Summary
Glutation S-transferases (GSTs) er avgiftning enzymer involvert i metabolismen av mange kjemoterapeutiske legemidler. Overuttrykk av GSTs er korrelert med kreft kjemoterapi resistens. En måte å motvirke denne fenotypen på er å bruke inhibitorer. Denne protokollen beskriver en metode ved hjelp av en spektrofotometrisk analyse for å screene for potensielle GST-hemmere.
Abstract
Glutation S-transferases (GSTs) er metabolske enzymer som er ansvarlige for eliminering av endogene eller eksogene elektrofile forbindelser ved glutation (GSH) bøyning. I tillegg er GSTs regulatorer av mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPKs) som er involvert i apoptotiske veier. Overuttrykk av GSTs er korrelert med redusert terapeutisk effekt blant pasienter som gjennomgår kjemoterapi med elektrofile alkylerende midler. Bruke GST hemmere kan være en potensiell løsning for å reversere denne tendensen og øke behandling styrke. Å oppnå dette målet krever oppdagelsen av slike forbindelser, med en nøyaktig, rask og enkel enzymanalyse. En spektrofotometrisk protokoll ved hjelp av 1-klor-2,4-dinitrobenzen (CDNB) som substrat er den mest brukte metoden i litteraturen. Imidlertid gir allerede beskrevet GST hemmingseksperimenter ikke en protokoll som beskriver hvert trinn av en optimal hemmingsanalyse, for eksempel måling av Michaelis-Menten-konstanten (Km) for CDNB eller indikasjon på den anvendte enzymkonsentrasjonen, avgjørende parametere for å vurdere hemmingsstyrken til en testet forbindelse. Derfor, med denne protokollen, beskriver vi hvert trinn i en optimalisert spektrofotometrisk GST-enzymanalyse, til skjermbiblioteker av potensielle inhibitorer. Vi forklarer beregningen av både den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen (IC50) ogkonstanten avhemming (K i )-to egenskaper som brukes til å måle styrken til en enzymhemmer. Metoden som er beskrevet kan implementeres ved hjelp av et utvalg av GSTs hentet fra celler eller ren rekombinant menneskelige GSTs, nemlig GST alfa 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) eller GST pi 1 (GSTP1). Denne protokollen kan imidlertid ikke brukes på GST theta 1 (GSTT1), da CDNB ikke er et substrat for denne isoformen. Denne metoden ble brukt til å teste hemmingsstyrke av curcumin ved hjelp av GSTs fra equine lever. Curcumin er et molekyl som viser anti-kreft egenskaper og viste affinitet mot GST isoformer etter i silico docking spådommer. Vi viste at curcumin er en potent konkurransedyktig GST-hemmer, med en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM og en Ki på 23,2 ± 3,2 μM. Curcumin har potensial til å kombineres med elektrofil kjemoterapi medisiner for å forbedre effekten.
Introduction
Cytosoliske glutation S-transferase enzymer (GSTs, EC 2.5.1.18) katalyser konjugering av glutation (GSH) i ulike elektrofile forbindelser, for eksempel kjemoterapeutiske midler, for å avgifte og eliminere dem enkelt fra kroppen1. Syv isoformer av cytosolisk GST har blitt identifisert som alfa, mu, pi, sigma, omega, theta og zeta. GSTs uttrykkes hovedsakelig i leveren, testiklene, lungene og mage-tarmkanalen2. ISOFORMEN GST alfa 1 (GSTA1) uttrykkes høyt i hepatocytter. Kroppen heterogent uttrykker andre undertyper, inkludert GST pi 1 (GSTP1) hovedsakelig i hjernen, hjertet, og lungene, og GST mu 1 (GSTM1) i leveren og testiklene3. Selv om det er høy sekvens homologi mellom GST isoformer, viser hver substrat spesifisitet og er innblandet i stoffskifte og kreft på forskjellige måter, i henhold til differensialuttrykk4,5.
Elektrofile forbindelser enten inn i kroppen eksogent eller produseres endogent. Plantevernmidler, prostaglandiner, kreftfremkallende stoffer og kjemoterapeutiske legemidler er noen av de potensielle substrater for glutation konjugeringsreaksjoner6. For eksempel, noen elektron-mangelfull reaktiv forbindelse dannet i en celle er sannsynlig å bli en elektrofil substrat. Alkylerende midler som klorambucil eller melfalan elimineres som konjugater av GSH katalysert av GSTs, og økte nivåer av disse enzymene har blitt korrelert med motstand mot disseforbindelsene 6,7.
En annen viktig rolle cytosoliske GSTs er å regulere aktiviteten til mitogen-aktivert protein kinases (MAPK) som MAPK8 (også kjent som c-Jun N-terminal kinase, eller JNK1) og MAP3K5 (også kjent som apoptose signalregulerende kinase 1, eller ASK1)8. Noen isoformer i deres monomeriske konformasjon vil binde seg til disse proteinene og dermed blokkere fosforyleringskaskade. Under normale forhold vil GSTP1 isoform sequester MAPK8 (aktivatoren av c-Jun protein). Ved å kombinere c-Jun med c-Fos-proteinet dannes aktivatorproteinet 1 (AP-1) transkripsjonsfaktor, som er ansvarlig for å transkribere pro-apoptotiske gener. I stressede celler, komplekset dannet av GSTP1 og MAPK8 dissosierer, c-Jun er aktivert, og genene som fører til apoptose begynner å bli uttrykt9. Større uttrykk for denne GST isoformen kan derfor blokkere banen, noe som fører til økt celle levedyktighet, mer cellulær spredning, og lavere cellulær følsomhet for kjemoterapi. Lignende scenarier kan oppstå med paraloger av GSTP1, for eksempel GSTM1, som samhandler med MAP3K510.
Rollene spilt av GSTs i stoffskifte og i sekvestrasjon av MAPKs førte til hypotesen om at et større uttrykk for GSTs kan være et tegn på en tumorresistensmekanisme mot kjemoterapeutiskbehandling 6,11. For eksempel er GSTP1 overuttrykt i mange kreftformer, og dens tilstedeværelse har blitt korrelert med en dårlig prognose og økt forekomst av tilbakefall8. Polymorfisme i disse genene har også vist differensial eksponering og overlevelse for pasienter som presenterer ulike sykdommer, forsterke ideen om at disse enzymene er avgjørende for mekanismer for legemiddelresistens. For eksempel er personer med GSTM1 null genotype forbundet med lavere legemiddelklarering og bedre overlevelse12,,13. Det finnes flere potensielle metoder for å motvirke denne overuttrykket, for eksempel bruk av GSH analoger, prodrugs som aktiveres ved bøyning med GSTs, eller direkte GST-hemmere14,15.
