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Biochemistry

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Published: June 8, 2020 doi: 10.3791/60970
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of Florida

Summary

हम एक अनुकूलित टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक के लिए विस्तृत जानकारी शामिल है: प्रोटीन निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग, एक प्रोटेओमिक्स सुविधा के लिए प्रस्तुत करना, और डेटा विश्लेषण।

Abstract

प्रोटेओमिक प्रौद्योगिकियां शक्तिशाली तरीके हैं जो पूरे प्रोटेम पर रोग, उपचार या अन्य स्थिति के प्रभाव का वैश्विक दृष्टिकोण प्रदान करके जैविक प्रणालियों में कार्रवाई के तंत्र की हमारी समझ को सहायता कर सकती हैं। यह रिपोर्ट प्रोटीन नमूनों के निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन, लेबलिंग और बाद में डेटा विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है। हमारे अनुकूलित टीएमटी लेबलिंग प्रोटोकॉल के लिए कम टैग-लेबल एकाग्रता की आवश्यकता होती है और लगातार विश्वसनीय डेटा प्राप्त होता है। हमने विभिन्न प्रकार के माउस ऊतकों (यानी दिल, कंकाल मांसपेशी और मस्तिष्क) के साथ-साथ विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि परिणामी डेटासेट से हजारों प्रोटीन का मूल्यांकन कैसे किया जाता है।

Introduction

"प्रोटेओमिक्स" शब्द को पहले कोशिका, ऊतक या जीव1के पूरे प्रोटीन पूरक के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के रूप में परिभाषित किया गया था। प्रोटेओमिक विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर2के सापेक्ष मात्रा प्रदर्शन करने के लिए तकनीकों का उपयोग करके रोग विकास, चिकित्सीय रास्ते और स्वस्थ प्रणालियों में शामिल तंत्र और सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच को सक्षम करते हैं। इस तरह के अध्ययनों के प्रारंभिक विवरण 1 9 75 में प्रकाशित किए गए थे और इस उद्देश्य1,,3 के लिए दो-आयामी पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2डी-पेज) के उपयोगकाप्रदर्शन किया। 2डी विधि चार्ज (आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग, आईईएफ) और आणविक द्रव्यमान (सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, या एसडीएस-पेज)4के आधार पर प्रोटीन को अलग करती है। वर्षों के लिए, प्रत्येक जेल घटक पर किए गए 2D-PAGE और बाद में मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का संयोजन सबसे आम अलक्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तकनीक थी और कई पहले से अज्ञात प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल5,,6की पहचान की गई थी। 2D-PAGE दृष्टिकोण के सामान्य नुकसान यह हैं कि यह समय लेने वाला है, हाइड्रोफोबिक प्रोटीन के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है, और कम संवेदनशीलता7,,8के कारण मूल्यांकन किए गए प्रोटीन की कुल संख्या में सीमाएं हैं।

सेल कल्चर (SILAC) विधि में अमीनो एसिड द्वारा स्थिर आइसोटोप लेबलिंग नमूनों9में प्रोटीन बहुतायत की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए अगला लोकप्रिय दृष्टिकोण बन गया। इसमें कोशिकाओं की मेटाबोलिक लेबलिंग होती है जो मध्यम में एक मानक आवश्यक अमीनो एसिड की कमी होती है और उस विशिष्ट अमीनो एसिड10के आइसोटोप लेबल वाले संस्करण के साथ पूरक होती है। इस तकनीक का लाभ इसकी दक्षता और सटीक लेबलिंग9है । SILAC दृष्टिकोण के लिए मुख्य सीमा मुख्य रूप से कम सेल विकास दर आइसोटोप लेबल समावेश की वजह से है, जो विशेष रूप से अपेक्षाकृत संवेदनशील सेल लाइनों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है मानवरोगों मॉडलिंग 11।

