Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

В данной работе представлены два оптимизированных протокола исследования резидентных и периферических иммунных клеток в центральной нервной системе, включая головной и спинной мозг и мозговые оболочки. Каждый из этих протоколов помогает установить функцию и состав клеток, занимающих эти компартменты, в равновесном состоянии и воспалительных условиях.

Abstract

Центральная нервная система (ЦНС) состоит из головного и спинного мозга и окружена мозговыми оболочками, мембранными слоями, служащими барьером между периферией и ЦНС. ЦНС является иммунологически специализированным участком, и в стационарных условиях иммунная привилегия наиболее выражена в паренхиме ЦНС. Напротив, мозговые оболочки содержат разнообразный набор резидентных клеток, включая врожденные и адаптивные иммунные клетки. Во время воспалительных состояний, вызванных повреждением ЦНС, аутоиммунными заболеваниями, инфекцией или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки могут проникать в паренхиму и поселиться в мозговых оболочках. Считается, что эти клетки выполняют как полезные, так и вредные действия в патогенезе ЦНС. Несмотря на эти знания, мозговые оболочки часто упускаются из виду при анализе компартмента ЦНС, потому что традиционные методы экстракции тканей ЦНС опускают менингеальные слои. В этом протоколе представлены два различных метода быстрого выделения тканей ЦНС мышей (т.е. головного мозга, спинного мозга и мозговых оболочек), которые подходят для последующего анализа с помощью одноклеточных методов, иммуногистохимии и методов гибридизации in situ. Описанные методы обеспечивают комплексный анализ тканей ЦНС, идеально подходящий для оценки фенотипа, функции и локализации клеток, занимающих компартмент ЦНС, в гомеостатических условиях и при патогенезе заболевания.

Introduction

Центральная нервная система (ЦНС) является иммунологически специализированным участком. Паренхима ЦНС, исключая ликворное пространство, мозговые оболочки и сосудистую сеть, классически рассматривается как иммунопривилегированный участок 1,2,3,4,5 и относительно лишена иммунных клеток в гомеостатических условиях 2,6,7. Напротив, мозговые оболочки, состоящие из слоев твердой мозговой оболочки, арахноидального слоя и слоев мия, являются важнейшими компонентами компартмента ЦНС, активно участвуя в гомеостатическом иммунном надзоре и воспалительных процессах при патогенезе заболевания 3,6,7,8. В равновесном состоянии мозговые оболочки поддерживают многочисленные иммунные клетки, включая врожденные лимфоидные клетки (ILC), макрофаги, дендритные клетки (DC), тучные клетки, Т-клетки и, в меньшей степени, В-клетки 9,10,11.

Мозговые оболочки представляют собой сильно васкуляризированные структуры и содержат лимфатические сосуды, обеспечивающие лимфатическую связь между ЦНС и ее периферией 8,12,13,14. При воспалительных состояниях, вызванных повреждением ЦНС, инфекциями, аутоиммунными заболеваниями или даже нейродегенерацией, периферические иммунные клетки проникают в паренхиму и изменяют иммунный ландшафт в мозговых оболочках. После клеточной инфильтрации мозговые оболочки могут представлять собой функциональную нишу для периферических иммунных клеток, способствуя агрегации иммунных клеток, локальной активации иммунных клеток и длительному выживанию в компартменте ЦНС. Выраженное воспаление менингеальных оболочек наблюдается при множественных заболеваниях, поражающих ЦНС, включая рассеянный склероз (РС)15,16,17,18,19, инсульт 20,21, стерильные повреждения 22,23 (т.е. повреждение спинного мозга и черепно-мозговые травмы), мигрени 24 и микробную инфекцию 25,26,27,28,29. Таким образом, характеристика резидентных клеток и периферических иммунных клеток в менингеальном компартменте имеет важное значение для понимания роли этих клеток в стационарных условиях и патогенеза заболевания.

Извлечение головного, спинного мозга и мозговых оболочек из черепной коробки и тел позвонков является технически сложным и трудоемким процессом. В настоящее время не существует методов быстрого извлечения мозга с неповрежденными всеми тремя менингеальными слоями. Несмотря на то, что ламинэктомия дает превосходную морфологию тканей спинного мозга и сохраняет менингеальные слои, она чрезвычайно трудоемка и сложна30,31. И наоборот, более традиционные методы экстракции, такие как извлечение головного мозга из черепной коробки и гидравлическая экструзия спинного мозга, способствуют быстрому извлечению ткани ЦНС, но при использовании этих методов утрачиваются как паутинные, так и твердые мозговые оболочки30,31. Опущение твердой мозговой оболочки и паутинных слоев при обычном выделении тканей головного и спинного мозга приводит к неполному анализу клеток в компартменте ЦНС. Таким образом, идентификация новых методик, ориентированных на быстрое извлечение тканей ЦНС с интактными мозговыми оболочками, имеет решающее значение для оптимального анализа компартмента ЦНС.

