Summary
我们提出了优化的串联质量标签 （TMT） 标签协议，其中包括以下每个步骤的详细信息：蛋白质提取、定量、沉淀、消化、标记、提交到蛋白质组学设施以及数据分析。
Abstract
蛋白体技术是强有力的方法论，通过提供疾病、治疗或其他疾病对整个蛋白体的影响的全球视图，帮助我们理解生物系统中的行动机制。本报告为蛋白质样品的提取、定量、沉淀、消化、标记和后续数据分析提供了详细的协议。我们优化的TMT标签协议要求降低标签标签浓度，并实现一致可靠的数据。我们使用这种协议来评估各种小鼠组织（即心脏、骨骼肌和大脑）以及体外培养的细胞中的蛋白质表达特征。此外，我们还演示如何从生成的数据集中评估数千种蛋白质。
Introduction
术语"蛋白质组学"最初被定义为细胞、组织或生物体1的整个蛋白质补充的大规模表征。蛋白质组分析能够研究与疾病发展、治疗途径和健康系统相关的机制和细胞过程，使用技术对蛋白质表达水平2进行相对定量。这些研究的初步描述发表于1975年，并证明使用二维多丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）用于此目的11，3。32D 方法基于电荷（异电聚焦、IEF）和分子质量（硫酸盐钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，或 SDS-PAGE）4分离蛋白质。多年来，对每种凝胶成分进行的2D-PAGE和随后的串联质谱法的组合是最常见的非靶点蛋白表达分析技术，并鉴定出许多以前未知的蛋白质表达特征55，6。62D-PAGE 方法的一般缺点是，它非常耗时，对疏水性蛋白质不能很好地工作，并且由于灵敏度低而,评估的蛋白质总数有局限性。
在细胞培养（SILAC）方法中，氨基酸的稳定同位素标记成为样品9中识别和量化蛋白质丰度的下一种流行方法。它包括细胞的代谢标记，这些细胞在介质中孵育，缺乏标准必需氨基酸，并辅以同位素标记版本的特定氨基酸10。该技术的优点是其效率和精确贴标9。SILAC方法的主要局限性主要是同位素标签的加入导致细胞生长速度降低，这在相对敏感的细胞系中特别具有挑战性，模拟人类疾病11。
2003年，一种新颖而强大的蛋白质组学技术，涉及串联质量标签（TMT）等baric标签，被引入领域12。TMT标签是一种强大的方法，由于其对检测相对蛋白质表达水平和翻译后修饰的敏感性提高了13。截至本发布日期，TMT 套件已开发，可同时标记 6、10、11 或 16 个样品。因此，可以同时测量多条件下的肽丰度，同时进行生物复制14、15、16。14,15,16我们最近使用TMT来描述巴思综合症（BTHS）17小鼠模型的心脏蛋白体剖面。17在此过程中，我们能够证明接受基因治疗治疗的BTHS小鼠的心脏状况得到了广泛的改善，并识别了受BTHS影响的新蛋白质，这些蛋白质揭示了心肌病中涉及的新治疗途径。
在这里，我们描述了一种使用组织样本或细胞颗粒进行多路复用TMT定量蛋白质组学分析的详细方法。在提交到核心之前进行样品制备和标记可能是有益的，因为标记的试血肽比原始冷冻样品更稳定，并非所有核心都有处理所有样品类型的经验，实验室中制备样品可以节省内核时间，而核心通常存在长时间的积压。有关该过程的质谱部分的详细描述，请参阅基尔申鲍姆等人和佩鲁马尔等人18、19。,19
样品制备协议包括以下主要步骤：提取、定量、沉淀、消化和标记。这种优化的协议的主要优点是，它降低了标签成本，改善了蛋白质提取，并持续生成高质量的数据。此外，我们还描述了如何在短时间内分析 TMT 数据以筛选数千种蛋白质。我们希望，该议定书鼓励其他研究团体考虑将这一强有力的方法纳入其研究。
Protocol
佛罗里达大学的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物研究。
1. 试剂的制备
- 准备 CHAPS Lysis 缓冲液（150 mM KCl，50 mM HEPES pH = 7.4，0.1% CHAPS，每 50 mL 缓冲 1 片蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）。不含蛋白酶抑制剂的缓冲剂可在4°C下储存长达6个月，或将蛋白酶抑制剂储存在-20°C至1年。
- 制备100 mM三聚二苯甲酸酯（TEAB）：将500μL的1MTEAB添加到4.5mL的超纯水。
- 准备200 mM三分（2卡盒叶）磷酸（TCEP）：将70μL的0.5M TCEP（变性试剂）添加到70μL的超纯水。然后加入35μL的1MTEAB。
- 制备 5% 羟基胺：将 50 μL 的 50% 羟基胺添加到 450 μL 的 100 mM TEAB。
2. 蛋白质提取
- 根据 IACUC 批准的协议，将四头肌与安乐死小鼠分离。冻结并保持在-80°C或继续协议立即使用。
- 切切分离约10毫克的新鲜或冷冻四头肌小鼠组织。使用骨骼肌时使用钳子分离纤维。或者，如果使用细胞培养，在 CHAPS 赖塞缓冲液的 300 μL 中重新挂起 ±3 x 106细胞，然后跳到步骤 2.4。
- 使用 2 mL 管将组织均匀化，管中填充约 200 μL 的 1 mm 硅珠/硅珠和 500 μL 的 CHAPS 水成石解缓冲液。根据需要向上或向下缩放（例如，在 250 μL 的 CHAPS 乳液缓冲液中 5 毫克的组织）。
- 执行声波（10倍，每10秒，50%振幅和30秒的冰间隔），释放与DNA结合的蛋白质。通过将水化酶通过连接到1 mL注射器的21 G针头传递10倍，或者通过37°C的苯酶孵育（44 U/mL）30分钟，可以实现相同的DNA降解结果。
- 在4°C下将水清液在16，000 x g下离心10分钟，并将上清液转移到新的离心管。
3. 蛋白质测量
- 使用已建立的协议确定上清剂的蛋白质浓度（参见材料表）。
注：最好在 ±2 μg/μL 下使用样品，但也可以使用浓度较低的样品。如果使用浓度较低的样品，则需要在步骤 5.1 中适当调整还原/烷化试剂的体积。 - 使用 CHAPS 水合液缓冲液准备 BSA 标准曲线稀释。
