Summary
Présenté ici est un protocole pour découvrir les gènes conducteurs surexprimés maintenant les cellules souches du cancer établies dérivées des cellules HT29 colorectal. RNAseq avec la bioinformatique disponible a été exécutée pour étudier et examiner des réseaux d’expression de gène pour élucider un mécanisme potentiel impliqué dans la survie des cellules de tumeur ciblées.
Abstract
Les cellules souches cancéreuses jouent un rôle vital contre les thérapies cliniques, contribuant à la rechute tumorale. Il y a beaucoup d’oncogènes impliqués dans la tumorigenèse et l’initiation des propriétés de tige de cancer. Puisque l’expression de gène dans la formation des tumeurs cancéreuses côloresphères cancéreuses côlores est peu claire, il faut du temps pour découvrir les mécanismes fonctionnant sur un gène à la fois. Cette étude démontre une méthode pour découvrir rapidement les gènes moteurs impliqués dans la survie des cellules souches du cancer colorectal in vitro. Les cellules cancéreuses colorectales HT29 qui expriment le LGR5 lorsqu’elles sont cultivées sous forme de sphéroïdes et accompagnent une augmentation des marqueurs de stemness CD133 ont été sélectionnées et utilisées dans cette étude. Le protocole présenté est utilisé pour effectuer RNAseq avec la bioinformatique disponible pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés dans la formation de tumeurs côlores de tige HT29-dérivées. La méthodologie peut rapidement dépister et découvrir les gènes conducteurs potentiels dans d’autres modèles de maladies.
Introduction
Le cancer colorectal (CRC) est l’une des principales causes de décès avec une prévalence et une mortalité élevées dans le monde1,2. En raison de mutations et d’amplifications génétiques, les cellules cancéreuses se développent sans contrôle prolifératif, ce qui contribue à la survie cellulaire3, anti-apoptose4, et la stemness cancer5,6,7. Dans un tissu tumoral, l’hétérogénéité tumorale permet aux cellules tumorales de s’adapter et de survivre pendant les traitements thérapeutiques8. Les cellules souches cancéreuses (CSC), avec un taux plus élevé d’auto-renouvellement et de pluripotence que les types de cancer différentiel, sont principalement responsables de la récurrence tumorale9,10 et métastatique CRC11. Les CSC présentent plus de résistance aux médicaments12,13,,14 et propriétés anti-apoptose15,16, survivant ainsi les chimiothérapies tumorales.
Ici, afin d’étudier le mécanisme potentiel de stemness dans les cellules souches sélectionnées CRC, RNAseq a été exécuté pour dépister les gènes exprimés différemment dans les sphéroïdes de tumeur. Les cellules cancéreuses peuvent former des sphéroïdes (également appelés tumeurs) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de faible adhérence et stimulées par des facteurs de croissance ajoutés au milieu cultivé, y compris le FEM, le bFGF, le HGF et l’IL6. Par conséquent, nous avons sélectionné des cellules tumorales CRC HT29 qui résistent aux chimiothérapies avec une augmentation de STAT3 phosphorylé lorsqu’elles sont traitées avec de l’oxaliplatine et de l’irinotecon17. En outre, HT29 a exprimé des marqueurs de tige plus élevés lorsqu’ils sont cultivés dans les conditions de culture décrites. Le modèle CSC dérivé du HT29 exprimait des quantités plus élevées de récepteurs couplés à la protéine G riches en protéines de leucine 5 (LGR5)18, un marqueur spécifique des cellules souches CRC19,20. En outre, CD133, considéré comme un biomarqueur général pour les cellules souches cancéreuses, est également fortement exprimé dans la ligne cellulaire HT2921. Le but de ce protocole est de découvrir des groupes de gènes conducteurs dans les tumeurs de type tige du cancer établies basées sur des ensembles de données bioinformatiques plutôt que d’étudier les oncogènes individuels22. Il étudie les mécanismes moléculaires potentiels par l’analyse RNAseq suivie d’analyses bioinformatiques disponibles.
Le séquençage de prochaine génération est une méthode de séquençage de l’ADN à haut débit, facilement disponible et fiable basée sur l’aide informatique, utilisée pour examiner de manière exhaustive les gènes du conducteur pour guider les thérapies tumorales23. La technologie est également utilisée pour détecter l’expression des gènes à partir de la transcription inversée d’un échantillon d’ARN isolé24. Cependant, lors du dépistage avec RNAseq, les gènes les plus importants à cibler avec la thérapie peuvent ne pas avoir le différentiel d’expression le plus élevé entre les échantillons expérimentaux et témoins. Par conséquent, certaines bioinformatiques ont été développées pour classer et identifier les gènes basés sur des ensembles de données actuels tels que KEGG25, GO26,27, ou PANTHER28, y compris l’analyse des voies d’ingéniosité(IPA) 29 et NetworkAnalyst30. Ce protocole montre l’intégration de RNAseq et NetworkAnalyst pour découvrir rapidement un groupe de gènes dans les sphéroïdes sélectionnés dérivés de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29. L’application de cette méthode à d’autres modèles de la maladie est également suggérée pour découvrir des différences dans les gènes importants.