В данной статье представлены два метода быстрого извлечения головного, спинного мозга и мозговых оболочек у мышей, облегчающие последующий анализ резидентных клеток и периферических иммунных клеток в паренхиме и мозговых оболочках ЦНС. Эти оптимизированные протоколы сосредоточены на 1) выделении одноклеточных суспензий для последующего анализа и 2) подготовке ткани к гистологической обработке. Получение одноклеточных суспензий из тканей головного мозга, спинного мозга, твердых мозговых и паутинных мозгов32 позволяет проводить одновременный анализ клеток, находящихся как в паренхиматозном, так и в менингеальном компартментах. Одноклеточные суспензии могут быть использованы в различных областях, включая анализ клеточных культур для стимуляции in vitro 33, иммуноферментное пятно (ELISpot)28,34,35, проточную цитометрию 36,33 и одноклеточную 37 или объемную транскриптомику. Кроме того, оптимизированный протокол декальцинации всего головного и спинного мозга с интактными черепами или позвоночными столбами, соответственно, позволяет мягко декальцинировать окружающую кость, оставляя мозговые оболочки нетронутыми и сохраняя морфологию тканей. Этот метод позволяет проводить селективную идентификацию белков или РНК с помощью методов иммуногистохимии (ИГХ) или гибридизации in situ (ISH) как в паренхимозном, так и в менингеальном пространствах. Характеристика фенотипа, состояния активации и локализации резидентных клеток и периферических иммунных клеток в ЦНС может предоставить информацию, необходимую для понимания того, как отдельные типы клеток в компартменте ЦНС вносят вклад в гомеостаз и патогенез заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Во всех работах с животными используются протоколы, рассмотренные и одобренные Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Гейзеля в Дартмуте.

1. Обработка образцов головного и спинного мозга для декальцинации

  1. Выделение образцов головного и спинного мозга
    1. Усыпьте мышь с помощью ингаляции CO2 . Следите за тем, чтобы расход CO2 вытеснялся на 10–30% от объема сепаратора в минуту.
    2. Используя щипцы, приподнимите мечевидный отросток и разрежьте ножницами брюшную стенку сбоку чуть ниже грудной клетки, подтягивая вверх, чтобы избежать перерезания нижележащих кровеносных сосудов или органов. Разрежьте диафрагму сбоку.
    3. Разрежьте грудную клетку по боковым краям параллельно легким вплоть до ключицы. С помощью щипцов приподнимите грудину и зажмите грудину гемостатом. Поместите гемостат над головой, чтобы отодвинуть грудную клетку и обнажить сердце.
    4. С помощью щипцов захватите сердце возле его верхушки и сделайте надрез в правом предсердии сердца, чтобы обеспечить выход. Введите иглу 25 G со шприцем 10 мл, чтобы медленно ввести 10 мл ледяного 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) в левый желудочек для транскардиальной перфузии мыши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия должна происходить в течение 4-5 минут до тех пор, пока печень не очистится от крови. Для перфузии обычно достаточно 10 мл 1x PBS, но при необходимости можно использовать и больше. Прозрачная печень обычно указывает на адекватную перфузию.
    5. Острыми ножницами удалите голову путем обезглавливания (рис. 1; 1). Сделайте разрез на коже по средней линии (рис. 1; 2) и переверните кожу над глазами, чтобы освободить череп.
    6. Надрезают носовую кость, чтобы освободить нижнюю челюсть от черепа (рис. 1; 3). Удалите нижнюю челюсть, язык и глаза. Разрезают вдоль боковых сторон черепа, чтобы освободить ткань вдоль наружного слухового прохода (рис. 1; 4). Обрезайте, чтобы удалить всю лишнюю кожу, мышцы и ткани, покрывающие череп.
    7. Отделите грудную клетку от позвоночного столба, разрезав параллельно позвоночнику острыми ножницами (рис. 1; 5 и 6). Сделайте небольшой надрез в нижней поясничной области, чтобы изолировать позвоночный столб (рис. 1; 7). Обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки (Рисунок 1; 8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление лишней ткани из позвоночного столба и черепа необходимо для получения адекватного проникновения фиксирующего параформальдегида (PFA) и этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) буфера для декальцификации.
  2. Постфиксация, декальцинация и криоконсервация
    1. С помощью щипцов поместите головной мозг с неповрежденным черепом или позвоночником в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл 4% PFA. Поместите пробирки при температуре 4 °C не менее чем на 48 часов для надлежащей фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание чрезмерной фиксации ткани не превышайте 72 ч фиксации. Время фиксации образцов костей перед декальцинацией увеличивается. Адекватная фиксация защитит ткани от последствий декальцинации и обеспечит лучшую морфологию тканей.
    2. Промойте головной или спинной мозг, удалив ткань из 4% PFA щипцами и поместив ткань в одноразовую пробирку объемом 14 мл с 10 мл 1x PBS на 5 минут. Перенесите головной или спинной мозг в коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл 10% ЭДТА (рН = 7,2–7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пробирки большего размера с 10 мл ЭДТА дает ЭДТА большую площадь контакта с тканью и ускоряет процесс декальцинации.
    3. Ежедневно проверяйте, мягкая ли кость и податливая: извлеките ткань из раствора ЭДТА с помощью щипцов, поместите ее на чашку Петри и осторожно проверьте мягкость кости иглой 25 G. Если игла легко проникает в кость, процесс декальцинации завершен.
    4. Извлеките ткань из раствора ЭДТА и перенесите головной или спинной мозг в одноразовую пробирку объемом 14 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и промойте в течение 10 минут. Повторите стирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Декальцинация обычно занимает 2–3 дня. Раствор следует менять каждые 2–3 дня, если кость еще недостаточно декальцинирована. Однако длительная инкубация в ЭДТА после декальцинации кости может повредить морфологию ткани.
    5. Приготовьте 10%, 20% и 30% растворы сахарозы, добавив сахарозу в 1x PBS. Например, для 10% сахарозы добавьте 10 г сахарозы и доведите объем до 100 мл, используя стерильный 1x PBS. Хранить раствор при температуре 4 °C до 1 месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы сахарозы склонны к росту микроорганизмов, поэтому образцы не следует хранить в этих растворах в течение длительных периодов времени.
    6. Извлеките ткань из 1x PBS, поместите ее в 10 мл 10% раствора сахарозы и храните при температуре 4 °C. Оставьте ткань на 24 часа или пока она не опустится на дно пробирки.
    7. Повторите этот процесс, переместив ткань сначала в 20% раствор сахарозы, а затем в 30% раствор сахарозы. Дайте ткани погрузиться в 30% сахарозу (не менее 24 ч) и приступайте к заделке ткани.
  3. Встраивание и замораживание тканей
    1. С помощью щипцов удалите ткань из 30% сахарозы, поместите ее на чашку Петри и наклоните чашку, чтобы избавиться от излишков раствора сахарозы на ткани. С помощью скальпеля разрежьте ткань на нужные сегменты.
    2. Создайте тонкий слой компаунда оптимальной температуры резки (OCT) на дне криомолда и поместите кусочек (кусочки) ткани в форму. Полностью покройте ткань ОКТ-соединением, убедившись в отсутствии пузырьков.
    3. Мгновенную заморозку блоков, наведя курсор на жидкий азот 38 или поместив блоки на 100% изопропанол/суспензиюсухого льда39 до тех пор, пока блок не станет непрозрачным. Заверните криоформы в алюминиевую фольгу и храните блоки при температуре -80 °C для длительного хранения. Переместите блоки до -20 °C перед секционированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при секционировании и выполнении гистологических протоколов на декальцинированном головном мозге, так как слои черепа и менингеальных оболочек могут быть потеряны при грубом обращении со срезами.

