Summary
यह प्रोटोकॉल जीवित पशु इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में सीसीएल 5-मध्यस्थता पेरिओस्टेल स्केलेटल स्टेम सेल माइग्रेशन का पता लगाने का वर्णन करता है।
Abstract
पेरिओस्टेल कंकाल स्टेम सेल (पी-एसएससी) आजीवन हड्डी के रखरखाव और मरम्मत के लिए आवश्यक हैं, जिससे उन्हें फ्रैक्चर उपचार को बढ़ाने के लिए उपचार के विकास के लिए एक आदर्श ध्यान केंद्रित किया जाता है। पेरिओस्टेल कोशिकाएं फ्रैक्चर उपचार के लिए नए चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोब्लास्ट की आपूर्ति करने के लिए तेजी से एक चोट में स्थानांतरित होती हैं। परंपरागत रूप से, सेल माइग्रेशन को प्रेरित करने के लिए एक साइटोकाइन की प्रभावकारिता केवल एक ट्रांसवेल या खरोंच परख प्रदर्शन करके विट्रो में आयोजित की गई है। मल्टीफोटॉन उत्तेजना का उपयोग करके इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी में प्रगति के साथ, यह हाल ही में पता चला था कि 1) पी-एसएससी प्रवासी जीन सीसीआर 5 को व्यक्त करते हैं और 2) सीसीआर 5 लिगैंड के साथ उपचार जिसे सीसीएल 5 के रूप में जाना जाता है, फ्रैक्चर उपचार में सुधार करता है और सीसीएल 5 के जवाब में पी-एसएससी के प्रवास में सुधार करता है। इन परिणामों को वास्तविक समय में कैप्चर किया गया है। यहां वर्णित एक प्रोटोकॉल है जो सीसीएल 5 के साथ उपचार के बाद चोट की ओर कैल्वेरियल सीवन कंकाल स्टेम सेल (एसएससी) आला से पी-एसएससी माइग्रेशन की कल्पना करने के लिए है। प्रोटोकॉल एक माउस संयम और इमेजिंग माउंट के निर्माण, माउस calvaria की शल्य चिकित्सा तैयारी, एक calvaria दोष के प्रेरण, और समय अंतराल इमेजिंग के अधिग्रहण का विवरण देता है।
Introduction
फ्रैक्चर मरम्मत एक गतिशील, बहुकोशिकीय प्रक्रिया है जो भ्रूण कंकाल के विकास और रीमॉडलिंग से अलग है। इस प्रक्रिया के दौरान, क्षतिग्रस्त ऊतक से चोट के संकेतों के प्रेरण के बाद कंकाल स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं की तेजी से भर्ती, प्रसार और बाद के भेदभाव का पालन किया जाता है, जो फ्रैक्चर 1 की समग्र स्थिरता और निर्धारण के लिए सभी महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, फ्रैक्चर हीलिंग के शुरुआती चरणों में नरम कैलस गठन की आवश्यकता होती है, जिसे मुख्य रूप से पेरिओस्टेल निवासी कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है2। जब हड्डियां घायल हो जाती हैं, तो पेरिओस्टेल कोशिकाओं का एक सबसेट तेजी से प्रतिक्रिया करता है और कॉलस 3 के भीतर नए विभेदित उपास्थि मध्यवर्ती और ओस्टियोब्लास्ट में योगदान देता है, जो पेरिओस्टियम के भीतर एक अलग कंकाल स्टेम / पूर्वज सेल आबादी की उपस्थिति को फंसाता है। इसलिए, पेरिओस्टेम-निवासी कंकाल स्टेम कोशिकाओं (एसएससी) की पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन अपक्षयी हड्डी रोगों और हड्डी के दोषों के लिए एक आशाजनक चिकित्सीय दृष्टिकोण का गठन करता है।
एसएससी को अस्थि मज्जा सहित कई ऊतक स्थानों में रहने के लिए माना जाता है। अस्थि मज्जा के समान, osteogenic / chondrogenic एसएससी को भी पेरिओस्टेम 4,5,6 में पहचाना गया है। भ्रूण की हड्डी के विकास के दौरान इन पेरिओस्टेल एसएससी (पी-एसएससी) को प्रारंभिक मेसेनकाइमल वंश मार्करों (यानी, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7, और Axin2-CreER8) के साथ लेबल किया जा सकता है। इन एकल आनुवंशिक वंश अनुरेखण मॉडल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि लेबल किए गए सेल आबादी के भीतर पर्याप्त विषमता है। इसके अलावा, वे लेबल किए गए एसएससी को विवो में अपनी संतानों से अलग नहीं कर सकते हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हमने हाल ही में अस्थि मज्जा एसएससी (बीएम-एसएससी) 11 से पी-एसएससी को स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए एक दोहरी रिपोर्टर माउस (Mx1-Cre + Rosa26-Tomato + α SMA-GFP +) विकसित किया है। इस मॉडल के साथ, यह निर्धारित किया गया है कि पी-एसएससी को Mx1 + αSMA + दोहरी लेबलिंग द्वारा चिह्नित किया गया है, जबकि अधिक विभेदित Mx1 + कोशिकाएं अस्थि मज्जा, एंडोस्टेल और पेरिओस्टेल सतहों, और कॉर्टिकल और ट्रैबेक्यूलर हड्डियों 11,12 में रहती हैं।