Alle disse metodene er for tiden under undersøkelse, og noen forbindelser har begynt kliniske studier for deres potensielle bruk blant pasienter. Men så vidt vi vet, er det ingen forbindelser i bruk som GST-hemmere i kliniske innstillinger15. Faktisk er mangel på spesifisitet for visse isoformer eller uttømming av GSH i normale celler, noe som kan føre til toksisitet forårsaket av akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) i organsystemer, bare noen av ulempene som reduserer potensialet til GST-hemmere14,15. Risikoen for at disse forbindelsene kan utøve andre farmakodynamiske effekter på kroppen begrenser også bruken. Etakrinsyre, for eksempel, er den mest studerte GST-hemmeren i laboratoriemiljøer, men fordi den primært brukes som et sterkt vanndrivende, begrenser denne egenskapen bruken i kombinasjon med andre legemidler i kliniske omgivelser. Curcumin er en annen naturlig forbindelse vellykket screenet som en GST-hemmer. Dette molekylet er en polyfenoleter hentet fra Curcuma longa arter av gurkemeie. Det har vist lovende resultater som et mulig behandlingsalternativ mot kreft ved å indusere apoptose av ulike typer tumorcellelinjer16,17. Forbindelsen kan regulere ulike cellulære veier, som tyrosin kinase18 eller GST banen. Studier med rene proteiner har vist sin hemming styrke på GSTA1, GSTM1 og GSTP119,,20. Det ble imidlertid observert motstridende resultater i kreftceller, hvor større intracellulær GST-aktivitet ble målt når celler ble behandlet med curcumin21. Dermed er det viktig å undersøke halvmaksimal hemmende konsentrasjon (IC50) og konstant hemming (K i )av enhverantatt GST-hemmer ved hjelp av en tydelig beskrevet protokoll med riktige kontroller før du planlegger ytterligere cellulære eksperimenter.
Screening og testing potensielle nye GST hemmere er derfor av betydelig klinisk interesse, og enhver ny forbindelse funnet må være trygg og effektiv for bruk i kombinasjon med elektrofile legemidler. Fokusering forskning på isoform-spesifikke hemmere kan aktivere GST hemming i tumorvev viser spesifikke mønstre av GST uttrykk, og dermed tillater utviklingen av en effektiv kombinasjonsbehandling. Å finne inhibitorer med differensialmodimodi kan også være av interesse. For eksempel kan en konkurransedyktig hemmer som bruker GSH som substrat indusere uttømming. Denne reduksjonen av GSH-konsentrasjonen i celler ble vist å indusere oksidativt stress i nevroner, noe som førte til apoptose. En annen vanlig modus for hemming – ikke-konkurransedyktig hemming – kan ikke reverseres selv om substratet er tilstede i høye konsentrasjoner.
Frekvensen av enzymatisk aktivitet er representert ved Michaelis-Menten konstant (Km) og maksimal hastighet (Vmaks), som kan bestemmes ved å plotte en Michaelis-Menten graf, med substratkonsentrasjonen mot hastigheten på reaksjonen23. Km er konsentrasjonen av substrat som kreves for å okkupere halvparten av de enzymatiske aktive stedene, noe som betyr at en høy Km representerer mindre affinitet. Vmax representerer maksimal hastighet på reaksjonen, nådd når alle de aktive områdene er okkupert av substratet. Km er lik halv Vmaks. Det er tre vanligste modi for inhibering: konkurransedyktige, konkurransedyktige og ikke-konkurrerende. Ved konkurransehemming binder inhibitoren seg til det aktive stedet av enzymet og konkurrerer med substratet. Derfor endres ikke Vmax etter tilsetning av hemmeren, men Km øker, da mer substrat er nødvendig for å motvirke hemmingen. Ukonkurransedyktig hemming oppstår bare når substratet danner et kompleks med enzymet. I dette tilfellet, da nivået av hemming avhenger av substratet og enzymkonsentrasjonen, reduseres Vmax og Km når hemmeren legges til reaksjonen. Den siste modusen for hemming er ikke-konkurransedyktig og er en blanding av de to andre hemmingsmønstrene. Hemmeren kan binde seg til det aktive stedet av enzymet om enzymet er bundet til substratet eller ikke. Herreduseres V max etter tilsetning av hemmeren, men Km endres ikke24.
En spektrofotometrisk analyse som målte GST-aktiviteten ble først utviklet av Habig et al. i 1974 ved hjelp av 1-klor-2,4-dinitrobenzene (CDNB) som substrat for reaksjonen22. Bøyning mellom GSH og CDNB danner GS-DNB, som viser en maksimal lysabsorpsjon ved bølgelengden på 340 nm, som kan registreres med et spektrofotometer. Det meste av teknikken som er forklart nedenfor er avledet fra Habig et al., inkludert informasjon om de beste innstillingene og viktige optimaliseringspunkter for en hemmende analyse. Teknikken kan brukes til screening potensielle GST hemmere, enten valgt av rasjonelle narkotika valg ved hjelp av beregningsmessige spådommer eller av litteratur gjennomgang. Hvordan tilpasse protokollen til nylig syntetiserte GST proteiner eller spesifikke isoformer er også diskutert. For eksempel kan testing av den hemmende styrken av GST isoformer som viser en klinisk relevant polymorfisme eller av enkeltkjernerpolymorfimer (SNPer) være potensielle bruksområder for denne protokollen, rettet mot pasientspesifikke GSTs.
Denne protokollen gir en rask, gjennomførbar og effektiv metode for screening av potensielle GST-hemmere in vitro før andre funksjonelle studier. Trinnene som trengs for å evaluere de mest målte egenskapene til en enzymatisk hemmer er beskrevet: den hemmende konsentrasjonen 50 (IC50) som er konsentrasjon av inhibitor som kreves for å redusere den enzymatiske aktiviteten til det halve; og konstanten av hemming (Ki) som representerer likevektkonstanten av dissosiasjonen mellom inhibitoren og enzymet, karakteristisk for affiniteten mellom disse to molekylene. Disse to verdiene måles ved ikke-lineær regresjon og bruker ligninger som er spesifikke for henholdsvis hver modus for hemming. Vi viser også vurderingen av dette mønsteret av hemming, ved hjelp av Michaelis-Menten tomter for å bestemme endringen av Vmax og Km etter tilsetning av hemmeren23,,25,,26.