Par rapport à l’étude de l’expression génique individuelle, une technique à haut débit offre des avantages pour trouver des gènes conducteurs potentiels facilement pour la médecine de précision tumorale. Avec des ensembles de données utiles tels que KEGG, GO, ou PANTHER, des gènes spécifiques peuvent être identifiés en fonction des modèles de la maladie, des voies de signalisation, ou des fonctions spécifiques, ce qui permet de se concentrer rapidement sur des gènes spécifiques et importants, ce qui permet d’économiser du temps et des coûts de recherche. Une application similaire est utilisée dans les études précédentes14,18,31. En particulier, une tumeur est plus compliquée parce que différents types de tumeurs expriment des gènes distinctifs et des voies de survie et de prolifération. Par conséquent, ce protocole peut détecter des gènes distinguant différents types de tumeurs dans des circonstances différentes. Il est possible de trouver des stratégies efficaces contre les cancers en comprenant le mécanisme de l’expression spécifique des gènes.
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Protocol
1. Culture cellulaire et formation de tumeursphères
- Culture HT29 cellules dans un plat de 10 cm contenant le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% sérum bovin foetal (FBS) et 1% antibiotique pénicilline-streptomycine (P/S).
- Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions aseptiques, jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence.
- Trypsiniser les cellules HT29 avec 1 mL de trypsine de 0,25% pendant 5 min à 37 °C et par conséquent neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de DMEM avec 10% FBS et 1% P/S.
- Compter les cellules HT29 à l’aide d’un hémocytomètre.
- Ajouter 2 000 cellules/puits à un faible attaché 6 plaques de puits avec 2 mL de DMEM sans sérum avec 1% P/S et complété par 0,2% B27, 20 ng/mL du facteur de croissance épidermique (FEM), 20 ng/mL du facteur de croissance du fibroblaste (bFGF), 20 ng/mL du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) et 20 ng/mL d’interleukine 6 (IL6).
- Faire pousser les cellules à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions aseptiques.
- Ajouter 0,5 mL de cellules souches cancéreuses moyenne tous les 2 jours jusqu’à ce que les tumeurs mesurent >100 μm de diamètre pendant au moins 7 jours.
- Observez et mesurez le diamètre de la tumeur à l’aide d’un microscope inversé avec un système d’imagerie cellulaire numérique.
- Lorsque les tumeurs atteignent >100 μm de diamètre, trypsinize les tumeursphéres avec 0,25% trypsin pendant 5 min à 37 °C et neutraliser la trypsin en ajoutant 2x le volume du milieu de croissance. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifugeuse à 1 200 tr/min pendant 10 min et retirer le supernatant.
- Incuber 5 x 104 cellules avec 2 μL d’anti-LGR5-PE et 2 μL d’anti-CD133-PE dans 100 μL de DMEM individuellement pendant 30 min à température ambiante, en secouant à 200 tr/min.
REMARQUE : Le CD133 est un biomarqueur général des cellules souches cancéreuses qui est fortement exprimé dans les cellules HT29. - Ajoutez 900 μL de PBS et analysez l’expression LGR5 et CD133 à l’aide de la cytométrie de flux. Un changement de fluorescence dans le canal FL2-H indique l’expression des gènes.
2. Isolement de l’ARN
REMARQUE : Utilisez un kit commercial (voir tableau des matériaux)avec une colonne rapide pour l’isolement de l’ARN suivant les instructions du fabricant.
- Ajouter 50 μL de PBS aux cellules récoltées (2 x 105 cellules) et les réutiler avec du pipetage.
- Ajouter 200 μL de tampon de lyse contenant 2 μL de bêta-mercaptoéthanol (β-ME). Vortex rapidement et laisser reposer pendant 5 min.
- Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 10 min. Recueillir le supernatant et mélanger avec 200 μL d’éthanol à 70 %.
- Utilisez la colonne jointe pour enlever le solvant par centrifugation à 14 000 x g pendant 1 min.
- Laver à l’aide de la solution de lavage 1 et 2 pour éliminer complètement les non-ARN par centrifugation à 14 000 x g pendant 1 min.
