af blokken er den samme som scenen og den øverste kant af blokken.
- Sæt klingen i, og juster afstanden fra blokken fra klingen for at tage sektioner.
- Tag skiver med en tykkelse på 10 μm. Hold udskæring, indtil interessepunktet er nået enten manuelt eller ved hjælp af trim-funktionen.
- Hvis du vil samle skiver, skal du bruge en lille flad pensel og en detaljepensel. Når formen begynder at blive skåret, skal du bruge den flade børste til forsigtigt at trække skiven mod stativet. Ved skæring gennem prøven skal bevægelsen være kontinuerlig og uden pause, selv om hastigheden kan afhænge af prøvens fasthed.
- Mens du skærer, skal du bruge den flade børste til forsigtigt at styre skiven, som den er lavet. Skiven behøver ikke at være flugter med scenen på dette punkt, så gør det muligt at billow at ikke forårsage tårer eller trækker og påvirke histologi.
BEMÆRK: Ved udskæring af hele embryoner kan denne del være særlig vanskelig, især når der skiftes vævstyper. Sørg for, at skiverne er lavet uden pauser, og børsten trækker ikke for aggressivt i skiverne. Når vævstyper ne skifter, kan skiven gå i stykker, så det er vigtigt at holde temperaturen kold. Hvis brud er et problem, skal du sænke temperaturen eller øge prøvens tykkelse. - Sæt blokkens bevægelse på pause, når prøven er helt skåret igennem, men skiven er endnu ikke fri for blokken. Uden at flytte den flade børste fra skiven, skal du bruge detaljepenslen til at klappe skiven ned for at gøre den flad og fryse mod scenen.
- Hold skiven der i ~10 s, før du fjerner detaljepenslen og afslutter skiven. Brug de to pensler til forsigtigt at flade skiven mod scenen, forhindre enhver rullende, og holde den mod scenen for ~ 20-30 s.
- Vend udsnittet og samkopier mod scenen igen. Flyt en elektrostatisk ladet slide tæt nok til, at skiven kan tiltrækkes, og hold dig til diaset uden at skulle røre diaset til scenen. Mærk diasene med en blyant.
- Opbevar objektglassene i en lufttæt boks for at beskytte vævet mod isoprustning under opbevaring. Til kortvarig opbevaring skal objektglassene opbevares ved -20 °C, før de farvning. Til langtidsopbevaring opbevares ved -80 °C.
5. Mikrotomeskæring for paraffinindlejret væv
- Placer blokkene på is, inden de skal opbevares, for at afkøle prøverne. Når cool, paraffin skiver lettere og kan producere tyndere skiver.
- Der tilberedes et vandbad på 40-45 °C med ultrarent vand.
- Sæt klingen i holderen i mikrotomen. Sørg for, at den sidder godt fast, og indstil derefter frigangsvinklen. Sørg for, at frigangsvinklen er korrekt. Dette kan kontrolleres i henhold til producentens anvisninger.
- Placer paraffinblokken i mikrotomen. Sørg for, at den er korrekt orienteret, så klingen skærer lige over blokken.
- Sørg for, at klingen vender korrekt med blokken ved at lave et par skiver. Gør dette omhyggeligt, så der kan foretages justeringer.
- Trim blokken, indtil det punkt af interesse er nået.
- Lav skiver ved den ønskede tykkelse. Tag hensyn til, at de første par skiver sandsynligvis vil blive kasseret.
- Afhente sektioner og flytte dem ind i vandbadet ved hjælp af pincet. Dette skulle få sektionerne til at flade ud. Brug pincet til at justere dem efter behov.
- Flyt en elektrostatisk ladet slide tæt nok til, at skiven kan tiltrækkes, og hold sig til diaset. Mærk diasene med en blyant.
- Placer alle indsamlede slides i et sliderack. Lad objektglassene tørre natten over ved 37 °C.
6. Afparaffinisering af væv
- Objektglassene vaskes i følgende rækkefølge: 3 min i xylen (2x), 3 min i en 1:1 xylen/100% ethanolopløsning, 3 min i 100% ethanol (2x), 3 min i 95% ethanol, 3 min i 70% ethanol, 3 min i 50% ethanol.
7. Hæmatoxylin og eosin farvning
- Gør diasene klar til farvning.
- Hvis olT-forberedt væv medsis, lægges i blød i destilleret vand i ~4 min, indtil OLT er opløst, og tør det tørre.
