Imagerie en temps réel de la migration induite par CCL5 de cellules souches squelettiques périostées chez la souris

La réparation des fractures est un processus dynamique et multicellulaire qui se distingue du développement et du remodelage du squelette embryonnaire. Au cours de ce processus, l’induction de signaux de blessure provenant de tissus endommagés est suivie du recrutement, de la prolifération et de la différenciation subséquente des cellules souches/progénitrices squelettiques, qui sont toutes essentielles à la stabilité globale et à la fixation des ^fractures1. En particulier, les premiers stades de la guérison des fractures nécessitent la formation de callosités molles, qui est principalement attribuée aux cellules résidentes périostées2. Lorsque les os sont blessés, un sous-ensemble de cellules périostées réagit rapidement et contribue à de nouveaux intermédiaires cartilagineux et ostéoblastes dans le ^callosité3, impliquant la présence d’une population distincte de cellules souches squelettiques / progénitrices dans le périoste. Par conséquent, l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches squelettiques (CSE) résidentes du périoste constituent une approche thérapeutique prometteuse pour les maladies osseuses dégénératives et les défauts ^osseux4.

On pense que les SSC résident dans plusieurs emplacements tissulaires, y compris la moelle osseuse. À l’instar de la moelle osseuse, des SSC ostéogéniques/chondrogènes ont également été identifiés dans le périoste4,5,6.  Ces SSC périostés (P-SSC) peuvent être marqués avec des marqueurs de lignée mésenchymateuse précoce (c.-à-d. Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 et Axin2-CreER8) au cours du développement osseux du fœtus4,7,8,9,10. Une limitation importante de ces modèles de traçage de lignée génétique unique est qu’il existe une hétérogénéité substantielle au sein des populations cellulaires marquées. De plus, ils ne peuvent pas distinguer les SSC étiquetés de leur progéniture in vivo. Pour remédier à cette limitation, nous avons récemment développé une souris rapporteur double (Mx1-Cre⁺Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺) pour visualiser distinctement les P-SSC des SSC de moelle osseuse (BM-SSCs)¹¹. Avec ce modèle, il a été déterminé que les P-SSC sont marqués par un double marquage Mx1⁺αSMA⁺, tandis que les cellules Mx1⁺ plus différenciées résident dans la moelle osseuse, les surfaces endostéale et périostéale, ainsi que dans les os corticaux et trabéculaires11,12.

De multiples cytokines et facteurs de croissance sont connus pour réguler le remodelage et la réparation des os et ont été testés pour l’amélioration de la réparation squelettique dans les défauts critiques du ^segment1,13. Cependant, en raison de la complexité cellulaire des modèles de blessures générés par la perturbation de la barrière physique du compartiment osseux, les effets directs de ces molécules sur la migration et l’activation endogènes de P-SSC pendant la guérison ne sont pas clairs. Les caractéristiques fonctionnelles et la dynamique migratoire des SSC sont souvent évaluées in vitro en effectuant un test de transpuit ou de grattage, en combinaison avec des cytokines ou des facteurs de croissance connus pour induire la migration dans d’autres populations cellulaires. Ainsi, l’interprétation des résultats de ces expériences in vitro pour une application dans leurs systèmes in vivo correspondants est difficile. À l’heure actuelle, l’évaluation in vivo de la migration des cellules souches/progénitrices squelettiques n’est généralement pas observée en temps réel; il est plutôt mesuré à des points temporels fixes après la fracture5,7,14,15,16.

Une limite de cette méthode est que la migration n’est pas évaluée au niveau d’une seule cellule; il est plutôt mesuré par des changements dans les populations cellulaires. Grâce aux progrès récents de la microscopie intravitale d’animaux vivants et à la génération de souris rapporteures supplémentaires, le suivi in vivo de cellules individuelles est désormais possible. En utilisant la microscopie intravitale d’animaux vivants, nous avons observé la migration distincte des P-SSC de la niche de suture calvariaire vers une lésion osseuse dans les 24 à 48 heures suivant la blessure chez les souris Mx1 / Tomato / αSMA-GFP.

CCL5/CCR5 a récemment été identifié comme un mécanisme de réglementation influençant le recrutement et l’activation des P-SSC au cours de l’intervention précoce en cas de blessure. Fait intéressant, il n’y a pas eu de détection en temps réel d’une migration importante de P-SSC en réponse à une blessure. Cependant, le traitement d’une blessure avec CCL5 produit une migration robuste et directionnelle distincte des P-SSC, qui peut être capturée en temps réel. Par conséquent, l’objectif de ce protocole est de fournir une méthodologie détaillée pour enregistrer la migration in vivo des P-SSC en temps réel après le traitement par CCL5.

Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine.

1. Préparation de la souris

1. Croisez des souris ^Mx1-Cre17 et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)¹⁸ (achetées au jackson Laboratory) avec des souris αSMA-GFP (fournies ici par les Drs Ivo Kalajzic et Henry Kronenberg) pour générer des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato⁺α SMA-GFP⁺ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figure 2A).
2. Pour l’induction Mx1-Cre, injecter aux souris 25 mg/kg de pIpC tous les deux jours pendant 10 jours.
3. Irradier des souris avec 9,5 Gy 1 jour avant la transplantation intraveineuse de 1 x ¹⁰⁶ cellules mononucléaires de moelle osseuse entières de souris sauvages C57BL/6 (WT-BMT)¹⁹.
4. Après 6 à 8 semaines de récupération, soumettez les souris à l’imagerie in vivo du protocole de migration cellulaire périostée décrit ci-dessous.
   REMARQUE: L’irradiation et le WT-BMT des souris Mx1-Cre sont nécessaires pour éliminer les cellules hématopoïétiques marquées mx1 de manière endogène qui peuvent répondre à une blessure. Six à huit semaines après l’irradiation, le nombre de cellules hématopoïétiques de l’hôte est à <5 % et donc prêt pour ^{l’imagerie19}.

2. Dispositif de retenue de souris et support d’imagerie

1. Créez un dispositif de retenue pour souris avec un tube conique de 50 mL (Figure 1A).
   1. À l’aide de ciseaux pointus, percez un trou dans le fond du conique. Couper du trou inférieur au sommet du conique (le côté coupé sera le haut du dispositif de retenue).
   2. Faites une coupe d’environ 4 à 5 cm de long parallèlement à la coupe précédente et à mi-chemin (~2 cm) du haut du dispositif de retenue. Enlevez cette section du conique et lissez les bords étaient nécessaires.
2. Construisez un support d’imagerie à tube conique à l’aide d’une plaque d’angle réglable, d’un poteau optique de 0,5 po et d’une pince à angle droit pour le poteau de 0,5 po, hexagonal de 0,1875 po (Figure 1B et table des matériaux).
   1. Ajustez la plaque d’angle à un angle de 35°. Sur le côté gauche de la plaque d’angle, vissez le poteau optique dans le deuxième trou à partir de l’arrière de la plaque.
   2. Sur le côté droit de la plaque réglable, insérez une vis à molette hexagonale de 0,25 pouce à ressort de 0,1875 po à ressort dans le deuxième trou à partir de l’avant et les derniers trous de la plaque. La pince à angle droit sera utilisée avec le poteau optique pour fixer le dispositif de retenue conique de la souris en place.

3. Intervention chirurgicale préopératoire

1. Anesthésie de la souris
   1. Pour la gestion de la douleur, injecter par voie sous-cutanée à la souris de la buprénorphine à libération prolongée (1 mg/kg p.c.) 30 à 60 minutes avant la chirurgie.
   2. Anesthésier les souris à l’aide d’une anesthésie par combinaison CCM (combo III) de rongeurs contenant 37,5 mg/mL de kétamine, 1,9 mg/mL de xylazine et 0,37 mg/mL d’acépromazine. La posologie appropriée pour les souris est de 0,75 à 1,50 mL par 1 kg de poids corporel. La dose durera de 30 à 45 minutes.
   3. Une fois la souris anesthésiée, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux avec un coton-tige stérile pour prévenir la déshydratation des yeux.
   4. Pour l’imagerie à long terme (>45 min), administrer à nouveau l’anesthésie pour maintenir une profondeur d’anesthésie appropriée comme suit.
      1. Préparer une seringue de 1 mL avec une quantité suffisante de combo III pour maintenir l’anesthésie pendant la durée d’imagerie prévue (0,75 mL/kg p.c. par 30 min de sédation supplémentaire). Fixez un ensemble de perfusion d’aiguille papillon de 25 G avec un tube de 12 po à la seringue et poussez l’anesthésique à travers le tube et l’aiguille.
      2. Insérez l’aiguille papillon par voie intrapéritonéale, puis collez l’aiguille en place.
         REMARQUE: C’est ainsi que le combo III supplémentaire sera administré pendant l’imagerie de sorte qu’il n’est pas nécessaire de déplacer l’animal ou de perturber le plan de vue.
   5. Fournir un support thermique avec un coussin chauffant maintenu à 37 ° C tout au long de la procédure. Pour une imagerie prolongée (>1 heure), un support de fluide supplémentaire sera nécessaire.  Des liquides supplémentaires peuvent être fournis par voie intraveineuse avec un Combo III supplémentaire pendant l’imagerie ou une solution saline de 33 mL/kg (0,9 NaCl) par voie sous-cutanée.
2. Contention de la souris et préparation du site chirurgical
   1. Utilisez des tondeuses pour enlever autant de poils que possible du haut de la tête. Appliquez la crème dépilatoire sur la zone rasée pour enlever les poils restants au site chirurgical.
   2. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée par un manque de réponse aux pincements d’orteils. Après 15 min, si la souris n’est pas complètement anesthésiée, administrer une deuxième dose plus faible de combo III (<0,75 mL/kg p.c.).
   3. Placez la souris dans la queue de retenue en premier, en la faisant glisser suffisamment vers l’arrière pour que le nez pende légèrement au-dessus du bord du conique.
   4. Collez les pattes avant au fond du tube conique à l’aide de ruban adhésif médical.
   5. Placez le tube conique avec la souris sur un support d’imagerie réglé à un angle de 35° et fixez-le à l’aide de la pince à angle droit (Figure 1C).
   6. Une fois la souris fixée dans le support d’imagerie, nettoyez le site chirurgical 3x avec des gommages alternés de gommage à la bétadine et d’alcool isopropylique à 70%. Encore une fois, vérifiez que l’animal est complètement sous sédation.
   7. Déplacez la souris sur un tampon absorbant propre et placez un drapé sur la souris pour créer un grand champ stérile.