2003 में, एक उपन्यास और मजबूत प्रोटेओमिक्स तकनीक जिसमें टैंडेम मास टैग (टीएमटी) आइसोबेरिक लेबल शामिल हैं, जिसे12क्षेत्र में पेश किया गया था। टीएमटी लेबलिंग एक शक्तिशाली तरीका है क्योंकि इसकी बढ़ी हुई संवेदनशीलता है ताकि सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और पोस्टट्रांसलेशनलसंशोधनों कापता लगाया जा सके । इस प्रकाशन की तारीख के रूप में, टीएमटी किट विकसित की गई है जो एक साथ 6, 10, 11 या 16 नमूनों को लेबल कर सकती है। नतीजतन,14,,15,,16में जैविक प्रतिकृति के साथ कई परिस्थितियों में पेप्टाइड बहुतायत को मापना संभव है। हमने हाल ही में बार्थ सिंड्रोम (बीटीटीएस)17के माउस मॉडल के कार्डियक प्रोटेओमिक प्रोफाइल की विशेषता के लिए टीएमटी का उपयोग किया था। ऐसा करने में, हम जीन थेरेपी के साथ इलाज BTHS चूहों के हृदय प्रोफाइल में व्यापक सुधार प्रदर्शित करने में सक्षम थे और BTHS द्वारा प्रभावित उपन्यास प्रोटीन की पहचान है कि उपन्यास चिकित्सकीय कार्डियोमायोपैथी में शामिल रास्ते से पता चला ।

यहां, हम ऊतक नमूनों या सेल छर्रों का उपयोग करमल्टीप्लेक्स टीएमटी मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह नमूना तैयारी और लेबलिंग एक कोर करने के लिए प्रस्तुत करने से पहले प्रदर्शन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है क्योंकि लेबल ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स कच्चे जमे हुए नमूनों की तुलना में अधिक स्थिर हैं, नहीं सभी कोर सभी नमूना प्रकार से निपटने का अनुभव है, और एक प्रयोगशाला में नमूने तैयार करने कोर के लिए समय बचा सकता है, जो अक्सर लंबे बैकलॉग है । इस प्रक्रिया के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी भाग के विस्तृत विवरण के लिए कृपया किरशेनबॉम एट अल और पेरुमल एट अल18,,19देखें।

नमूना तैयारी प्रोटोकॉल में निम्नलिखित प्रमुख कदम होते हैं: निष्कर्षण, मात्रा, वर्षा, पाचन और लेबलिंग। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के प्रमुख लाभ यह हैं कि यह लेबलिंग की लागत को कम करता है, प्रोटीन निष्कर्षण में सुधार करता है, और लगातार उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करता है। इसके अलावा, हम कम समय में हजारों प्रोटीन को स्क्रीन करने के लिए टीएमटी डेटा का विश्लेषण करने का वर्णन करते हैं। हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल अन्य शोध समूहों को अपने अध्ययन में इस शक्तिशाली पद्धति को शामिल करने पर विचार करने के लिए प्रोत्साहित करता है ।

Protocol

फ्लोरिडा विश्वविद्यालय से संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति सभी पशु अध्ययन को मंजूरी दे दी ।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. चैप्स लाइस बफर (150 एमएम केसीएल, 50 एमएम एचईपीई पीएच = 7.4, 0.1% चैप्स, और 1 प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल टैबलेट प्रति 50 मीटर बफर) तैयार करें। प्रोटीज़ अवरोधकों के बिना बफर को 6 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्रोटीज़ अवरोधक के साथ बफर किया जा सकता है।
  2. 100 mM ट्राइथेलम्मोनियम बाइकार्बोनेट (टीईबी) तैयार करें: अल्ट्राप्यूरी पानी के 4.5 एमएल में 1 एम टीईबी के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  3. अल्ट्राप्योर पानी के 70 माइक्रोन एजेंट के लिए 0.5 एम टीसीईपी, एक डेनट्यूरिंग रिएजेंट के 70 माइक्रोन जोड़ें 200 एमएम ट्रिस (2-कार्बोस्टेथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड ( टीसीईपी) तैयार करें। इसके बाद 1 एम टीईबी के 35 माइक्रोन डालें।
  4. 5% हाइड्रोक्सीलामाइन तैयार करें: 100 एमएम टीईबी के 450 माइक्रोन में 50% हाइड्रोक्सिलमाइन का 50 माइक्रोन जोड़ें।