- Hvis du bruger paraffin indlejret væv, skal de afparaferes. Se trin 6.1.
- Placer slæden i filtreret 0,1% hæmatoxylin i 10 min. Placer slæden i destilleret vand, ændre vandet 1x straks og derefter igen efter 3 min.
- Placer diasi0,5% eosin for 10 s eller dip 12x. Dyp diaset i destilleret vand, indtil eosin ikke længere striber, omkring 2-3 dips.
- Dehydrere diaset ved iblødsætning i 50% ethanol for 10 s, 75% ethanol for 10 s, 95% ethanol til 30 s, og 100% ethanol i 1 min. Dip i xylen indtil xylen kommer ud glat, ~ 5-7 dips.
- Lad xylen fordampe og montere ser ud med et hurtigttørrende monteringsmedium, der har et brydningsindeks tæt på glas.
8. Kvalitativ analyse af almindelige hjertefejl
- Tag billeder af alle prøver ved hjælp af et omvendt eller stereomikroskop og dets respektive kamera. Tag makroskopiske og mikroskopiske billeder, afhængigt af de typer af defekter, der analyseres. Makroskopiske billeder kan tages med enhver forstørrelse under 10x. Mikroskopiske billeder skal tages ved 40x forstørrelse eller højere. De billeder taget i dette papir blev taget med 5x forstørrelse ved hjælp af et stereomikroskop og en 40x luft mål (linse NA af 0,55) ved hjælp af en omvendt mikroskop.
BEMÆRK: Makroskopiske billeder er et godt udgangspunkt, fordi de giver udsigt til hele hjertet (Figur 3). Efterhånden som mønstrene identificeres, kan specifikke områder fokuseres på og undersøges yderligere. - Line up alle billederne side om side på en computerskærm. Har alle billederne af kontrolprøver på den ene side af skærmen og alle billederne af eksperimentelle prøver på den anden side af skærmen. Det er bedst at analysere en behandlingsgruppe ad gangen.
- Se efter forskelle i fænotyper mellem behandlingsgrupper, der starter på nøgleområder, hvor almindelige hjertefejl finder sted. Dette vil variere afhængigt af, om billederne er makroskopisk, som skildrer grov anatomi af hjertet, eller mikroskopisk, som skildrer mikroskopisk anatomi af hjertevævet.
- Begynd at søge efter almindelige makroskopiske hjertefejl, såsom ventrikulære septaldefekter (Figur 2A), atrieflimren septal defekter (Figur 2B), og patent ductus arteriosus (Figur 2C). Alle disse defekter er lettest ses i den tværgående opfattelse af hjertet.
- At identificere septal defekter, overveje at se på flere skiver, fordi de kan observeres i et plan af vævet og ikke en anden.
BEMÆRK: Nogle gange en defekt er ikke manglen på en septum, men et hul i septum. Vær derfor meget opmærksom på ikke fejl en tåre for en septal defekt. Leder du efter konsistenser mellem nærliggende skiver i et bestemt område kan bekræfte, om dette faktisk er en defekt eller en tåre fra udskæring. - For at identificere fejl i udstrømningskanalen, såsom patentet ductus arteriosus, bruge flere skiver til at følge de store blodkar, som de forlader hjertet. Opret et billede af de store blodkar i forhold til hinanden. Et eksempel findes i figur 2C.
BEMÆRK: Nogle uregelmæssigheder kan skyldes et embryons udviklingsstadium (f.eks. lukker patentductus arteriosus efter fødslen, kort efter fødslen; ventrikulær septum lukker ikke helt før ~e14.5). Nogle andre almindelige makroskopiske hjertefejl, der ikke er inkluderet i tallene omfatter vedvarende afkortning atereriosus, som lettest kan påvises på e16.5 og senere; dobbelt stikkontakt højre hjertekammer (DORV), som kan detekteres i skiver, hvor hjertet kommer ind i udstrømningskanalen; og en altoverskyggende aorta22. En almindelig mikroskopisk hjertefejl omfatter nedsat muskelkomprimering (Figur 4).
9. Kvantitativ analyse af hjertemusklen komprimering ved hjælp af hæmatoxylin og eosin farvede væv
- Ved hjælp af den makroskopiske visning af de farvede vævsprøver (figur 4A) identificeres en region af interesse for billedet ved en 40x forstørrelse (figur 4B). Til dette papir blev væggen i venstre hjertekammer brugt. Gem billedet i det ønskede format. I dette papir blev billederne gemt som .tif-filer.
