Summary
De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.
Abstract
Het doel van het manuscript is om een stapsgezind protocol te bieden voor het uitvoeren van immunofluorescentiemicroscopie om de door straling geïnduceerde DNA-schaderespons te bestuderen die wordt veroorzaakt door neutronengamma mixed-beam die wordt gebruikt in boor neutronenvangsttherapie (BNCT). In het bijzonder wordt de voorgestelde methode toegepast voor de detectie van activering van reparatie-eiwitten, die als foci kan worden gevisualiseerd met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor DNA-dubbelstrengbreuken (DNA-DSB's). DNA-herstel foci werden beoordeeld door immunofluorescentie in darmkankercellen (HCT-116) na bestraling met de neutronen gemengde straal. DNA-DSB's zijn de meest genotoxische laesies en worden in zoogdiercellen hersteld door twee belangrijke trajecten: niet-homologe end-joining pathway (NHEJ) en homologe recombinatiereparatie (HRR). De frequenties van foci, immunochemisch gekleurd, voor veelgebruikte markers in de radiobiologie zoals γ-H2AX, 53BP1 worden geassocieerd met DNA-DSB-nummer en worden beschouwd als efficiënte en gevoelige markers voor het toezicht op de inductie en reparatie van DNA-DSB's. Vastgesteld werd dat γ-H2AX foci reparatieeiwitten aantrekt, wat leidt tot een hogere concentratie van reparatiefactoren in de buurt van een DSB. Om DNA-schade op cellulair niveau te monitoren, werd immunofluorescentieanalyse gepland voor de aanwezigheid van DNA-PKcs representatieve reparatieeiwitfoci van het NHEJ-traject en Rad52 van het HRR-traject. We hebben een betrouwbaar immunofluorescentie-kleuringsprotocol ontwikkeld en geïntroduceerd voor de detectie van door straling geïnduceerde DNA-schaderespons met antilichamen die specifiek zijn voor herstelfactoren van NHEJ- en HRR-trajecten en waargenomen door straling geïnduceerde foci (RIF). De voorgestelde methode kan worden gebruikt voor het onderzoek naar reparatie-eiwit dat sterk wordt geactiveerd in het geval van neutronen-gemengde straalstraling, wat de dominantie van het reparatietraject aangeeft.
Introduction
De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van de detectie van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie-vlekken, bijvoorbeeld in de cellijn van darmkanker bij de menselijke darmkanker na bestraling met de neutronen gemengde straal.
Ioniserende straling (IR) veroorzaakt een veelheid van verschillende soorten DNA-schade (DNA-DSB's, DNA-SSB's, DNA-basisschade) waaruit DNA-dubbelstrengbreuken de meest genotoxische DNA-laesies zijn1. Niet-gerepareerde breuken kunnen celdood veroorzaken, terwijl verkeerd gerepareerde pauzes de kans op chromosoomherschikking, mutagenese en verlies van beslissende genetische informatie verhoogt. De schade respons trajecten reageren op DSB's omvatten trajecten van DNA-reparatie, zoals niet-homologe end joining (NHEJ), een mechanisme dat vereist Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, en DNA ligase IV als belangrijke factoren2,3,4,5,6. Bij zoogdieren is de tweede belangrijkste DNA-reparatieroute homologe recombinatiereparatie (HRR) die belangrijke componenten vereist - de Rad52 epistasis genfamilie- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 en Rad587. Rad51 en Rad54 zijn belangrijke menselijke recombinatiefactoren die betrokken zijn bij reparatiemechanismen die verband houden met de replicatiestress en DNA-breuken in eukaryoten. Interessant is dat de downregulatie van de HRR-route het NHEJ-pad verbetert, wat foutgevoelig is en wijst op de relevantie van hr-paden voor de genoomstabiliteit8.
De eerste stap van DSB's vorming is de fosforylatie van de γ-H2AX histone bij Ser-139 door Ataxia telangiectasia gemuteerde kinase (ATM) uit de PI3 kinase familie7,8. Interessant is dat H2AX fosforylatie gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie techniek als foci (γ-H2AX foci) met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor fosforyleerde H2AX6. Er is een 1:1 relatie tussen het aantal DSB's en γ-H2AX foci, daarom wordt DSB marker, γ-H2AX, uitgebreid bestudeerd door de karakterisering van focivorming, grootte en hoeveelheid6,7,8,9,10,11. Vorming van γ-H2AX foci leidt tot de rekrutering en accumulatie van DNA-schaderespons (DDR) eiwitten en chromatine-modificerende factoren, zoals 53BP1 (p53 binding protein 1), MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 en vele anderen repareren factoren waardoor stralingsgeïduceerde foci (RIF) ontstaat. Al deze eiwitten colokeren met γ-H2AX via directe of indirecte binding1,11,12.