- Centrifugeuse à nouveau à 14.000 x g pendant 2 min pour enlever l’éthanol résiduel.
- Ajouter 50 μL d’eau distillée, la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 1 min et la recueillir.
- Mesurer la concentration d’ARN à l’aide de l’OD260 à l’aide d’un spectrophotomètre.
Concentration d’ARN (μg/mL) = (OD260) x (40 μg ARN/mL) et OD260/OD280 > 2. Les échantillons d’ARN doivent avoir un numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) > 7.
3. Profilage RNAseq et analyse bioinformatique
REMARQUE : L’analyse RNAseq a été effectuée commercialement (voir tableau des matériaux)pour étudier les gènes différentiels dans les tumeurs dérivées de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29.
- Utilisez les services commerciaux pour les étapes RNAseq, y compris la construction de bibliothèques, le contrôle de la qualité de la bibliothèque et le séquençage de l’ADN.
- Le rapport de données doit contenir des informations importantes, y compris les nombres de lecture, la modification de la liste2 et la valeur p. Sélectionnez les gènes différentiels selon les paramètres suivants : les gènes avec un changement de 1 log2 avec le nombre de lectures >100 dans le groupe HT29 tumorsphere, et les gènes <-1 log2 changent avec le nombre de lectures >100 dans le groupe parental HT29. Dans ce cas, une valeur p < 0,05 a été jugée acceptable et les données ont été utilisées (Tableau 1).
NOTE : Ici, un nombre de gènes >100 a été utilisé comme seuil pour poursuivre l’étude d’un gène particulier et valider son expression. - Utilisez un logiciel d’analysestatistique (voir tableau des matériaux), pour afficher une carte thermique et identifier les gènes surexprimés >1 et les gènes réglementés < 1 dans le changement de pli log2.
- Utilisez le logiciel R pour dessiner la parcelle de volcan avec x: log2 changement de pli; y: -log10 (valeur p) pour montrer les gènes différentiels.
- Installer la bibliothèque R
install.packages(library(calibrage)) - Lisez les données dans RStudio avec le programme suivant :
res <-read.csv(« /Users/xxx.csv », en-tête=T)
tête(rés)
avec(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC vs HT29 », xlim=c(-6,6), col="#C0C0C0 »))
avec(sous-ensemble(res, pwue<.05 & log2FoldChange>1), points(log2FoldChange, -log10(pwtore), pch=19, col="red »))
avec(sous-ensemble(res, pwue<.05 & log2FoldChange<(-1)), points(log2FoldChange, -log10(pwe), pch=19, col="blue »))
avec(sous-ensemble(res, pwue>.05), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, col="#444444 »))
abline(h=1,3, lty=2)
abline(v=1, lty=2)
abline(v=(-1), lty=2) - Exécutez la course pour obtenir le volcan Plot.
- Installer la bibliothèque R
4. Sélection des gènes du conducteur
- Sélectionnez Entrée de gène unique dans NetworkAnalyst.
- Copier et coller les gènes surexprimés sélectionnés du tableau 1 avec « humain » spécifié comme symbole génétique officielde type organisme et ID .
REMARQUE : Sinon, utilisez Ensembl Gene ID pour copier-coller. - Insérez les données en cliquant sur Télécharger et procéder à l’analyse à l’aide de l’interaction protéines-protéines (PPI) suivant l’IPP génétique.
- Utilisez la base de données string interactome avec une coupure de score de confiance de 900 pour montrer les gènes de semences qui relient les gènes téléchargés. Les gènes des graines associés à un plus grand nombre de gènes individuels ont été choisis comme gènes moteurs qui peuvent être impliqués dans le maintien de la formation de tumeurs dérivées de HT29.
REMARQUE : Il existe trois ensembles de données interactives à utiliser : IMEx, STRING et Rolland. STRING contient des preuves expérimentales de confiance plus élevées. Avec des nombres de gènes téléchargés plus faibles, IMEx peut être sélectionné pour prédire et capter les gènes du conducteur dans les réseaux interactome. - Sélectionnez Procéder dans la vue d’ensemble du mappage.
- Sélectionnez Blanc dans l’atlas d’arrière-plan et force dans le bouton Disposition.
- Sélectionnez PANTHER BP pour analyser le groupe de gènes upregulation.
NOTE : Ceci montre que HSPA5 était responsable de l’anti-apoptose dans les tumeurs HT29-dérivées dans cette étude (Figure 3A). Pour affiner le champ fonctionnel spécifique, la classification KEGG, GO ou PANTHER peut être utilisée alternativement pour sélectionner les gènes de pilote spécifiques.