- Åbn billedet i ImageJ-software.
- Indstil billedet til 8-bit. Dette gør det muligt for billedet at udnytte tærskelværktøjet i næste trin23,24. Det kan du gøre ved at vælge "Billede | Type | 8-bit".
- Indstil billedets grænse. Formålet med dette trin er kun at vælge de pixel, der repræsenterer baggrunden, bortset fra de pixel, der repræsenterer vævene23,24.
BEMÆRK: Dette overfladeareal trækkes senere. En korrekt tærskel vil vælge de pixels, som forskeren ønsker at udelukke fra muskelvæv overfladeareal. Derfor bør slutresultatet omfatte vævet i gråtoneskala, og baggrunden vil blive valgt.- Klik på "ImageJ | Billede | Juster | Tærskel". Flyt den øverste bjælke for at foretage justering af tærskler. Luk vinduet for tærskeljusteringer uden at foretage andre ændringer, når de ønskede sektioner er markeret21.
- Brug værktøjet Polygonmarkeringer til at vælge den plads, som vævet optager. Sørg omhyggeligt for, at konturerne sporer vævsgrænserne, da løse sporinger vil give falske målinger.
- Juster måleindstillingerne på ImageJ, så softwaren kun måler det pixelområde, der blev valgt ved hjælp af tærskelværktøjet i trin 9.423. "ImageJ | Analyser | Angiv målinger | Område og grænse for tærskel". Vælg kun Område og Begræns til tærskel.
- Mål området for de fremhævede pixel. "ImageJ | Analyser | Foranstaltning". Denne værdi repræsenterer området i det negative mellemrum.
- Mål området for hele den pågældende region. Dette er det område, der blev valgt ved hjælp af værktøjet Polygonmarkeringer. "Billede J | Analyser | Angiv målinger | Område". Vælg kun Område, og fravælg Grænse til tærskel. Mål derefter, vælge "Billede J | Analyser | Foranstaltning".
- Beregn det område, det faktiske muskelvæv optager inden for regionen af interesse. Træk arealet af det negative rum fra området i hele regionen af interesse. Denne værdi er det område af muskelvæv.
- Beregn muskelkomprimeringsindekset (MCI). Del området af muskelvæv med det område af regionen af interesse.
Jo større MCI-værdien er, jo mere komprimeret er musklen. Disse MCI-værdier kan derefter anvendes til statistisk analyse for at teste for signifikante ændringer i muskelkomprimering mellem behandlingsgrupper (figur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muskelkomprimeringsindekset blev sammenlignet mellem hjerter, der udviklede sig under to forskellige miljøer, en kontrol og en eksperimentel gruppe. Disse protokoller blev brugt til at analysere komprimering af muskelvæv kvantitativt, som tillod statistisk analyse. Muskelkomprimering viste sig at være signifikant reduceret i de eksperimentelle hjerter i forhold til de embryoner, der udviklede sig under ikke-eksperimentelle forhold.
Embryoner blev kasseret, hvis observationstidspunktet syntes unøjagtig. Selv om hæmmet vækst af embryoner kunne være et resultat af behandlingen af eksperimentet, og der er en række udviklingsmæssige fremskridt, avl blev fordelt tilstrækkeligt til at sikre timingen af embryo udvikling. Iscenesættelse af embryoner blev udført ved hjælp af Theiler Iscenesættelse21. Prøver blev anset for at være dårligt skåret, hvis skiverne ikke afspejlede konsistens, eller hvis de havde indlysende tårer eller folder. Farvning forudsat nok kontrast til at gøre ud væv kanter, men var ikke så mørkt, at gøre celle funktioner skelnes. Slides blev derefter afbildet med et omvendt mikroskop med en 40x objektiv. MCI-værdier blev beregnet ved hjælp af ImageJ-software og Microsoft Excel. Disse MCI-værdier blev analyseret ved hjælp af en T-test.
