Summary
Cet article rapporte que l’ajout de Y-27632 à TIVA moyen peut augmenter considérablement le rendement des mélanocytes des tissus de la peau adulte.
Abstract
L’isolement et la culture des mélanocytes primaires des tissus cutanés sont très importants pour la recherche biologique et ont été largement utilisés pour des applications cliniques. Isoler les mélanocytes primaires des tissus cutanés par la méthode conventionnelle prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour passer suffisamment. Plus important encore, les tissus utilisés sont généralement des avant-parents nouveau-nés et il est encore un défi d’isoler efficacement les mélanocytes primaires des tissus adultes. Nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode d’isolement pour les mélanocytes qui ajoute Y-27632, un inhibiteur de la rhénase, au milieu de culture initial pendant 48 h. Par rapport au protocole conventionnel, cette nouvelle méthode augmente considérablement le rendement des mélanocytes et raccourcit le temps nécessaire pour isoler les mélanocytes des tissus de prépuce. Nous décrivons maintenant cette nouvelle méthode plus en détail en utilisant l’épiderme adulte pour la culture efficace des mélanocytes primaires. Fait important, nous montrons que les mélanocytes obtenus à partir de tissus adultes préparés par cette nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement. Ce nouveau protocole bénéficiera de manière significative aux études des défauts de pigmentation et des mélanomes utilisant des mélanocytes primaires préparés à partir de tissus de peau adultes facilement accessibles.
Introduction
Le but de cette étude était de développer un protocole simple et efficace pour isoler les mélanocytes de l’épiderme de la peau adulte pour la recherche biologique et les applications cliniques. Les mélanocytes, qui sont situés dans l’épiderme basal de la peau et dans les follicules pileux, jouent un rôle important dans la pigmentation de la peau et des cheveux en produisant de la mélanine1. La pigmentation cutanée résultante des mélanocytes épidermiques agit comme un filtre de rayonnement ultraviolet qui réduit /empêche les dommages d’ADN aux cellules sous-jacentes dans la peau2. La prolifération anormale des mélanocytes dans la peau est assez commune, comme dans la formation de nevi bénin (taupes) dans lequel les mélanocytes potentiellement se transformer en croissance oncogène suivie par la sénescence cellulaire3.
Depuis 1957, l’isolement et la culture subséquente des mélanocytes primaires humains est possible4, mais ce n’est que depuis 1982 qu’il existe une méthode efficace qui peut reproduire les cultures de mélanocytes humains à partir de l’épiderme5. La méthode conventionnelle pour isoler les mélanocytes primaires de l’épiderme implique une digestion enzymatique en deux étapes. En bref, la peau est d’abord digérée avec du dispase pour séparer l’épiderme du derme, après quoi l’épiderme est digéré avec de la trypsine pour produire des suspensions contenant des mélanocytes et des kératinocytes, qui peuvent ensuite être cultivées sélectivement dans différents médias. Actuellement, la culture initiale prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour que les mélanocytes atteignent la confluence en utilisant la méthode conventionnelle, qui est probablement due à la faible efficacité de leur isolement. Par conséquent, l’augmentation de la production initiale de mélanocytes à partir de tissus de la peau adulte serait très utile pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.
De nombreux facteurs de croissance, dont la plupart ont été sécrétés par les kératinocytes (p. ex., α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF et SCF)5à8, régulent la différenciation et la prolifération des mélanocytes mammifères. En l’absence de couches d’alimentation, l’absence de ces facteurs de croissance conduit à la diminution de la prolifération des mélanocytes et leur apoptose accrue9. La co-culture des kératinocytes comme cellules d’alimentation et de mélanocytes pourrait conduire à la prolifération accélérée des mélanocytes et à la réduction de l’apoptose. Cependant, la méthode de co-culture exige non seulement plus de tissus de peau pour préparer des kératinocytes, ce qui n’est pas pratique, mais aussi ne pourrait pas fonctionner efficacement parce que les conditions de culture exigées par les mélanocytes ne favorise pas la croissance des kératinocytes, et vice-versa.