2. Подготовка мозговых оболочек и тканей ЦНС к окрашиванию методом проточной цитометрии

  1. Извлечение черепной чашечки и головного мозга
    1. Острыми ножницами удалите голову путем обезглавливания (рис. 2А; 1). С помощью ножниц сделайте разрез на коже по средней линии (рис. 2А; 2) и переверните кожу над глазами, чтобы освободить череп.
    2. Поместите ножницы в большое затылочное отверстие и начните разрезать череп латерально вдоль коры по направлению к обонятельной луковице, сохраняя разрезы над наружным слуховым проходом и нижней челюстью (рис. 2А; 3). Выполните те же надрезы на противоположной стороне, при этом надрезы сходятся у обонятельной луковицы, чтобы освободить черепную чашечку от мозга (рис. 2А; 3).
    3. С помощью щипцов откинуть черепную крышку и поместить ее в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодной среды RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. Держите трубку на льду.
    4. Используя изогнутые щипцы, поместите щипцы ниже основания мозга и приподнимите, чтобы освободить мозг от черепной чашечки. Поместите мозг в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. Держите тюбик на льду до обработки.
  2. Извлечение тканей позвоночного столба и спинного мозга
    1. С помощью щипцов и острых ножниц отделите грудную клетку от позвоночного столба, разрезав параллельно позвоночнику (рис. 2А; 4 и 5). Сделайте небольшой надрез в нижней поясничной области, чтобы изолировать позвоночный столб (рис. 2А; 6). Обрежьте и удалите все оставшиеся мышцы вдоль позвоночника, чтобы обнажить позвонки (Рисунок 2A; 7).
    2. Поместите сверхтонкие хирургические ножницы в позвоночный столб и разрежьте вдоль бокового края столба (Рисунок 2C). Полностью обрежьте противоположный боковой край, чтобы разделить позвоночный столб на переднюю и заднюю части.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг останется прикрепленным к позвонковому столбу.
    3. С помощью щипцов медленно и осторожно отделите спинной мозг от позвоночного столба и поместите ткань в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с 25 мМ HEPES. Перенесите переднюю и заднюю части позвоночного столба в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл холодного RPMI с 25 мМ HEPES.
  3. Удаление мозговых оболочек для приготовления одноклеточных суспензий
    1. С помощью щипцов извлеките тюбетейку из носителя RPMI. Использование острых щипцов (щипцы #7; Таблица материалов), надрежьте вокруг внешнего края черепной чашечки (Рисунок 2B) и отклейте мозговые оболочки от края черепной чашечки, соскабливая, чтобы удалить твердую мозговую и паутинную оболочки. Поместите мозговые оболочки в чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мозговых оболочек как из головного, так и из спинного мозга требует практики. Если пользователь испытывает трудности с извлечением мозговых оболочек, используйте препарирующий микроскоп, чтобы помочь в удалении.
    2. Извлеките позвоночный столб из трубки. Острыми щипцами надрежьте края позвоночного столба, чтобы освободить мозговые оболочки, и отделите мозговые оболочки от края позвонка с помощью изогнутых щипцов. Поместите мозговые оболочки в чашку Петри.
    3. Поместите ситечко из нейлоновой сетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Переместите мозговые оболочки в ситечко и добавьте 3 мл RPMI с добавлением 25 мМ HEPES. С помощью поршня от шприца объемом 5 мл измельчите ткань и среду через ситечко.
    4. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл промойте ситечко дополнительными 2–3 мл среды RPMI/HEPES до тех пор, пока все видимые ткани не пройдут через ситечко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество клеток для проточного цитометрического анализа, мозговые оболочки нескольких животных могут быть объединены вместе. В этом эксперименте (рис. 3 и 4) мозговые и спинные оболочки головного и спинного мозга 4–5 мышей были объединены вместе. Если образцы объединены, потребуется дополнительная среда для измельчения ткани через нейлоновое сетчатое ситечко, чтобы предотвратить перегрев ткани.
    5. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл перенесите клетки и среду в новую коническую пробирку объемом 15 мл. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл промойте коническую пробирку объемом 50 мл с 5 мл среды, чтобы собрать оставшиеся клетки. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы гранулировать клетки.
    6. Используя пипетку Пастера с вакуумом, отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не допустить образования гранул клеток, и повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме и буфере.
    7. Для подсчета одноклеточной суспензии разбавляют небольшой объем клеток (т. е. 5–10 мкл) с использованием красителя трипанового синего (разведение 1:10) и RPMI. Добавьте 10 мкл раствора в гемоцитометр.