Figur 1: Plug-analyse resulterer i C57BL6/J-mus. (A) En mus med et let identificerbart samlejestik. B) En mus uden copulation stik. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Almindelige hjertefejl. Skemaer af den sande forventede morfologi af en medfødt hjertefejl. (A) Tværgående visning af en ventrikulær septaldefekt. (B) Tværgående opfattelse af en atrieseptal defekt. (C) Patent ductus arteriosus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hematoxylin og eosin plet af e15.5 hjerter. (A) Et plettet hjerte, der udviklede sig under normale forhold. Skalabar = 750 μm. (B) Et plettet hjerte, der udviklede sig under forsøgsbetingelser. Skalabar = 750 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kvantitativ analyse af muskelkomprimering mellem hjerter, der udviklede sig under normal moderkost og hjerter, der udviklede sig under essentielle fedtsyrer mangelfuld e-kost. (A) Hematoxylin og eosin farves hjerter på en makroskopisk (5x) visning. Skalastænger = 1.000 μm. (B) Hematoxylin og eosinfarvede hjerter ved mikroskopisk udsyn (40x). Skalastænger = 75 μm. (C) De resulterende data for målinger af muskelkomprimeringsindeks. Værdierne blev analyseret ved hjælp af en T-test (n = 4 pr. behandlingsgruppe). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol udforsker de teknikker, der er involveret i analysen af hjerteudvikling i embryonale hjerter. Nogle begrænsninger af denne metode er den nødvendige fysiske fingerfærdighed for de forberedende teknikker, som kan kræve praksis, og dygtighed med mikroskop billeddannelse. Hvis skiverne opnået på kryoat er rodet, vil hæmatoxylin og eosin farvning ikke være klar, eller hvis billederne taget på mikroskopet har dårlig belysning, så den metode, der anvendes med ImageJ vil ikke arbejde. En begrænsning af tærskelfunktionen i ImageJ-softwaren er, at den vælger pixel, der er placeret i den ene ende af en grænse, der afhænger af pixelværdien. Derfor medtages eller udelades pixel, der findes på den forkerte side af tærsklen, forkert eller udelades i beregningen. I sidste ende vil fejlfinding være nødvendig for vedtagelse af protokollerne til brug i en undersøgelse.
I tilfælde af, at hjertet udvinding er for svært, overveje at springe til trin 2,8. Derudover overveje at fjerne mere end blot hjertet og lungerne fra brysthulen. Målet bliver derefter større og lettere at manipulere, og direkte kontakt mellem hjertet og de fine pincet er minimeret. Ved skæring af kryokroner vil forsøgsprøverne altid være direkte sammenlignet med kontrolprøver. Dette giver plads til brugerfejl, så længe fejlen er konsistent i alle eksempler. For at minimere brugerfejl og undgå falske resultater skal du sørge for, at der opnås sammenlignelige sektioner fra begge behandlingsgrupper. Hvis mere end én person for eksempel producerer sektioner, skal du sørge for, at en person producerer et lige antal sektioner til kontrolelementer og alle behandlingsgrupper og ikke kun én undergruppe. Endelig, når tærskelbilleder på ImageJ, tærskelværktøjet bruges til at give maksimal frihed ved at vælge pixel, der repræsenterer væv og pixel, der ikke gør. Hvis det er nødvendigt, skal du justere billedernes kontrast for yderligere at intensivere pixelværdien af baggrunden fra vævspixelværdien. Selvom der er fejlfindingsmuligheder, kræver teknikkerne stadig en høj grad af dygtighed. Men, udførelse af denne protokol giver adgang til data, der ikke typisk måles i andre hjerteudviklingsmæssige forskningsundersøgelser. Udnyttelsen af denne protokols karakteristika kan således yde et væsentligt bidrag til en videnskabelig undersøgelse.
Identifikation af virkningerne af eksperimentelle behandlinger i kardiologi forskning ofte undersøges gennem morfologi vurdering. Dette er især tilfældet i udviklingsmæssige biologi, hvor moderkagen gør det vanskeligt for fysiologiske træk ved at udvikle hjerter, der skal måles. Derfor morphological analyse, der giver indsigt i funktionen af hjertet dramatisk flytter bane af udviklingsmæssige biologi forskning. Selv om de fleste papirer analysere tykkelsen af hjertemusklen til at bestemme styrken af hjertet, direkte måling af muskel komprimering kunne give yderligere indsigt i fysiologi en udvikle pattedyr hjerte25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at rapportere.
Acknowledgments
Den Aguirre Lab er støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute of National Institutes of Health under tildeling nummer K01HL135464 og af American Heart Association under tildeling nummer 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