Protocol
1. Utarbeidelse av GST-enzymløsningen
MERK: Prosedyren for å forberede enzymoppløsningen avhenger av om enhetene for enzymatisk aktivitet er kjent før analysen. En enzymatisk enhet er mengden enzym som trengs for å syntetisere 1 μmol produkt per minutt. Enzymatisk aktivitet er representert i enhet/ml eller μmol/min/ml og avhenger av fortynningen av den enzymatiske oppløsningen. Spesifikk enzymatisk aktivitet er representert i enhet/mg eller μmol/min/mg og avhenger utelukkende av renheten av oppløsningen. Begge disse egenskapene bestemmes nedenfor. Hvis den enzymatiske enheten til en isolert GST isoform er ukjent, må den anslås å justere de enzymatiske konsentrasjonene for hver reaksjon og gi reproduserbare resultater.
- Hvis den enzymatiske enheten i GST som brukes i analysen er kjent:
- Forbered en fersk lagerløsning av GST-enzymet ved 0,1 E/ml i vann og fortsett deretter med trinn 2.
MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C i aliquots i flere måneder eller ved -80 °C i lengre perioder, men fryse-/tinesyklusen må unngås.
- Forbered en fersk lagerløsning av GST-enzymet ved 0,1 E/ml i vann og fortsett deretter med trinn 2.
- Hvis den enzymatiske enheten for GST som brukes i analysen er ukjent:
- Kvantifisere enzymet oppløsning protein konsentrasjon ved hjelp av en bicinchoninic acid (BCA) protein analyse, eller andre kit.
- Fortynn proteinoppløsningen til en endelig proteinkonsentrasjon på 0,02 mg/ml.
- Tilsett 20 μL av enzymoppløsningen, 20 μL GSH 25 mM (molekylvekt: 307,32 g/mol) og 150 μL av Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) til en 96-brønnsplate. For det tomme, tilsett 20 μL vann i stedet for enzymoppløsningen.
- Tilsett 10 μL CDNB 50 mM (molekylvekt: 202,55 g/mol) substrat til hver brønn.
- På en spektrofotometrisk mikroplateleser angir du parametrene for lesing av brønnene ved 340 nm. Det anbefales å måle absorbansen hvert minutt i 10 minutter.
- Sett platen inn i mikroplateleseren, og start avlesningen i henhold til innstillingene for trinn 1.2.5.
- Beregn endringen i absorbans per minutt for de enzymatiske prøvene og det tomme.
MERK: Kontroller at reaksjonen er lineær ved å plotte absorbans på y-aksen og minutter på x-aksen. Hvis reaksjonen ikke er lineær og når et platå, betyr det at alt underlaget brukes og reaksjonen er for rask. Dermed redusere mengden av enzym lagt til brønnen ved å fortynne lagerløsningen med to. - Blank-korrigere testprøvens absorbansmålinger.
- Med ligning 1, som representerer øl-Lambert-loven, beregne konsentrasjonen av GS-DNB dannet (i μM) av reaksjonen hvert minutt.
Ligning 1:
hvor C er konsentrasjonen av substratet i μM, A340/min er endringen i absorbans per minutt, målt i trinn 1.2.7, ε er molar utryddelseskoeffisient for CDNB konjugat på 340 nm (0,0096 μM-1* cm-1), og l er lengden på lysbanen i brønnen (i cm). For en 96-brønns plate fylt med 200 μL enzymatisk oppløsning, er banelengden rundt 0,55 cm. Denne verdien kan variere i henhold til platemodellen og bør verifiseres med produsenten. - For å bestemme mengden produkt som finnes i en brønn i μmol / min, multiplisere resultatene funnet ved hjelp av ligning 1 med volumet av løsningen, 2 x 10-4 L.
- Normaliser aktiviteten per mengde protein som brukes ved å dele resultatene av trinn 1.2.9 med 4 x 10-4 mg. Resultatet er den spesifikke enzymatiske aktiviteten i enhet/mg eller μmol/min/mg.
MERK: Hvis fortynningen ble endret i trinn 1.2.6, på grunn av en ikke-lineær reaksjon, juster proteinmengden tilsvarende. - For å finne enzymatisk aktivitet, juster resultatene til proteinkonsentrasjonen i mg/ml ved å multiplisere den spesifikke enzymatiske aktiviteten som finnes i trinn 1.2.10 med 0.002 mg/ml. Dette vil gi enzymatisk aktivitet i enhet / ml eller μmol / min / ml.
MERK: I motsetning til den enzymatiske aktiviteten, vil dette tiltaket ikke endres avhengig av fortynningen av proteinoppløsningen. Samme notat som trinn 1.2.10, men for proteinkonsentrasjonen. - Forbered en lagerløsning av GST-enzymet ved 0,1 enhet/ml i vann og fortsett deretter med trinn 2.
MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C i aliquots i flere måneder eller ved -80 °C i lengre perioder, men fryse-/tinesyklusen må unngås. Kontroll av enzymatisk aktivitet anbefales hvis forsøkene utføres i løpet av en lengre periode, da nedbrytning av proteinoppløsningen kan oppstå.
2. Måling av Michaelis-Menten konstant av GST isoform for CDNB
MERK: Prosedyren er forklart for et CDNB-substrat, men kan brukes på andre substrat, for eksempel GSH. Hver konsentrasjon av CDNB trenger sin egen blanke, da absorbansen ved 340 nm vil øke i henhold til CDNB-konsentrasjonen.
- Forbered seks forskjellige konsentrasjoner av CDNB, fra 10 mM til 100 mM, i etanol 95% (v / v).
- Forbered analyseoppløsningen, med 10 μL CDNB, 20 μL GST-enzym, 20 μL GSH 25 mM og 150 μL DPBS. For det tomme, i stedet for CDNB-løsningen, legg bare til 10 μL etanol 95%.
- Forbered en blank for hver CDNB konsentrasjon, med 10 μL CDNB, 20 μL vann, 20 μL GSH 25 mM og 150 μL DPBS.
- Ta opp absorbansen ved 340 nm hvert minutt i 10 minutter med en mikroplateleser.
- Blank-korrigere absorbansen ved å trekke resultatene fra det tomme fra de riktige andre testbrønnene. I henhold til de målte verdiene beregner du reaksjonens hastighet ved hjelp av Formel 2.
Ligning 2:
der A340/min er den eksperimentelt bestemte endringen i absorbans per minutt, er Vtotalt (totalt volum) lik 0,2 ml,V-enzymet (volum av enzym) er 0,02 ml, og εGS-DNB er molarutryddelseskoeffisienten til GS-DNB-konjugatet på 340 nm (9,6 mM-1*cm-1). I en 200 μL brønn av en 96-brønns plate er banelengden 0,55 cm (avhengig av platetype) og utryddelseskoeffisienten tilsvarer 5,3 mM-1. Hastigheten kan representeres enten med μmol/ml/min eller mM/min. - Plott Michaelis-Menten-grafen med hastigheten (på y-aksen) mot substratkonsentrasjonen (på x-aksen).