4. Intervention chirurgicale

1. Incision d’ouverture
   1. À l’aide d’une pince à pointe fine, ramassez la peau immédiatement médiale jusqu’à l’oreille droite. Avec des ciseaux à microdissection, coupez la peau maintenue par la pince.
      REMARQUE: Initier l’incision en utilisant la méthode décrite ci-dessus crée une incision arrondie qui convient mieux à la suture après la procédure.
   2. Faites une incision transversale à partir de l’incision initiale vers l’oreille gauche (<1 cm).  Faites une autre incision, à partir de l’incision initiale, vers le nez de l’animal (~ 2–3 mm après l’œil droit).
   3. Séparez la peau du périoste à l’aide de la pince et des ciseaux pour couper doucement à travers le tissu conjonctif séparant la peau du périoste de calvaria.
   4. À l’aide d’un coton-tige stérile, appliquez une pommade ophtalmique sur le dessus du lambeau de peau.  Ramassez doucement le lambeau de peau et pliez-le sur l’œil gauche. L’intersection des sutures sagittales et coronales doit être clairement exposée (Figure 1E).
      REMARQUE: La pommade ophtalmique est utilisée pour maintenir le lambeau de peau en place.
   5. Rincez la surface ouverte avec du PBS stérile pour nettoyer la zone de tout sang et poils résiduels.
      REMARQUE: Si nécessaire, utilisez une pince à pointe fine pour enlever les poils qui restent après le rinçage, mais veillez à ne pas endommager le périoste.
2. Microfracture
   1. Pour générer des microfractures sur la calvaire, retirez le piston d’une seringue à insuline de 29 G et coupez l’extrémité arrière de la seringue, autour des marques de 300 à 400 uL.
      REMARQUE: Cette étape facilite la manœuvre sous une portée de dissection lors de la production de la blessure.
   2. Placez l’extrémité d’un biseau (une à deux largeurs d’aiguille) vers le nez à partir de la suture coronale et une à deux largeurs d’aiguille à droite de la suture sagittale (Figure 1E).
   3. Faites tourner doucement la seringue dans le sens des aiguilles d’une montre, puis dans le sens inverse des aiguilles d’une montre plusieurs fois.
      REMARQUE: Chez les jeunes souris, une très petite quantité de pression vers le bas est nécessaire pour créer une microfracture circulaire. Veillez à ne pas laisser l’aiguille pénétrer dans le cerveau, car cela provoquerait des saignements et interférerait avec l’imagerie.
   4. Utilisez une aiguille de 27 G pour élargir la microfracture à ~0,4 mm. S’il reste des fragments d’os dans la microfracture, rincez la zone avec du PBS. S’il reste encore des fragments d’os dans la microfracture, utilisez l’aiguille de 29 G pour les extraire doucement.
   5. Répétez les étapes 4.2.1 à 4.2.4 pour créer une blessure sur le côté gauche de la suture sagittale.
      REMARQUE: À ce stade, il existe deux options: 1) procéder immédiatement au traitement par CCL5 (rubrique 4.3) et à l’imagerie (rubrique 5); ou 2) fermer le site chirurgical à la suite des procédures postopératoires visées à la rubrique 6. 24 heures plus tard, anesthésiez à nouveau la souris, rouvrez la vue chirurgicale, traitez la blessure avec CCL5 (rubrique 4.3) et effectuez une imagerie intravitale (section 5) et des soins postopératoires (rubrique 6).
3. Traitement CCL5
   1. À partir d’un stock de RANTES (100 ng/mL), fabriquer une solution de 10 ng/mL à l’aide d’une matrice à membrane basale (Table des matériaux). Conservez cette solution sur la glace pour garder la matrice sous forme liquide.
   2. Traiter chaque blessure avec 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) à l’aide d’une pipette de 2 à 20 μL (cette pointe de pipette a un diamètre plus grand, ce qui est plus efficace lors de l’utilisation d’un liquide visqueux). Laissez la matrice se solidifier.
   3. Une fois la matrice solidifiée, couvrez doucement la calvaire avec le lambeau de peau pour vous assurer que le tissu ne se déshydrate pas. Incuber pendant 1 h avant l’imagerie.