Het is belangrijk om DNA-schade en reparatie op te sporen met een goede gevoelige test, daarom wordt meer aandacht besteed aan de ontwikkeling van zeer nauwkeurige technieken13. In het kader van DNA-schade- en herstelstudies is de methodologie cruciaal voor de gevoelige detectie van genoom-DNA-schade, beschrijving van de schadecategorie en kwantificering van DNA-schade- en reparatiemechanismen13. Om enkele cellen met beschadigd DNA te detecteren, wordt komeettest vaak gebruikt in radiobiologische studies14. Andere beschikbare cytogenetische methoden herkennen chromosomale afwijkingen, waaronder dicentrics, translocaties, acentrische fragmenten, ringen en chromatiïdentypeafwijkingen en micronucleuschromosomale schade (Mn). De meest gebruikte methode in de radiobiologie, vooral in biologische dosimetrie, is de dicentric chromosoomtest vanwege de hoge specificiteit voor straling15. PCR, een klassieke moleculaire methode, kan bijvoorbeeld het type gedetecteerde DNA-schade niet herkennen. In dit geval passeren de immunometrische methoden het gevoeligheidsniveau omdat de reacties specifiek zijn tussen het antigeen en het antilichaam. Immunofluorescentie beeldvorming levert visueel bewijs voor het verschijnen van verschillende eiwitten in verschillende foci in reactie op DNA-schadelijke stoffen zoals ioniserende straling16. De activeringsniveaus van de mRNA-niveaus van schade en reparatieeiwitten zijn echter gemakkelijk te detecteren door real-time PCR, wat een goede kwantitatieve methode is voor verdere moleculaire studies in het kader van DNA-schaderespons17.
Rekening houdend met het feit dat γ-H2AX foci reparatiefactoren18aantrekt , om DNA-schade en -herstel op cellulair niveau te monitoren, hebben we een betrouwbare immunofluorescentie-kleuringsprocedure ontwikkeld, gebaseerd op de analyse van de representatieve reparatieeiwitfoci uit het NHEJ-traject (DNA-PKcs) en Rad52 van het HRR-traject.
Hier stellen we het gebruik van immunodetetie voor deze eiwitten voor als de efficiënte en gevoelige procedure voor het monitoren van DNA-DSB inductie en reparatie. Tot nu toe waren er geen gegevens beschikbaar over DNA-DSB's op basis van foci van reparatie-eiwitten op cellulair niveau na de neutronenmixstraalbestraling voor BNCT, behalve γ-H2AX en 53BP1-markers19. Wij stellen de aanpassing van de HCT-116 darmkankercellijn voor, omdat deze zelf rijk is aan DSBs-foci, als een standaardcellijn voor DNA-schadeanalyse, omdat RIF's gemakkelijk detecteerbaar zijn. Deze aanhangende cellijn is eenvoudig te onderhouden en geschikt voor bestralingsprocedures. De voorgestelde procedure is gebaseerd op een enorme hoeveelheid eerdere studies met betrekking tot de algemene immunofluorescentieprocedure van γ-H2AX-kleuring. Het bevat echter alle details met betrekking tot de selectie van geschikte antilichamen met geteste verdunningen voor elk representatief eiwit dat tot elke reparatieroute behoort. Bovendien beschrijft het het gebruik van een unieke neutronen gemengde bundel gebruikt in BNCT therapie. We raden echter aan om de studies uit te breiden met beide methoden, immunofluorescentie kleuring eerst en vervolgens, met high-cost moleculaire analyse zoals eerder uitgevoerd4,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van celcultuur en experimentele opzet
- Onderhoud menselijke darmkankercellen, HCT-116 zoals aanbevolen door de leverancier, in monolagen in 75 cm2 kweekkolven met 10 mL geformuleerde McCoy's 5a Medium Modified, aangevuld met 10% foetale runderserum en 1% antimycotische antimycotische oplossing voor antibiotica.