    8. Подсчитайте ячейки, как описано ранее,40,41, усредняя не менее двух 16 квадратных сеток для точности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3, например, объединенные, гранулированные клетки из мозговых оболочек были ресуспендированы в 250 мкл буфера флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) (1x PBS с 1% FBS) для последующего поверхностного окрашивания. Клетки разбавляли 1:10 для подсчета (5 мкл клеток, 5 мкл трипанового синего, 40 мкл RPMI). Это разбавление дало от 50 до 100 клеток на 16 квадратных сеток, что обеспечило более точный подсчет клеток, поскольку клетки не были ни слишком плотными и перекрывающимися, ни слишком разреженными. Количество ядросодержащих клеток из объединенных мозговых и спинных мозговых оболочек у каждой мыши было следующим: для мозговых оболочек мышей, получавших фиктивное лечение, = 100 000–150 000 клеток, а для мозговых оболочек мышей, вызванных вирусом мышиного энцефаломиелита (TMEV-IDD), = 300 000–350 000 клеток. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от точности сбора, обработки и наличия воспаления мозговых оболочек.
    9. Приступайте к желаемому методу одиночных клеток, такому как поверхность FACS (Рисунок 3)14,36,42,43,44, протоколы внутриклеточного окрашивания 33,45, стимуляция in vitro, анализы клеточных культур 33,46,47, анализ ELISPOT 28,34,35 и объемный или одноклеточный транскриптомика37,48.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все пробирки на льду между этапами обработки.
  4. Приготовление одноклеточных суспензий тканей головного и спинного мозга
    1. Перенесите ткань головного или спинного мозга со средой в верхнюю часть чашки Петри диаметром 100 мм, высыпав ткань и среду из трубки. С помощью щипцов переместите ткань на дно чашки Петри. Мелко измельчите головной или спинной мозг стерильным лезвием бритвы. Используя лезвие бритвы, переместите измельченную ткань в нижнюю часть тарелки, соскребая, чтобы собрать ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола ферментативного пищеварения, приведенного ниже, до двух спинных мозгов могут быть объединены вместе для обработки. Мозги должны обрабатываться индивидуально.
    2. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте в чашку Петри 3 мл RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS). С помощью серологической пипетки объемом 10 мл пипетка поднимается и опускается, чтобы ресуспендировать ткань в среде и переложить в коническую пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последующим применением является анализ секвенирования отдельных клеток или объемных РНК или клеточных культур, партии FCS должны быть протестированы, чтобы убедиться, что клетки не активированы перед анализом. В качестве альтернативы ячейки могут быть обработаны с использованием 1x PBS с 0,04% BSA вместо RPMI с 10% FCS.
    3. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл промойте чашку Петри дополнительными 2 мл среды, чтобы собрать остатки ткани, и переложите в коническую пробирку для получения общего объема 5 мл. Держите трубки на льду между этапами обработки.
    4. С помощью пипетки ресуспендируйте порошок коллагеназы I в среде Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) для получения желаемой концентрации (т. е. 100 мг/мл). Добавьте коллагеназу типа I в коническую пробирку, содержащую измельченный образец ткани, чтобы получить желаемую конечную концентрацию (т.е. 50 мкл для 1 мг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие концентрации коллагеназы увеличивают выход клеток, но могут расщеплять маркеры клеточной поверхности. Таким образом, партии коллагеназы I должны быть титрованы для определения оптимальной концентрации, необходимой для получения наибольшего количества жизнеспособных клеток со всеми необходимыми маркерами клеточной поверхности. Например, коллагеназа I была исследована в конечных концентрациях 0,5 мг/мл, 1 мг/мл и 2 мг/мл на отдельных образцах головного или спинного мозга. Жизнеспособность клеток определяли методом исключения трипанового синего, а маркеры клеточной поверхности CD45, CD19 и CD4 оценивали методом проточной цитометрии. Концентрация коллагеназы I в концентрации 1 мг/мл давала наибольшее количество живых клеток, сохраняя при этом все интересующие маркеры клеточной поверхности. Таким образом, эта концентрация была использована для дальнейших экспериментов по изучению этих типов клеток.
    5. Осторожно ресуспендируйте порошок ДНКазы I, используя 0,15 М хлорида натрия до желаемой концентрации. Добавьте ресуспендированную ДНКазу I в коническую пробирку, содержащую измельченный образец ткани, чтобы получить конечную концентрацию 20 ед/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ДНКазы I варьируется в зависимости от единиц активности на мл. Концентрация, добавляемая в образец ткани, будет изменяться в зависимости от единиц активности флакона на миллилитр. Конечная требуемая концентрация на образец составляет 20 ед/мл.
    6. Поместите пробирки в штатив для пробирок на водяную баню с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 40 минут. Переворачивайте пробирки каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешать ткань с ферментами. После инкубации добавьте 500 мкл 0,1 М ЭДТА (рН = 7,2) в каждую пробирку для получения конечной концентрации 0,01 М ЭДТА и инкубируйте еще 5 мин для инактивации коллагеназы.