5. Imagerie intravitale

1. Paramètres du microscope
   1. Allumez le laser multiphoton (laser titane-saphir femtoseconde). Réglez la longueur d’onde sur 880 nm et ajustez la puissance pour l’imagerie de deuxième génération harmonique (SHG) (440 nm) de l’os.
   2. Allumez les lasers à semi-conducteurs 488 nm et 561 nm pour l’excitation des cellules exprimant GFP et tdTomato, respectivement.
   3. Allumez les détecteurs PMT (tube photomultiplicateur) pour la deuxième génération d’harmoniques (détection 405-455 nm) et GFP (détection 505-550 nm). Activez le détecteur HyD 3 pour le signal de la tomate (détection 590-620 nm).
2. Montage
   1. Avant de déplacer la souris vers la lunette, vérifiez le plan visuel de la calvaire en appuyant doucement sur l’arrière de la tête de la souris. Si le plan n’est pas de niveau, ajustez la position en faisant pivoter doucement le dispositif de retenue de la souris vers la gauche ou la droite.
      REMARQUE: Il s’agit d’une étape critique pour garantir une qualité d’image suffisante.
   2. Appliquer de la méthylcellulose stérile à 2 % dans l’eau (p/v) pour couvrir toute la calvaire et le lambeau de peau et éviter le dessèchement des tissus.
   3. Placez la souris sur l’étage du microscope motorisé à axe XYZ (Figure 1G). En utilisant la lumière épifluorescente, alignez la souris de sorte que 1) elle soit orientée vers le microscope et 2) l’intersection des sutures coronales et sagittales soit le point de référence centré de la scène.
   4. Placez le couvercle en verre sur la zone d’imagerie et vérifiez l’alignement (Figure 1H).
3. Imagerie time-lapse
   1. Utilisez une lentille à faible grossissement (objectif d’immersion dans l’eau 25x avec NA = 0,95) pour scanner la calvaire. Acquérir une image de référence de l’intersection de la suture sagittale et coronale.
   2. À l’aide du SHG et des signaux fluorescents des cellules, localisez chaque vue de blessure et enregistrez les coordonnées XYZ ainsi que les distances des sutures sagittales et coronales (Figure 2B).
   3. Choisissez un emplacement sur les sutures coronales ou sagittales pour l’imagerie à long terme. Prenez une image détaillée de la pile Z de cette zone à partir de la référence pendant l’imagerie.
      REMARQUE: Étant donné que les sutures représentent une niche P-SSC connue, c’est de là que les cellules migreront en réponse à la lésion de la calvaire.
   4. Utilisez les paramètres du logiciel time-lapse pour enregistrer une image toutes les 1 min pendant au moins 1 h. Entre les instantanés, comparez le champ de vision actuel avec le champ de vision initial. S’ils sont différents, utilisez l’image Z-stack pour déterminer dans quelle direction le champ de vision doit être ajusté.

6. Soins postopératoires aux animaux

1. Après imagerie, rincer la calvaire exposée avec du PBS stérile pour éliminer la méthylcellulose.
2. Pour fermer l’incision, placez doucement le lambeau de peau sur la calvaire. Utilisez des cotons-tiges stériles pour enlever la pommade ophtalmique résiduelle et sécher le site d’incision.
3. À l’aide de sutures non absorbables en nylon monofilament de taille 5-0 avec une aiguille de coupe inversée C-1 attachée, fermez le site chirurgical. Utilisez un coton-tige stérile pour appliquer une pommade antibiotique triple sur l’incision fermée.
   REMARQUE: Les cicatrices sont réduites avec des techniques de suture de haute qualité et un saignement minimal.
4. Placez la souris dans une cage propre sur une surface chaude et vérifiez toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la position couchée sternale soit atteinte.
5. Administrer une deuxième dose de buprénorphine à libération prolongée 72 h après la chirurgie.
6. Surveillez quotidiennement le comportement de câlin, la fourrure ébouriffée et / ou le manque de déambulation jusqu’à ce que les sutures soient retirées (~ 1 semaine).