Des études antérieures ont rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de ROCK, dans le milieu de croissance peut améliorer le rendement des cellules épidermiques primaires humaines des tissus de la peau10-14. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier si l’isolement des mélanocytes primaires humains bénéficierait de la présence de Y-27632. En effet, l’ajout de Y-27632 dans le milieu15de tiva d’inoculation , qui contient TPA, IBMX, Na3VO4 et dbcAMP, a considérablement augmenté le rendement des mélanocytes primaires isolés des tissus de prépuce dans les cultures initiales16. Par rapport au protocole conventionnel, ce nouveau protocole est nettement plus efficace pour augmenter le rendement des mélanocytes16. Par conséquent, ce protocole décrit la nouvelle méthode en détail à l’aide de tissus cutanés adultes basés sur une étude précédente16 afin de promouvoir son application dans la recherche biologique de base et appliquée.
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Protocol
L’utilisation de tissus prépuces adultes dans ce protocole a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine (no 2015120401, date : 12 mai 2015).
REMARQUE : Effectuer toutes les procédures suivantes dans un environnement stérile pour prévenir les contaminations des cellules et des cultures.
1. Préparations
- Recueillir les tissus frais du prépuce adulte des chirurgies de circoncision dans des tubes de 15 mL contenant 10 mL de saline tampon de phosphate (PBS) et stocker dans 4 °C.
REMARQUE : Séparez les tissus comme indiqué ci-dessous dans les 24 h suivant leur excision. - Préparer les réactifs et le milieu de culture.
- Préparer 3% de P/S (pénicilline/streptomycine) comme solution de lavage. Mélanger 50 mL de PBS avec 1,5 mL de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 mg/L) (P/S).
- Préparer la solution de terminaison (solution de neutralisation) pour la neutralisation de la digestion enzymatique. Supplément 1% P/S, sérum bovin foetal (FBS) en DMEM moyen.
- Préparer les mélanocytes de TIVA à la culture : F12 de Jambon; 10% FBS; 1x P/S/glutamine; 50 ng/mL 12-O-tétradecanoyl phorbol-13-acétate (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-méthyl xanthine (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-monophosphate cyclique (dbcAMP).
2. La méthode conventionnelle
- Prétraitement des tissus cutanés
- Rincer chaque tissu avant-carin adulte une fois avec 10 mL d’éthanol à 75 % (alcool) pendant 30 s, puis rincer deux fois avec 10 mL de solution de lavage (3 % de P/S), pendant 5 min chacun.
NOTE: Laver les tissus prépuce avec 10 mL de PBS au début s’il ya beaucoup de sang. Tous les lavages sont préparés dans des plats de culture cellulaire de 100 mm. - Gratter chaque tissu prépuce à l’aide d’une lame chirurgicale pour enlever les tissus adipeux sous-cutanés et les tissus conjonctifs lâches dans le couvercle d’un plat de culture cellulaire de 100 mm.
REMARQUE : Utilisez un scalpel pour gratter les couches de graisse jusqu’à ce que seuls l’épiderme mince et le derme dense restent. - Transférer chaque prépuce adulte dans un autre plat de culture de 100 mm avec le côté derme vers le bas.
REMARQUE : Coupez chaque tissu avant-peau adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus efficacement. - Ajouter 2,5 mg/mL à chaque plat de culture de 100 mm avec des tissus de prépuce adultes et incuber de 16 à 20 h à 4 °C.
REMARQUE : Chaque gramme de tissu est digéré avec 10 mL de solution dispase.
- Rincer chaque tissu avant-carin adulte une fois avec 10 mL d’éthanol à 75 % (alcool) pendant 30 s, puis rincer deux fois avec 10 mL de solution de lavage (3 % de P/S), pendant 5 min chacun.
- Séparation de l’épiderme du tissu prépuce adulte
- Après la digestion pendant 16 à 20 h, séparer l’épiderme du derme à l’aide de pinces à épiler. Prenez un côté du bord dermique du tissu avec une pince à épiler et la position correspondante de la partie épidermique avec une autre pince à épiler et épluchez doucement l’épiderme.