2. प्रोटीन निकालने

  1. एक IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार एक इच्छामृत्यु माउस से क्वाड्रिसेप्स मांसपेशी को अलग करें। फ्रीज और बनाए रखने -80 डिग्री सेल्सियस या तत्काल उपयोग के लिए प्रोटोकॉल के साथ जारी है।
  2. लगभग 10 मिलीग्राम ताजा या जमे हुए क्वाड्रिसेप्स माउस ऊतक को अलग करने के लिए कट करें। कंकाल की मांसपेशियों के साथ काम करते समय चिमटी का उपयोग करके अलग फाइबर। वैकल्पिक रूप से, यदि सेल संस्कृतियों के साथ काम कर रहे हैं, तो चैप्स लिसिस बफर के 300 माइक्रोन में ~ 3 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 2.4 कदम उठाने के लिए छोड़ दें।
  3. 1 मिमी जिरकोनिया/सिलिका मोतियों के लगभग 200 माइक्रोन से भरे 2 एमएल ट्यूबों का उपयोग करके एक मनका बाधित का उपयोग करके ऊतकों को समरूप करें और चैप्स लिसिस बफर के 500 माइक्रोन। उपयुक्त के रूप में ऊपर या नीचे स्केल (जैसे, CHAPS lysis बफर के 250 μL में ऊतक के 5 मिलीग्राम) ।
  4. डीएनए से बंधे प्रोटीन को जारी करने के लिए ध्वनि (10 एस के लिए 10x 50% आयाम और बर्फ पर 30 एस अंतराल के साथ) करें। एक ही डीएनए क्षरण परिणाम या तो सिरिंज lysis के साथ एक 21 जी एक 1 मिलीग्राम सिरिंज से जुड़ी सुई के माध्यम से lysate 10x गुजर रहा है, या बेंजोनेस इनक्यूबेशन (४४ U/mL) द्वारा 30 डिग्री सेल्सियस के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त किया जा सकता है ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर lysate और एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण।

3. प्रोटीन माप

  1. स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अधिनेत की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: यह सबसे अच्छा है ‧2 μg/μL पर नमूनों का उपयोग करें, लेकिन कम केंद्रित नमूनों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि कम केंद्रित नमूना का उपयोग किया जाता है तो चरण 5.1 में कम करने/एल्किलैटिंग अभिकर्ताओं की मात्रा को उचित रूप से समायोजित करना आवश्यक होगा।
  2. चैप्स लाइस बफर का उपयोग करके बीएसए मानक वक्र कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करें, और 15 min के बाद, 750 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।

4. रिएजेंट उपचार को कम करना/अल्किलेटिंग

  1. प्रति कंडीशन 200 माइक्रोन प्रोटीन को एक नई सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और चैप्स लाइसिस बफर का उपयोग करके 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में समायोजित करें। प्रोटीन एकाग्रता बहुत कम होने पर 200 माइक्रोन तक स्केल करना संभव है, लेकिन कम करने/अल्कालैटिंग रिएजेंट की मात्रा को उचित रूप से समायोजित करना न भूलें।
  2. 200 एम टीसीईपी के 5 माइक्रोन जोड़ें और 1 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट सैंपल डालें।
  3. उपयोग करने से तुरंत पहले, 100 एमएम टीईबी के 132 माइक्रोन में आयोडोसेटामाइड (यानी 9 मिलीग्राम) की एक ट्यूब को भंग करके 375 एमएम आईओडोएसेटामाइड तैयार करें। इस समाधान को प्रकाश से बचाएं।
  4. नमूने में 375 mM iodoacetamide के 5 μL जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) प्रकाश से संरक्षित पर 30 min के लिए इनक्यूबेट।

5. मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म वर्षा20

  1. प्रोटीन के प्रत्येक 100 μL और संक्षेप में भंवर नमूनों में मेथनॉल के 400 माइक्रोन जोड़ें।
  2. आरटी में 10 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। यह नमूना ट्यूब के किनारों पर जमा तरल पदार्थ को शामिल करने के लिए है।
  3. मिश्रण में क्लोरोफॉर्म के 100 माइक्रोन जोड़ें और संक्षेप में भंवर करें। यदि नमूने में फॉस्फोलिपिड की अधिक सांद्रता है तो क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोन का उपयोग करें।
  4. आरटी में 10 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। यह नमूना ट्यूब के किनारों पर जमा तरल पदार्थ को शामिल करने के लिए है।
  5. इसमें 300 माइक्रोन पानी और भंवर जोर-जोर से डालें। समरूप समाधान प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
  6. आरटी में 1 मिनट के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें ट्यूब को रैक में स्थानांतरित करते समय परतों को परेशान करने से बचने के लिए बेहद सावधान रहें।
    नोट: ट्यूब में अब तीन चरण होने चाहिए: 1) शीर्ष परत (यानी, अलौकिक), पानी और मेथनॉल का मिश्रण; 2) मध्य परत (यानी, इंटरफेज), सफेद उपजी प्रोटीन; और 3) बॉटम लेयर (यानी बॉटम फेज), क्लोरोफॉर्म।
  7. अतिशयोक्ति को सावधानी से हटा दें।
  8. शेष इंटरफेज और बॉटम चरण में मेथनॉल के 300 माइक्रोन जोड़ें। भंवर सख्ती से।
  9. आरटी में 2 मिनट के लिए 9,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें ट्यूब को रैक में स्थानांतरित करते समय परतों को परेशान करने से बचने के लिए बेहद सावधान रहें।
  10. अतिशयोक्ति को सावधानी से हटा दें।
  11. धीरे हवा की एक धारा के तहत संभव के रूप में ज्यादा तरल के रूप में aspirate (उदाहरण के लिए, एक वैक्यूम केंद्रित का उपयोग कर) आरटी पर जब तक गोली सिर्फ थोड़ा नम (~ 10 min) है । चूंकि प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक समय अलग हो सकता है, इसलिए आकलन करने के लिए हर 2 मिन की जांच करें। आगे की प्रोसेसिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर करें।

6. प्रोटीन पाचन

  1. टीईबी लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन में उपजी प्रोटीन पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: इस चरण में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए वैकल्पिक है।
  2. उपयोग करने से तुरंत पहले, 1μg/μL ट्राइप्सिन को 100 माइक्रोन स्टोरेज सॉल्यूशन (50 एम एम एसिटिक एसिड) के 100 माइक्रोन को 100 माइक्रोन ग्लास शीशी के नीचे जोड़कर तैयार करें और आरटी स्टोर में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट-80 डिग्री सेल्सियस पर सिंगल-यूज डोज में रिएजेंट शेष रहें।
  3. प्रति 100 माइक्रोन प्रोटीन के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। नमूना 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पचा। यह कदम प्रोटीन के पूर्ण घुलनशीलता के लिए महत्वपूर्ण है; इन शर्तों को संशोधित न करें। पाचन के बाद, यह मानक प्रोटीन परख का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए वैकल्पिक है ।

7. पेप्टाइड लेबलिंग

  1. उपयोग करने से तुरंत पहले, टीएमटी लेबल किट अभिकर्मकों को आरटी में समान करें।
  2. प्रत्येक ट्यूब के लिए निर्जल एसीटोनिट्रिल के 41 माइक्रोन के अलावा के माध्यम से 0.8 मिलीग्राम टीएमटी टैग शीशियों में से प्रत्येक को भंग करें। कभी-कभी भंवर के साथ आरटी में 5 मिन के लिए अभिकर्ता को इनक्यूबेट करें। संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्रित करें।
    नोट: टीएमटी टैग की 0.8 मिलीग्राम की एकाग्रता आमतौर पर दो सेट लेबल करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, अन्य जांचकर्ताओं ने यह प्रदशत किया है कि इस एकाग्रता को और कम किया जा सकता है और अभी भी विश्वसनीय डेटा15प्राप्त कर रहा है ।
  3. ध्यान से प्रत्येक 100 माइक्रोन नमूने में टीएमटी लेबल रिएजेंट के 41 माइक्रोन जोड़ें।
  4. आरटी में 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया इनक्यूबेट ।
  5. प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए नमूने में 5% हाइड्रोक्सीलैमाइन के 8 माइक्रोन जोड़ें और 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. नमूनों को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में बराबर मात्रा में विभाजित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: इस चरण में नमूने स्थिर हैं और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है। मानक प्रोटीन परख ों का उपयोग करके इस बिंदु पर एकाग्रता को मापने के लिए वैकल्पिक है।