- Definer maksimal hastighet (Vmaks)for reaksjonen og Michaelis-Menten konstant (Km) (det vil vil vil at substratkonsentrasjonen ved halvparten av Vmaks).
MERK: Ved hjelp av programvare som GraphPad Prisme, kan enzymet kinetikkkurve monteres ved hjelp av en ikke-lineær regresjon for beregning av Michaelis-Menten enzym kinetikk parametere, for eksempel Vmax og Km. - Forbered en CDNB lagerløsning ved 20 ganger beregnet Km i etanol 95% (v / v).
3. Absorbans av den potensielle GST-hemmeren
MERK: Dette trinnet utføres for å undersøke om den potensielle GST-hemmeren som brukes i reaksjonen, produserer en metabolitt som øker absorbansen ved bølgelengden som måles. Hvis den gjør det, vil mengden inhibitor som brukes ha innvirkning på resultatene, og en bestemt blank bør være forberedt for hver konsentrasjon.
- Fortynn hemmeren til de nødvendige konsentrasjonene.
MERK: Forbered tre forskjellige fortynninger, helst de laveste, midterste og høyeste konsentrasjonene som ble testet under hemmingsanalysen. Maksimal DMSO-konsentrasjon i brønnen skal være lik eller mindre enn 1 % (v/v). Vi testet DMSO-konsentrasjonens effekt på analysen i laboratoriet vårt, og 1 % endret ikke GST-aktiviteten betydelig. - I en 96-brønns plate, tilsett 2 μL av den potensielle GST-hemmeren, 20 μL GSH 25 mM og 168 μL DPBS. Bruk en passende kontroll, uten hemmer, ved å legge til like mengder av oppløsningsvæsken som brukes til hemmerprøvene.
- Inkuber reaksjonen i 10 minutter, for å begynne den enzymatiske reaksjonen.
MERK: Dette trinnet kan optimaliseres ved å teste forskjellige inkubasjonstider, med de to målene for å starte reaksjonen samtidig som den unngår total uttømming av substratet. - Tilsett 10 μL CDNB i hver brønn for å oppnå en endelig konsentrasjon ved Km funnet i trinn 2.
- Rist platen i noen sekunder.
- Ta opp absorbansen ved 340 nm hvert minutt i 10 minutter med en mikroplateleser.
- Beregn endringen i absorbans per minutt.
- Kontroller endringen i absorbans sammenlignet med både den tomme reaksjonen og den negative kontrollreaksjonen uten hemmer.
- Hvis det er en betydelig endring, bruk blank for hver hemmerkonsentrasjon for å justere resultatene.
MERK: Dette resultatet indikerer at reaksjonens bestanddeler, uten GST-enzym, reagerer spontant og produserer en metabolitt som øker absorbansen ved 340 nm. For å korrigere for denne ekstra absorbansen, bør en bestemt blank måles for hver konsentrasjon. - Hvis det ikke er noen signifikant endring i absorbans, bruk en generell blank, som bare inneholder oppløsningsvæsken som brukes til GST-hemmerfortynningen, for alle konsentrasjonene.
- Hvis det er en betydelig endring, bruk blank for hver hemmerkonsentrasjon for å justere resultatene.
4. Hemmingsanalyse av GST- og IC50-vurdering
- Forbered ni konsentrasjoner av den potensielle GST-hemmeren.
MERK: Konsentrasjonene kan tilpasses i henhold til resultatene. Målet er å definere bunn- og toppplatåene i den ikke-lineære regresjonskurven. Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon om dette trinnet. - Klargjør analyseoppløsningen ved å fortynne 20 μL av GSH-oppløsningen ved 25 mM med 148 μL DPBS. Tilpass volumet i henhold til antall brønner som brukes i analysen.
- I en klar 96-brønnsplate, klargjør den enzymatiske reaksjonen i et endelig volum på 190 μL. Det anbefales å bruke en flerkanals pipette for disse trinnene.
- For testbrønnene, tilsett 20 μL av enzymoppløsningen, 2 μL av den potensielle GST-hemmerløsningen og 168 μL av analyseoppløsningen.
- For kontrollen, tilsett 20 μL av enzymoppløsningen, 2 μL av fortynningsmiddelet som brukes til GST-hemmeren og 168 μL av analyseoppløsningen.
- For de tomme brønnene, tilsett 20 μL vann, 2 μL av den potensielle GST-hemmeren og 168 μL av analyseoppløsningen.
MERK: Hvis GST-hemmeren absorberer 340 nm bølgelengde, bør en bestemt blank tilberedes for hver konsentrasjon testet.
- Tilsett 10 μL av CDNB-oppløsningen ved 20x Km til hver brønn, inkludert det tomme. Det anbefales å bruke en flerkanals pipette for dette trinnet.
- Rist platen i noen sekunder.
- Mål absorbansen ved 340 nm hvert minutt i 10 minutter ved hjelp av en mikroplateleser.
- Blank-korrigere absorbansen ved å trekke resultatene fra testbrønnen blanks.
- Normaliser resultatene ved å dele verdiene som oppnås ved hjelp av GST-hemmerløsningen med kontrollens absorbans per minutt uten hemmer.
- Plott de ikke-lineære regresjonsgrafene til den logaritmiske konsentrasjonen (x-aksen) av hemmeren mot GST-aktiviteten (y-aksen), og bestem dermed IC50.
MERK: GraphPad Prisme beregner IC50 fra de ikke-lineære regresjonsplottene ved å forutsi konsentrasjonen som vil vise 50% av den enzymatiske aktiviteten i kontrollen. Prediksjonen er basert på bunn- og toppplatåer, samt kurven av skråningen dannet av sigmoid grafen.
5. Vurdering av Ki ogtype hemming
- Forbered fire forskjellige CDNB konsentrasjoner: tre høyere og en lik Km tidligere funnet.
- Forbered tre forskjellige konsentrasjoner av GST-hemmere, lik eller under den tidligere funnet IC50.
- Utfør hemmingsanalysen som beskrevet i trinn 4.2 til 4.7.
- Beregn hastigheten på reaksjonene ved hjelp av Formel 2.
- Plott Michaelis-Menten grafer for hver hemmerkonsentrasjon og beregn Vmaks og Km av hver reaksjon.
- I henhold til endringene i Vmax og Km ved bruk av ulike konsentrasjoner, vurdere GST-hemmerens modus for hemming.
MERK: Dette trinnet er forklart mer detaljert i resultat- og diskusjonsdelene. - Basert på modus for hemming, beregne Ki.