- Laver l’épiderme 3x avec une solution de lavage (3% P/S), puis transférer l’épiderme dans un tube.
- Submerger l’épiderme en ajoutant 5 ml de trypsin à 0,05% dans le tube et incuber dans un bain d’eau pendant 30 min à 37 °C.
REMARQUE : Secouez le tube pour vous assurer que l’épiderme est complètement submergé avant l’incubation.
- Collecte et culture des cellules primaires
- Ajoutez un volume égal de solution de terminaison (10% FBS, 1% P/S en DMEM) pour neutraliser la trypsine et la pipette de la solution de haut en bas 10-15 fois pour séparer les cellules épidermiques.
- Passer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 50 ml à travers un filtre à mailles de 100 μm pour enlever les débris.
- Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
- Retirez le supernatant et ajoutez 10 mL de milieu d’inoculation TIVA pour résuspender les cellules.
- Ensemencez les cellules réesspensées dans un plat de culture de 100 mm.
- Culture dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO2.
- Changer le support tous les 2 jours.
- Cellules de passage quand elles atteignent 80% confluence.
3. La nouvelle méthode
REMARQUE : La procédure de préparation et de digestion des tissus dans la nouvelle méthode est la même que celle décrite ci-dessus pour la méthode conventionnelle, la seule différence étant que les cellules fraîches isolées sont réesspensées dans 10 mL de milieu TIVA contenant 10 μM Y-27632.
- Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support par un support TIVA normal sans Y-27632. Après cela, les conditions culturelles sont les mêmes entre les méthodes nouvelles et conventionnelles.
4. Passage cellulaire
- Retirer le milieu TIVA et rincer chaque plat de culture deux fois avec pbs.
- Ajouter 2 mL de 0,05% de trypsine par plat de culture cellulaire de 100 mm.
REMARQUE : Agitez le plat pour assurer un contact adéquat entre les enzymes digestives et le fond du plat. - Digèrez dans un incubateur de 37 °C pendant 2 min.
- Utilisez un microscope pour vérifier les cellules, et assurez-vous que la plupart des cellules se sont dissociées du plat de culture cellulaire.
REMARQUE : Appuyez doucement sur le plat pour libérer les cellules pour arrondir et flotter dans la solution. Prolongez le temps de digestion si la plupart des cellules ne sont pas suspendues après avoir tapé, mais pas plus de 5 minutes de plus. - Transférer les mélanocytes dans un tube de 15 mL après avoir neutralisé l’activité de trypsine en ajoutant 2 ml de solution de terminaison. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
- Resuspendez chaque granulé de cellule avec 10 mL de milieu TIVA après avoir lentement enlevé le supernatant, puis comptez le nombre de mélanocytes.
- Assiette d’environ 1 x10 6 mélanocytes dans 10 mL de TIVA moyen par plat de culture cellulaire de 100 mm.
- Renouveler le milieu de culture cellulaire tous les 48 h.
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Representative Results
La figure 1 montre un diagramme schématique comparant les méthodes conventionnelles et les nouvelles. La procédure de préparation et de digestion des tissus avec la nouvelle méthode est la même que la procédure pour la méthode conventionnelle, la seule différence étant que les cellules isolées sont resuspendées dans 10 mL de TIVA moyen en présence de 10 μM Y-27632. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support par un support TIVA normal sans Y-27632. La méthode conventionnelle d’isoler les mélanocytes primaires des tissus cutanés nécessite habituellement environ 3 à 4 semaines pour que les mélanocytes se développent en nombre suffisant pour passer, mais plus important encore, les tissus proviennent généralement de nouveau-nés et il est très difficile d’isoler les mélanocytes primaires des tissus de la peau adulte. Cependant, en utilisant la nouvelle méthode, les mélanocytes des tissus adultes sont observés en nombre significativement plus grand que les mélanocytes isolés en utilisant la méthode conventionnelle. Des vues microscopiques ont été prises aux jours 3, 6 et 8 lors de l’isolement des mélanocytes des tissus cutanés adultes en utilisant la méthode conventionnelle et la nouvelle méthode (Figure 2A). Dans ces vues microscopiques, la nouvelle méthode a augmenté de manière significative le rendement des mélanocytes aux jours 6 et 8. Les nombres de mélanocytes ont ensuite été quantifiés en comptant au moins 10 champs microscopiques différents aux jours 3, 6 et 8. Les résultats ont montré que le nombre de mélanocytes isolés à l’aide de la nouvelle méthode est beaucoup plus élevé que le nombre de mélanocytes isolés en utilisant la méthode conventionnelle aux jours 6 et 8 (figure 2B). Après 8 jours de culture, les mélanocytes ont été récoltés à l’aide de trypsine, puis comptés avec un compteur cellulaire automatisé dans chaque plat de 100 mm, ce qui a révélé que la nouvelle méthode a augmenté le rendement des mélanocytes d’environ cinq fois (Figure 2C). Les vues microscopiques prises au jour 9, un jour après le passage, ont montré que les mélanocytes transmis prolifèrent normalement (figure 2D), ce qui a été confirmé par la coloration Ki67 (Figure 2E).