8. मास स्पेक्ट्रोस्कोपी

  1. नमूनों को एक प्रोटेओमिक्स सुविधा में सबमिट करें (इस अध्ययन में यूएफ आईसीबीआर प्रोटेओमिक्स कोर सुविधा का उपयोग किया गया था), जहां सभी नमूनों को C18 स्पिन कॉलम का उपयोग करके संयुक्त और शुद्ध किया जाता है।
    नोट: मुख्य सुविधा के साथ चर्चा करें कि वे प्रस्तुतियां के लिए पसंद किए जाने वाले सटीक कदमों की पुष्टि करने के लिए उन्हें तैयार करने से पहले नमूने कैसे जमा करें।
  2. संयुक्त मल्टीप्लेक्स नमूने के अनुसार निम्नलिखित प्रक्रियाओं का अनुरोध करें: ठोस चरण निष्कर्षण, एचपीएलसी (एससीएक्स, एसई), ज़िप टिप, और एलसी-एमएस/एमएस (प्रोटीन आईडी के लिए 2 घंटे ढाल, यदि >10QE प्लस)।
  3. एक बार डेटा एकत्र हो जाने के बाद, मुख्य सुविधा प्रोटीन पहचान के लिए विक्रेता-आपूर्ति सॉफ्टवेयर का उपयोग करके रॉ फाइलों को संसाधित करेगी।

9. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा आमतौर पर कोर से 7z प्रारूप में उपयोगकर्ता को वापस दिया जाता है, जिसके लिए प्रत्येक डेटासेट के अनुसार लगभग 16 जीबी डिस्क स्पेस (इस मामले में 11 नमूने) की आवश्यकता हो सकती है। डेटा प्रोसेसिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि एक कंप्यूटर उपलब्ध है जो कम से कम 3.4 गीगाहर्ट्ज है।
  2. 7-ज़िप फ़ाइल प्रबंधक का उपयोग करफ़ाइलनिकालें। इन निकाली गई फाइलों में रॉ डेटा, पीडीस्टडी फॉर्मेट फाइल और पीडीरिजल्टव्यू फॉर्मेट फाइल होती है। आगे के विश्लेषण के लिए सभी फाइलों को सहेजें।
  3. प्रोटेम डिस्कवरी 2.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके खुली फ़ाइल।
    नोट: फाइल प्रारूप "फ़ाइल नाम.पीडीस्टडी" है। यदि "फ़ाइल नाम.pdResultView" खोला जाता है तो नियंत्रण नमूने का चयन करना संभव नहीं है।
  4. 'सैंपल्स'Samplesपैनल पर कंट्रोल सैंपल सिलेक्ट करें।
  5. विश्लेषणपरिणामपैनल पर आईडी का चयन करके खुला परिणाम।
  6. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर को निर्यात करें।
  7. कच्चे डेटा (सभी प्रोटीन की पहचान) सहेजें।
  8. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर फाइल खोलें। इसमें सभी प्रोटीन होंगे, जिनकी पहचान हो चुकी है।
  9. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर फ़ाइल में'फ़िल्टर'फ़ंक्शन का उपयोग करें"प्रोटीन एफडीआर कॉन्फिडेंस: संयुक्त" उच्च में(कॉलम बी),'#Unique पेप्टाइड्स" 2 से अधिक(कॉलम कश्मीर),और या तो'बहुतायत अनुपात'में से एक विशेष रूप से खाली(कॉलम एस डब्ल्यूतक)।
  10. समारोह के साथ'पी-वैल्यू'गणना के लिए एक कॉलम डालें
    = TTEST (नियंत्रण समूह, प्रयोगात्मक समूह, पूंछ, प्रकार)
  11. समारोह के साथ'सांख्यिकीय महत्व'के लिए एक कॉलम डालें
    = आईएफ (पी-वैल्यू एंड एलटी;0.05, "महत्व", एनएस")
  12. 'सांख्यिकीय महत्व'को स्क्रीन करने के लिए'फ़िल्टर'फ़ंक्शन का प्रयोग करें जिसमें'महत्व'दिखाया गया है। परिणाम नियंत्रण समूह और प्रयोगात्मक समूह में सांख्यिकीय महत्व के साथ विश्लेषण प्रोटीन से पता चलता है ।
  13. नियंत्रण समूह की तुलना में प्रयोगात्मक समूह में काफी अधिक या कम प्रोटीन अभिव्यक्ति बहुतायत निर्धारित करें, समारोह के साथ"विनियमन"के लिए एक कॉलम डालें
    =आईएफ (औसत (नियंत्रण समूह) और औसत (प्रायोगिक समूह), "अपरेच","डाउनरेगुलर")