    7. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте в каждую пробирку 9 мл RPMI с добавлением 10% FCS, чтобы довести объем каждой пробирки до ~14,5 мл. Центрифуга при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Используя пипетку Пастера с вакуумом, отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не касаться клеточной гранулы.
    8. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл добавьте 3 мл 100% исходного раствора с градиентом изотонической плотности в пробирку, содержащую клеточную гранулу. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте дополнительную среду RPMI 10% FCS, чтобы довести окончательный объем до 10 мл, и повторно суспендируйте клеточную гранулу, чтобы создать слой раствора с градиентом изотонической плотности 30%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте 100% изотоническую среду градиента плотности, аликвоту, и храните при 4 °C до 3 месяцев. Для приготовления 100% исходного раствора изотонического градиента плотности разбавьте среду градиента плотности (таблица материалов) буфером для разбавления среды градиента плотности. Приготовьте буфер для разбавления среды градиента плотности (80,0 г/л NaCl, 3,0 г/л KCl; 0,73 г/лNa2HP0 4, 0,20 г/л KH2HP04; 20,0 г/л глюкозы) и фильтр стерилизуют с помощью системы вакуумных фильтров. Приготовьте 100% исходный раствор изотонического градиента плотности, смешав 1 часть буфера для разбавления градиента плотности и 9 частей среды градиента плотности. Хорошо перемешайте.
    9. Инвертируйте и хорошо перемешайте каждую пробирку перед добавлением 70% исходного раствора изотонического градиента плотности. Введите серологическую пипетку объемом 1 мл, содержащую 1 мл 70% исходного раствора с градиентом изотонической плотности, на дно пробирки. Медленно подложите 1 мл раствора, стараясь не образовывать пузырьков. Медленно извлеките серологическую пипетку из пробирки, стараясь не нарушить градиент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 70% подложки 100% исходный раствор изотонического градиента плотности следует разбавить до 70% с помощью среды RPMI (т. е. 7 мл 100% раствора изотонического градиента плотности и 3 мл среды RPMI хорошо перемешать). Кроме того, создание чистой, ненарушенной 70%-ной подложки необходимо для удаления остатков миелина и получения чистых одноклеточных суспензий на границе градиента после центрифугирования.
    10. Центрифуга при 800 x g в течение 30 мин при 4 °C без торможения. Аспирируйте надосадочную жидкость, включая слой миелиновых остатков, до тех пор, пока в пробирке не останется 2–3 мл, стараясь не повредить клеточный слой. Соберите клеточный слой между градиентом плотности 30/70% с помощью пипетки объемом 1 мл и переложите в новую коническую пробирку объемом 15 мл.
    11. Используя серологическую пипетку объемом 10 мл, добавьте 10% среды RPMI FCS, чтобы довести окончательный объем до 15 мл. Центрифуга 450 x g в течение 5 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клеточные слои из двух пробирок могут быть объединены, если это необходимо. Не объединяйте более двух пробирок, иначе ячейки не будут образовываться из-за высокой градиентной концентрации среды.
    12. Аспирируйте надосадочную жидкость осторожно, чтобы не повредить клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме/буфере для подсчета клеток с помощью гемоцитометра (например, ресуспендируйте один спинной мозг в 250 мкл буфера FACS для последующего поверхностного окрашивания) (рисунок 3).
    13. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите клеточные суспензии в верхнюю часть верхней пробирки фильтра (Таблица материалов) и дайте клеткам отфильтроваться на дно пробирки, чтобы удалить оставшийся мусор миелина.
    14. Используя исключающий краситель трипанового синего, разбавляют и подсчитывают клетки на гемоцитометре, усредняя не менее двух 16 квадратных сеток для точности40,41.
    15. Приступайте к желаемому методу анализа отдельных клеток.
      Примечание: Используя различные формы коллагеназы (т.е. D, тип I, тип II, тип IV), можно эффективно выделить иммунные клетки, микроглию (рис. 3), астроциты, перициты, эндотелиальные клетки49 и нейроны50 . Количество клеток ядра, полученное для получения результатов с использованием титрованного фермента коллагеназы I, было следующим: Весь фиктивный мозг = 500 000–600 000 клеток; Весь мозг TMEV-IDD = 800 000–1 000 000 клеток; Весь спинной мозг, обработанный симуляцией, = 150 000–200 000 клеток; Весь спинной мозг TMEV-IDD = 300 000–400 000. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от точности сбора, обработки и наличия воспаления ЦНС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот репрезентативный эксперимент был направлен на количественную оценку В- и Т-клеток и описание локализации В- и Т-клеток в менингеальных и паренхиматозных компартментах ЦНС в гомеостатических условиях, а также в мышиной модели прогрессирующего рассеянного склероза (т.е. TMEV-IDD). TMEV-IDD индуцировали у 5-недельных самок мышей SJL путем внутричерепной инфекции 5 x 106 бляшеобразующих единиц (PFU) TMEV BeAn, как описано ранее29.