MERK: I GraphPad Prisme vil forskjellige ligninger bli brukt til å beregne Ki i i henhold til arten av hemmingen. Ligningene som brukes er basert på observert Km og Vmax etter tilsetning av hemmeren og sammenlignet med kontrollens Km og Vmaks.
Representative Results
Michaelis-Menten konstant (Km) av CDNB med GST fra equine lever
Curcumin er en trygg naturlig forbindelse selv etter inntak ved høyeredoser 27 som viste kreftegenskaper16. Den hemmende styrken til dette molekylet er vist på humane rekombinante GSTs19,20. Ved hjelp av den beskrevne protokollen evaluerte vi curcumins effekt på GST-aktivitet ved hjelp av en pool av GST isoformer fra equine lever. Ifølge leverandøren er den spesifikke aktiviteten til denne blandingen av proteiner 25 E / mg. En lagerløsning på 0,1 E/ml ble tilberedt ved å oppløse det lyofiliserte pulveret i riktig mengde vann. Ethakrynsyre ble brukt parallelt som en positiv kontroll da denne forbindelsen er den mest brukte GST-hemmeren i studier. Trinn for å definere en GST-aktivitetsanalyse og testing av inhibitorer er beskrevet i figur 1.
Km må defineres for hver enzymsubstratreaksjon fordi bruk av substratkonsentrasjonen tilsvarende Km ikke ville sikre noen skjevhet vedrørende bestemmelse av modusen for hemming28. Seks forskjellige konsentrasjoner av CDNB, fra 0,5 mM til 5 mM, ble testet for å måle denne parameteren, ved hjelp av en fast konsentrasjon på 2,5 mM GSH.
Reaksjonens endelige volum var 200 μL, i en 96-brønns plate. En bestemt blank ble brukt for hvert eksperiment, ved hjelp av samme konsentrasjon av CDNB som testen godt fordi spontan bøyning av CDNB og GSH kunne oppstå og kan øke absorbansen. En endelig enzymkonsentrasjon på 0,01 enhet/ml ble brukt til alle reaksjonene, ved å tilsette 20 μL av lageroppløsningen til analyseblandingen. Absorbans ved 340 nm ble registrert hvert minutt i 10 minutter. Hastigheten (i mM/min) av reaksjonen ble beregnet ved hjelp av Formel 2. En Michaelis-Menten graf ble plottet av substratkonsentrasjonen (mM) mot hastigheten (μM/min) (figur 2), og Km av reaksjonen ble beregnet. Eksperimentet ble gjentatt til minst tre sett med data viste lignende resultater. Km cdnb med GST fra equine lever ble målt som 0,26 ± 0,08 mM. En konsentrasjon på 0,2 mM CDNB ble brukt for hver hemmende analyse ved hjelp av denne gruppen av GSTs.
Ingen spontan dannelse av en metabolitt som absorberes ved 340 nm ble målt under eksperimenter ved bruk av curcumin inkubert alene med GSH og CDNB. Det samme blanke ble brukt for hver hemmerkonsentrasjon i hvert eksperiment.
Curcumins hemmende styrke på GSTs
Curcumins hemmende styrke ble spådd ved hjelp av en i silico docking simulering med programvare (f.eks AutoDock Vina versjon 1.1.2). 29 Den frie bindingsenergien mellom forskjellige GST isoformer (nemlig GSTA1, GSTM1 og GSTP1) og curcumin ble spådd (data vises ikke). Deretter ble konstanten av hemming Kjeg beregnet ved hjelp av Equation 3.
Ligning 3:
der ∆G er den frie bindingsenergien som finnes ved hjelp av silicoanalysen, er R gasskonstanten på 1.987 cal * K-1* mol-1, og T er temperaturen under eksperimentet, i dette tilfellet i Kelvin (298 K).
Basert på de frie bindende energiresultatene som returneres av AutoDock Vina, er curcumin en potent GST-hemmer av henholdsvis human GSTA1, GSTM1 og GSTP1, med Ki-verdier på henholdsvis 78,1 μM, 78,1 μM og 27,4 μM. De første hemmende analysene ble utført ved hjelp av disse beregningsmessige K i estimatene,og konsentrasjonene ble justert i henhold til resultatene, om nødvendig.
Først ble IC50 estimert. Denne egenskapen er konsentrasjonen av inhibitor som reduserer et enzyms reaksjonshastighet med 50%. Det er derfor avhengig av enzymkonsentrasjonen30. Ni endelige konsentrasjoner av inhibitoren ble utarbeidet, fra 0,39 μM til 100 μM med hver konsentrasjon dobbelt så stor som den forrige. Analyseløsningen består av 20 μL GSH 2,5 mM, 20 μL GST fra hestelever ved 0,01 E/ml-finale, 2 μL av curcuminløsningen og 148 μL PBS. Kontrollen var sammensatt av samme løsning med fortynningsmiddelet som brukes til curcumin. Denne blandingen ble inkubert i 15 minutter for å starte enzymanalysen og for å unngå nedbrytning av curcumin i analyseløsningen, da denne forbindelsen er ustabil i bufferløsninger31. Deretter ble 10 μL CDNB-oppløsning ved 4 mM lagt til hver brønn, for en endelig konsentrasjon på 0,2 mM CDNB. Absorbans ved 340 nm ble registrert hvert minutt i 10 minutter, for å beregne endringer i absorbans per minutt. For å beregne IC50 ble hvert utvalg inkubert med curcumin normalisert til kontrollen, for å gi prosentandelen av aktiviteten. Disse resultatene ble analysert ved hjelp av plottingsprogramvaren ved å beregne den ikke-lineære regresjonen av den logaritmiske konsentrasjonen av inhibitoren versus hemmingen. IC50 funnet for curcumin på GST fra equine leveren var 31,6 ± 3,6 μM (figur 3A).
Det samme eksperimentet ble utført parallelt ved hjelp av etakrinsyre som en positiv kontroll, med konsentrasjoner fra 0,39 til 100 μM, som med curcumin. IC50 ble funnet å være 6,6 ± 1,1 μM (figur 3B).