- Kweek cellen in een bevochtigde 5% CO2-omgeving bij 37 °C tot 70% van de samenvloeiing met gemiddelde vernieuwing om de 2 tot 3 dagen.
- Om bnct-stralen (bijvoorbeeld neutronenstraal plus 10BPA) en BNCT-effect van het doden van kankercellen als zware deeltjes te verkrijgen en het grootste deel van hun energie in de boorhoudende kankercellen te deponeren, de dag voor bestraling, voeg boorleveringsmiddel toe aan het celkweekmedium – bijvoorbeeld 10BPA, 4-Borono-L-fenylalanine (10 μg 10B/mL, 0,925 mM definitief) 12-16 uur (maximale opname van boor) vóór de bestraling, zoals eerder onderzocht voor darmkankercellen en schildklierkankercellen20,21.
OPMERKING: Als u een andere cellijn gebruikt, waarvoor geen gegevens bestaan in het geval van BNCT-studie, test u de booropname voor elke cellijn om een optimale boorconcentratie te verkrijgen. Meet de 10BPA cellulaire opname door inductief gekoppelde plasma optische emissiespectroscopie (ICP-OES) zoals uitgevoerd door Dagrosa groep21. - Na 12-16 uur boorlevering, het medium aanzuigen en de cellen wassen met 10 mL van 1x PBS. Probeer vervolgens de cellen door 2 mL Trypsin-EDTA-oplossing toe te voegen aan de cellen en 5 minuten bij 37 °C uit te broeden om het celloslating te verbeteren. Wanneer cellen beginnen los te komen, stopt u de trypsineactie door 10 mL volledig medium toe te voegen.
- De celsuspensie in de buis van 15 mL aanzuigen en de cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde celteller door 10 μL van 0,4% trypanblauw toe te voegen tot 10 μL cellen, meng en 10 μL op een telplaat. Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 1 x 106 cellen/mL van het medium. Aliquot 1 mL van de celsuspensie per cryotube.
- Bereid thermoluminescente dosimeters (TLD's) voor voor de meting van gamma-ray doses en goudfolies voor neutronenfluencies en bevestig TLD's aan de cryotubes of celkweekkolf vóór de bestraling.
- Bestraal de 1 x 106 cellen/mL met de neutronen gemengde bundel bij aanbevolen minimale thermische neutronenflux van 5,9 x 1011 (n/cm-2 min−1)4 in kweekkolven of cryotubes, afhankelijk van de faciliteitsmogelijkheden.
OPMERKING: Stel de tijd van bestraling in voordat u de aanbevolen neutronenflux wilt verkrijgen. - Zaad 1 mL bestraalde cellen (1 x 106 cellen/mL) op 22 x 22 mm coverslips in petrischaaltjes van 35 mm of 6 putplaten, aangevuld met 2 mL benodigd medium. Incubeercellen voor maximaal 3 uur bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-omgeving om ze aan de deklips te laten bevestigen. Observeer de bevestiging van cellen van tijd tot tijd onder een omgekeerde microscoop met 20x doelstelling.
OPMERKING: Voor HCT-116 cellen is de minimale dichtheid 600.000 cellen voor zaad. Voor een snelle verdere kleuring procedure gebruik kamer dia's, verminderen celdichtheid dienovereenkomstig.
2. Fixatie van cellen
- Verwijder na bestraling en incubatie van cellen het medium uit de aangesloten cellen en was de cellen eenmaal met 2,5 mL PBS.
- Fix cellen met 1 mL van 70% ethanol voor 10 min op RT.
OPMERKING: Gebruik 1%-3,7% paraformaldehyde (PFA) voor fixatie zoals eerder aanbevolen19. Het protocol is hier gepauzeerd. Bewaar vaste cellen in ethanol in een vriezer bij -20 °C gedurende niet meer dan een paar weken voor verdere analyse en immunofluorescentie vlekken.
3. Permeabilisatie van cellen
- Na fixatie ethanol uit de petrischaal halen en wassen met 2,5 mL 1x PBS.
OPMERKING: Laat de cellen niet drogen tussen de spoelstappen. - Voeg voorzichtig 1 mL van 0,2% triton X-100/PBS toe om de coverslips te bedekken met cellen in petrischaaltjes.
- Incubeer voor 5 minuten op RT.
- Was de cellen 3x met 2,5 mL 1x PBS.
