Summary
本議定書では、先天性心不全に関連するマウスの発達表現型を定性的かつ定量的に分析する手順を説明する。
Abstract
先天性心不全(CHD)は、ヒトの出生時欠損の最も一般的なタイプであり、すべての出生の最大1%に影響を及ぼす。しかし、CHDの根本的な原因はまだ十分に理解されていません。開発中のマウスは、マウスとヒトの間の心臓発達プログラムが非常に保存されているため、CHDの研究にとって貴重なモデルです。プロトコルは、所望の妊娠段階のマウス胚を生成する方法、下流処理のために心臓を分離して保存する方法、構造学によってCHDの一般的なタイプを識別する定量的方法(例えば、心室中隔)を詳細に記述する欠陥、心房中隔欠損、特許性管管動脈管)、および定量的な構造学法は、一般的な筋圧膜型を測定する。これらの方法は、サンプルの調製、収集、および分析に関与するすべてのステップを明確にし、科学者がCHDを正しく、再現的に測定することを可能にします。
Introduction
CHDは、ヒトにおける出生時欠損の最も一般的なタイプであり、出生時欠損関連死の主な原因である1、2、3、4、5、6。新生児の約90%がCHDを生き残っているが、それはしばしば、患者の生活と医療システム7、8、9、10に大きな負担を課す、長年にわたって重大な罹患率および医学的介入に関連している。純粋に遺伝的要因の外では、CHDの原因は十分に理解されていません4.未確認の原因は、米国心臓協会およびその他の情報源2、3、4、11によると、すべてのCHD症例の約56-66%を占める。既知の因子には、遺伝子変異、CTV、デノボ単一ヌクレオチド変異、および異数体が含まれる。母体の生活様式2、12、経済的剥奪、および人種13を結ぶ疫学的研究によって示唆されるように、環境および食事因子もCHDに寄与する重要な供給源であると疑われる。CHDおよび他の心血管欠損のメカニズムと原因を調査することは、予防戦略および新しい治療オプション1、4、17、18、19を開発するために重要である。
開発中のマウスは、哺乳類のCHDを研究するための基礎モデルです。しかし、心臓形態を保存する分節、発達段階の分析、CHD関連欠陥の同定など、採用された方法や分析の中には、マウスの心臓の分析に新しい科学者にとっては困難な場合があります。このプロトコルで説明されている方法の目的は、これらのプロセスに対して定性的かつ定量的なガイドラインを提供することです。したがって、このプロトコルでは、所望の妊娠期の胚を産生するために時間交配を行い、無傷の心臓回復(流出路などの関連組織を含む)、心臓固定および準備のために妊婦を解剖する方法を説明するクライオスタット断面化、基本的な構造学的方法、一般的な心臓欠損の定量的分析、および心筋圧密の定性的分析は、いくつかのタイプのCHDに対する一般的な前駆体表現型である。
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Protocol
本論文で参照されている実験で使用されたすべての動物は、ミシガン州立大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の動物ケアガイドラインを使用して治療した。
1. 胚生成のためのC57BL6/Jマウスのタイミング交配
- マウスが繁殖年齢(6-8週間)に達したら、ハーレム繁殖形式(すなわち、1匹の雄1匹につき2匹の雌)にまとめる。午後または夕方に繁殖のためにそれらを設定します。
注:マウスは、多くの場合、彼らの住宅施設内でライトがオフになった後、1時間以内に繁殖します。メスは約6〜8ヶ月で繁殖から引退し、オスは12ヶ月以下で使用する必要があります。 - 計量方法を使用して受精を決定する場合、重み付け方法は、交尾プラグのみを監視する方法よりも遅いペースでタイミング交配を進行させるため、マウスを大きなグループで繁殖させる。
- 翌朝、午前8時から午後12時の間に交尾プラグを確認してください。プラグアッセイが午前8時より早く行われると、膣管内のプラグが深すぎて観察できない危険性があります。プラグアッセイが午後12時以降に行われると、プラグが抜け落ちるおおありです。