Le rendement accru des mélanocytes par Y-27632 au cours de la culture initiale après l’isolement a été montré par la régulation des kératinocytes dans une publication précédente16. Comme le montre la figure 3, Y-27632 n’a pas augmenté la croissance et la prolifération des mélanocytes à passage (figure 3A-B) et n’a pas empêché l’apoptose des mélanocytes (figure 3C-D). Cependant, Y-27632 a considérablement augmenté l’attachement aux kératinocytes (figure 3E-H)et a également favorisé sa survie (Figure 3I) dans les médias TIVA de culture de mélanocytes. Soit la co-culture avec les kératinocytes en présence de Y-27632 ou le milieu conditionné dérivé des kératinocytes traités Y-27632 pourrait augmenter considérablement la croissance des mélanocytes (Figure 3J).
Pour caractériser davantage les mélanocytes isolés à l’aide de la nouvelle méthode, le MITF, un marqueur spécifique de mélanocytes, a été analysé à l’aide de la coloration d’immunofluorescence (IF) pour vérifier la pureté des mélanocytes après le passage initial. La figure 4A montre que le pourcentage de cellules exprimant le MITF au passage 1 était de près de 100 %, ce qui indique que des mélanocytes purs ont été obtenus après le premier passage par la nouvelle méthode, qui est similaire à la méthode conventionnelle. Pour vérifier si les mélanocytes isolés en utilisant la nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement, ils ont été traités avec du forskolin (FSK) pendant 2 jours in vitro, ce qui a induit les niveaux de pigmentation des mélanocytes (figure 4B). Pris ensemble, ces données suggèrent que les mélanocytes isolés en utilisant la nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement et peuvent produire des pigments.
Figure 1 : Comparaison de la nouvelle méthode et de la méthode conventionnelle. Ce schéma montre une comparaison de la méthode conventionnelle avec la nouvelle méthode d’isolement. La seule différence est que les cellules fraîches isolées sont réesspendées dans 10 mL de milieu TIVA en présence de 10 μM Y-27632. Deux jours après l’ensemencement, le milieu est remplacé par un milieu TIVA normal sans Y-27632. La nouvelle méthode atteint habituellement une densité de mélanocytes appropriés pour passer au cours du jour 8, tandis que la méthode conventionnelle prend habituellement environ 20 jours pour augmenter un nombre suffisant de mélanocytes pour passer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : La nouvelle méthode d’isolement augmente la production de mélanocytes primaires. (A) Images représentatives des mélanocytes préparées par la méthode conventionnelle (rangée supérieure) et par la nouvelle méthode (rangée inférieure) aux jours 3, 6 et 8 après l’inoculation initiale. (B) Quantification des nombres de mélanocytes préparées à l’aide de la méthode conventionnelle et de la nouvelle méthode en comptant les nombres de mélanocytes dans au moins 10 champs microscopiques différents (numéro cellulaire/vision) aux jours 3, 6 et 8. Toutes les expériences ont été effectuées en triple et les résultats sont exprimés comme le nombre moyen de cellules par champ microscopique. (C) Après la culture pendant 8 jours, les mélanocytes ont été récoltés à l’aide de trypsine et le nombre de mélanocytes préparés selon la méthode conventionnelle et la nouvelle méthode ont été comptés à l’aide d’une plaque de comptage cellulaire. Le nombre de cellules a été calculé à partir d’expériences triplicates, et les résultats montrent le nombre moyen de cellules par plat de 100 mm. (D) Après avoir compté le nombre de mélanocytes à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé, les mélanocytes préparés selon la méthode conventionnelle ou la nouvelle méthode ont été ensemencés dans de nouveaux plats et des photos microscopiques ont été prises au jour 9. (E) Les mélanocytes isolés en utilisant la nouvelle méthode au passage 0 ou au passage 