एकाधिक साइटोकिन्स और विकास कारकों को हड्डी remodeling और मरम्मत को विनियमित करने के लिए जाना जाता है और महत्वपूर्ण खंड दोष1,13 में कंकाल की मरम्मत की वृद्धि के लिए परीक्षण किया गया है। हालांकि, हड्डी के डिब्बे के शारीरिक बाधा के विघटन के माध्यम से उत्पन्न चोट मॉडल की सेलुलर जटिलता के कारण, अंतर्जात पी-एसएससी माइग्रेशन और उपचार के दौरान सक्रियण पर इन अणुओं के प्रत्यक्ष प्रभाव अस्पष्ट हैं। एसएससी की कार्यात्मक विशेषताओं और प्रवासी गतिशीलता का मूल्यांकन अक्सर एक ट्रांसवेल या खरोंच परख करके विट्रो में किया जाता है, साइटोकिन्स या विकास कारकों के साथ संयोजन में अन्य सेल आबादी में प्रवास को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, विवो सिस्टम में उनके अनुरूप में आवेदन के लिए इन इन विट्रो प्रयोगों से परिणामों की व्याख्या चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान में, कंकाल स्टेम / पूर्वज सेल माइग्रेशन के विवो मूल्यांकन में आमतौर पर वास्तविक समय में नहीं देखा जाता है; बल्कि, यह फ्रैक्चर के बाद के निश्चित समय बिंदुओं पर मापा जाता है5,7,14,15,16.
इस विधि की एक सीमा यह है कि माइग्रेशन का मूल्यांकन एकल-सेल स्तर पर नहीं किया जाता है; बल्कि, यह सेल आबादी में परिवर्तन के माध्यम से मापा जाता है। लाइव पशु इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी और अतिरिक्त रिपोर्टर चूहों की पीढ़ी में हाल ही में प्रगति के कारण, व्यक्तिगत कोशिकाओं की विवो ट्रैकिंग में अब संभव है। जीवित पशु इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने एमएक्स 1 / टमाटर / αSMA-GFP चूहों में 24-48 घंटे के बाद की चोट के भीतर एक हड्डी की चोट के लिए कैल्वरिया सीवन आला से पी-एसएससी के अलग-अलग प्रवास को देखा।
CCL5/CCR5 को हाल ही में प्रारंभिक चोट प्रतिक्रिया के दौरान भर्ती और सक्रियण P-SC को प्रभावित करने वाले एक नियामक तंत्र के रूप में पहचाना गया था। दिलचस्प बात यह है कि वास्तविक समय में चोट के जवाब में पर्याप्त पी-एसएससी माइग्रेशन का कोई पता नहीं चला था। हालांकि, सीसीएल 5 के साथ एक चोट का उपचार पी-एसएससी के एक मजबूत, दिशात्मक रूप से अलग प्रवास का उत्पादन करता है, जिसे वास्तविक समय में कैप्चर किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सीसीएल 5 के साथ उपचार के बाद वास्तविक समय में पी-एसएससी के इन विवो माइग्रेशन को रिकॉर्ड करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करना है।
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Protocol
सभी चूहों को रोगज़नक़ मुक्त स्थितियों में बनाए रखा गया था, और सभी प्रक्रियाओं को Baylor College of Medicine की Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. माउस तैयारी
- क्रॉस Mx1-Cre17 और Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (टॉम) 18 चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा) αSMA-GFP चूहों के साथ (Drs. Ivo Kalajzic और हेनरी क्रोनबर्ग द्वारा प्रदान की गई) Mx1-Cre + Rosa26-Tomato + α SMA-GFP + (Mx1 / Tomato / αSMA-GFP) रिपोर्टर चूहों (चित्रा 2A) उत्पन्न करने के लिए।
- Mx1-Cre प्रेरण के लिए, 10 दिनों के लिए हर दूसरे दिन 25 मिलीग्राम / किलोग्राम पीआईपीसी के साथ चूहों को इंजेक्ट करें।
- जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों (WT-BMT) 19 से 1 x 106 पूरे अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अंतःशिरा प्रत्यारोपण से पहले 9.5 Gy 1 दिन के साथ चूहों को विकिरणित करें।
- वसूली के 6 से 8 सप्ताह के बाद, नीचे वर्णित पेरिओस्टेल सेल माइग्रेशन प्रोटोकॉल के इन विवो इमेजिंग के अधीन चूहों।
नोट: Mx1-Cre चूहों के विकिरण और WT-BMT अंतर्जात Mx1-लेबल हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आवश्यक हैं जो चोट का जवाब दे सकते हैं। विकिरण के बाद छह से आठ सप्ताह, मेजबान की हेमटोपोइएटिक सेल गिनती <5% पर है और इस प्रकार इमेजिंग 19 के लिए तैयार है।