10. महत्वपूर्ण हिट का मूल्यांकन करने के तरीके

  1. टीएमटी अध्ययनों में पहचानी गई महत्वपूर्ण हिट के बीच प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए, बातचीत जीन/प्रोटीन (स्ट्रिंग) संस्करण 11.021के पुनर्प्राप्ति के लिए खोज उपकरण का उपयोग करें: https://string-db.org/
  2. समूहों द्वारा वर्गीकृत करने के लिए (यानी, आणविक कार्य, जैविक प्रक्रियाएं, और प्रोटीन कक्षाएं) विकासवादी संबंधों (पैंथर) ऑन्टोलॉजी वर्गीकरण सॉफ्टवेयर22के माध्यम से प्रोटीन विश्लेषण का उपयोग करें: http://www.pantherdb.org/
  3. विभिन्न प्रकार के रास्तों में प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए, पाथवे विश्लेषण सॉफ्टवेयर23का उपयोग करें।

11. एक भंडार बैंक में प्रोटेओमिक डेटा अपलोड करें

  1. प्रोटेओमिक्स IDEntificantions डाटाबेस (प्राइड) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंटरएक्टिव वर्चुअल एनवायरमेंट (मासवेवी) में प्रोटेओमिक डेटा सबमिट करने के लिए निम्नलिखित जानकारी शामिल है: पीक लिस्ट फाइलें (एमजेडएक्सएमएल जैसे मानक प्रारूप में प्रोसेस्ड मास स्पेक्ट्रम फाइलें, एमजेडएमएल, या एमजीएफ), फ़ाइलों (एमजेडीडेंटएमएल या एमजेडटैब जैसे मानक प्रारूप में स्पेक्ट्रम पहचान) और कच्चे स्पेक्ट्रम फ़ाइलें (एक अमानक या साधन-विशिष्ट प्रारूप में कच्चे द्रव्यमान स्पेक्ट्रम फ़ाइलें जैसे। रॉ फाइलें या । WIFF फ़ाइलें)।
  2. सबमिट करने के लिए, एक खाता बनाने के लिए और संबद्धता और परियोजना विवरण जैसी जानकारी शामिल है। फिर, चरण 11.1 में सूचीबद्ध फ़ाइलों का चयन करें और उन्हें अपलोड करें।
  3. एक आधिकारिक डेटासेट बनाने के लिए, इन अपलोड की गई फ़ाइलों पर एक सबमिशन वर्कफ्लो चलाएं।
    नोट: प्रस्तुत करने के बाद, डेटासेट भंडार बैंक में निजी होगा। निजी विकल्प के साथ, डेटा केवल अधिकृत उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है। दो अतिरिक्त विकल्प हैं: 1) साझा डेटासेट, जो जर्नल समीक्षकों और सहयोगियों तक पहुंच प्रदान करता है; या 2) पब्लिक डेटासेट, जो सार्वजनिक डेटासेट खोजों में दिखाई देगा। इन भंडारों की एक और महत्वपूर्ण विशेषता अपलोड किए गए डेटा को अपडेट करने और मौजूदा डेटासेट के साथ बाद के प्रकाशनों को संबद्ध करने की क्षमता है।

Representative Results

स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं को चैप्स बफर में चित्रित किया गया था, जिसे हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप में तैयार किया गया था, और हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप से तैयार किया गया था, और हमारे टीएमटी लेबलिंग विधि में विस्तृत रूप से तैयार किया गया था, और एक साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए फ्लोरिडा इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी रिसर्च (यूएफ-आईसीबीआर) प्रोटेओमिक्स कोर विश्वविद्यालय में प्रस्तुत किया गया था। डेटा अधिग्रहण और कोर से वितरण के बाद, डेटासेट विक्रेता-आपूर्ति सॉफ्टवेयर में खोला गया था और निम्नलिखित कटऑफ फिल्टर लागू किए गए थे: ‧2 अद्वितीय पेप्टाइड्स, सभी चैनलों में मौजूद प्रत्येक प्रोटीन नमूने के लिए रिपोर्टर आयन, और केवल महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन (पी ♫ 0.05) शामिल हैं। तालिका 1 डेटा का सारांश देता है: 39,653 कुल पेप्टाइड्स, जिनमें से 7,211 में दो अद्वितीय पेप्टाइड्स से बराबर या उससे अधिक हैं, और 3,829 में सभी चैनलों के लिए रिपोर्टर आयन शामिल हैं। इन 3,829 पेप्टाइड्स के लिए पी मान की गणना छात्र टी टेस्ट द्वारा की गई थी और पी 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था। इसके अलावा, स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में रोगग्रस्त से प्रोटीन के सापेक्ष वितरण का निर्धारण करने के लिए एक गुना-परिवर्तन कटऑफ का उपयोग किया गया था: डाउनरेविनियमित (नीला) या अपरेविनियमित (लाल)(चित्रा 1)।

पैंथर ओंटोलॉजी वर्गीकरण प्रणाली और स्ट्रिंग विश्लेषण का उपयोग करके काफी डिसिकोरेल प्रोटीन अभिव्यक्ति की सूची का आकलन किया गया था। पैंथर विश्लेषण ों ने आणविक कार्य(चित्रा 2बी)के आधार पर रोगग्रस्त कोशिकाओं में काफी कम(चित्रा 2ए)या उच्च बहुतायत के आधार पर प्रोटीन की एक वर्गीकृत सूची दिखाई। काफी कम के प्रोटीन के स्ट्रिंग विश्लेषण(चित्रा 2सी)और उच्च(चित्रा 2डी)बहुतायत प्रोटीन के बीच कई बातचीत और मजबूत संघों की पहचान की ।

Figure 1
चित्रा 1: ज्वालामुखी प्रोटीन जिसकी बहुतायत काफी बदल (काला) नहीं था प्रदर्शित साजिश, काफी कम (नीला), या काफी वृद्धि (लाल) रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पैंथर (ए, बी) और स्ट्रिंग (सी, डी) द्वारा काफी कम या उच्च बहुतायत प्रोटीन की पहचान की काफी डिसविनियमित हिट के प्रतिनिधि मूल्यांकन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कुल पेप्टाइड्स कुल पहचान की गई ♫ 2 अद्वितीय पेप्टाइड्स मात्रानिर्धारित प्रोटीन काफी बदल प्रोटीन
कम उच्च
39653 7211 4457 3829 296 108

तालिका 1: डेटासेट विश्लेषण प्रति मात्रा निर्धारित प्रोटीन की प्रतिनिधि तालिका।

Discussion

टीएमटी आधारित आइसोबेरिक स्थिर आइसोटोप लेबलिंग पद्धतियों का उपयोग करके प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए नमूने सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन निष्कर्षण बहुत सावधानी से करना और एक लाइसिस बफर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिसमें एक प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल24,,25शामिल है। प्रोटीन पाचन के दौरान अप्रत्याशित प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल एक महत्वपूर्ण अभिकर्ता है। हमारे प्रोटोकॉल और विक्रेता द्वारा प्रदान की गई वर्तमान एक के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि हम स्तनधारी कोशिकाओं और ऊतकों के साथ हमारे अनुभव के आधार पर चैप्स लिसिस बफर के उपयोग की दृढ़ता से सलाह देते हैं। हम कोशिका छर्रों और ऊतकों दोनों के लिए मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म प्रोटीन वर्षा दृष्टिकोण का उपयोग करने का भी सुझाव देते हैं ।

आदर्श रूप में, प्रोटीन निष्कर्षण, माप, कम करने/alkylating अभिकर्मक उपचार, और मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म वर्षा सभी एक ही दिन किया जाता है । इस सिफारिश के बाद बाद लेबलिंग के लिए और अधिक सटीक प्रोटीन सांद्रता में परिणाम होगा । प्रोटीन वर्षा कदम अभिकर्मकों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है जो मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में हस्तक्षेप करेगा। वर्षा चरण सहित टीएमटी26के संकल्प को काफी बढ़ाता है । संक्षेप में, हमारे टीएमटी प्रोटोकॉल के प्रमुख फायदे विभिन्न प्रकार के नमूनों, इसकी प्रजनन क्षमता और प्राप्त विश्वसनीय डेटा के लिए उच्च लेबलिंग क्षमता हैं।

चूंकि इस टीएमटी अनलक्षित प्रोटेओमिक्स रणनीति की मल्टीप्लेक्स प्रकृति का विस्तार जारी है, इसलिए यह उपन्यास खोजों को बनाने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में शोधकर्ताओं की क्षमता को उत्तरोत्तर बढ़ाएगा । विशेष रूप से जैव चिकित्सा क्षेत्र में, हमने और अन्य लोगों ने इस तकनीक को रोग में कार्रवाई के उपन्यास तंत्र और विभिन्न चिकित्सीय के सापेक्ष प्रभावों की खोज करने वाले अध्ययनों में तेजी से जानकारीपूर्ण पाया है। इन सभी कारणों से, यह शक्तिशाली तकनीक आधुनिक अनुसंधान अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले अन्य OMICS दृष्टिकोणों के प्रदर्शनों की सूची का पूरक है और महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करती है जो आगे चिकित्सीय विकास का मार्गदर्शन कर सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम अपने नमूनों के प्रसंस्करण के लिए यूएफ-आईसीबीआर प्रोटेओमिक्स सुविधा को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानR01 HL136759-01A1 (कैप) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 50 mL Thermo Fisher 90114 Reagent for protein labeling
50% Hydroxylamine, 5 mL Thermo Fisher 90115 Reagent for protein labeling
Acetic acid Sigma A6283 Reagent for protein digestion
Anhydrous acetonitrile, LC-MS Grade Thermo Fisher 51101 Reagent for protein labeling
Benzonaze nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNA shearing
Bond-Breaker TCEP solution, 5 mL Thermo Fisher 77720 Reagent for protein labeling
BSA standard Thermo 23209 Reagent for protein measurement
CHAPS Thermo Fisher 28300 Reagent for protein extraction
Chloroform Fisher BP1145-1 Reagent for protein precipitation
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 4693132001 Reagent for protein extraction
DC Protein Assay BioRad 500-0116 Reagent for protein measurement
Excel Microsoft Office Software for data analyses
Heat block VWR analog 12621-104 Equipment for protein digestion incubation
HEPES Sigma RDD002 Reagent for protein extraction
Methanol Fisher A452-4 Reagent for protein precipitation
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Fisher 90058 Reagent for protein digestion
Potassium chloride Sigma 46436 Reagent for protein extraction
Sigma Plot 14.0 Sigma Plot 14.0 Software for data analyses
Sonicator Fisher Scientific FB120 DNA shearing
Spectra Max i3x Multi-Mode Detection Platform Molecular Devices Plate reader for protein measurement
Thermo Scientific Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Reagent for protein measurement
Thermo Scientific Pierce Quantitative Fluorescent Peptide Assay Thermo Fisher 23290 Reagent for protein measurement
Thermo Scientific Proteome Discoverer Software Thermo Fisher OPTON-30945 Software for data analyses
TMT 10plex Isobaric Label Reagent Set 0.8 mg, sufficient reagents for one 10plex isobaric experiment Thermo Fisher 90110 Reagent for protein labeling
TMT11-131C Label Reagent 5 mg Thermo Fisher A34807 Reagent for protein labeling
Water, LC-MS Grade Thermo Fisher 51140 Reagent for protein extraction

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References

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Suzuki-Hatano, S., Tsai, A. C., Daugherty, A., Pacak, C. A. TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis. J. Vis. Exp. (160), e60970, doi:10.3791/60970 (2020).

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