1 ont été fixés et tachés avec l’anticorps Ki67 (rouge) et DAPI (noyaux, bleu). (B-C), Student’s t-test a été utilisé pour analyser les différences entre la nouvelle et la méthode conventionnelle, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Toutes les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Y-27632 améliore la croissance des mélanocytes par la régulation des kératinocytes. (A) Les mélanocytes purs (passage 3) ont été traités avec 10 μM Y-27632 pour 12, 24, 48 et 60 h et le nombre de mélanocytes a été analysé par l’essai CCK-8. (B) Les mélanocytes purs (passage 3) ont été traités avec 10 μM Y-27632 pendant 48h, puis ont été fixés pour la coloration de Ki67. Quantification du pourcentage de cellules positives Ki67 parmi les cellules vivantes totales indiquées avec la coloration nucléaire DAPI. (C-D) Les mélanocytes purs (passage 3) ont été traités avec 10 μM Y-27632 pendant 48 h et ont ensuite été soit tachés pour les cellules apoptotiques avec l’iodée Annelin V-FITC et propidium suivies de l’analyse FACS (C) ou fixées pour l’essai TUNEL. (E) L’épiderme isolé après la digestion de trypsine a été plaqué avec le milieu de TIVA avec ou sans Y-27632 (10 μM) et 2 jours plus tard l’analyse d’immunofluorescence des kératinocytes a été exécutée avec un anticorps de pan-cytokératine (pan-ck). (F) Quantification des kératinocytes dans les plats traités et témoins Y-27632 à partir (E) en pourcentage de kératinocytes dans un total de 500 cellules comptées. (G) Passage pur 3 kératinocytes ont été ensemencés dans le milieu TIVA avec ou sans Y-27632 (10 μM). Des images de cellules épidermiques sont montrées un jour après l’ensemencement. (H) Quantification des kératinocytes attachés dans les plats traités et témoins Y-27632 à partir de (G) comme pourcentage de cellules attachées dans un total de 5000 cellules ensemencées. (I) Le passage pur 3 kératinocytes ont été plaqués avec le milieu de TIVA en présence ou en absence de Y-27632. Les images microscopiques ont été obtenues à 24 h. (J) Panneau gauche : Nombres égaux de passage pur 3 mélanocytes ont été plaqués avec le milieu de TIVA dans 4 groupes avec addition(s) comme indiqué(s) indiqué(s) comme indiqué(s) indiqué(s) : 1) Y-27632 (10 μ M) seul (Y en graphique), 2) passage 3 kératinocytes seuls, 3) kératinocytes et Y-27632 (10 μM) (K+Y), et 4) aucun ajout (contrôle négatif, con). Des changements relatifs de pli dans la prolifération des mélanocytes par rapport au contrôle négatif ont été déterminés en comptant le nombre de mélanocytes à 24 h et 48 h après le placage. Panneau droit : Les supports TIVA conditionnés ont été obtenus des 4 groupes de cultures de mélanocytes de passage dans (panneau gauche) à 48 h après le placage. Ensuite, un nombre égal de mélanocytes de passage 3 ont été plaqués en 4 groupes, chacun avec l’un des médias conditionnés. Des changements relatifs de pli dans la prolifération des mélanocytes par rapport au contrôle négatif ont été déterminés en comptant le nombre de mélanocytes à 24 h et 48 h après le placage. (A-J) Toutes les expériences ont été répétées pendant 3 fois, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Toutes les barres des images représentent 100 μm. Le chiffre a été modifié de Mi et coll.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Caractérisation des mélanocytes isolés selon la nouvelle méthode. (A) Images représentatives de la coloration d’immunofluorescence du MITF (rouge) dans les mélanocytes préparés à l’aide de la méthode nouvelle ou conventionnelle. DAPI tache les noyaux (bleu). (B) Les granulés cellulaires ont été prélevés à partir de mélanocytes préparés selon la nouvelle méthode et ont été traités pendant 2 jours avec du forskolin (FSK) ou du véhicule DMSO comme un contrôle (con). Toutes les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole décrit ici était basé sur une publication