Det neste trinnet var å vurdere curcumins modus for hemming på disse overføringene. Fire forskjellige konsentrasjoner av curcumin ble testet: 0, 7,5, 15 og 30 μM, sammen med fire forskjellige konsentrasjoner av CDNB: 0,2, 0,4, 1 og 1,5 mM. Protokollen var den samme som for det forrige eksperimentet. Hastigheten på hver betingelse ble beregnet ved hjelp av Formel 2. En kurve ble plottet for hver hemmerkonsentrasjon, med hastigheten (i μM/min) mot substratkonsentrasjonen (mM) (figur 3C). Vmax og Km ble bestemt basert på hver tomt med GraphPad Prisme. Den potensielle hemmerens modus for hemming ble vurdert i henhold til endringene i disse to parametrene og analysenes forskjellige tilstand. 24 Siden Vmax ikke signifikant endret seg mellom forholdene, men Km økte med de forskjellige hemmerkonsentrasjonene, er curcumins hemming av GSTs konkurransedyktig. Dette mønsteret av hemming oppstår når hemmeren konkurrerer med substratet for det aktive stedet av enzymet. For å måle Ki av en konkurransedyktig hemmer bruker GraphPad Ligning 4 og ligning 5 som beskrevet av Copeland et al.32.
Ligning 4:
Ligning 5:
der K m obs er den observerte Michaelis-Menten konstant, Km er Michaelis-Menten konstant av kontrollen, [I] er hemmerkonsentrasjonen, Ki er konstanten av hemming, Y er hastigheten, og X er substratkonsentrasjonen.m obs
Beregningene er basert på de samme eksperimentene som vurderingen av inhiberingsmodusen. Ki anslått for curcumin hemming av GST fra equine leveren var 23,2 ± 3,2 μM.
Figur 1: Flytskjema som beskriver trinnene i GST-enzymatiske og hemmingsanalyser. Detaljer om prosedyren presenteres i protokolldelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Michaelis-Menten plott av GST enzym aktivitet. Økt konsentrasjon av substratet CDNB ble brukt med en fast konsentrasjon av GSH (2,5 mM) for å bestemme GST-aktiviteten fra et utvalg av GST fra hestelever. Km verdi for CDNB ble bestemt som 0,26 ± 0,08 mM i henhold til kurven av grafen. Hvert datapunkt på plottet representerer gjennomsnittet av fire forskjellige eksperimentelle løp med SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av curcumin og etakronsyre på GST enzymaktivitet. (A-B) Tillegg av økende konsentrasjoner av enten curcumin (A) eller positiv kontroll ethakrynsyre (B), mens du holder samme GST (0,01 U / ml), GSH (2,5 mM) og CDNB (0,2 mM) endelige konsentrasjoner ble brukt til å beregne IC50 av begge forbindelsene for GST fra equine lever med en ikke-lineær regresjon. IC50 ble bestemt som 31,6 ± 3,6 μM for curcumin og 6,6 ± 1,1 μM for etakrinsyre. (C) Michaelis-Menten plott av ulike konsentrasjoner av curcumin, testet mot varierende konsentrasjoner av CDNB substrat indikerer en konkurransedyktig modus for hemming. Uten hemmer ble Vmax og Km målt som henholdsvis 132,7 ± 4,6 μM og 0,5 ± 0,08 μM. Med 30 μM curcumin, Vmax og Km var 130,4 ± 13,1 μM og 1,08 ± 0,39 μM. Datapunkter i alle grafer (A-C) representerer midler til tre forskjellige eksperimentelle løp med SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi tilbyr en protokoll som beskriver hvert trinn i en spektrofotometrisk GST-enzymanalyse, til screene putative hemmere (figur 1, tabell 1) og kvantifisere deres hemmende styrke. Vi understreket også de mest avgjørende kriteriene å vurdere for nøyaktige enzymanalyser som gir reproduserbare resultater. Hovedfordelene med den beskrevne protokollen over andre kolorimetriske metoder eller massespektrometri er at denne protokollen er rask og enkel å utføre og gi kvantitative målinger av GST-aktiviteten, samt hemmingsstyrke av screenede molekyler.
Vi presenterer måten å beregne de to viktigste Michaelis-Menten parametrene til en enzymhemmer: IC50 og Ki. En potent hemmer vil utøve lavest mulig Ki og IC50, noe som indikerer at affiniteten mellom inhibitoren og enzymet er høyt30. Siden IC50 er avhengig av enzymkonsentrasjonen oganalyseforholdene 33, kan det være vanskelig å bruke denne verdien til å sammenligne hemmere fra forskjellige eksperimenter eller oppnås ved hjelp av andre analyseforhold34. Ved hjelp av konstant hemming Ki er en bedre indikator på hemmende styrke av potensielle forbindelser. K i kan brukes til å sammenligne to inhibitorermed forskjellige modi for hemming, da det utelukkende er avhengig av affiniteten mellom inhibitoren og enzymet. Men for å ha en klar ide om arten av hemmingen må man bestemme begge hemmerens parametere30. Vi målte curcumins ' IC50 og Ki som 31,6 ± 3,6 μM og 23,2 ± 3,2 μM, noe som indikerer at denne forbindelsen er en potent GST-hemmer. Disse resultatene bekreftet i silico spådommer, som estimerte Ki verdier mellom 27,4 til 78,1 μM for ulike menneskelige GST isoformer og curcumin.
Enzymatisk aktivitet eller reaksjonshastighet og enzymmengde
Som nevnt ovenfor er IC50 avhengig av enzymkonsentrasjonen, og å gjennomføre et eksperiment med et ukjent nivå av enzymatisk aktivitet kan føre til falske konklusjoner33. For å kontrollere for andre faktorer, noe som kan redusere hemmende aktivitet, bør man vurdere og måle enzymatisk aktivitet for hver nye gruppe GSTs. For eksempel kan nedbrytning av en enzymatisk batch, forårsaket av for mange fryse-/tinesykluser, redusere aktiviteten og dermed føre til en lavere IC50 selv om eksperimentet ble kjørt under samme forhold. Med andre ord, ved hjelp av 0,01 enheter av enzym vil ikke gi de samme resultatene som å bruke 1 enhet. Bruk av for mange enzymer kan føre til en rask uttømming av substratet og reaksjonen vil ikke ha en lineær form. Denne parameteren kan dermed føre til unøyaktig resultat, da ingen endring i absorbans ville bli sett etter en lang inkubasjonstid.
Km Verdi
For å sikre de beste forutsetningene for å vurdere hvilken type hemming som vises av en hemmer, må substratkonsentrasjonen være lik eller under Michaelis-Menten-konstanten (Km). Km er representert ved konsentrasjonen av substrat som kreves for å okkupere halvparten av de aktive stedene på enzymet28. For eksempel kan høyere substratkonsentrasjon motvirke en konkurransedyktig hemmer og vurdere denne typen hemming vil være vanskelig i en slik setting. Dermed er et av de avgjørende trinnene i denne metodikken fastsettelsen av enzymets Km for det valgte substratet (her CDNB). I noen studier ble denne verdien ikke bestemt, og dette kan føre til falske konklusjoner om mønsteret av hemming forårsaket av hemmingen, oghvis modusen for hemming er feil, vil K jeg bli beregnet feil som ligningen er avhengig av mønsteret av hemming26,28. Hvis en annen GST isoform er testet, er en ny vurdering av Km-verdien obligatorisk, da denne verdien er unik for et par enzym og ligand. Da vi brukte en konsentrasjon av CDNB litt lavere enn Km (0,2 mM), som vi definerte som 0,26 ± 0,08 mM, ble den forventede konkurransemodusen for hemming av curcumin på GST nøyaktig bestemt.
IC50
Å få en god sigmoidal kurve som å anslå IC50 krever å finne både bunnen og toppen platåer. Bunnplatået representerer konsentrasjonene av en hemmer som gir maksimal hemmende aktivitet. I noen tilfeller, en forbindelse kan ikke hemme enzymet fullt ut, selv ved høye konsentrasjoner, på grunn av slike tekniske problemer som løselighet. Verktøy som GraphPad Prisme kan imidlertid passe det nederste platået ganske nøyaktig. Det øverste platået består av konsentrasjoner av inhibitoren, som ikke er tilstrekkelige til å hemme enzymet, og derfor er aktiviteten maksimal. Begge disse platåene er avgjørende for å bestemme IC50 samt konsentrasjoner i mellom, for å finne skråningen av kurven- da kan IC50 være avledet fra formen på sigmoidkurven35. Curcumin er dårlig løselig i vann, og dermed er maksimal konsentrasjon som brukes i denne analysen begrenset, for å unngå nedbør i analyseløsningen. Dermed ble mindre konsentrerte løsninger, som ikke hemmer fullt gst-aktiviteten, brukt. Dette reiste spørsmål for fastsettelse av bunnplatået. For å motvirke dette problemet spådde vi bunnverdier basert på den ikke-lineære regresjonsgrafen, som ga en IC50 på 31,6 ± 3,6 μM for curcumin (figur 3A). For etakrinsyre var det ikke nødvendig å forutsi verdiene for bunnplatået da denne forbindelsen er løselig i analyseløsningen og IC50 ble målt til 6,6 ± 1,1 μM.
Denne metoden kan brukes på de mest uttrykte GST isoformene i menneskelige, nemlig GSTA1, GSTM1 eller GSTP1. Denne protokollen er imidlertid ikke egnet til å kvantifisere aktiviteten til ISOFORM FOR GSTT1, da CDNB ikke er et substrat for denne undertypen. 36, 37 år gammel I mellomtiden kan protokollen endres litt for å motvirke dette problemet. For eksempel , ved hjelp av 1,2-epoxy-3-(4'-nitrophenoxy)propan (ENPP) som substrat for GSTT1 og måle antall konjuger på 360nm i stedet for 340nm. 37.
Trinn av protokollen kan være tilpasset og brukes til å teste GST aktivitet og inhibitor testing i celle kultur eksperimenter. Måling av GST-aktiviteten på celler behandlet med og uten en GST-hemmer vil indikere om denne forbindelsen kan brukes i en slik eksperimentell setting. Det er spesielt interessant når hemmeren er lipofil. For eksempel presenterte vi at curcumin er en potent GST-hemmer ved hjelp av denne protokollen. Likevel kan bruken av cellulære studier være begrenset, da molekylet er dårlig løselig i vann og brytes raskt i medium. 31 En annen forbedring av denne protokollen er mulig angående ikke-isoform spesifisitet av substratet CDNB. Ved hjelp av denne protokollen i cellestudier vil bare gi informasjon om den generelle GST-aktiviteten, men ikke på aktiviteten til nøyaktig GST-undertype. Legge isoform-spesifikke substrat og / eller ved hjelp av bestemte rekombinante GST isoform vil tillate å teste isoform spesifikke GST hemmere.
For å konkludere beskriver vi en komplett prosedyre for å teste GST-hemmere som har potensial til å brukes i kombinasjon med elektrofil kjemoterapi. Vi understreket de avgjørende trinnene i en GST-enzym og hemmingsanalyse, for å teste potensielle interessante molekyler og bestemme effektiviteten som hemmer med kvantitative verdier, IC50 og Ki. Denne metoden kan brukes på noen antatt sammensatte og utføres på de mest uttrykte menneskelige GST isoformer (GSTA1, GSTM1 og GSTP1), eller litt tilpasset for å utføre cellekulturstudier med GST-hemmere eller måle aktiviteten til andre interessante GST isoform av valget.
| Reagenser | navn | Konsentrasjon i analyseoppløsningen | Andre |
| Substrat | CDNB | Målt km (mM) | Fortynnet i 95% etanol. Den endelige etanolkonsentrasjonen bør ≤ 5 % (v/v) |
| Konjugaterende substrat | Gsh | 2,5 mM | Fortynnet i vann. |
| Konsentrasjonen må mette løsningen. | |||
| Buffer | Pbs | - | pH = 7,1 |
| Enzym | Pool av GST isoformer eller ren isoform | 0,01 enhet/ml, bestemt eksperimentelt. | Fortynnet i vann. |
| GST-hemmer | Potensiell sammensatte valg | IC50: 3 konsentrasjoner som maksimalt hemmer, 3 som minimalt hemmer, og 3 i mellom. | Fortynnet i DMSO og deretter i vann, for å ha en endelig konsentrasjon av DMSO ≤ 1% (v / v) |
| Ki: 3 konsentrasjoner rundt IC50. | |||
| Parametere | |||
| Romtemperatur (25°C) | |||
| pH = 7,1 | |||
| DMSO ≤ 1% (v/v) | |||
| Etanol ≤ 5% (v/v) | |||
Tabell 1: Sammendrag av reagensene og parametrene som skal vurderes under en GST-hemmingsanalyse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette forskningsarbeidet ble støttet av CANSEARCH Foundation. Forfatterne ønsker å anerkjenne Ms. Laurence Lesne og Mr. Yoann Sarmiento for teknisk assistanse, spesielt i å gjennomføre replikere eksperimenter mens standardisere analysene med inhibitorer. Fruktbare diskusjoner og innspill fra Mr. Denis Marino, Dr. Simona Mlakar og Dr. Vid Mlakar er sterkt anerkjent. Vi takker Dr.Patricia Huezo-Diaz Curtis for hennes hjelp med fortellingen om videoen. Vi takker Dr. Muthukumar for hans innspill på i silico spådommer. Vi takker også Mr. Darren Hart for hans hjelp i engelskspråklig bevislesing av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) | Sigma-Aldrich | 237329 | Substrate used for the GST enzymatic assay |
| Corning UV-Transparent Microplates | Sigma-Aldrich | CLS3635 | Transparent plate to perform the enzymatic assay. When using 200 ul, the pathlength is 0.552 cm for this plate. |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 8511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | To prepare the stock of the putative inhibitor |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Buffer for the enzymatic reaction |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 10542382 | To dilute the CDNB |
| Glutathione S-Transferase from equine liver | Sigma-Aldrich | G6511 | Used for the results section, to test the inhibition potency of curcumin |
| L-glutathione reduced (GSH) | Sigma-Aldrich | G4251 | Co-substrate for the GST enzymatic assay |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | To quantify the amount of protein present in the enzymatic solution |
| Spectramax iD3 | Molecular devices | To do spectrophotometric measurments |
References
- Mannervik, B., Danielson, U. H. Glutathione transferases--structure and catalytic activity. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 23 (3), 283-337 (1988).
- Awasthi, Y. C., Sharma, R., Singhal, S. S.
- Rowe, J. D., Nieves, E., Listowsky, I. Subunit diversity and tissue distribution of human glutathione S-transferases: interpretations based on electrospray ionization-MS and peptide sequence-specific antisera. Biochemical Journal. 325, Pt 2 481-486 (1997).
- Beckett, G. J., Hayes, J. D.
- Oakley, A. Glutathione transferases: a structural perspective. Drug Metabolism Reviews. 43 (2), 138-151 (2011).
- Townsend, D. M., Tew, K. D. The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance. Oncogene. 22 (47), 7369-7375 (2003).
- Tew, K. D. Glutathione-associated Enzymes in Anticancer Drug Resistance. Cancer Research. 54 (16), 4313-4320 (1994).
- Laborde, E. Glutathione transferases as mediators of signaling pathways involved in cell proliferation and cell death. Cell Death and Differentiation. 17 (9), 1373-1380 (2010).
- Adler, V., et al. Regulation of JNK signaling by GSTp. The EMBO Journal. 18 (5), 1321-1334 (1999).
- Cho, S. G., et al. Glutathione S-Transferase Mu Modulates the Stress-activated Signals by Suppressing Apoptosis Signal-regulating Kinase 1. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12749-12755 (2001).
- Hayes, J. D., Flanagan, J. U., Jowsey, I. R.
- Lo, H. W., Ali-Osman, F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance. Current Opinion in Pharmacology. 7 (4), 367-374 (2007).
- Ansari, M., et al. Glutathione S-transferase gene variations influence BU pharmacokinetics and outcome of hematopoietic SCT in pediatric patients. Bone Marrow Transplantation. 48 (7), 939-946 (2013).
- Mahajan, S., Atkins, W. M. The chemistry and biology of inhibitors and pro-drugs targeted to glutathione S-transferases. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 62 (11), 1221-1233 (2005).
- Allocati, N., Masulli, M., Ilio, C. D., Federici, L. Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7 (1), 8 (2018).
- Aggarwal, B. B., Kumar, A., Bharti, A. C. Anticancer potential of curcumin: preclinical and clinical studies. Anticancer Research. 23 (1), 363-398 (2003).
- Han, S. S., Chung, S. T., Robertson, D. A., Ranjan, D., Bondada, S. Curcumin causes the growth arrest and apoptosis of B cell lymphoma by downregulation of egr-1, c-myc, bcl-XL, NF-kappa B, and p53. Clinical Immunology. 93 (2), Orlando, Fla. 152-161 (1999).
- Golonko, A., Lewandowska, H., Świsłocka, R., Jasińska, U. T., Priebe, W., Lewandowski, W. Curcumin as tyrosine kinase inhibitor in cancer treatment. European Journal of Medicinal Chemistry. 181, 111512 (2019).
- Awasthi, S., et al. Curcumin-glutathione interactions and the role of human glutathione S-transferase P1-1. Chemico-Biological Interactions. 128 (1), 19-38 (2000).
- Appiah-Opong, R., Commandeur, J. N. M., Istyastono, E., Bogaards, J. J., Vermeulen, N. P. E. Inhibition of human glutathione S-transferases by curcumin and analogues. Xenobiotica; the Fate of Foreign Compounds in Biological Systems. 39 (4), 302-311 (2009).
- Dubey, V., Owusu-Apenten, R. Curcumin Restores Glutathione-S-Transferase Activity for LNCaP Prostate Cancer Cells. Pure and Applied Chemistry. 2, 61-72 (2014).
- Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. The Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
- Johnson, K. A., Goody, R. S. The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry. 50 (39), 8264-8269 (2011).
- Ochs, R. S.
- Bisswanger, H.
- Acker, M. G., Auld, D. S. Considerations for the design and reporting of enzyme assays in high-throughput screening applications. Perspectives in Science. 1 (1), 56-73 (2014).
- Cheng, A. L., et al. Anticancer Research. 21, 2895-2900 (2001).
- Yang, J., Copeland, R. A., Lai, Z. Defining Balanced Conditions for Inhibitor Screening Assays That Target Bisubstrate Enzymes. Journal of Biomolecular Screening. 14 (2), 111-120 (2009).
- Uppugunduri, C. R. S., Muthukumaran, J., Santos-Silva, T., Ansari, M. Identification of putative substrates and inhibitors for Glutathione S-transferases using computational methods. Zenodo. , (2017).
- Burlingham, B. T., Widlanski, T. S. An Intuitive Look at the Relationship of Ki and IC50: A More General Use for the Dixon Plot. Journal of Chemical Education. 80 (2), 214 (2003).
- Wang, Y. J., et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 15 (12), 1867-1876 (1997).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods of Biochemical Analysis. 46, 1 (2005).
- Kalliokoski, T., Kramer, C., Vulpetti, A., Gedeck, P. Comparability of Mixed IC50 Data - A Statistical Analysis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Brandt, R. B., Laux, J. E., Yates, S. W. Calculation of inhibitor Ki and inhibitor type from the concentration of inhibitor for 50% inhibition for Michaelis-Menten enzymes. Biochemical Medicine and Metabolic Biology. 37 (3), 344-349 (1987).
- Brooks, H. B., et al. Basics of Enzymatic Assays for HTS. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2012).
- Arakawa, S., et al. Evaluation of hepatic glutathione transferase Mu 1 and Theta 1 activities in humans and mice using genotype information. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 40 (3), 497-503 (2012).
- Sherratt, P. J., Pulford, D. J., Harrison, D. J., Green, T., Hayes, J. D. Evidence that human class Theta glutathione S-transferase T1-1 can catalyse the activation of dichloromethane, a liver and lung carcinogen in the mouse. Comparison of the tissue distribution of GST T1-1 with that of classes Alpha, Mu and Pi GST in human. The Biochemical Journal. 326 (3), 837-846 (1997).