2. माउस संयम और इमेजिंग माउंट
- एक 50 mL शंक्वाकार ट्यूब (चित्रा 1A) के साथ एक माउस संयम बनाएँ।
- नुकीली कैंची का उपयोग करके, शंक्वाकार के नीचे के माध्यम से एक छेद प्रहार करें। शंक्वाकार के शीर्ष पर नीचे के छेद से काटें (कट पक्ष संयम के शीर्ष पर होगा)।
- पिछले कट के समानांतर लगभग 4-5 सेमी लंबा कट करें और संयम के शीर्ष से आधे रास्ते (~ 2 सेमी) नीचे करें। शंक्वाकार और चिकनी किनारों के इस अनुभाग को निकालें आवश्यक थे।
- एक समायोज्य कोण प्लेट, एक 0.5 "ऑप्टिकल पोस्ट, और 0.5" पोस्ट, 0.1875 "हेक्स (चित्रा 1B और सामग्री की तालिका) के लिए एक समकोण क्लैंप का उपयोग करके एक शंक्वाकार ट्यूब इमेजिंग माउंट का निर्माण करें।
- कोण प्लेट को 35° कोण में समायोजित करें। कोण प्लेट के बाईं ओर, प्लेट के पीछे से दूसरे छेद में ऑप्टिकल पोस्ट को पेंच करें।
- समायोज्य प्लेट के दाईं ओर, प्लेट पर सामने और अंतिम छेद से दूसरे छेद में एक स्प्रिंग-लोडेड 0.1875 "हेक्स-लॉकिंग 0.25" थंबस्क्रू डालें। समकोण क्लैंप का उपयोग ऑप्टिकल पोस्ट के साथ किया जाएगा ताकि शंक्वाकार माउस संयम को सुरक्षित किया जा सके।
3. प्रीऑपरेटिव सर्जिकल प्रक्रिया
- माउस संज्ञाहरण
- दर्द प्रबंधन के लिए, चमड़े के नीचे सर्जरी से 30-60 मिनट पहले निरंतर रिलीज buprenorphine (1 मिलीग्राम / किग्रा बीडब्ल्यू) के साथ माउस को इंजेक्ट करें।
- कृंतक III सीसीएम संयोजन (कॉम्बो III) संज्ञाहरण का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें जिसमें 37.5 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन, 1.9 मिलीग्राम / एमएल xylazine, और 0.37 मिलीग्राम / एमएल एसेप्रोमाज़िन होता है। चूहों के लिए उपयुक्त खुराक शरीर के वजन के प्रति 1 किलोग्राम 0.75-1.50 मिलीलीटर है। यह खुराक 30-45 मिनट तक चलेगी।
- एक बार माउस anesthetized है, आंख निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं।
- लंबी अवधि की इमेजिंग (>45 मिनट) के लिए, उचित संवेदनाहारी गहराई को बनाए रखने के लिए फिर से संज्ञाहरण का प्रशासन करें।
- नियोजित इमेजिंग अवधि (0.75 mL / kg BW प्रति 30 मिनट अतिरिक्त बेहोश करने की क्रिया) के लिए संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए कॉम्बो III की पर्याप्त मात्रा के साथ एक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें। सिरिंज के लिए 12 "टयूबिंग के साथ एक 25 जी तितली सुई जलसेक सेट संलग्न करें और टयूबिंग और सुई के माध्यम से संवेदनाहारी धक्का।
- तितली सुई intraperitoneally डालें, फिर जगह में सुई टेप.
नोट: यह है कि अतिरिक्त कॉम्बो III को इमेजिंग के दौरान कैसे प्रशासित किया जाएगा जैसे कि जानवर को स्थानांतरित करने या दृश्य के विमान को बाधित करने की कोई आवश्यकता नहीं है।
- प्रक्रिया के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए हीटिंग पैड के साथ थर्मल समर्थन प्रदान करें। लंबे समय तक इमेजिंग (>1hr) के लिए अतिरिक्त द्रव समर्थन आवश्यक होगा। पूरक तरल पदार्थ इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त कॉम्बो III या 33 एमएल / किग्रा खारा (0.9 NaCl) चमड़े के नीचे के साथ आईपी प्रदान किया जा सकता है।
- माउस संयम और सर्जिकल साइट की तैयारी
- सिर के ऊपर से जितना संभव हो उतना बालों को हटाने के लिए क्लिपर्स का उपयोग करें। सर्जिकल साइट पर किसी भी शेष बालों को हटाने के लिए शेव किए गए क्षेत्र में डिपिलेटरी क्रीम लागू करें।
- सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से पैर की अंगुली pinches के लिए प्रतिक्रिया की कमी से anesthetized है. 15 मिनट के बाद, यदि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटिक नहीं है, तो कॉम्बो III (<0.75 mL / kg BW) की दूसरी छोटी खुराक का प्रशासन करें।
- माउस को संयम पूंछ में पहले रखें, इसे पीछे की ओर काफी पीछे की ओर स्लाइड करें जैसे कि नाक शंक्वाकार के किनारे पर थोड़ा लटक जाती है।
- मेडिकल टेप का उपयोग कर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे के लिए सामने पंजे टेप.