В настоящем исследовании оценивали В- и Т-клетки в мозговых оболочках, головном и спинном мозге во время хронического ВМЭ-ЙДЗ на 120-й день после инфекции. В качестве контрольной группы использовали мышей соответствующего возраста, получавших фиктивную терапию. Исследование состояло из двух экспериментов. Первый был сосредоточен на получении одноклеточных суспензий для проточной цитометрической оценки, хорошо зарекомендовавшей себя методики анализа и количественной оценки клеточного состава путем оценки клеточной поверхности и/или внутриклеточных антигенов (n = 4 фиктивно обработанных; n = 5 TMEV-IDD). Второй эксперимент был направлен на описание локализации В- и Т-клеток в компартменте ЦНС с использованием иммуногистохимии на декальцинированных тканях головного и спинного мозга (n = 3 фиктивно обработанных; n = 8 TMEV-IDD).

После выделения одноклеточных суспензий из головного и спинного мозга и объединенных мозговых оболочек (головного и спинного мозга) от мышей, обработанных TMEV-IDD и фиктивной обработкой, ко всем образцам был применен протокол поверхностного окрашивания. Вкратце, одноклеточные суспензии инкубировали с фиксируемым окрашиванием исключения жизнеспособности (780) в течение 15 мин, промывали, блокировали Fc-блоком в присутствии сыворотки мышей в течение 15 мин и окрашивали конъюгированными антителами к маркерам клеточной поверхности, включая CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) и CD4 (GK1.5; ПЭ) в течение 30 мин, как описано ранее28,29. Затем клетки промывали и анализировали с помощью проточного цитометра28,29. Стробирование жизнеспособности проводили, как описано ранее28. Экспрессию CD45 оценивали, чтобы отличить инфильтрирующие иммунные клетки CD45hi периферического происхождения (P1) от CD45lo микроглии (P2) и CD45- нейронов, астроцитов и олигодендроцитов в головном и спинном мозге (P3; Рисунок 3А). У мышей, подвергшихся фиктивному лечению, в тканях спинного и головного мозга присутствовало малогипер-клеток CD45. В мозговых оболочках для идентификации гипериммунных клеток CD45hi применялся тот же отрог для экспрессии CD45hi, который использовался для данных по головному и спинному мозгу (P1; Рисунок 3В) и исключить неиммунные клетки, присутствующие в мозговых оболочках (т.е. фибробласты, эндотелиальные клетки). У мышей, получавших симуляцию, в мозговых оболочках присутствовало малогипер-клеток CD45 (<0,1%). Среди высокоиммунных клеток CD45 в тканях ТМЭВ-ИД ЦНС В-клетки и CD4-Т-клетки были идентифицированы по поверхностной экспрессии CD19 и CD4 соответственно (рис. 3B–D). Во всех тканях ТМЭВ-ИДД ЦНС наблюдалось увеличение процентного содержаниягипериммунных клеток CD45 по сравнению с мышами, получавшими фиктивную терапию (рис. 4А). Во время хронического ВМЭВ-ЙДЗ процент В-клеток средигипериммунных клеток CD45 в головном и спинном мозге был выше по сравнению с менингеальным компартментом (рис. 4B).

Для выявления локализации В-клеток и Т-клеток в компартменте ЦНС при хронической ТМЭВ-ИДД декальцинированные головной и спинной мозг оценивали с помощью иммуногистохимии с использованием протокола окрашивания, описанного ранее29. Мозговые оболочки и сосудистая сеть были разграничены с помощью ламинина, компонента базальной мембраны29,51 и ER-TR7, ретикулярного клеточного маркера фибробластов52,53. При обычном извлечении мозга из черепной крышки слой пиа был неповрежден, но остальные менингеальные слои были исключены (рис. 5А). В спинном мозге гидравлическая экструзия привела к отсутствию всех менингеальных слоев (данные не показаны). Как в декальцинированном головном, так и в спинном мозге все менингеальные слои были интактными (рис. 5B). Для изучения локализации В- и Т-клеток при хроническом ВМЭВ-ИДЗ экспрессия IgG использовалась для определения локализации изотип-переключаемых В-клеток 29, а CD3 — для визуализации всех Т-клеток29. Совместное окрашивание IgG с ER-TR7 показало, что изотип-переключаемые IgG+ В-клетки присутствуют в паренхиме ЦНС и мозговых оболочках (рис. 6А). Клеточные агрегаты в мозговых оболочках ER-TR7+ содержали множественные IgG+ В-клетки и CD3+ Т-клетки (рис. 6B).

Репрезентативные результаты показывают высокий процент как В-клеток, так и Т-клеток в паренхиматозном и менингеальном компартментах у мышей с хроническим ВМЭВ-ИДД по сравнению с мышами соответствующего возраста, получавшими фиктивное лечение. Анализ ВПХ также показал, что в ткани TMEV-IDD В-клетки и Т-клетки были рассеяны в паренхиме, но были тесно связаны в мозговых оболочках, образуя воспалительные агрегаты. У пациентов с прогрессирующим рассеянным склерозом воспалительные агрегаты менингеальных оболочек связаны с повреждением прилегающих тканей и худшими исходами заболевания. При хронической ВМЭВ-ЙДЗ стойкое присутствие В- и Т-клеток в ЦНС и агрегация в мозговых оболочках могут быть связаны с повреждением тканей и прогрессированием заболевания. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как воспаление менингеальных и паренхиматозных узлов влияет на демиелинизацию, нейродегенерацию и клиническую инвалидность.