- 按照制造商的说明操作，15 分钟后，在 750 nm 处读取吸光度。
4. 减少/烷基化试剂处理
- 将每个条件200μg的蛋白质转移到新的离心管中，并使用CHAPS乳液缓冲液调整到最终体积为100μL。当蛋白质浓度过低时，可以扩展到200μL，但不要忘记适当调整还原/烷化试剂的体积。
- 加入5 μL的200 mM TCEP，并在55°C下孵育样品1小时。
- 在使用前，立即将一管碘酰胺（即9毫克）溶解到132 μL的100 mM TEAB中制备375 mM碘酰胺。保护此解决方案免受光照。
- 在样品中加入5μL的375 mM碘酰胺，并在室温（RT）保护下孵育30分钟。
5. 甲醇/氯仿降水20
- 在每个100μL的蛋白质和短暂涡旋样品中加入400μL甲醇。
- 在 RT 时在 9，000 x g时离心 10 s。这是结合液体沉积在样品管的两侧。
- 在混合物中加入100μL氯仿，并短暂涡旋。如果样品的磷脂浓度较高，请使用200μL的氯仿。
- 在 RT 时在 9，000 x g时离心 10 s。这是结合液体沉积在样品管的两侧。
- 大力加入300μL的水和涡流。获得同质解决方案非常重要。
- 在 RT 处，在 9，000 x g处离心 1 分钟，在将管转移到机架时，请格外小心，以免干扰层。
注：管子现在应该包含三个阶段：1）顶层（即上清），水和甲醇的混合物;2）中间层（即相间），白色沉淀蛋白;和3）底层（即底部相），氯仿。 - 小心地取出上清液。
- 在剩余的相位和底部相中加入300μL甲醇。漩涡大力。
- 在 RT 处，在 9，000 x g处离心 2 分钟，在将管转移到机架时，请格外小心，避免干扰层。
- 小心地取出上清液。
- 在 RT 处在气流下（例如，使用真空集中器）轻轻吸气尽可能多的液体，直到颗粒稍微潮湿（约 10 分钟）。由于每个样本的必要时间可能不同，请每 2 分钟检查一次以评估。将颗粒储存在-80°C，直到进一步加工。
6. 蛋白质消化
- 在TEAB赖塞缓冲液的100μL中重新悬浮沉淀蛋白颗粒。
注：在此步骤中测量蛋白质浓度是可选的。 - 在使用前，立即制备1 μg/μL胰蛋白酶，在100μg胰蛋白酶玻璃瓶底部加入100μL的胰蛋白酶储存溶液（50 mM醋酸），并在RT储存剩余试剂中孵育5分钟，一次性剂量为-80°C。
- 每100 μg蛋白质加入2.5μL的胰蛋白酶。在37°C下通宵消化样品。此步骤对于蛋白质的完全溶解至关重要;不要修改这些条件。消化后，使用标准蛋白质测定测量蛋白质浓度是可选的。
7. 肽标签
- 在使用前，将 TMT 标签套件试剂与 RT 进行平衡。
- 通过在每个管中添加41μL的无水乙酰甲酸酯，溶解每个0.8mg TMT标签小瓶。在 RT 孵化试剂 5 分钟，偶尔进行旋涡。暂时使管离心。
注：0.8mg TMT 标签的浓度通常足以标记两组。然而，其他调查人员已经证明，这种浓度可以进一步降低，仍然产生可靠的数据15。 - 小心地将 41 μL 的 TMT 标签试剂添加到每个 100 μL 样品中。
- 在 RT 处孵化反应 1 小时。
- 在样品中加入8μL的5%羟基胺，孵育15分钟以淬火反应。
- 将样品分成相同数量的新离心管，储存在-80°C。
注：在此步骤中，样品是稳定的，可以提交进行质谱。使用标准蛋白质测定来测量浓度是可选的。
8. 质谱
- 将样品提交到蛋白质组学设施（本研究使用 UF ICBR 蛋白质组学核心设施），其中所有样本都使用 C18 旋转柱进行组合和纯化。
注：与核心设施讨论如何在准备样品之前提交样品，以确认他们喜欢提交的具体步骤。 - 请求每个组合多路复用样品的以下程序：固相提取、HPLC（SCX、SE）、拉链笔尖和LC-MS/MS（蛋白质 ID的2小时梯度，如果 >10QE Plus）。
- 收集数据后，核心设施将使用供应商提供的蛋白质识别软件处理 RAW 文件。
9. 数据分析
- 数据通常以 7z 格式从内核返回用户，每个数据集可能需要大约 16 GB 的磁盘空间（在本例中为 11 个示例）。对于数据处理，请确保计算机可用时至少为 3.4 GHz。
- 使用 7-Zip 文件管理器提取文件。这些提取的文件包含 RAW 数据、pdStudy 格式文件和 pdResultView 格式文件。保存所有文件以进行进一步分析。
- 使用 Proteome 发现 2.2 软件打开文件。
注： 文件格式为"文件名.pd研究"。如果打开"文件名.pdResultView"，则无法选择控制示例。 - 在"样本"面板上选择控制样本。
- 通过在"分析结果"面板上选择ID打开结果。
- 导出到电子表格软件。
- 保存原始数据（识别的所有蛋白质）。
- 打开电子表格软件文件。这将包含所有已识别的蛋白质。
- 在电子表格软件文件中，使用"过滤器"功能来筛选"蛋白质 FDR 置信度：组合"在高（列 B）中，"#Unique肽"高于2（列 K），以及其中一个"丰度比"仅空白（列 S到W）。
- 使用 函数插入用于"p 值"计算的列
*TTEST（对照组、实验组、尾部、类型） - 插入具有函数的"统计意义"列
*IF（p-值<0.05，"显著性"，"NS"） - 使用"过滤器"功能筛选"统计意义"，显示"显著性"。结果表明，分析的蛋白质在对照组和实验组具有统计学意义。
- 与对照组相比，确定实验组中蛋白质表达丰度明显高于或较低，插入具有功能的"调节"列
*IF（控制组）>AVERAGE（实验组），"向上管制"，"放松"）
10. 评估重大点击数的方法
- 要识别 TMT 研究中确定的重要命中之间的蛋白质-蛋白质相互作用，请使用搜索工具检索相互作用的基因/蛋白质 （STRING） 版本 11.021 ：https://string-db.org/
- 要按组（即分子功能、生物过程和蛋白质类）分类，请使用蛋白质分析通过进化关系（PANTHER）本体分类软件22：http://www.pantherdb.org/ http://www.pantherdb.org/