Il a été proposé que les progéniteurs squelettiques aient un potentiel migratoire ou circulatoire20. Récemment, des souris rapporteures Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) ont été générées, dans lesquelles les P-SSC sont marquées par un double marquage Mx1+α SMA+ (Figure 2A,B). Une migration importante des P-SSC Mx1+α SMA+ s’est produite hors du mésenchyme de suture dans les 24 à 48 heures suivant la blessure11.  La possibilité de détecter la migration in vivo de P-SSC en temps réel 24 heures après un défaut de calvaire a également été testée. Peu ou pas de migration des P-SSC Mx1+αSMA+ a été observée dans les 1 h suivant l’imagerie (Figure 2C).

Les P-SSC Mx1+α SMA+ expriment de manière unique le récepteur CCL5 connu sous le nom de CCR511. Ainsi, le traitement d’un défaut de calvarie 24 h après la blessure avec CCL5 a induit une migration directionnelle distincte loin de la suture coronale et vers la vue de la blessure (Figure 2D, E). Dans les 1 h suivant l’imagerie, l’un des P-SSC Mx1+αSMA+ a migré d’environ 50 μm vers la blessure (Figure 2E). D’autres P-SSC Mx1+αSMA+ ont également été observés en migration en réponse au traitement par CCL5, mais dans une moindre mesure.

Figure 1 : Configuration pour l’imagerie in vivo des calvaries de souris. Images représentatives de la contention de souris (A) et de la monture d’imagerie (B) utilisées lors de l’imagerie en direct. (C) Souris dans le dispositif de retenue et fixée au support d’imagerie. (D) Représentation schématique de la structure des calvariaires de souris, identifiant les sutures frontales (FS), coronales (CS), sagittales (SS) et lambdoïdes (LS). (E) Placement représentatif des lésions de microfracture de calvarie. (F) Mise en place d’une suture chirurgicale postopératoire pour une guérison optimale et une imagerie future. Images représentatives du placement de la monture sur l’étage du microscope (G) et du placement du couvercle (H). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Imagerie in vivo en temps réel de la migration Mx1+αSMA+ P-SSC. (A) Schéma de la préparation de souris double rapporteurEs Mx1/Tomato/αSMA-GFP.  Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 25 mg / kg de pIpC tous les deux jours pendant 10 jours (1). Les souris Mx1/Tomato/αSMA-GFP ont été irradiées létalement avec 9,5 Gy (2) 1 jour avant la transplantation intraveineuse de 1 x 106 cellules mononucléaires de moelle osseuse entières de souris WT C57BL/6 (3).  Après 6 à 8 semaines de récupération (lorsque les cellules hématopoïétiques de l’hôte sont inférieures à 5%), les souris ont été soumises à des expériences de lésion osseuse. Mx1+ (Tomato+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomato+GFP+) et os (bleu). (B) Projection Z maximale d’une lésion de calvaire représentative (cercle blanc) et localisations d’imagerie (carré blanc) par rapport aux sutures sagittales (SS) et coronales (CS) de souris Mx1/Tomato/αSMA-GFP.  Les lignes pointillées représentent les sutures de calvaria. (C) L’imagerie in vivo de la réponse des P-SSC Mx1+α SMA+ 24 heures après la blessure. Barre d’échelle = 25 μm. (D) 24 heures après la blessure, CCL5 a été administré à la vue de la blessure, et l’imagerie in vivo a été effectuée 1 h plus tard en ce qui concerne la suture coronale (CS). Le carré blanc représente l’emplacement des images de migration cellulaire illustrées dans (E). Barre d’échelle = 75 μm.  (E) Migration des P-SSC Mx1+α SMA+ sur la surface osseuse (bleue) vers la vue de la blessure (en haut à droite). Barre d’échelle = 25 μm. Dans (C, D, E), les chiffres indiquent l’heure de l’imagerie. La flèche jaune indique la direction de l’emplacement de la blessure. L’astérisque indique la trajectoire migratoire de Mx1+α SMA+ P-SSC. L’image est représentative des résultats de trois à cinq souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L.C.O. et D.P. divulguent un brevet en instance intitulé « Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair » (BAYM. P0264US. P1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.