Figure 1
Рисунок 1: Изоляция головного и спинного мозга для декальцинации. Синими пунктирными линиями обозначены разрезы, сделанные для изоляции головного мозга с неповрежденным черепом (разрезы 1-4) и позвоночного столба (разрезы 5-8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Изоляция головного мозга, спинного мозга и мозговых оболочек для одноклеточных методов. (А) Синими пунктирными линиями обозначены разрезы, сделанные для изоляции черепной чашечки с неповрежденными мозговыми оболочками и головным мозгом (разрезы 1-3) и позвоночного столба (разрезы 5-7). Боковой разрез 3 делается с обеих сторон черепа. (В) Синей линией обозначен разрез, сделанный для разреза и удаления мозговых оболочек в черепной чашечке, а также разрезы, сделанные на позвоночном столбе (обе боковые стороны) для изоляции спинного мозга и мозговых оболочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Идентификация CD45hi инфильтрирующих иммунных клеток в тканях ЦНС. (A) Стратегия стробирования для идентификации CD45hi инфильтрирующих иммунных клеток (P1), CD45lo микроглии (P2) и CD45-олигодендроцитов, астроцитов и нейронов среди общего количества живых клеток спинного мозга у мышей, получавших симуляцию (красный) или TMEV-IDD (синий). Минимальноеколичество гипер-клеток CD45 было обнаружено в головном и спинном мозге, подвергшихся фиктивному лечению. (B) Стратегия стробирования для идентификации CD19+ В-клеток и CD4+ Т-клеток среди CD45hi инфильтрирующих иммунных клеток (P1) у мышей с ВМВ-ИДД. Стратегии стробирования были схожи для тканей головного и спинного мозга. (C) Стратегия стробирования для идентификацииCD45 hi-клеток (P1) в мозговых оболочках мышей с фиктивным лечением (красный) и хроническим ВМЭВ-ИДД (синий). (D) Стратегия стробирования для идентификации CD19+ В-клеток и CD4+ Т-клеток среди CD45hi инфильтрирующих иммунных клеток (P1) в мозговых оболочках мышей с хроническим ВМВ-ИДД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Увеличение количествагипериммунных клеток CD45 и CD19+ В-клеток в тканях ЦНС при хроническом ВМЭ-ИДЗ. Гистограммы, сводные данные проточной цитометрии, полученные из мозговых оболочек, головного и спинного мозга, обработанных симуляцией или ВМВ-ИДД, показывают процентное соотношение инфильтрирующих иммунных клеток CD45 hi (А) или процентное содержание CD19+ В-клеток (В). Для тканей TMEV-IDD данные проточной цитометрии были получены от пяти мышей, при этом спинной и головной мозг обрабатывались индивидуально, в то время как мозговые оболочки были объединены для анализа. Для мышей, подвергшихся фиктивному лечению, данные проточной цитометрии были получены от четырех мышей, спинной и головной мозг обрабатывались индивидуально, в то время как мозговые оболочки были объединены для анализа. Данные по спинному и головному мозгу приведены в виде среднего значения ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Интактные менингеальные слои в декальцинированных головном и спинном мозге. (А) Мозг, извлеченный из черепной крышки, или (Б) декальцинированный мозг с интактными черепами и позвоночными столбами у мышей с хроническим ТМЭВ-ИДД оценивали на DAPI (синий), менингеальные маркеры ламинина (зеленый) и ER-TR7 (красный). Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Агрегация иммунных клеток была очевидна в мозговых оболочках при хроническом ВМЭ-ИДЗ. (A) Декальцинированные позвоночные столбы мышей с хроническим ТМЭВ-ИДД были исследованы на наличие IgG (зеленый) для выявления изотип-переключенных иммунных клеток в паренхиме и в мозговых оболочках ER-TR7+ (красный). (B) CD3+ Т-клетки (зеленые) и IgG+ В-клетки с переключением изотипа (красные) были окрашены совместно с оболочками ER-TR7+ для оценки локализации в ткани спинного мозга. Белыми стрелками выделены В- и Т-клетки в мозговых оболочках. Масштабная линейка = 50 мкм. Белые прямоугольники обозначают области, выбранные для обрезанных изображений (справа; масштабная линейка = 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы оценки клеточного состава в компартменте ЦНС в период гомеостаза и заболевания имеют важное значение для понимания физиологических и патологических состояний ЦНС. Однако, несмотря на то, что они служат важным барьером в ЦНС и содержат разнообразный набор иммунных клеток, мозговые оболочки часто исключаются из анализа, потому что многие традиционные методы извлечения тканей для головного и спинного мозга не позволяют собирать эти мембраны. Это упущение является критическим ограничением в нашем понимании клеточного состава и функции мозговых оболочек, а также их роли в устойчивом состоянии и воспалительных состояниях. Недавние исследования показали, что как резидентные, так и периферические иммунные клетки, находящиеся в менингеальном компартменте, играют важную роль в поддержании гомеостаза в ЦНС, а также в патогенезе заболевания ЦНС. Эти исследования подчеркивают необходимость анализа не только паренхиматозного компартмента, но и окружающих менингеальных слоев. Описанные здесь протоколы позволяют быстро изолировать головной и спинной мозг с сохранением мозговых оболочек, что в конечном итоге позволяет проводить всесторонний анализ компартмента ЦНС с использованием как гистологических, так и одноклеточных исследований. Репрезентативные результаты сосредоточены на оценке иммунных клеток в компартменте ЦНС; однако протоколы могут быть адаптированы для анализа микроглии, астроцитов, нейронов, перицитов, эндотелиальных клеток или других резидентных клеток ЦНС.