- 要识别各种途径中的蛋白质相互作用，请使用通路分析软件23。
11. 将蛋白酶数据上载到存储库银行
- 要将蛋白质组数据提交到蛋白质组学 IDENTicantions 数据库 （PRIDE） 或质谱交互式虚拟环境 （MassIVE） 包括以下信息：峰值列表文件（以标准格式（如 mzXML）处理的频谱文件， mzML，或MGF），结果文件（频谱识别的标准格式，如mzIdentML或mzTab），和原始频谱文件（原始质量谱文件在非标准或仪器特定的格式，如。RAW 文件或 。WIFF 文件）。
- 要提交，请创建一个帐户，并包含关联和项目详细信息等信息。然后，选择步骤 11.1 中列出的文件并上载它们。
- 要创建官方数据集，请对这些上载的文件运行提交工作流。
注： 提交后，数据集将在存储库库中为私有。使用私有选项，数据仅对授权用户可用。还有两个附加选项：1） 共享数据集，它允许访问日记审阅者和协作者;1） 共享数据集，允许访问日志审阅者和协作者;1） 共享数据集，允许访问日志审阅者和协作者;或 2） 公共数据集，该数据集将显示在公共数据集搜索中。这些存储库的另一个重要功能是能够更新上载的数据并将后续发布与现有数据集相关联。
Representative Results
健康和病变细胞被解解在CHAPS缓冲液中，按照我们的TMT标签方法详细准备，并提交给佛罗里达大学生物技术研究跨学科中心（UF-ICBR）蛋白质组学核心，用于液体色谱，并结合质谱。从核心采集和传递数据后，数据集在供应商提供的软件中打开，并应用了以下截止滤波器：#2独特的肽，报告离子，每个蛋白质样本存在于所有通道，并只包括显著改变的蛋白质（p = 0.05）。表1汇总了数据：共39，653种肽，其中7，211种具有等于或大于两种独特的肽，3，829种包括所有通道的记者离子。这3，829个肽的p值是由学生的t测试计算的，p = 0.05被认为是显著的。此外，使用折叠变化截止来确定与健康细胞相比，患病蛋白质的相对分布：下管制（蓝色）或上调节（红色）（图1）。
使用PANTHER本体分类系统和STRING分析评估了明显营养不良的蛋白质表达列表。黑豹分析显示，基于显著降低（图2A）或基于分子功能的病变细胞中较高的丰度（图2B），对蛋白质的分类清单。对蛋白质的串分析（图2C）和更高（图2D）的丰度识别了蛋白质之间的多重相互作用和强关联。
图1：火山图显示蛋白质的丰度没有显著变化（黑色），显著降低（蓝色），或显著增加（红色）在疾病和健康控制细胞。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：代表评估显著营养不良的命中由PANTHER（A，B）和字符串（C，D）识别显著低或更高的丰度蛋白质。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 肽总数 | 已识别总数 | • 2种独特的肽 | 定量蛋白质 | 显著改变的蛋白质 | |
| 低 | 高 | ||||
| 39653 | 7211 | 4457 | 3829 | 296 | 108 |
表1：每个数据集分析的量化蛋白质的代表性表。
Discussion
为了使用基于TMT的同位素稳定同位素标记方法成功地制备样品进行蛋白体分析，在4°C下非常小心地提取蛋白质，并使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒24，25,25的解毒液缓冲液至关重要。蛋白酶抑制剂鸡尾酒是避免蛋白质消化过程中意外蛋白质降解的关键试剂。我们的协议与供应商提供的当前协议之间的一个关键区别是，我们强烈建议根据我们对哺乳动物细胞和组织的经验使用 CHAPS 赖塞缓冲液。我们还建议对细胞颗粒和组织使用甲醇/氯仿蛋白沉淀方法。
理想情况下，蛋白质提取、测量、还原/烷化试剂处理和甲醇/氯仿沉淀均在同一天进行。遵循这项建议将导致更准确的蛋白质浓度，以便随后进行贴标。蛋白质沉淀步骤对于去除干扰串联质谱的试剂非常重要。包括降水步骤大大提高了TMT26的分辨率。总之，我们的TMT协议的主要优点是针对不同类型的样品的高标签效率、其可重复性以及获得可靠的数据。
随着TMT非靶向蛋白质组学策略的多重性质不断扩大，它将逐步提高不同领域研究人员进行新发现的能力。特别是在生物医学领域，我们和其他人发现，在探索疾病新作用机制和各种治疗药物的相对影响的研究中，这项技术的信息越来越丰富。出于所有这些原因，这一强大的技术补充了现代研究中使用的其他OMICS方法，并提供了能够指导进一步治疗发展的关键信息。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢UF-ICBR蛋白质组学处理我们的样品的设施。这项工作得到了国家卫生研究院R01 HL136759-01A1（CAP）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL | Thermo Fisher | 90114 | Reagent for protein labeling |
| 50% Hydroxylamine, 5 mL | Thermo Fisher | 90115 | Reagent for protein labeling |
| Acetic acid | Sigma | A6283 | Reagent for protein digestion |
| Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51101 | Reagent for protein labeling |
| Benzonaze nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNA shearing |
| Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL | Thermo Fisher | 77720 | Reagent for protein labeling |