- 尾の基部で女性をつかみ、マイクロピペットの先端を使用して膣管への開口部を調査する。交尾プラグは粘膜バリア(図1A)のように見えますが、場合によっては少し見えにくいかもしれません。地殻はまた、交尾プラグが存在または存在していたことを示す。粘膜バリアがない場合(図1B)、女性は交配していないか、交尾プラグがすでに脱落している可能性があります。
- 交尾の朝を e0.5 と呼びます。
注: C57BL6/J マウスでは、交尾プラグを識別するのが困難な場合があります。したがって、プラグが見られなかったにもかかわらず、マウスが交配することがあります。交尾は必ずしも概念につながるとは限りません。これは、C57BL6/Jマウスでしばしばより可能性が高い。したがって、体重の進行を監視して妊娠を確認する(ステップ1.4を参照)。重量を量るは妊娠している女性を識別し、プラグが受胎につながったことを確認するのに役立ちます。連続した夜のために女性を交配するとき注意してください。特定の男性が交尾プラグを製造するのが得意であることが観察された場合、その男性は同じ女性との連続した夜の交尾を信頼することができます。 - 彼らは正常に以前に繁殖されているように、証明されたブリーダーであるマウスでは、妊娠の可能性が高いことに注意してください。証明されたブリーダーを持っている可能性を高めるために、使用される男性はあまりにも古いであってはなりません。
- プラグアッセイに続いて、メスの重量を量る。この計量は、7-10日後にフォローアップする必要があります。体重増加が1.73gを超える場合、マウスは妊娠している可能性が高い20.体重増加が1.73gを下回る場合、妊娠とは無関係である可能性が高く、マウスは繁殖集団に再導入されるべきである。
注:C57BL6/Jマウスは小さなごみ(平均して5〜6個の胚)を生成します。妊娠を決定する方法の重量を量る大多数のために正確である。この方法を使用すると、12.8%の偽陽性率を提供し、実際に妊娠している女性の3%を除外します20.研究者が望ましい妊娠時間が後で起きることを心配している場合は、ステップ1.5に進みます。 - オプション: 解剖が行われる日は、物理的な検査によって妊娠が進行していることを確認します。尾のベースで女性をつかみ、体を伸ばします。これは、手首にマウスを置き、尾のベースを穏やかに引っ張ることによって行うのが最も簡単です。女性が妊娠している場合は、下胴体に特に体重増加が起こり、小さな塊として表示される可能性があります。
注:妊娠はe12.5の早い段階で触知可能であり、ほとんどの場合e14.5によって触知可能になります。C57BL6/Jマウスは小さなごみサイズを有するため、物理的な徴候がなくてもメスが妊娠している可能性がある。
2. 心臓回復のための雌と胚の解剖
- 解剖開始前に、室温で以下の溶液を調製する。
- 0.5mM濃度でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)を溶解します。
注:一度準備したら、氷の上に溶液を保持し、4°Cで使用することをお勧めします。汚染が懸念される場合は、使用前にオートクレーブする必要があります。 - パラホルムアルデヒド(PFA)を4%濃度でPBSに溶解します。
注:一度準備したら、氷の上に溶液を保持し、4°Cで使用することをお勧めします。長期保存のため、4 °C以上で保管してください。PFA溶液の濃度は、組織サンプルの下流の用途によって異なる場合があります。この割合は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、免疫体化学、および免疫蛍光染色に使用されます。
- 0.5mM濃度でリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)を溶解します。
- メスが望ましい妊娠段階に達したら、マウスは動物使用の承認されたガイドラインに従って正しい時刻に安楽死させるべきです。タイミングが半日(例えば、e15.5)にある場合、彼らは午後12時近くに犠牲にする必要があります。タイミングが丸い日(例えば、e15.0)にある場合は、午前12時近くに犠牲にする必要があります。
注:受胎は、マウスがペアになっている夜の真夜中近くに発生すると仮定されます。しかし、正確な受胎時刻を決定することは困難です。このため、タイミングは正確ではなく、推定されます。 - 4本の手足を固定した後、尿道の周りから胸骨に向かって始めて、胴体に沿ってI字型の切開を慎重に行います。
- 子宮は骨盤領域のすぐ上に位置する可能性が高い。マウスの子宮はY字型です。したがって、それは非常に長く、胴体の周りに巻かれる可能性があります。そっと持ち上げて取り外します。これは、スクープモーションで細かい鉗子の側面を使用して行います。子宮の表面組織は、最初に子宮を引き出すときに細かい鉗子の先端によって非常に慎重につかむことができる。はさみを使って子宮を体から切ります。
注意:子宮の異常なY字型を念頭に置いて、子宮全体が取り除かっていることを確認してください。 - 子宮を氷冷PBSに浸します。子宮の一方の端を固定し、それを単一のラインに伸ばします。
- 子宮を切り分け、各セクションには別々の胚が含まれる。細かい鉗子で胚をそっと剥がします。これは、各手の鉗子のペアで行うのが最も簡単です。取り除いたら、4°CのPBS-EDTA溶液で満たされた新しいペトリ皿にすぐに胚を入れます。
注: 通常の PBS ソリューションも使用できますが、EDTA はサンプルの凝固を防ぎます。 - テラー ステージング21を使用して胚をステージングします。ステージングは単一のごみ内の胚によって異なるため、個々の胚をステージングします。
注:これはまた、胚の可能性のある先天性心不全の先見性を提供することができます。典型的には、先天性心不全の症状は、胚形態において観察され得る。特定の心臓病に関連する他の主要な欠陥が存在し得ることが多い。 - 心臓は、胚の年齢に応じて様々な方法で除去され得る。
注:除去中に流出路がそのまま残るかどうかが不明な場合は、心臓よりも多くの組織を取り除くか(流出管をそのままにして心臓と鉗子の間の直接接触を最小限に抑える)か、胚全体を分析します。- 解剖スコープと2組の細かい鉗子を使用して、胚を背中に置き、胸部へのアクセスを安定させる。これは、鉗子で腕を固定するか、腕を取り外し、胴体を固定することによって行うことができます。
- 2番目の細い鉗子の鋭利な点を使用して、胚の胸骨に沿って切開を行い、鎖骨の間をへそまで伸ばします。胸腔の内側に向かって徐々に働きながら、非常に細かく表面的な切開を行うことによって開始します。心臓はかろうじて見えるようになるはずです。これらの表面的な切開の間に鉗子と接触させないでください。
- 最初の鉗子を使用してリブケージを開けて、胚の胴体を軽く絞り、リブケージに少し尾を引きます。心が飛び出すか、明らかになるはずです。心臓が出てくるには穏やかな同軸が必要な場合があります。鉗子の側面を使用して、鉗子のポイントが心臓と接触しないようにします。ワークスペースと鉗子を清潔に保つために、近くに糸くずのないワイプを保管してください。
- 静かに鉗子の側面で肺血管をつかみ、組織を切断しないようにし、胸腔から心臓を引き出します。それから、心臓をきれいにしなさい。
注:胚e13.5以下の場合、心臓は心膜で覆われています。これは心臓に到達するために削除する必要があります。
- ステレオスコープを使用して、後で参照するために心臓の写真を撮ります。
- 1-2分間PBS-EDTA溶液で心臓をすすいで、約45〜60分間PFA溶液に入れて固定します。胚全体の分析が望ましい場合は、一晩浸漬する。PFA溶液の体積は、固定される組織の体積の5〜6倍であるべきである。
注:この潜伏時間は、後の研究によって異なる場合があります。このインキュベーション時間は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、免疫染色、および免疫蛍光染色に使用されます。 - PBS-グリシン3xで5〜10分洗浄し、PBSに戻します。アジドナトリウムまたはペニシリン/ストレプトマイシンも、細菌の増殖を最小限に抑え、無傷の組織を保存するために添加することができる。心臓は4°Cで短期間保存できるようになりました。
3. 組織の準備
注:組織は、OCT(最適な切断温度)埋め込みまたはパラフィン埋め込みのいずれかを使用して調製することができます。どちらの方法にも長所と短所があり、どの埋め込み方法を使用するかを決定する際には、分析の目的を考慮する必要があります。
- OCT 埋め込み
注:この方法は、凍結細胞が抗原反応性を維持し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色に使用することができ、より速くスライスを生成することができるので、ホルマリン/パラフィン埋め込みよりも好ましい場合があります。- 30%(w/v)濃度でPBSに溶解したスクロースの溶液を調製する。
- 新しい15 mL円錐形チューブまたはPBS-30%スクロースを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに組織を移します。最初は、組織が浮かぶ。
- 冷蔵庫に4°Cに置きます。組織は、通常24〜40時間でチューブの底に沈むとき、OCT埋め込みの準備ができています。
注:筋肉組織は、凍結/解凍サイクル中に著しく苦しみ、ネイティブの形態を失います。スクロースは組織に吸収され、形態の保存を改善できる凍結保存剤として働く。組織の浮遊を十分に監視するのに十分な溶液がチューブに存在することを確認してください。PBS-スクロースは細菌で汚染されやすいので、真菌または細菌の過剰増殖を示す曇りがないか頻繁に溶液をチェックしてください。汚染のリスクを最小限に抑えるために、ペニシリン/ストレプトマイシンまたはアジドナトリウムのいずれかをPBSスクロース溶液に添加することができます。 - パスツールピペットで心臓を取り除き、ピペットの開口部が組織を引き裂かないように十分に広いかどうかを確認してください。必要に応じて、ピペットをはさみで切ります。胚全体を扱う場合は、鉗子を使用してサンプルを取り出します。
注:これを穏やかに行います。ピペットの開口部が心臓を取り出すのに十分な幅であっても、ピペットの縁は依然として組織を引き裂くことができる。鉗子は、あまりにも積極的に使用すると、組織サンプルをインデントすることができます。 - 糸くずのない拭き取りで組織を空気乾燥させます。サンプルをOCT金型に配置して、切断する所望の位置(すなわち、矢状、横、コロナ)に入れます。サンプルが完全に水没するまでOCT化合物を追加し、組織と接触する泡がないことを確認します。
- 金型を-20°Cで一晩または数日に置き、金型を-80°Cに移動します。24時間後、金型は凍結切断の準備ができています。この形式の組織は、長期保存することができる。
- パラフィン埋め込み
- エタノールを使用して、この連続して組織を脱水する:10分間50%エタノール、10分間70%エタノール、10分間80%エタノール、10分間95%エタノール、10分間100%エタノール(この3倍を行う)。
- この連続して一連のエタノール/キシレン溶液に組織を浸す:10-15分のための2:1エタノール/キシレン溶液、10-15分のための1:1エタノール/キシレン溶液、10-15分のための1:2エタノール/キシレン溶液、10-15分のための100%キシレン(この3xを行う)。
- キシレンをパラフィンに置き換えるには、 真空オーブン(54~58°C)に組織を浸し、2:1キシレン/パラフィン溶液を30分間、1:1キシレン/パラフィン溶液30分間、30分間1:2キシレン/パラフィン溶液、100%パラフィン100%パラフィン1〜2時間、100%パラフィン100%を1-2hまたは1-2hまたは1-2hで100%パラフィンします。
注:長期間にわたって60°Cを超えて組織を加熱すると、パラフィンポリマーが劣化し、組織が脆くなります。 - 新鮮なパラフィンを使用して、所望の位置に組織を埋め込む。
OCT 埋め込み組織のクライオスタット切除
- クライオスタットで、サンプルが-80°Cの冷凍庫に保存されていた場合は、すべてのサンプルを最低1時間内部に置きます。すべてのセクションが収集されるまで、そこに残る必要があります。
- クライオスタットが正しい温度設定になっていることを確認します。クライオスタット室内の環境温度は-20°C程度で、クライオスタットのアームは約-24°Cである必要があります。
注: この温度は、ブロックがスライスにどのように反応するかによって異なります。矛盾したスライスが問題である場合、環境の温度が下がる可能性があります。 - モールドの開いた側の端を引っ張って緩め、金型が狭くなる閉じた端でブロックを挟んで、その金型からOCTブロックを取り除きます。
- OCT ブロックを取り付けるには、室温 OCT をチャックの中央からエッジまで置きます。チャック全体を覆う必要はありません。
- OCT ブロック(ステップ 3.1 を参照)を金型に配置します。モールドの閉じた側に対してブロックのエッジがチャック上に向いている必要があります。チャックのOCTを白く不透明になるまで凍らせます( 5~10分程度。
- ブロックが腕の温度に来るように、さらに5〜10分間腕にチャックを置きます。平行スライスを取得するには、ブロックのエッジがステージに平行になるまでアームを調整し、ステージとブロックの下端の間の距離がステージとブロックの上端と同じになるまで調整します。
- ブレードを挿入し、ブレードからのブロックの距離を調整して、セクションを取ります。
- スライスを厚さ10μmで取り、対象点が手動で、またはトリム機能を使用するまでスライスし続けます。
- スライスを収集するには、小さなフラットペイントブラシとディテールブラシを使用します。金型がカットされ始めるときは、フラットブラシを使用して、スタンドに対してスライスをそっと引っ張ります。サンプルを切断する場合、速度はサンプルのハリに依存しますが、動きは連続的で一時停止する必要があります。
- スライスしながら、平らなブラシを使ってスライスを優しく導きます。スライスは、この時点でステージとフラッシュする必要はありませんので、涙や引っ張り、神学に影響を与えないようにビロウすることができます。
注:胚全体をスライスする場合、特に組織タイプを変更する場合、この部分は特に困難になる可能性があります。スライスが一時停止なしで作られ、ブラシがスライスをあまり積極的に引っ張らないようにしてください。組織の種類が変わると、スライスが壊れる可能性があるため、温度を冷たく保つことが重要です。破損が問題の場合は、温度を下げるか、サンプルの厚さを増やしてください。 - サンプルが完全に切り取られたが、スライスがまだブロックから解放されていない場合は、ブロックの動きを一時停止します。スライスからフラットブラシを動かさずに、ディテールブラシを使用してスライスを軽くたたき、平らにし、ステージに固定します。
- 詳細ブラシを取り外してスライスを仕上げる前に、〜10 sのスライスを保持します。2本のペイントブラシを使って、スライスをステージに対して優しく平らにし、転がりを防ぎ、〜20〜30sのステージに対して保持します。
- スライスを反転し、再びステージに対して平らにします。静電に帯電したスライドを、スライスが引き付けられるほど近くに移動し、スライドをステージに触れることなくスライドに付着させます。スライドに鉛筆でラベルを付けます。
- スライドを気密箱に保管して、保管中の氷の蓄積から組織を保護します。短期保存の場合、スライドは染色前に-20°Cで保存する必要があります。長期保存のため-80 °Cに保ちます。
5. パラフィン埋め込み組織用ミクロトーム切除
- サンプルを冷やすために、切り離す前に氷の上にブロックを置きます。冷やすと、パラフィンのスライスがより簡単になり、薄いスライスを生成することができます。
- 超純水を使用して40〜45°Cの水浴を準備します。
- ブレードをマイクロトーム内のホルダーに入れます。安全であることを確認し、クリアランス角度を設定します。クリアランス角度が正しいことを確認します。これは、製造元の指示に従って確認できます。
- パラフィンブロックをミクロトームに入れる。ブレードがブロック全体をまっすぐ切り取るように、正しい方向に設定されていることを確認します。
- 2、3枚のスライスを作って、ブレードがブロックと正しく向き合っていることを確認します。調整を行うことができるように、これを慎重に行います。
- 目的のポイントに到達するまでブロックをトリムします。
- 希望の厚さにスライスを作ります。最初の数個のスライスが破棄される可能性が高いことを考慮してください。
- セクションをピックアップし、鉗子を使用して水浴にそれらを移動します。これにより、セクションが平坦化されます。フォースを使用して、必要に応じて調整します。