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Representative Results
Pour établir le modèle d’étude du mécanisme dans les cellules souches cancéreuses, des cellules ht29 colorectales ont été employées pour la culture des tumeurs de tige-comme de cancer in vitro dans une plaque à faible attachement contenant B27, EGF, bFGF, HGF, et IL6. Les tumeursphères >100 μm de diamètre ont été formées en 7 jours (Figure 1A). Les tumeursphéres ont été trypsinized aux cellules simples et analysées utilisant la cytométrie de flux pour détecter l’expression de LGR5 et DE CD133. LGR5 a augmenté dans les tumeurs HT29-drived de 1,1% à 11,4% et les cellules ont été détectées à l’aide de cytométrie de flux (Figure 1B). Un autre marqueur de stemness, CD133, est également passé de 61,8% à 81,1% dans les tumeurs cultivées dérivées de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29 (Figure 1C). Ensuite, les tumeurs étaient prêtes pour l’enquête RNAseq.
RNAseq a été utilisé pour étudier le profil d’expression de gène dans les tumeurs HT29-dérivées comparées aux cellules parentales HT29. Le taux d’erreur dans la lecture des nucléotides était de 0,03 % pour les deux échantillons. Le taux total de cartographie génétique était de 87,87 % pour ht29 et de 87,25 % pour les tumeurs dérivées de HT29. Les fragments par kilobase de transcription par million (FPKM), la normalisation des comptes de détective pour indiquer la transcription (ARNm) expression, intervalle entre 0 et 1 était de 75,87% pour les cellules HT29, et 77,16% pour les tumeurs dérivées HT29. Les résultats étaient appropriés pour le séquençage conséquent. Après le séquençage lit, les gènes avec log2 changent >1 dans la upregulation et <-1 en downregulation avec la valeur p < 0.05 indiquée par la carte thermique (Figure 2A,Tableau 1,Tableau 2) ont été sélectionnés. Il y avait 79 gènes upregulated et 33 gènes downregulated sélectionnés. En outre, l’intrigue du volcan utilisant le changement de pli log2 et la valeur p (-log10 p valeur) a été utilisée pour distinguer les gènes significatifs entre les tumeurs dérivées de HT29 et les cellules parentales HT29 (Figure 2B). Sur la base de la sélection préliminaire, trois gènes potentiellement upregulated ont été identifiés, y compris ACSS2, HMGCS1, et PCSK9, dans les tumeurs dérivées HT29 (Figure 2A). En outre, afin d’identifier les gènes de conducteur non seulement en fonction du changement de pli log2, NetworkAnalyst a été utilisé. Les gènes upregulated avec log2 fold change >1 avec la valeur p <0.05 ont été analysés et ont abouti à 10 gènes de semences reliant les réseaux génétiques, y compris HSPA5, HSP90AA1, BRCA1, SFN, E2F1, COCS, CDC6, ALYREF, SQSTM1, et TOMM40 (Figure 3A). Pour identifier la fonction et l’importance des gènes des graines, l’interface de classification pourrait être utilisée pour effectuer PANTHER BP afin de déterminer les gènes impliqués dans l’anti-apoptose dans les tumeurs dérivées de HT29. Les résultats indiquent que HSPA5 et SQSTM1 ont été associés à une régulation négative de l’apoptose (figure 3A). En outre, les 10 gènes sélectionnés ont donc été validés; l’expression a augmenté dans les tumeurs dérivées de HT29 comme confirmée à l’aide de qPCR (Figure 3B).
Figure 1 : Établissement in vitro d’une tumeur semblable à une tige cancéreuse. (A) HT29 a été utilisé pour former des tumeursphères, et (B) LGR5 a été détecté dans les tumeurs dérivées HT29 (Barre d’échelle = 100 μm). (C) CD133 a été utilisé comme un autre marqueur pour identifier les caractères de stemness dans les tumeurs établies. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Heatmap et volcan complot ont été utilisés pour sélectionner les gènes différentiels dans les tumeurs dérivées HT29. Changement de pliage log2 >1 et <-1 avec le nombre de lecture >100, p valeur < 0,05 ont été utilisés pour exclure les gènes non significatifs et s’assurer que les données étaient exactes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : NetworkAnalyst a été utilisé pour identifier les gènes conducteurs dans les tumeurs dérivées de HT29. (A) Les gènes upregulated ont été sélectionnés et analysés par conséquent, et une interface de classification, PANTHER BP, a fourni les fonctions potentielles pour les gènes de conducteur différentiel. (B) Puis, qPCR a été employé pour valider les 10 gènes upregulated dans les tumeurs HT29-dérivées comparées aux cellules parentales de HT29. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1 : Les gènes upregulated dans les tumeurs HT29-serived par rapport aux cellules parentales HT29 analysées par RNAseq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Les gènes dégulés dans les tumeurs HT29-serived par rapport aux cellules parentales HT29 analysées par RNAseq. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Dans cette étude, des tumeurs de tige de cancer cultivées ont été employées comme modèle dans l’analyse des données de RNAseq avec la bioinformatique disponible. Pour un modèle de maladie, des tumeurs HT29-dérivées ont été employées. Parce que les tumeurs ont une résistance aux médicaments contre les thérapies tumorales, le modèle établi peut être utilisé pour étudier les mécanismes détaillés de la résistance en étudiant les différences dans l’expression des gènes. En outre, la technologie génomique utilisant RNAseq avec la bioinformatique disponible fournit une compréhension rapide du modèle d’étude afin que les gènes potentiellement impliqués puissent être validés avec une plus grande confiance. En outre, le genre de gènes impliqués dans la formation des tumeursphéres peut être identifié.