récente16. Une certaine attention devrait être accordée aux étapes critiques suivantes pour obtenir les meilleurs résultats avec la nouvelle méthode. Tout d’abord, la séparation réussie de l’épiderme et du derme est cruciale. Couper les tissus du prépuce adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus soigneusement et plus facilement pour séparer l’épiderme du derme. Deuxièmement, lors de la séparation de ces deux couches, la contamination du derme doit être évitée puisque les fibroblastes dermiques peuvent également se développer dans le milieu de culture des mélanocytes. Troisièmement, l’étape de digestion de la trypsine doit être inférieure à 30 min; sinon, il diminuera considérablement la viabilité des cellules isolées.
Cette nouvelle méthode réduit considérablement le temps nécessaire à l’isolement des mélanocytes. Les mélanocytes épidermiques humains produisent de la mélanine, qui protège la peau des dommages causés par l’irradiation solaire. Eisinger et Marko ont proposé la première méthode pratique pour la culture des mélanocytes humains à partir de l’épiderme5. Plus important encore, les tissus utilisés proviennent généralement de nouveau-nés et il est très difficile d’isoler les mélanocytes primaires des tissus de la peau adulte. L’inhibiteur de la protéine Y-27632 associé à Rho améliore considérablement l’efficacité de l’isolement épidermique des cellules souches11à13. En outre, nous avons également signalé une méthode pour isoler les cellules épidermiques primaires humaines des tissus de la peau en présence de Y-2763210,11. Dans ce protocole, il a été démontré que Y-27632 augmentait efficacement le rendement des mélanocytes primaires. L’utilisation de la méthode conventionnelle a un faible taux de récupération cellulaire et a besoin d’environ 3 à 4 semaines de culture pour les mélanocytes de croître en nombre suffisant pour le passage. Cette nouvelle méthode, dans laquelle Y-27632 est ajouté au milieu de croissance TIVA, a augmenté le rendement des mélanocytes d’environ cinq fois, et les mélanocytes obtenus peuvent proliférer normalement. Nous avons également testé la nouvelle méthode à l’aide d’un support commercial et trouvé des résultats similaires. En ce qui concerne le mécanisme impliqué, une étude récente a démontré que l’effet de Y-27632 pour améliorer l’efficacité de l’isolement des mélanocytes se produit principalement par les kératinocytes16.
Fait important, nous avons obtenu des mélanocytes purs avec la fonction normale en utilisant la nouvelle méthode. Les mélanocytes de passage 1 (P1) ont été presque tous tachés pour l’expression mitf indiquant que les mélanocytes purs sont obtenus après le premier passage. Les mélanocytes primaires à fort potentiel de croissance sont très importants pour la recherche biologique et les applications cliniques. Les mélanocytes isolés en utilisant la nouvelle méthode peuvent être induits au pigment après traitement avec le forskolin, un activateur de cyclase d’adénylate qui augmente les niveaux cycliques d’AMP, indiquant que ces mélanocytes peuvent fonctionner normalement, qui sera utile pour étudier les défauts de pigmentation et le mélanome14.
En résumé, une méthode très efficace a été établie avec succès pour isoler les mélanocytes primaires des tissus de peau adultes. Cette méthode améliorée pourrait contribuer à fournir un nombre suffisant de mélanocytes d’une manière rapide pour la recherche biologique et pour des applications cliniques.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt de conflit.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 et the Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) à X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) et The Funds Funds Funds of Shandong University (2019GN043) à J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
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