- 静電に帯電したスライドを、スライスが引き付けられるほど近くに移動し、スライドに付着します。スライドに鉛筆でラベルを付けます。
- 収集したすべてのスライドをスライドラックに配置します。スライドを37°Cで一晩乾燥させます。
6. 組織の脱パラフィン
- スライドを次の順序で洗浄する:キシレン(2x)で3分、1:1キシレン/100%エタノール溶液で3分、100%エタノール(2x)で3分、エタノール95%で3分、エタノール70%で3分、50%エタノールで3分。
7. ヘマトキシリンとエオシン染色
- スライドを染色する準備をします。
- OCT調製組織を使用する場合は、OCTが溶解するまで蒸留水に約4分間浸漬し、乾燥させます。
- パラフィン埋め込み組織を使用する場合は、脱パラフィン化する必要があります。ステップ 6.1 を参照してください。
- 濾過された0.1%ヘマトキシリンにスライドを10分間入れ、蒸留水にスライドを入れ、水を1x直ちに交換し、3分後にもう一度交換します。
- スライドを0.5%のエオシンに10 sまたはディップ12倍に入れる。エオシンがストリークしなくなるまで、2〜3ディップ程度になるまで、蒸留水にスライドを浸します。
- 50%エタノールに10s、75%エタノールで10s、95%エタノールで30s、100%エタノールに浸して脱水し、キシレンが滑らかになるまでキシレンに浸し、〜5〜7ディップ。
- ガラスに近い屈折率を持つ迅速な乾燥型取り付け媒体で、キシレンを蒸発させ、取り付けます。
8. 一般的な心臓欠陥の定性的分析
- 反転またはステレオ顕微鏡とそのそれぞれのカメラを使用して、すべてのサンプルの画像を撮ります。分析される欠陥の種類に応じて、巨視的で顕微鏡的な画像を撮ります。マクロコピー画像は、10倍以下の倍率で撮影できます。顕微鏡画像は40倍以上の倍率で撮影する必要があります。この論文で撮影した写真は、逆顕微鏡を用いて、ステレオ顕微鏡と40倍の空気対物(レンズN.A.0.55)を用いて5倍の倍率で撮影した。
注: マクロコピー画像は心全体を見るため、出発点として適しています (図 3)。パターンが特定されると、特定の領域に焦点を当て、さらに調査することができます。 - コンピュータの画面上ですべての画像を並べて並べて表示します。画面の片側にコントロールサンプルのすべての画像と、画面の反対側に実験サンプルのすべての画像を持っています。一度に1つの治療グループを分析するのが最善です。
- 一般的な心臓の欠陥が起こる重要な領域から始まる、治療群間のフェノタイプの違いを探します。これは、画像が巨視的であるか、心臓の総解剖学を描写しているか、または心臓組織の顕微鏡解剖学を描写する顕微鏡的であるかどうかによって異なります。
- 心室中隔欠損(図2A)、心房中隔欠損(図2B)、および特許性動脈管(図2C)などの一般的な巨視的な心臓欠陥の探索を開始する。これらの欠陥のすべては、心臓の横方向のビューで最も容易に見られます。
- 中隔欠損を特定するには、複数のスライスを見ることを検討してください。
注:欠陥は中隔の欠如ではなく、中隔の穴である場合があります。したがって、裂け目を中隔欠陥と間違えないように注意してください。特定の領域内の近くのスライス間の一貫性を探すと、これが実際に欠陥か、スライスによる裂け目か確認できます。 - 特許管動脈管などの流出路の欠陥を特定するには、心臓を離れる主要な血管に従うために複数のスライスを使用します。互いに対する主要な血管のイメージを作成します。図2C に例を示します。
注:いくつかの不規則性は、胚の発達段階に起因する可能性があります(例えば、特許管動脈は出生後、出生直後に閉鎖され、心室中隔は〜e14.5まで完全に閉じません)。図に含まれていない他のいくつかの一般的な巨視的な心臓の欠陥には、永続的なトランカスアテレリオスが含まれており、e16.5以降で最も簡単に検出できます。心臓が流出路に入るスライスで検出することができる二重出口右心室(DORV)。そしてオーバーライドする大オルタ22.一般的な顕微鏡的な心臓の欠陥は、減少した筋肉圧圧を含む(図4)。
ヘマトキシリンとエオシン染色組織を用いた心筋圧着の定量的分析
- 染色された組織サンプルの巨視的な図(図4A)を用いて、40倍の倍率で対象となる領域を画像化する領域を特定する(図4B)。この論文では左心室の壁を用いた。目的の形式でイメージを保存します。このペーパーでは、イメージは .tif ファイルとして保存されました。
- イメージを ImageJ ソフトウェアで開きます。
- イメージを 8 ビットに設定します。これにより、画像は次のステップ23,24で閾値ツールを利用することができる。これを行うには、 "画像 |タイプ |8ビット"。
- 写真のしきい値を設定します。この手順の目的は、背景を表すピクセルのみを選択することです。
注: この表面積は後で減算されます。正しい閾値は、研究者が筋肉組織の表面積から除外したいピクセルを選択します。したがって、最後の結果は、グレースケールで組織を含める必要があり、背景が選択されます。- をクリックしてください "イメージJ |イメージ |調整 |しきい値".上部のバーを移動して、しきい値の調整を行います。目的のセクションが選択されたら、他の変更を行わずにしきい値調整ウィンドウを閉じます21.
- ポリゴン選択ツールを使用して、組織が占めるスペースを選択します。緩いトレースは誤った測定を提供するので、輪郭が組織の境界線をトレースすることを注意深く確認してください。
- ImageJ の測定設定を調整して、ソフトウェアはステップ 9.423のしきい値ツールを使用して選択したピクセルの領域のみを測定するようにします。イメージJ |分析 |測定の設定 |エリアとしきい値に制限 ".[範囲] と[しきい値に制限]のみを選択します。
- ハイライトされたピクセルの面積を測定します。イメージJ |分析 |".この値は、負のスペースの面積を表します。
- 対象地域全体の面積を測定します。これは、ポリゴン選択ツールを使用して選択された領域です。画像J |分析 |測定の設定 |エリア"。[領域のみ] を選択し、[しきい値に制限] をオフにします。次に、測定し、「イメージJ |分析 |".
- 実際の筋肉組織が対象領域内で占めている領域を計算します。対象領域全体の領域から負の領域を減算します。この値は、筋肉組織の領域です。
- マッスル圧縮指数(MCI)を計算します。筋肉組織の面積を対象領域の面積で割ります。
MCI 値が大きいほど、筋肉の圧縮が大きくなります。これらのMCI値は、治療群間の筋肉圧の有意な変化を検定するために統計分析に使用することができます(図4C)。
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Representative Results
筋肉圧指数は、コントロールと実験群の2つの異なる環境下で発達する心臓の間で比較された。これらのプロトコルは、筋肉組織の圧縮を定量的に分析するために使用され、統計的分析が可能であった。筋肉圧圧は、非実験的条件で発症した胚に対して実験心臓において有意に減少することが示された。
観察のタイミングが不正確に見える場合、胚は廃棄されました。胚の発育不伴は実験の治療の結果であり得るが、発達の進展には範囲があるが、繁殖は胚発生のタイミングを確保するために十分に間隔を空けた。胚のステージングは、Theiler Staging21を使用して行われました。サンプルは、スライスが一貫性を反映していない場合、または明らかな涙や折り目がある場合は、十分にスライスされていないと考えられていました。染色は組織の端を作るのに十分なコントラストを提供したが、細胞の特徴を区別できないほど暗くはなかった。その後、スライドを40倍の目的で反転顕微鏡で画像化した。MCI値は、イメージJソフトウェアとExcelを使用して計算されました。これらのMCI値はT検定を用いて分析した。
図1:プラグアッセイはC57BL6/Jマウスで結果を出す。(A) 容易に識別できる交尾プラグを持つマウス。(B) 交尾プラグのないマウス。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:一般的な心臓の欠陥。先天性心不全の真の予想形態の概略図。(A) 心室中隔欠損の横図。(B) 心房中隔欠損の横断的な見解。(C)特許性動脈管管管。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:e15.5心臓のヘマトキシリンおよびエオシン染色(A) 正常な条件下で発達したステンドハート。スケールバー= 750 μm(B) 実験条件下で発達したステンドハート。スケールバー= 750 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:通常の母性食下で発達した心臓と必須脂肪酸欠乏性の母親の食事の下で発症した心臓との間の筋肉圧入の定量的分析。(A)ヘマトキシリンとエオシンは巨視的な(5倍)の見解で心臓を染色した。スケールバー= 1,000 μm(B) 顕微鏡図でヘマトキシリンとエオシン染色された心臓 (40x)。スケールバー = 75 μm(C) 筋圧縮指数測定の結果データ。T検定を用いて値を分析した(n=4治療群あたり)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、胚性心臓における心臓発達の分析に関与する技術を探る。この方法のいくつかの制限は、準備技術に必要な物理的な器用さであり、練習を必要とし、顕微鏡イメージングを伴うスキルを有する。クライオスタットで得られたスライスが乱雑な場合、ヘマトキシリンとエオシン染色が明確でない場合、または顕微鏡で撮影した画像の照明が悪い場合、ImageJで使用される方法は機能しません。ImageJ ソフトウェアのしきい値機能の制限は、ピクセル値に応じてしきい値の一端に位置するピクセルを選択することです。したがって、しきい値の間違った側に存在するピクセルは、誤って計算に含まれるか除外されます。最終的には、調査で使用するプロトコルを採用するためにトラブルシューティングが必要になります。
心臓抽出が困難な場合は、ステップ2.8にスキップすることを検討してください。さらに、胸腔から心臓と肺以上のものを取り除くことを検討してください。その後、ターゲットはより大きく、操作しやすくなり、心臓と細かい鉗子との間の直接接触が最小限に抑えられます。クライオスタットの切り離し時、実験サンプルは常にコントロールサンプルと直接比較されます。これにより、すべてのサンプルでエラーが一貫している限り、ユーザー エラーの余地がいくらか得られます。ユーザーエラーを最小限に抑え、誤った結果を避けるために、両治療群から同等のセクションを取得するようにしてください。たとえば、複数の人がセクションを作成している場合、1 つのサブグループだけでなく、1 人の個人がコントロールとすべての治療グループのセクションを均等に作成することを確認します。最後に、ImageJ で画像をしきい値にする場合、しきい値ツールを使用して、組織を表すピクセルと、選択しないピクセルを選択する際に最大の自由度を設定できます。必要に応じて、画像のコントラストを調整して、組織のピクセル値から背景のピクセル値をさらに強めます。トラブルシューティングのオプションはありますが、この手法には高度なスキルが必要です。しかし、このプロトコルを実行すると、他の心臓発達研究では通常測定されないデータにアクセスできます。したがって、このプロトコルの機能を利用することは、科学的調査に大きく貢献する可能性があります。
心臓病研究における実験的治療の影響を特定することは、形態評価を通じてしばしば調査される。これは特に、胎盤が心臓の発達の生理学的特徴を測定することを困難にする発生生物学の場合です。したがって、心臓の機能に関する洞察を可能にする形態学的解析は、発生生物学研究の軌跡を劇的に変化させています。ほとんどの論文は心臓の厚さを分析して心臓の強さを決定するが、筋肉圧の直接測定は、発達中の哺乳類心臓25、26、27の生理学に関するさらなる洞察を提供することができる。
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Disclosures
著者らは報告する開示を持っていません。
Acknowledgments
アギーレ研究所は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464の下で、賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
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