La qualité de l’ARN est essentielle pour l’analyseRNAseq 32. Assurez-vous que l’échantillon a RIN >7, car il augmente la certitude entre la cartographie des lectures, la cartographie des gènes et fpkm. Lors de l’analyse des données RNAseq,IPA 29 et NetworkAnalyst30 étaient disponibles pour identifier les gènes potentiels et les voies de signalisation. Cependant, il est essentiel d’exclure les gènes inutiles selon les paramètres suivants : les gènes montrant un changement de fold >1 log2 avec les comptes de lecture >100 dans le groupe expérimental, et les gènes <-1 log2 changent avec le nombre de lecture > 100 dans le groupe témoin. Des nombres de lecture plus élevés sont plus faciles pour la validation conséquente à l’aide de taches qPCR ou occidentales.
Sur la base de la compréhension des fonctions et des processus biologiques, il existe de nombreux outils de bioinformatique permettant une étude rapide des mécanismes potentiels des maladies d’intérêt. Combinés à un outil à haut débit pour dépister l’expression des gènes tels que RNAseq, des mécanismes potentiels régulant le développement des maladies étudiées peuvent être proposés et étudiés. Ici, la méthode d’étude de la formation des tumeurs de tige-comme CRC dérivées de HT29 a indiqué que SQSTM1 et HSPA5 étaient les gènes cibles upregulated et impliqués dans l’anti-apoptose dans les tumeursphères. Par conséquent, d’autres expériences peuvent être conçues pour étudier le mécanisme détaillé de ces gènes, ce qui se traduit par plus de confiance et d’efficacité lors de la réalisation d’études de recherche.
Ici, seuls les gènes upregulés dans les tumeurs ont été analysés parce que l’upregulation a été considérée comme induite par l’ajout des facteurs de croissance. Sinon, si l’expérience utilisait l’effondrement génétique dans les cellules tumorales, les gènes dégulés seraient considérés comme des cibles qui peuvent être sélectionnées pour l’étude en utilisant la bioinformatique. Bien que la méthodologie soit rapide et fiable, la validation ultérieure est toujours nécessaire par l’intermédiaire de taches qPCR et occidentales. Il est également suggéré que plus de lignées cellulaires soient utilisées pour la validation de l’expression génique, en particulier pour les échantillons cliniques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de divulgation financière pertinente.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Laboratoire de biologie des radiations de l’Institut de recherche radiologique de l’hôpital Chang Gung Memorial pour son soutien technique. Cette étude a été soutenue par des subventions de l’hôpital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), de l’hôpital général Cheng Hsin (CHGH 106-06) et de l’hôpital Commémoratif Mackay (MMH-CT-10605 et MMH-106-61). Les organismes de financement n’ont eu aucune influence dans la conception de l’étude et de la collecte, de l’analyse et de l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| iRiS Digital Cell Imaging System | Logos Biosystems, Inc | I10999 | for observing the formation of tumorspheres |
| Flow cytometry | BD biosciences | FACSCalibur | for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres |
| anti-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 detection reagent |
| anti-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 detection reagent |
| EGF | GenScript | Z00333 | for culture of tumorspheres |
| bFGF | GenScript | Z03116 | for culture of tumorspheres |
| HGF | GenScript | Z03229 | for culture of tumorspheres |
| IL6 | GenScript | Z03034 | for culture of tumorspheres |
| PureLink RNA extraction kit | Invitrogen | 12183025 | isolate total RNA for RNAseq analysis |
| RNAseq performance | Biotools, Taiwan | RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan | |
| NetworkAnalyst | Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | a statistical analysis software |
References
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