- एक इमेजिंग माउंट पर माउस के साथ शंक्वाकार ट्यूब रखें जो 35 ° कोण पर सेट किया गया है और समकोण क्लैंप (चित्रा 1 C) का उपयोग करके सुरक्षित है।
- एक बार माउस इमेजिंग माउंट में सुरक्षित होने के बाद, बीटाडीन स्क्रब और 70% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल के वैकल्पिक स्क्रब के साथ सर्जिकल साइट 3x को साफ करें। फिर से, जांचें कि जानवर पूरी तरह से बेहोश है।
- माउस को एक साफ अवशोषक पैड पर ले जाएं और एक बड़ा बाँझ क्षेत्र बनाने के लिए माउस पर एक ड्रेप रखें।
4. शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
- उद्घाटन चीरा
- ठीक-ठीक इत्तला वाले संदंश का उपयोग करके, त्वचा को तुरंत दाहिने कान में औसत दर्जे का उठाएं। माइक्रोडिसेक्शन कैंची के साथ, संदंश द्वारा आयोजित की जा रही त्वचा को काटें।
नोट:: ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर चीरा शुरू करने से एक गोल चीरा बनता है जो प्रक्रिया के बाद suturing के लिए अधिक उपयुक्त है। - प्रारंभिक चीरा से बाएं कान (<1 सेमी) की ओर शुरू होने वाला एक अनुप्रस्थ चीरा बनाएं। एक और चीरा बनाओ, प्रारंभिक चीरा से शुरू होकर, जानवर की नाक की ओर (~ 2-3 मिमी दाईं आंख से पहले)।
- संदंश और कैंची का उपयोग करके पेरिओस्टेम से त्वचा को अलग करें ताकि त्वचा को कैलवेरिया पेरिओस्टेम से अलग करने वाले संयोजी ऊतक के माध्यम से धीरे से काटा जा सके।
- एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके, त्वचा फ्लैप के शीर्ष पर कुछ नेत्र मरहम लागू करें। धीरे से त्वचा फ्लैप उठाओ और इसे बाईं आंख पर मोड़ें। सैजिटल और कोरोनल टांके के प्रतिच्छेदन को स्पष्ट रूप से उजागर किया जाना चाहिए (चित्रा 1 ई)।
नोट: नेत्र मरहम जगह में त्वचा फ्लैप रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। - किसी भी रक्त और अवशिष्ट बालों के क्षेत्र को साफ करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ खुली सतह फ्लश करें।
नोट: यदि आवश्यक हो, तो फ्लशिंग के बाद बने रहने वाले बालों को हटाने के लिए ठीक-ठीक इत्तला दी गई संदंश का उपयोग करें, लेकिन पेरिओस्टेम को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
- ठीक-ठीक इत्तला वाले संदंश का उपयोग करके, त्वचा को तुरंत दाहिने कान में औसत दर्जे का उठाएं। माइक्रोडिसेक्शन कैंची के साथ, संदंश द्वारा आयोजित की जा रही त्वचा को काटें।
- माइक्रोफ्रैक्चर
- कैल्वरिया पर माइक्रोफ्रैक्चर उत्पन्न करने के लिए, 29 जी इंसुलिन सिरिंज के प्लंजर को हटा दें और सिरिंज के पिछले छोर को 300-400 यूएल चिह्नों के आसपास काट दें।
नोट: यह चरण चोट का उत्पादन करते समय विच्छेदन क्षेत्र के तहत पैंतरेबाज़ी करना आसान बनाता है। - कोरोनल टांके से नाक की ओर एक बेवल (एक से दो सुई चौड़ाई) की नोक रखें और सैजिटल टांके के दाईं ओर एक से दो सुई चौड़ाई (चित्रा 1 ई)।
- धीरे से सिरिंज को दक्षिणावर्त घुमाएं, फिर कई बार वामावर्त घुमाएं।
नोट: युवा चूहों में, एक परिपत्र माइक्रोफ्रैक्चर बनाने के लिए बहुत कम मात्रा में नीचे की ओर दबाव की आवश्यकता होती है। ध्यान रखें कि सुई को मस्तिष्क में प्रवेश न करने दें, क्योंकि इससे रक्तस्राव होगा और इमेजिंग में हस्तक्षेप होगा। - ~ 0.4 मिमी के लिए माइक्रोफ्रैक्चर को चौड़ा करने के लिए एक 27 जी सुई का उपयोग करें। यदि हड्डी के टुकड़े माइक्रोफ्रैक्चर में रहते हैं, तो पीबीएस के साथ क्षेत्र को फ्लश करें। यदि हड्डी के टुकड़े अभी भी माइक्रोफ्रैक्चर में बने हुए हैं, तो उन्हें धीरे से स्कूप करने के लिए 29 जी सुई का उपयोग करें।
- चरण 4.2.1–4.2.4 को दोहराएं ताकि सैगिटल सीवन के बाईं ओर चोट लग सके।
नोट: इस बिंदु पर, दो विकल्प हैं: 1) तुरंत सीसीएल 5 उपचार (अनुभाग 4.3) और इमेजिंग (अनुभाग 5) के लिए आगे बढ़ें; या 2) अनुभाग 6 में पश्चात की प्रक्रियाओं के बाद सर्जिकल साइट को बंद करें। 24 घंटे बाद, माउस को फिर से एनेस्थेटिक करें, सर्जिकल दृष्टि को फिर से खोलें, सीसीएल 5 (अनुभाग 4.3) के साथ चोट का इलाज करें, और इंट्रावाइटल इमेजिंग (अनुभाग 5) और पश्चात की देखभाल (अनुभाग 6) करें।
- कैल्वरिया पर माइक्रोफ्रैक्चर उत्पन्न करने के लिए, 29 जी इंसुलिन सिरिंज के प्लंजर को हटा दें और सिरिंज के पिछले छोर को 300-400 यूएल चिह्नों के आसपास काट दें।
- CCL5 उपचार
- RANTES (100 ng / mL) के स्टॉक से, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके 10 ng / mL का समाधान करें। मैट्रिक्स को तरल रूप में रखने के लिए इस समाधान को बर्फ पर रखें।
- 2-20 μL पिपेट का उपयोग करके CCL5 (10 ng / μL) के 2 μL के साथ प्रत्येक चोट का इलाज करें (इस पिपेट टिप का एक बड़ा व्यास है, जो चिपचिपा तरल का उपयोग करते समय अधिक प्रभावी होता है)। मैट्रिक्स को ठोस करने की अनुमति दें।
- एक बार मैट्रिक्स ठोस हो जाने के बाद, धीरे से त्वचा के फ्लैप के साथ कैल्वरिया को कवर करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक निर्जलित न हो जाए। इमेजिंग से पहले 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
5. Intravital इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप सेटिंग्स
- मल्टीफोटॉन लेजर (femtosecond टाइटेनियम-नीलम लेजर) को चालू करें। तरंग दैर्ध्य को 880 एनएम पर सेट करें और हड्डी की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग (440 एनएम) के लिए शक्ति को समायोजित करें।
- GFP- और tdTomato-व्यक्त कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए क्रमशः 488 nm और 561 nm ठोस राज्य लेजर को चालू करें।
- दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (405-455 एनएम का पता लगाने) और जीएफपी (505-550 एनएम का पता लगाने) संकेतों के लिए पीएमटी (फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब) डिटेक्टरों को चालू करें। टमाटर (590-620 एनएम का पता लगाने) संकेत के लिए HyD 3 डिटेक्टर चालू करें।
- बढ़ता हुआ
- माउस को दायरे में ले जाने से पहले, माउस के सिर के पीछे धीरे से दबाकर कैल्वरिया के दृश्य विमान की जांच करें। यदि विमान स्तर नहीं है, तो माउस संयम को धीरे से बाईं या दाईं ओर घुमाकर स्थिति को समायोजित करें।
नोट:: यह पर्याप्त छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। - पूरे कैल्वरिया और त्वचा के फ्लैप को कवर करने और ऊतक के सूखने को रोकने के लिए पानी (डब्ल्यू / वी) में बाँझ 2% मिथाइलसेल्यूलोज लागू करें।
- XYZ-अक्ष motorized माइक्रोस्कोप चरण (चित्रा 1G) पर माउस रखें। एपिफ्लोरोसेंट प्रकाश का उपयोग करके, माउस को संरेखित करें ताकि 1) यह माइक्रोस्कोप का सामना कर रहा हो और 2) कोरोनल और सैगिटल टांके का प्रतिच्छेदन चरण का केंद्रित संदर्भ बिंदु है।
- इमेजिंग क्षेत्र पर ग्लास कवर रखें और संरेखण (चित्रा 1 एच) की डबल-जांच करें।
- माउस को दायरे में ले जाने से पहले, माउस के सिर के पीछे धीरे से दबाकर कैल्वरिया के दृश्य विमान की जांच करें। यदि विमान स्तर नहीं है, तो माउस संयम को धीरे से बाईं या दाईं ओर घुमाकर स्थिति को समायोजित करें।
- टाइम-लैप्स इमेजिंग
- कैल्वरिया को स्कैन करने के लिए एक कम आवर्धन लेंस (एनए = 0.95 के साथ 25x जल विसर्जन उद्देश्य) का उपयोग करें। sagittal और कोरोनल टांका चौराहे की एक संदर्भ छवि प्राप्त करें।
- कोशिकाओं से एसएचजी और फ्लोरोसेंट संकेतों का उपयोग करते हुए, प्रत्येक चोट की दृष्टि का पता लगाएं और XYZ निर्देशांक के साथ-साथ सैगिटल और कोरोनल टांके (चित्रा 2 बी) से दूरी को रिकॉर्ड करें।
- लंबी अवधि की इमेजिंग के लिए या तो कोरोनल या सैगिटल टांके पर एक स्थान चुनें। इमेजिंग के दौरान संदर्भ से इस क्षेत्र की एक विस्तृत जेड-स्टैक छवि लें।
नोट: चूंकि टांके एक ज्ञात पी-एसएससी आला का प्रतिनिधित्व करते हैं, इसलिए यह वह जगह है जहां कोशिकाएं कैल्वरिया चोट के जवाब में माइग्रेट हो जाएंगी। - कम से कम 1 घंटे के लिए हर 1 मिनट में एक छवि रिकॉर्ड करने के लिए टाइम-लैप्स सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स का उपयोग करें। स्नैपशॉट के बीच के समय में, दृश्य के प्रारंभिक फ़ील्ड के साथ दृश्य के वर्तमान फ़ील्ड की तुलना करें. यदि वे भिन्न हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए Z-स्टैक छवि का उपयोग करें कि दृश्य के क्षेत्र को किस दिशा में समायोजित करने की आवश्यकता है।
6. पश्चात पशु देखभाल
- इमेजिंग के बाद, मिथाइलसेल्यूलोज को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ उजागर कैल्वरिया को कुल्ला करें।
- चीरा को बंद करने के लिए, धीरे से त्वचा को कैल्वरिया पर फ्लैप रखें। अवशिष्ट नेत्र मरहम को हटाने और चीरा साइट को सुखाने के लिए बाँझ कपास swabs का उपयोग करें।
- एक संलग्न सी -1 रिवर्स काटने की सुई के साथ मोनोफिलामेंट नायलॉन 5-0 आकार nonabsorbable टांके का उपयोग करते हुए, सर्जिकल साइट को बंद करें। बंद चीरा के लिए ट्रिपल एंटीबायोटिक मरहम लागू करने के लिए एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें।
नोट: स्कारिंग उच्च गुणवत्ता suturing तकनीकों और न्यूनतम रक्तस्राव के साथ कम हो गया है। - माउस को एक गर्म सतह पर एक साफ पिंजरे में रखें और हर 15 मिनट की जांच करें जब तक कि स्टर्नल रिकंबेंसी प्राप्त न हो जाए।
- निरंतर रिलीज buprenorphine 72 ज सर्जरी के बाद की एक दूसरी खुराक प्रशासन.
- Huddling व्यवहार, ruffled फर, और / या ambulation की कमी के लिए दैनिक मॉनिटर जब तक टांके हटा दिए जाते हैं (~ 1 सप्ताह).
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Representative Results
कंकाल पूर्वजों को प्रवासी या संचार क्षमता 20 होने का प्रस्ताव दिया गया है। हाल ही में, Mx1-Cre+ Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) रिपोर्टर चूहों को उत्पन्न किया गया था, जिसमें P-SSCs को Mx1+ α SMA+ दोहरी लेबलिंग (चित्रा 2A,B) द्वारा चिह्नित किया गया था। Mx1 + α SMA + P-SC का पर्याप्त प्रवास 24-48 घंटे के भीतर सिवनी मेसेनकाइम से बाहर हुआ। इसके अलावा परीक्षण किया गया था विवो पी-एसएससी माइग्रेशन में वास्तविक समय में पता लगाने की संभावना 24 घंटे एक कैल्वरिया दोष के बाद। Mx1 + αSMA + P-SSC का कोई माइग्रेशन इमेजिंग (चित्रा 2 C) के 1 घंटे के भीतर नहीं देखा गया था।
Mx1 + α SMA + P-SC विशिष्ट रूप से CCL5 रिसेप्टर को व्यक्त करते हैं जिसे CCR511 के रूप में जाना जाता है। इस प्रकार, एक calvaria दोष का उपचार 24 ज सीसीएल 5 प्रेरित दिशात्मक रूप से अलग प्रवास के साथ कोरोनल टांके से दूर और चोट की दृष्टि (चित्रा 2 डी, ई) की ओर प्रेरित के साथ चोट के बाद. इमेजिंग के 1 घंटे के भीतर, Mx1 + αSMA + P-SC में से एक ने चोट की ओर लगभग 50 μm स्थानांतरित कर दिया (चित्रा 2E)। अन्य Mx1 + αSMA + P-SSC को भी CCL5 उपचार के जवाब में माइग्रेट करते हुए देखा गया था, लेकिन कुछ हद तक।
चित्रा 1: माउस calvaria के विवो इमेजिंग में के लिए सेट-अप. माउस संयम (ए) और इमेजिंग माउंट (बी) की प्रतिनिधि छवियों का उपयोग लाइव इमेजिंग के दौरान किया जाता है। (सी) संयम में माउस और इमेजिंग माउंट के लिए सुरक्षित. (डी) माउस कैल्वरिया संरचना का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, ललाट (एफएस), कोरोनल (सीएस), सैगिटल (एसएस), और लैम्बडोइड (एलएस) टांके की पहचान करता है। (ई) कैल्वरिया माइक्रोफ्रैक्चर चोटों का प्रतिनिधि प्लेसमेंट। (एफ) इष्टतम उपचार और भविष्य की इमेजिंग के लिए पोस्टऑपरेटिव सर्जिकल सीवन प्लेसमेंट। माइक्रोस्कोप चरण (जी) और कवरस्लिप प्लेसमेंट (एच) पर माउंट प्लेसमेंट की प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: Mx1 + αSMA + P-SSC माइग्रेशन के विवो इमेजिंग में वास्तविक समय। (ए) Mx1/Tomato/αSMA-GFP दोहरी रिपोर्टर चूहों की तैयारी की योजनाबद्ध। चूहों को 10 दिनों के लिए हर दूसरे दिन 25 मिलीग्राम / किलोग्राम पीआईपीसी के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था (1). Mx1 / टमाटर / αSMA-GFP चूहों को WT C57BL / 6 चूहों (3) से 1 x 106 पूरे अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अंतःशिरा प्रत्यारोपण से 1 दिन पहले 9.5 Gy (2) के साथ घातक रूप से विकिरणित किया गया था। वसूली के 6-8 सप्ताह के बाद (जब मेजबान की हेमटोपोइएटिक कोशिकाएं 5% से कम होती हैं), चूहों को हड्डी की चोट के प्रयोगों के अधीन किया गया था। Mx1+ (टमाटर+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+(Tomato+GFP+), और हड्डी (नीला). (बी) Mx1/Tomato/αSMA-GFP माउस के सैगिटल (एसएस) और कोरोनल (सीएस) टांके के संबंध में एक प्रतिनिधि कैल्वरिया चोट (सफेद वृत्त) और इमेजिंग (सफेद वर्ग) स्थानों का अधिकतम जेड-प्रोजेक्शन। बिंदीदार रेखाएं कैल्वेरिया टांके का प्रतिनिधित्व करती हैं। (सी) एमएक्स 1 + α एसएमए + पी-एसएससी की वीवो इमेजिंग में चोट के बाद 24 घंटे प्रतिक्रिया। स्केल बार = 25 μm. (डी) 24 घंटे की चोट के बाद, सीसीएल 5 को चोट की दृष्टि पर प्रशासित किया गया था, और विवो इमेजिंग में कोरोनल सीवन (सीएस) के संबंध में 1 घंटे बाद किया गया था। सफ़ेद वर्ग (ई) में दिखाए गए सेल माइग्रेशन छवियों के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 75 μm. (ई) हड्डी (नीली) सतह पर चोट की दृष्टि (शीर्ष दाईं ओर) की ओर Mx1 + α SMA + P-SC का प्रवासन। स्केल बार = 25 μm. (सी, डी, ई) में, संख्याएं इमेजिंग के समय को इंगित करती हैं। पीला तीर चोट के स्थान की दिशा को इंगित करता है। तारांकन चिह्न Mx1+ α SMA+ P-SSC के प्रवासी पथ को इंगित करता है। छवि तीन से पांच चूहों के परिणामों का प्रतिनिधि है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हड्डी के उपचार के दौरान, पेरिओस्टेल कोशिकाएं एक चोट callus3 के भीतर नए विभेदित चोंड्रोसाइट्स और ओस्टियोब्लास्ट्स का मुख्य स्रोत हैं। अस्थि मज्जा के समान, osteogenic / chondrogenic एसएससी को भी पेरिओस्टेम 4,5,6 में पहचाना गया है। अंतर्जात पी-एसएससी कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। अक्सर, एसएससी की प्रवासी गतिशीलता का मूल्यांकन इन विट्रो में किया जाता है, जिससे विवो सिस्टम में उनके संबंधित की व्याख्या चुनौतीपूर्ण हो जाती है। लाइव पशु इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी में हाल ही में प्रगति और अतिरिक्त रिपोर्टर चूहों (Mx1 / Tomato / αSMA-GFP) की पीढ़ी के कारण, व्यक्तिगत कोशिकाओं के विवो ट्रैकिंग में अब संभव है। इस प्रकार, यह विधि वास्तविक समय में CCL5 प्रेरित P-SCSCs माइग्रेशन की इन विवो रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है।
इस विधि से जुड़ी कई तकनीकी चुनौतियां हैं जो इमेजिंग स्थिरता को प्रभावित कर सकती हैं। इस विधि के साथ एक प्रमुख तकनीकी चुनौती दृश्य के जेड-अक्ष विमान को बनाए रखना है। जेड-अक्ष बहाव (जेड-बहाव) निश्चित और जीवित नमूनों की दीर्घकालिक इमेजिंग में एक आम मुद्दा है, और यह काफी हद तक इमेजिंग वातावरण में तापमान परिवर्तन के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। यद्यपि इस आर्टिफैक्ट को पूरी तरह से प्रतिकार नहीं किया जा सकता है, मंच, उद्देश्य लेंस और सहायक संरचनाओं को कवर करने से जेड-ड्रिफ्ट 21 को कम करने में मदद मिलती है।
इसके अलावा, टाइम-लैप्स इमेजिंग से पहले इमेजिंग स्थान की जेड-स्टैक श्रृंखला प्राप्त करने से जेड-अक्ष का एक संदर्भ स्थापित होगा जिसे छवि अधिग्रहण के बीच संदर्भित किया जा सकता है (यानी, छवियों को आमतौर पर हर 30-60 सेकंड में लिया जाता है, जो यदि आवश्यक हो तो जेड-अक्ष में समायोजन के लिए समय की अनुमति देता है)। एक और तकनीकी चुनौती एक सुसंगत माइक्रोफ्रैक्चर बना रही है जो एक ही आकार, आकार और कैल्वरिया टांके से दूरी है। कोरोनल और सैगिटल टांके से दूरी महत्वपूर्ण है, क्योंकि कैल्वरिया टांके quiescent SSCs10 के लिए एक आला हैं। माइक्रोफ्रैक्चर की परिवर्तनशीलता को कम करने का सबसे अच्छा तरीका चूहों में इस तकनीक का अभ्यास करना है जो अंतिम विश्लेषण में शामिल नहीं हैं।
सीमाओं के बावजूद, यह विधि हड्डी की चोट के लिए विवो में व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक अद्वितीय प्रणाली प्रदान करती है। चूंकि फ्रैक्चर मरम्मत एक अत्यधिक जटिल प्रक्रिया है जिसमें कई सेल प्रकार शामिल हैं, इसलिए कई पहलू हैं जो पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं। इनमें से एक में चोट के प्रति पी-एसएससी की शुरुआती प्रवासी प्रतिक्रिया शामिल है। जबकि CCR5 / CCL5 एक अद्वितीय तंत्र है जिसके द्वारा पी-एसएससी को चोट के लिए भर्ती किया जाता है, यह संभव है कि अतिरिक्त साइटोकिन्स और विकास कारक फ्रैक्चर उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इससे पहले, विभिन्न साइटोकिन्स और विकास कारकों के साथ फ्रैक्चर के उपचार के परिणामस्वरूप समग्र फ्रैक्चर हीलिंग 22 में अत्यधिक परिवर्तनशील परिणाम हुए हैं। यह इमेजिंग विधि व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर संभावित दवा / साइटोकाइन / विकास कारक उपचार के शारीरिक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए एक अद्वितीय मंच प्रदान करती है। अंत में, यह विवो यंत्रवत डेटा में प्रदान करता है जो फ्रैक्चर हीलिंग की एक विशिष्ट चिकित्सा की वृद्धि का समर्थन कर सकता है।
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Disclosures
L.C.O. और D.P. एक लंबित पेटेंट का खुलासा "हड्डी की मरम्मत में Periosteal कंकाल स्टेम सेल" (BAYM) हकदार है। P0264US. पी 1)। शेष लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को टेक्सास पुरस्कार के हड्डी रोग कार्यक्रम, कैरोलीन विस लॉ फंड अवार्ड, और पुरस्कार संख्या R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 से D.P. के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के NIAMS द्वारा समर्थित किया गया था। हम बीसीएम ऑप्टिकल इमेजिंग और वाइटल माइक्रोस्कोपी कोर में एमई डिकिंसन और टीजे वडक्कन और एनआईएच (AI036211, CA125123, और DK056338) से वित्त पोषण के साथ बीसीएम उन्नत प्रौद्योगिकी कोर को धन्यवाद देते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” optical post | ThorLabs | TR2 | For imaging mount |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 27G needle | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G insulin syringe | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL conicol tube | Falcon | 352098 | For mouse restraint |
| Adjustable angle plate | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | For imaging mount |
| Alcohol wipes | Coviden | 6818 | |
| betadine surgical scrub | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1mg/mL Sustained Release | |
| Combo III | Obtained from staff veterinarian | N/A | 37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine |
| Coverslip | Fisher | 12-545-87 | 24 x 40 premium superslip |
| Fine tip forcepts | FST | 11254-20 | |
| Ketamine | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP with DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| Medical tape | McKesson | 100199 | 3" x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m) |
| Methocellulose | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| Microdissection scissors | FST | 1456-12 | |
| Motorized stage | Anaheim automation | N/A | |
| Needle holder | FST | 12500-12 | |
| Nonabsorbable sutures | McKesson | S913BX | monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle |
| Opthalmic ointment | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| Right-angle clamp for ½” post, 3/16” Hex | ThorLabs | RA90 | For imaging mount |
| Spring-loaded 3/16” Hex-locking ¼” thumbscrew | ThorLabs | TS25H | For imaging mount |
| Sterile cotton swabs | Henry Schen | 100-9249 | |
| Sterile DPBS (1x) | Corning | 21-030-CV | |
| Sterile drapes | McKessen | 25-517 | |
| Surgical gloves | McKessen | 3158VA | |
| Triple antibiotic ointment | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| Vacutainer blood collection set | BD | REF 367298 | 25G butterfly needle infusion set with 12" tubing |
References
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