Важнейшим этапом описанных методов является тщательное извлечение ткани, необходимое как для выделения чистых одноклеточных суспензий из головного, спинного мозга и мозговых оболочек, так и для получения тканей ЦНС с интактными черепами или позвоночными столбами, что позволяет получить высококачественную морфологию тканей. Отработка метода получения одноклеточных суспензий является ключом к успешной экстракции тканей, поскольку она не только повысит чистоту образца, но и улучшит выход клеток для последующих применений. Аналогичным образом, практика изоляции тканей ЦНС с интактными черепами или позвоночными столбами для адекватного удаления избыточной ткани, окружающей кость, является важным шагом, обеспечивающим лучшую фиксацию, декальцинацию и криоконсервацию ткани, все важнейшие компоненты для получения срезов тканей с высококачественной морфологией и интактными мишенями антигенов.

Одним из ограничений нашего протокола по выделению одноклеточных суспензий из мозговых оболочек является то, что он фокусируется на получении твердых мозговых и арахноидальных оболочек32,54, исключая выделение пиа, которая остается прикрепленной к головному или спинному мозгу посредством астроцитарных процессов. Несмотря на то, что клетки, находящиеся в pia mater, являются важным компонентом менингеального компартмента, было решено исключить pia mater во время приготовления одноклеточной суспензии из-за большого количества времени, необходимого для ее адекватного выделения55. Аналогичным образом, протокол фокусируется только на получении мозговых оболочек в верхней части черепа и исключает изоляцию инвагинирующих мозговых оболочек в головном мозге и сосудистом сплетении. Забор инвагинирующих мозговых оболочек и сосудистого сплетения может проводиться по ранее опубликованным протоколам55, хотя и является трудоемкой процедурой. В обоих случаях решение опустить часть менингеальных слоев было связано с количеством времени, необходимого для их изоляции. Сроки протокола, используемого для приготовления одноклеточных суспензий, необходимых для последующих применений, таких как проточная цитометрия, анализ клеточных культур и секвенирование РНК (RNAseq), имеют решающее значение для повышения жизнеспособности клеток и качества данных. Поэтому, в зависимости от конкретного исследовательского вопроса, следует соблюдать баланс между временем выделения образца и тщательностью извлечения мозговых оболочек. В действующем протоколе получены только одноклеточные суспензионные препараты из твердой мозговой оболочки и паутинной оболочки, что ограничивает возможность экстраполяции результатов на всю мозговую оболочку ЦНС. Однако, если эти методы используются в сочетании с ИГХ или ИШ анализом целостных срезов тканей с тремя слоями мозговых оболочек, можно получить более глубокое понимание клеточной и молекулярной динамики в паренхиматозном и менингеальном компартментах.

Еще одним ограничением протокола является низкое количество клеток, полученных из твердых мозговых и паутинных оболочек, особенно в гомеостатических условиях. Однако, если количество клеток в спинном мозге, головном мозге или мозговых оболочках считается слишком низким для анализа конкретной целевой популяции клеток, минимальное количество клеток, необходимое для этого анализа, может быть определено путем оценки общего числа событий, необходимых для данной точности (например, 5% коэффициента вариации), как описано в предыдущей литературе, специализирующейсяна анализе редких событий. Эти расчеты затем могут быть использованы для определения того, нужно ли объединять образцы, взятые от нескольких животных, чтобы получить достаточное количество клеток для анализа интересующей клеточной популяции.

Описанные методы обеспечивают существенный прогресс в исследовании клеточной динамики в компартменте ЦНС, расширяя анализ, чтобы включить в него менингеальный компартмент, которым обычно не уделяют должного внимания. Эти протоколы позволяют проводить индивидуальную экстракцию головного и спинного мозга, а также твердых мозговых и арахноидальных мозгов для создания одноклеточных суспензий. Кроме того, протокол декальцификации позволяет проводить гистологический анализ срезов тканей, включающих ткани головного или спинного мозга, включая три менингеальных слоя. Использование ЭДТА обеспечивает медленный, но щадящий процесс декальцинации, который наиболее подходит для образцов, где требуется высококачественная морфология тканей (например, IHC и ISH). Протокол использует рН 7,2–7,4 для замедления скорости декальцинации и обеспечения поддержания интактной морфологии тканей, что является явным преимуществом перед сильными и слабыми кислотами (например, соляной кислотой и трихлоруксусной кислотой), которые имеют более короткое время декальцинации, но влияют на качество морфологии тканей.

Будущие методы, направленные на изоляцию одноклеточных суспензий из мозговых оболочек, должны быть сосредоточены на разработке протоколов, позволяющих сократить время, необходимое для тщательной изоляции пиального слоя от тканей ЦНС и инвагинирующих мозговых оболочек в головном мозге. Получение полного комплекса из трех менингеальных слоев не только увеличит количество клеток для любого анализа, но и обеспечит более полную оценку резидентных и инфильтрирующих иммунных клеток, занимающих мозговые оболочки, окружающие ЦНС. В то же время, будущие протоколы, ориентированные на подготовку декальцинированных головного и спинного мозга, должны быть направлены на выявление новых агентов, направленных на ускорение декальцинации тканей при сохранении качества морфологии тканей. Тем не менее, в целом, последующие приложения, анализирующие одноклеточные суспензии ЦНС, включая двойные и паутинные оболочки, выполняемые в сочетании с комплексным анализом срезов ткани, могут обеспечить детальное понимание фенотипа, функции и локализации клеток в компартменте ЦНС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят сотрудников Центра сравнительной медицины и исследований (CCMR) в Дартмуте за их экспертную помощь мышам, использованным для этих исследований. Исследовательский фонд Борнштейна финансировал это исследование.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 159 мозговые оболочки центральная нервная система декальцинация иммуногистохимия одноклеточная суспензия иммунные клетки мыши
Выделение тканей центральной нервной системы и связанных с ними мозговых оболочек для последующего анализа иммунных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter