Summary
نحن نقدم بروتوكولًا لتسمية وتحليل الخلايا العصبية الهرمية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم التغيرات المورفولوجية المحتملة في الخلايا العصبية والعمود الفقري التشجري الذي قد يكمن وراء التشوهات الكيميائية العصبية والسلوكية.
Abstract
وقد أفيد أن حجم وشكل العمود الفقري التشجرات يرتبط اللدونة الهيكلية. لتحديد البنية المورفولوجية للخلايا العصبية الهرمية والعمود الفقري الدندري، يمكن استخدام تقنية وضع العلامات البالستية. في البروتوكول الحالي، يتم تسمية الخلايا العصبية الهرمية مع صبغة DilC18 (3) وتحليلها باستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود الفقري الدندري. للتحقيق في بنية الخلايا العصبية، يتم إجراء تحليل التشعب التشعب التشجري وتحليل شول، مما يسمح للباحثين باستخلاص استنتاجات حول تعقيد التفريكان التشعب يتكاثر وتعقيد المشتر العصبي، على التوالي. ويجري تقييم العمود الفقري الدندريتيكي باستخدام خوارزمية تصنيف تلقائية بمساعدة متكاملة من برنامج إعادة الإعمار، الذي يصنف العمود الفقري إلى أربع فئات (أي رقيقة، فطر، كعب، فيلوبوديا). وعلاوة على ذلك، يتم اختيار ثلاثة معلمات إضافية (أي الطول وقطر الرأس والحجم) لتقييم التعديلات في مورفولوجيا العمود الفقري التشدري. للتحقق من إمكانية التطبيق الواسع لتقنية وضع العلامات البالستية ، تم تصنيف الخلايا العصبية الهرمية من ثقافة الخلايا المختبرية بنجاح. وعموما ، فإن طريقة وضع العلامات البالستية هي فريدة من نوعها ومفيدة لتصور الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الفئران ، والتي في تركيبة مع برامج إعادة الإعمار المتطورة ، ويسمح للباحثين لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي.
Introduction
في عام 2000، وصف غان وآخرون تقنية وضع العلامات السريعة للخلايا العصبية الفردية وغليا في الجهاز العصبي الذي جمع بين الأصباغ الدهنية المختلفة، مما يسمح بوضع العلامات في وقت واحد من العديد من خلايا الدماغ مع ألوان مختلفة1،2. وفي الآونة الأخيرة، وصفت سيبولد وآخرون3 تقنية وضع العلامات البالستية التي أدخلت الأصباغ الفلورية (ديل) في الخلايا العصبية لشرائح الدماغ. تقنية تلطيخ متعددة الاستخدامات ، يتم تقدير العلامات البالستية لقدرتها على استخدامها في أنواع الحيوانات المتعددة وعبر مجموعة واسعة من الأعمار. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع المناعة لتحديد الفئات الفرعية من خلايا الدماغ3. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية (على سبيل المثال، غولجي كوكس الفضة التلقيح، الحقن المجهري)4، وضع العلامات البالستية يتيح فرصة للتمييز بشكل أوضح خصائص مورفولوجية، بما في ذلك العمود الفقري الدندري، وهي ميزة حاسمة لرسم الاستدلالات حول تعقيد الخلايا العصبية والاتصال متشابك5.
تتميز الخلايا العصبية الهرمية المجازية بdendrite واحد كبير، وdendrites القاعدية أقصر متعددة، والآلاف منالعمودالفقري الدندري6. تم العثور على الخلايا العصبية الهرمية في مناطق الدماغ متعددة تتعلق أعلى ترتيب المعالجة المعرفية, بما في ذلك قشرة الجبهية (PFC) وقرن آمون. في PFC ، لوحظت الخلايا العصبية الهرمية في الطبقات الثانية / الثالثة والطبقة الخامسة ، مع كل عرض مورفولوجيا فريدة من نوعها. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الثانية / الثالثة من PFC لديها dendrite apical أقصر وأقل تفريع من الخلايا العصبية الهرمية في طبقة V6. داخل قرن آمون، وتقع الخلايا العصبية الهرمية في كل من مناطق CA1 و CA3، مع كل عرض مورفوولوجيا متميزة. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1 تحمل dendrite apical أكثر تميزا، مع التفريع التي تحدث أبعد من سوما، بالنسبة إلى منطقة CA36.
العمود الفقري الدندريعلى الخلايا العصبية الهرمية في كل من PFC وقرن آمون هي الموقع الرئيسي للنقاط الاشتباك العصبي مثير7. الخصائص المورفولوجية للعمود الفقري التشجر، والتي تتميز كلاسيكيا إلى ثلاث فئات أساسية (أي رقيقة، كعب، أو فطر8)،وقد ارتبطت بحجم المشبك مثير9. العمود الفقري رقيقة، تتميز طويلة، والرقبة رقيقة، رئيس لمبة صغيرة، وأصغر كثافة postynaptic، هي أكثر غير مستقرة وتطوير اتصالات أضعف. ومع ذلك ، يتم التعرف على العمود الفقري للفطر ، والتي لديها رأس عمود فقري أكبر ، لتشكيل اتصالات متشابكة أقوى ، وهو تأثير ناتج عن حجمها الأكبر. في التباين الحاد ، تخلو العمود الفقري من رقبة العمود الفقري ، مما يعرض نسبة حجم رأس ورقبة متساوية تقريبًا8. داخل قرن آمون ، يمكن أيضًا ملاحظة العمود الفقري المتفرع ، حيث يحتوي العمود الفقري على رؤوس متعددة تخرج من نفس عنق العمود الفقري الدندري10. لذلك ، يمكن أن تعكس التغيرات المورفولوجية للعمود الفقري التشتري الوظائف والقدرة الهيكلية. وعلاوة على ذلك، فقد أثبتت الدراسات أن حجم وشكل العمود الفقري التشجري يرتبط بلدونتها الهيكلية، مما يؤدي إلى فكرة أن العمود الفقري الصغير يشارك في التعلم والاهتمام، في حين أن العمود الفقري الأكبر والأكثر استقرارًا، يشارك في عمليات طويلة الأجل، بما في ذلك الذاكرة11. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط توزيع العمود الفقري التشجرني على طول dendrite مع الاتصال متشابك5,12.
وهكذا، فإن هذه الورقة المنهجية لها ثلاثة أهداف: 1) تقديم بروتوكولنا للوسم الباليستي، الذي تم استخدامه بمعدل نجاح (أي الخلايا العصبية التي تستوفي معايير الاختيار والمناسبة للتحليل) من 83.3٪5و12و13 وعبر مناطق الدماغ المتعددة (أي PFC، النواة accumbens، قرن آمون)؛ 2) إثبات التعميم من هذه التقنية وتطبيقها على الخلايا العصبية نمت في المختبر؛ 3) تفصيل المنهجية المستخدمة في برامج إعادة بناء الخلايا العصبية والاستدلالات التي يمكن استخلاصها من هذه البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كارولينا الجنوبية (رقم الضمان الفيدرالي: D16-00028).
1. إعداد أنابيب الزمرة DiI / التنغستن
- حل 100 ملغ من polyvinylpyrrolidone (PVP) مع 10 مل من ddH2O. Vortex حل PVP طفيفة.
- ملء الأنابيب مع حل PVP (انظر جدول المواد)وتركها لمدة 20 دقيقة. ثم، طرد حل PVP من خلال الطرف الآخر من الأنابيب باستخدام حقنة 10 مل.
- الجمع بين 170 ملغ من حبات الناقلات الصغيرة التنغستن مع 250 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين. دوامة تعليق زمرة التنغستن بدقة.
- الجمع بين 6 ملغ من صبغة DilC18 (3) مع 300 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين. دوامة حل صبغ DilC18 (3) بدقة.
ملاحظة: تنفيذ الخطوات 1.3-1.4 في غطاء محرك السيارة الدخان. - Pipette 250 ميكرولتر من تعليق زمرة التنغستن على شريحة زجاجية. انتظر التعليق لتجف الهواء (~ 3 دقيقة).
- إضافة 300 ميكرولتر من محلول صبغة DilC18 (3) على الجزء العلوي من طبقة تعليق زمرة التنغستن. مزيج DiIC18 (3) محلول صبغة والتنغستن bead تعليق تماما مع طرف ماصة والسماح للخليط لتجف الهواء (~ 3 دقيقة).
- بمجرد تجفيفها، استخدم شفرة حلاقة لتقسيم الخليط إلى أنبوبين للطرد المركزي بـ 1.5 مل. ملء الأنابيب بالماء.
- سونيكات في حمام مائي (أمبير الأول، 100٪) حتى متجانسة (~ 5 دقيقة). تأكد من أن غيض من سونيكاتور تقع مباشرة على الأنابيب مع تعليق زى.
- الجمع بين اثنين من 1.5 مل من خليط متجانس في أنبوب مخروطي 15 مل. سونيكات الخليط لمدة 3 دقيقة أخرى.
- رسم حبات التنغستن-DilC18 (3) خليط صبغ في أنابيب المغلفة PVP باستخدام حقنة 10 مل. تغذية أنابيب في محطة التحضير (انظر جدول المواد).
- تدوير لمدة 1 دقيقة على محطة التحضير. إزالة بعناية جميع المياه من الأنابيب باستخدام حقنة 10 مل.
- بدوره على غاز النيتروجين وضبط تدفق النيتروجين إلى ما يقرب من 0.5 لتر في الدقيقة الواحدة (LPM)، وتدوير الأنابيب في محطة التحضير، وتجف مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة.
- إزالة الأنابيب من محطة التحضير ومقطعة إلى أطوال 13 ملم (مطابقة حجم التحميل من خرطوشة) باستخدام قاطع أنابيب. الحفاظ على أطوال 13 ملم في قوارير التلألؤ في الظلام.
2. إعداد أقسام الدماغ
ملاحظة: تم وضع الفئران F344/N الذكور البالغين في بيئة خاضعة للرقابة تحت ضوء 12/12: دورة داكنة مع وصول libitum الإعلاني إلى الطعام والماء. وتلقى جميع الحيوانات الرعاية باستخدام المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
- تُسْكُنُ الفئران ِ بعمق باستخدام 5% سيفوفلوران.
- المضي قدما إلى الخطوة التالية عندما الفئران لا تستجيب للمحفزات الضارة وردود الفعل غائبة.
- تأمين الفئران في موقف supine داخل غطاء الدخان الكيميائية.
- إجراء شق من خلال الجلد على طول خط الوسط الصدري. فصل الحجاب الحاجز وفتح الصدر مع مقص. أدخل إبرة 20 G × 25 مم في البطين الأيسر.
- قطع الأذين الأيمن على الفور مع مقص. Perfuse 50 مل من 100 mM PBS مع 5 مل / دقيقة من معدل التدفق. Perfuse 100 مل من 4٪ paraformaldehyde المخزنة مؤقتا في 100 mM PBS.
- إزالة الدماغ الفئران كامل الحق بعد التهوى.
- بعد إصلاح الدماغ بأكمله لمدة 10 دقيقة مع 4٪ من الشلل المتوسط.
ملاحظة: لا postfix في 4% paraformaldehyde لأكثر من 30 دقيقة، لأنه سيؤثر على وضع العلامات. - قطع 500 ميكرومتر أقسام التاجية سميكة باستخدام مصفوفة الدماغ الفئران (انظر جدول المواد). جعل القطع الأول والحفاظ على شفرة في مكانها. جعل قطع الثاني باستخدام شفرة ثانية وإزالة عموديا شفرة الأولى، والحفاظ على الأنسجة على سطح النصل.
- ضع شرائح الدماغ في لوحة جيدة 24 مع 1 مل من 100 مل PBS في كل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم قطع جميع الشرائح.
3. وضع العلامات البالستية وتصور أقسام الدماغ
- إزالة برنامج تلفزيوني من كل المستهدفة بشكل جيد.
- تحميل خرطوشة مع قطعة من الأنابيب الزمرة DiI / التنغستن ووضعها في قضيب.
- ضع قطعة من ورق التصفية بين شاشتين شبكيتين. قم بتوصيل المُطبق بخرطوم الهيليوم. ضبط ضغط الانتاج من الهيليوم إلى 90 جنيه لكل بوصة مربعة (psi).
- ضع المُطبق رأسيًا باليد على وسط البئر المستهدف على مسافة 1.5 سم بين العينة وشاشة الشبكة. النار في DiI / التنغستن أنابيب الخرز.
ملاحظة: تأكد من إزالة كافة PBS من الآبار المستهدفة قبل إطلاق النار. - تحميل خرطوشة مع المقبل DiI / التنغستن أنابيب البزة. اطلاق النار باستمرار على الخرز ديي / التنغستن من أنابيب على الشرائح المتبقية.
- ملء لوحة جيدا 24 مع 100 mM من برنامج تلفزيوني. يغسل مع 500 ميكرولتر من 100 mM الطازجة من برنامج تلفزيوني 3x. لا تدع شرائح الوجه أكثر أثناء الغسيل مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 500 ميكرولتر من جديد 100 mM PBS والحفاظ على شرائح في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 ساعة.
- نقل شرائح الدماغ على الشرائح الزجاجية باستخدام فرشاة غرامة.
ملاحظة: يمكن نقل ثلاثة أقسام الدماغ على كل شريحة زجاجية. - إضافة على الفور 1 مل من antifade تصاعد المتوسطة على كل قسم. ضع قسيمة تغطية 22 مم × 50 مم فوق أقسام الدماغ. تجفيف الشرائح الزجاجية في الظلام لمدة 2 أيام.
- قم بتشغيل نظام المجهر البؤري والتبديل إلى هدف 60×.
- تعيين نظام المجهر البؤري أن يكون التكبير من 60 × (A/1.4، النفط) وفاصل Z-الطائرة من 0.15 ميكرومتر (حجم الثقب 30 ميكرومتر، نصف قطر الثقب الخلفي المتوقع 167 نانومتر). استخدام 543 نانومتر الطول الموجي للحصول على صور من الخلايا العصبية ذات الاهتمام.
- الحصول على صور Z-كومة لنوع الخلايا العصبية المستهدفة على أساس حدود منطقة الدماغ والخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية.
ملاحظة: الحصول على ثلاث صور على الأقل fromm كل الحيوان.
4. استخدام المنهجية مع ثقافة الخلية
- عزل الخلايا العصبية القشرية الأولية من الفئران F344/N في يوم ما بعد الولادة الأول باستخدام منهجية14المبلغ عنها سابقا.
- الخلايا العصبية القشرية الأولية في طبق قاع الزجاج 35 ملم لمدة أسبوع واحد. تغيير نصف متوسط الثقافة مع المتوسطة نمو الخلايا العصبية الطازجة في اليوم الثالث بعد العزلة. اغسل الطبق الزجاجي السفلي 2x مع 1 مل من 100 مل PBS.
- إصلاح مع 4٪ بارامايدهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 3.2-3.6 لتسمية الخلايا بالستياً.
- يغسل مع 1 مل من 100 مل PBS 3x. إضافة 500 ميكرولتر من 100 mM الطازجة من برنامج تلفزيوني ويبقيه في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة 3 ساعة.
- إضافة 200 ميكرولتر من antifade تصاعد المتوسطة.
- الحصول على صور Z-كومة لكل الخلايا العصبية المستهدفة باستخدام المعلمات في الخطوة 3.10.
5. تحليل الخلايا العصبية والعمود الفقري التشجر
- الخلايا العصبية العمياء باستخدام أرقام التعليمات البرمجية لمنع التحيز المجرب.
- وضع معايير اختيار للخلايا العصبية على أساس منطقة الدماغ ذات الاهتمام.
ملاحظة: تشمل معايير الاختيار للخلايا العصبية تلطيخ التدندري المستمر ، والخلفية المنخفضة ، ولا توجد مجموعات صبغداخل الخلايا ، والحد الأدنى من نشر صبغة DiI في الفضاء خارج الخلية ، ومورفولوجيا تصحيح الخلايا العصبية الهرمية(الشكل 1). - فتح برامج إعادة بناء الخلايا العصبية (انظر الفيديو المرفقة 1).
- تحميل ملف صورة عن طريق النقر على"مجلد الملف"صورة في الزاوية اليسرى العليا.
- انقر فوق"سوما"ووضع علامة سوما من الخلايا العصبية على الصورة.
- انقر فوق"شجرة"وحدد"توجيه المستخدم".
- تتبع جميع فروع التشجر من الفائدة.
ملاحظة: بالنسبة للخلايا العصبية الهرمية، والتي تتميز بdendrite واحد apical وdendrites باسيلار متعددة، يتم تتبع فقط dendrite apical. تأكد من إرفاق جميع الفروع المتصلة ببعضها البعض. - انقر فوق"العمود الفقري".
- تحديد معلمات الكشف وانقر فوق"الكشف عن الكل".
ملاحظة: بالنسبة لشرائح الدماغ، المعلمات المتسقة المستخدمة عبر مناطق الدماغ هي: 2.0 (النطاق الخارجي)، 0.3 (الحد الأدنى للارتفاع)، 100٪ (حساسية الكاشف)، و 10 (الحد الأدنى للعدد). لثقافة الخلية، فمن الضروري لزيادة حساسية كاشف وتقليل العدد الأدنى. - تصنيف العمود الفقري عن طريق اختيار"تصنيف الكل".
ملاحظة: يتم تصنيف العمود الفقري الدندريات باستخدام خوارزمية لا يتجزأ من برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية15. - حفظ التتبع عن طريق تحديد صورة القرص في الزاوية اليسرى العليا.
- إجراء التحليلات المورفولوجية العمود الفقري العصبي والدندري.
- فتح الخلايا العصبية إعادة بناء برنامج التحليل الكمي (انظر الفيديو المرفقة 2).
- تحميل الصورة عن طريق النقر على"ملف"و"فتح ملف البيانات".
- انقر فوق"تحليل"و"تحليل هيكل متفرع"لتحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية ومورفولوجيا العمود الفقري التشجر.
- لمورفولوجيا الخلايا العصبية، انقر فوق"شجرة المجاميع"وحدد مربعل"Dendrite Totals".
- لمورفولوجيا العمود الفقري الأسنان، انقر فوق"العمود الفقري"ومن ثم حدد مربع ل"تفاصيل العمود الفقري".
- حفظ الإخراج كملف نص (.txt) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على جدول الإخراج وتحديد"حفظ إلى ملف".
- انقر فوق"تحليل"و"تحليل شول".
- تعيين نصف قطر البداية إلى 10 ميكرومتر وزيادة نصف القطر إلى 10 ميكرومتر.
- انقر فوق مربع"Dendrites"وانقر فوق"عرض".
- حفظ الإخراج كملف نص (.txt) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على جدول الإخراج وتحديد"حفظ إلى ملف".
6 - تحليل البيانات
- تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية (أي، تعقيد التفريط التشفري) البيانات.
- إضافة عدد التشعبات في كل أمر فرع وتقسيمها على العدد الإجمالي للdendrites. ضرب في 100 لحساب الترددات النسبية لعدد dendrites في كل أمر فرع.
- تحليل بيانات تحليل شول لفحص تعقيد المشتل العصبي واتصال العمود الفقري الدندري.
- حساب الخطأ المتوسط والقياسي للمتوسط لعدد التقاطعات في كل نصف قطر.
- جمع عدد من العمود الفقري تعتمد على نوع العمود الفقري (أي رقيقة، كعب، الفطر) في كل دائرة نصف قطرها وتقسيمها على العدد الإجمالي للعمود الفقري لهذا النوع العمود الفقري. اضرب بـ 100 لحساب الترددات النسبية لعدد العمود الفقري في كل نصف قطر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2A، تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية النموذجية في منطقة فرس النهر في أقسام دماغ الفئران من خلال تقنية وضع العلامات البالستية ، والتي تتميز بواحدة من dendrite apical كبيرة والعديد من الdendrites القاعدية الأصغر حول سوما. ويبين الشكل 2B الخلايا العصبية في برنامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية بعد الكشف عن سوما، تم تتبع فروع التشجر، وتم الكشف عن العمود الفقري. في وقت لاحق ، تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية ، والذي وفر فرصة لتقييم تعقيد التفريكان التشفري(الشكل 2C)وتعقيد الأربور العصبية(الشكل 2D).
في الشكل 2C، استوعنا طريقة ترتيب فرع الطرد المركزي ، التي تم جمعها من إخراج "شجرة المجاميع" ، لحساب عدد الشرائح التي اجتازت على طول كل dendrite وأمر الفرع المعين. تم فحص التردد النسبي للأجزاء في كل أمر فرع لأوامر الفرع من 1 إلى 15. عندما لوحظت تحولات في توزيع الفروع التشجرات بين المجموعات، يمكن الاستدلال على التعديلات في تعقيد التفريفي التشندرية. وعلاوة على ذلك، تم إجراء تحليل شول كمقياس تكميلي لتعقيد المشتل العصبي، حيث تم قياس عدد التقاطعات التشجرية التي تحدث كل 10 ميكرومتر من السوما في كل قسم عينة(الشكل 2D). عندما لوحظت تحولات في عدد التقاطعات التشجرية بين المجموعات، يمكن الاستدلال على التعديلات في تعقيد الأربور العصبية.
يمكن تقييم التغيرات المورفولوجية في العمود الفقري التشتري باستخدام الطول (ميكرومتر) وقطر الرأس (ميكرون) والحجم (ميكرومتر3)، كما رأينا في الشكل 3A-B. وعلاوة على ذلك، تم تصنيف العمود الفقري باستخدام نظام التصنيف التلقائي بمساعدة في برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية. تم فحص التردد النسبي لعدد العمود الفقري بين كل نصف قطر للرقيقة والفطر والعمود الفقري. وبالنظر إلى فهمنا لأنواع العمود الفقري التي تشكل اتصالات متشابكة أقوى (أي الفطر نسبة إلى كعب الكعب) وafferents الناقل العصبي، يمكن أن تشير التحولات في توزيع العمود الفقري على طول الخلايا العصبية إلى الاتصال متشابك.
وعلاوة على ذلك، قمنا بالتحقق من فائدة تقنية وضع العلامات البالستية على الخلايا العصبية الهرمية الأولية في ثقافة الخلايا. أولاً، قمنا باستزراع الخلايا العصبية الأولية لفرس النهر في D1 بعد الولادة (اليوم 1) على لوحة ثقافة الخلية المغلفة بالبولي L-ليسين لمدة أسبوعين أو حتى التقاء 70٪. ثم تم إصلاح العينات مع 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة وغسلها 2x مع برنامج تلفزيوني. بدءا من الخطوة 3.1 من هذا البروتوكول، ونحن على بالاسيد المسمى وصورة الخلايا العصبية الهرمية الأولية من قرن آمون. وأظهرت البيانات استقرار العلامات وتحديد الخلايا العصبية الهرمية على أساس شكل مثلث سوما والدمنت apical كبيرة(الشكل 4A). استخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية للتحقيق في العمود الفقري الدندريلل الخلايا العصبية الهرمية الأولية التي تزرع في ثقافة الخلايا يوفر فرصا مماثلة لتلك الموجودة في الدماغ الفئران. ويتضح نتائج المثال لتوزيع العمود الفقري التشجري رقيقة(الشكل 4B)وطول العمود الفقري التشجري تقاس في μm(الشكل 4C). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية الهرمية الأولية التي نمت في ثقافة الخلايا كان لها تفريع أقل من التشعب الدندريتي ، مما حال دون التقييم ، على الأقل في هذا المثال ، لتعقيد التفريكان التشعب يتشجر وتعقيد الأربور العصبية.
الشكل 1: معايير الاختيار المستخدمة للخلايا العصبية الهرمية في قشرة الجبهية المتوسطة المسماة باستخدام تكنولوجيا وضع العلامات البالستية. (أ)صورة تمثيلية بؤرية (60x) لخلية عصبية هرمية تحمل علامة جيدة من قشرة الجبهية المتوسطة. وشملت خلية عصبية هرمية واحدة مع سوما واضحة وdendrite apical تلطيخ مستمر ومشرق مع خلفية منخفضة. (ب-ج) صورة تمثيلية محورية (60x) لخلية عصبية هرمية من قشرة الجبهية المتوسطة مع تلطيخ الضوء في الفروع الأكثر ذهولًا(B)والخلفية العالية(C). (D)صورة تمثيلية محورية (60x) لخلية عصبية مُصّنة من قشرة الجبهية المتوسطة (استنادًا إلى إحداثيات Bregma) التي لها خصائص مورفولوجية معيبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وضع العلامات على الخلايا العصبية الهرمية في قرن آمون (HIP) باستخدام تكنولوجيا وضع العلامات البالستية والتقييمات العصبية الذرية. (أ)ثلاث صور تمثيلية محورية (60x) من الخلايا العصبية الهرمية التي تحمل علامة على حبات التنغستن الباليستية. (ب)تقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية: تحليل ترتيب فرع الترجس وتحليل شول. الصورة المقتصة للعمود الفقري التشجري الذي تم تحديد مورفولوجيا العمود الفقري فيه أيضًا باستخدام برنامج تحليل العمود الفقري التشجر. (ج)تحليلات أوامر الفرع المستخدمة لفحص التردد النسبي للفروع التشجرية بناء على أوامر فرعية مختلفة. (D)تم تقييم أعداد التقاطعات التشجرية كل 10 ميكرومتر من سوما باستخدام تحليل شول كمقياس لتعقيد الأربور العصبي. توصف البيانات بأنها ترددات نسبية لمجموعة البيانات بأكملها(C)أو تتناسب مع فواصل الثقة 95٪(D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - ما إذا كانت هناك نسبة تقييم مورفولوجيا العمود الفقري التشدري. (أ-ب)توزيع العمود الفقري الدندريوغرافي الذي يتضح كدالة لنوع العمود الفقري (أي رقيقة، كعب، فطر). كما تم تحليل معلمات العمود الفقري التشجرية الإضافية (أي الطول والحجم وقطر الرأس) كتقييم لمورفولوجيا العمود الفقري التشدري. ويتضح البيانات على أنها ترددات نسبية لمجموعة البيانات بأكملها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 - ما إذا كانت هناك نسبة وضع العلامات من الخلايا العصبية القشرية الأولية في المختبر باستخدام تكنولوجيا وضع العلامات البالستية. (أ)الصور المحورية التمثيلية (60x) من الخلايا العصبية القشرية الأولية التي تحمل علامة على حبات التنغستن الباليستية في المختبر. وتظهر نتائج مثال مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من العلامات البالستية في شرائح الدماغ لتوزيع العمود الفقري التشجرني رقيقة(B)وطول(C). ويتضح البيانات على أنها ترددات نسبية لمجموعة البيانات بأكملها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: إجراءات تتبع الخلايا العصبية والكشف عن العمود الفقري التشجر. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الفيديو 2: إجراءات جمع البيانات ومخرجاتها للتحليل الكمي. يرجى الضغط هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نصف تقنية وضع العلامات تنوعا للخلايا العصبية من كل من الدماغ الفئران وتلك التي تزرع في المختبر. وعلاوة على ذلك، نحن تقرير منهجية لاستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية وبرامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود الفقري الدندري. تقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود الفقري التشجري يوفر فرصة لتحديد التعديلات في تعقيد التشعب التشعب التشجر، تعقيد المشتل العصبي، مورفولوجيا العمود الفقري التشجر، والاتصال متشابك.
عند إجراء البروتوكول ، يجب على الباحثين إيلاء اهتمام خاص لبضع خطوات. أولاً، فإن ما بعد التثبيت في 4٪ PFA لفترة طويلة جداً سوف يضر بسلامة الغشاء الدهني ويسبب تسرب الصبغة خارج الخلايا. ثانيا، بالمقارنة مع خصوصية العلامات البالستية في شرائح الدماغ، والتي تستهدف الخلايا العصبية فقط، ووضع العلامات على الخلايا العصبية القشرية الأولية في المختبر يدخل وضع العلامات غير محددة من غليا لأن وضع العلامات الباليستية في شرائح الدماغ ليست محددة لنوع من الخلايا العصبية (أي، الخلايا العصبية الهرمية، الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة، خلية الحبيبية). وبالتالي، ينبغي الجمع بين إحداثيات البريغما، أو التقييمات المورفولوجية، أو علامات الخلايا المحددة مع طريقة وضع العلامات البالستية. ثالثاً، يمكن أن يتراوح سمك شرائح الدماغ بين 200-500 ميكرومتر؛ للحصول على أفضل النتائج يجب تحسينه. رابعا ، وترتبط كفاءة الوسم واختراق الصبغة لكثير من العوامل ، مثل ضغط الهيليوم ، وأوقات الحضانة بعد التطبيق الباليستي ، والخرز DiI / التنغستن ، والمسافة بين الشاشة شبكة وسطح شرائح الدماغ ، الخ. يجب تحسين البروتوكول لكل دراسة. خامسا، يجب تجنب كتل كبيرة أو مجموعات من حبات التنغستن المغلفة بالصبغة التسيارية أثناء التحضير، لأن الكتل لن تسمح بتمييز الخلايا العصبية الفردية. كما قررنا أن Di ينتشر في جميع أنحاء الخلايا العصبية الفردية أكثر تماما من DiO في هذه المنهجية الباليستية.
ومع ذلك ، بالمقارنة مع طرق وضع العلامات التقليدية4، فإن تقنية وضع العلامات البالستية تجعل التصوير البؤري عالي الدقة ممكنًا ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا العمود الفقري العصبي والدندري. وعلاوة على ذلك، يستخدم برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية خوارزمية للتصنيف التلقائي بمساعدة العمود الفقري التشدري (أي رقيقة، الفطر، كعب مكعب)، القياسات ترتيب فرع، تحليل شول الكلاسيكية، وقياس الميزات المورفولوجية للعمود الفقري التشدري، مثل الطول (ميكرومتر)، قطر الرأس (ميكرومتر)، وحجم (ميكروم3). يوفر التحديد الكمي للمعلمات العصبية المتعددة فرصة لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي.
وعموما، فإن طريقة وضع العلامات البالستية تسمح بتصور الهياكل العصبية في مناطق الدماغ المختلفة للفئران وفي ثقافة الخلايا، وهو أمر مهم لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي. في هذه الدراسة، نقدم طريقة لتسمية الخلايا العصبية الهرمية من خلال تقنية وضع العلامات البالستية. وعلاوة على ذلك، جنبا إلى جنب مع برامج إعادة بناء الخلايا العصبية، أظهرنا القدرة على فحص مورفولوجيا العمود الفقري العصبي والدندريتك في الخلايا العصبية هرمية فرس النهر. الاختلافات في مجموعة الخلايا العصبية و / أو مورفولوجيا العمود الفقري الدندري توفر فرصة لفهم الآليات الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ تضارب في المصالح لإعلانه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المنح المعاهد القومية للصحة HD043680، MH106392، DA013137، وNS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F. Jr, Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