| BSA standard | Thermo | 23209 | Reagent for protein measurement |
| CHAPS | Thermo Fisher | 28300 | Reagent for protein extraction |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | Reagent for protein precipitation |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 4693132001 | Reagent for protein extraction |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Reagent for protein measurement |
| Excel | Microsoft Office | Software for data analyses | |
| Heat block | VWR analog | 12621-104 | Equipment for protein digestion incubation |
| HEPES | Sigma | RDD002 | Reagent for protein extraction |
| Methanol | Fisher | A452-4 | Reagent for protein precipitation |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher | 90058 | Reagent for protein digestion |
| Potassium chloride | Sigma | 46436 | Reagent for protein extraction |
| Sigma Plot 14.0 | Sigma Plot 14.0 | Software for data analyses | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB120 | DNA shearing |
| Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform | Molecular Devices | Plate reader for protein measurement | |
| Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Reagent for protein measurement |
| Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay | Thermo Fisher | 23290 | Reagent for protein measurement |
| Thermo Scientific Proteome Discoverer Software | Thermo Fisher | OPTON-30945 | Software for data analyses |
| TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment | Thermo Fisher | 90110 | Reagent for protein labeling |
| TMT11-131C Label Reagent 5 mg | Thermo Fisher | A34807 | Reagent for protein labeling |
| Water, LC-MS Grade | Thermo Fisher | 51140 | Reagent for protein extraction |
References
- Graves, P. R., Haystead, T. A. Molecular biologist's guide to proteomics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1), 39-63 (2002).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample Preparation for Relative Quantitation of Proteins Using Tandem Mass Tags (TMT) and Mass Spectrometry (MS). Methods in Molecular Biology. 1741, 135-149 (2018).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. Journal of Biological Chemistry. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Rabilloud, T., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: a tutorial. Journal of Proteomics. 74 (10), 1829-1841 (2011).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Anderson, N. G., Anderson, N. L. Twenty years of two-dimensional electrophoresis: Past, present and future. Electrophoresis. 17 (3), 443-453 (1996).
- Haynes, P. A., Yates, J. R.
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Sury, M. D., Chen, J. X., Selbach, M. The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (10), 2173-2183 (2010).
- Zhang, G., Neubert, T. A. Use of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) for phosphotyrosine protein identification and quantitation. Methods in Molecular Biology. 527, 79-92 (2009).
- Wang, X., et al. SILAC-based quantitative MS approach for real-time recording protein-mediated cell-cell interactions. Scientific Reports. 8 (1), 8441 (2018).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).
- Cheng, L., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Peptide Labeling Using Isobaric Tagging Reagents for Quantitative Phosphoproteomics. Methods in Molecular Biology. 1355, 53-70 (2016).
- Navarrete-Perea, J., Yu, Q., Gygi, S. P., Paulo, J. A. Streamlined Tandem Mass Tag (SL-TMT) Protocol: An Efficient Strategy for Quantitative (Phospho)proteome Profiling Using Tandem Mass Tag-Synchronous Precursor Selection-MS3. Journal of Proteome Research. 17 (6), 2226-2236 (2018).
- Zecha, J., et al. TMT Labeling for the Masses: A Robust and Cost-efficient, In-solution Labeling Approach. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
- Bachor, R., Waliczek, M., Stefanowicz, P., Szewczuk, Z. Trends in the Design of New Isobaric Labeling Reagents for Quantitative Proteomics. Molecules. 24 (4), E701 (2019).
- Suzuki-Hatano, S., et al. AAV9-TAZ Gene Replacement Ameliorates Cardiac TMT Proteomic Profiles in a Mouse Model of Barth Syndrome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 13, 167-179 (2019).
- Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (40), e1954 (2010).
- Perumal, N., et al. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. Journal of Visualized Experiments. (144), e59140 (2019).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138, 141-143 (1984).
- Jensen, L. J., et al. STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Research. 37, D412-D416 (2009).
- Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
- Cirillo, E., Parnell, L. D., Evelo, C. T. A Review of Pathway-Based Analysis Tools That Visualize Genetic Variants. Frontiers in Genetics. 8, 174 (2017).
- Plaxton, W. C. Avoiding Proteolysis during the Extraction and Purification of Active Plant Enzymes. Plant and Cell Physiology. 60 (4), 715-724 (2019).
- Ryan, B. J., Henehan, G. T. Protein Chromatography: Methods and Protocols. Walls, D., Loughran, S. T. , Springer. New York. 53-69 (2017).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