OPMERKING: Verhoog het percentage Triton X-100 in PBS tot 0,5% indien nodig (meer foci detecteerbaar, afhankelijk van de geteste cellijn). Voer extra wasbeurten uit met PBST (PBS met 0,5% Tween) om niet-specifieke binding te voorkomen. - Blokverdringingsstap met 1 mL van 2% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) verdund in PBS en incubate voor minimaal 30 min of 1 h met 1% BSA.
LET OP: Deze stap kan worden weggelaten en is afhankelijk van het type antilichaam dat wordt gebruikt. U ook 5% FBS gebruiken zoals aanbevolen in ref4.
4. Kleuring van immunofluorescentie
- Voeg de juiste hoeveelheid primair antilichaam (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs en Anti-Rad52) toe die in PBS wordt verdund met BSA (2% Bovine Serum Fraction V albumin) zoals aanbevolen (zie tabel 1 met aanbevolen verdunningen) (100 μL is nodig per monster).
| Primair antilichaam | Functie | Aanbevolen verdunning | opslag [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | detectie van DNA-DSB's | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | detectie van RIFs van DNA-PKcs eiwit van NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | detectie van RIFs van Rad52-eiwit van HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Secundair antilichaam | in het donker | ||
| antimuis IgG FITC | ɣ-H2AX foci | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Geit Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | voor NHEJ en HRR reparatie eiwitten foci | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabel 1: Aanbevolen verdunningen en noten voor het gebruik van antilichamen die in punt 4 worden gebruikt.
- Bedek de petrischaal om de vochtigheid te behouden in een plastic doos met gehydrateerde lignine met gedestilleerd water en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in de couveuse.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Incubatie kan worden uitgevoerd bij 4 °C voor 's nachts. - Na incubatie voer 3 wasbeurten uit met 2,5 mL PBS.
LET OP: Laat de glijbaan niet drogen tijdens spoelstappen. - Voeg de juiste hoeveelheid secundair antilichaam (anti-muis IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) verdund in PBS met BSA (zie tabel 1) (100 μL is nodig per monster). Voor deze en de volgende stappen werken in het donker.
- Bedek de petrischaal opnieuw om de vochtigheid te behouden in een plastic doos met gehydrateerde lignine en incubeer gedurende minimaal 30 minuten bij 37 °C in de couveuse.
- Na incubatie voer 3 wasbeurten uit met 2,5 mL PBS.
- Voeg 100 μL DAPI verdund in PBS toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 μg/mL om de kernen tegen te houden.
- Incubeer binnenkort, voor een maximum van 2 min op RT.
- Na incubatie voer 3 wasbeurten uit met 2,5 mL PBS.
- Verwijder de PBS en zet voorzichtig een coverslip op de bovenkant van het montagemedium, het vermijden van de vorming van luchtbellen en afdichting randen van de coverslip met nagellak. Wacht tot de vernis droog is en schilder de coverslip rond.
- Wacht op de verharding van het montagemedium (tot 3 uur) voordat beeldanalyse onder fluorescentiemicroscopie.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Bewaar glazen platen in een plastic doos bij 4 °C in het donker.
5. Beeldverwerving en -analyse
- Verwerf beelden met een fluorescentiemicroscoop onder 100x doelstelling met onderdompelingsolie.
- Analyseer foci in de kernen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de volgende filters voor: Alexa Fluor 488: excitation·emission (nm): 496/519, emissiekleur groen; DAPI: excitatie·emissie (nm): 358·461, emissiekleur blauw.
OPMERKING: Analyse van DSB's langs sporen met één deeltjes kan geavanceerde microscopie vereisen, zoals confocale laserscanny met hogere resolutie.
- Analyseer foci in de kernen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de volgende filters voor: Alexa Fluor 488: excitation·emission (nm): 496/519, emissiekleur groen; DAPI: excitatie·emissie (nm): 358·461, emissiekleur blauw.
- Sla verworven afbeeldingen op en proces met geschikte beeldsoftware, bijvoorbeeld ImageJ of Image Pro3,20.
OPMERKING: Het gebruik van individuele macro's en plug-ins die zijn ontwikkeld voor automatische analyse of ontwikkeling/aankoop van individuele bio-informaticasoftware wordt aanbevolen. - Als u Image-Pro-software gebruikt voor foci-analyse, verwerkt u afbeeldingen in TIFF-bestanden: selecteer De knop Aantal/grootte en klik vervolgens op Typen [kies het type meting (bijvoorbeeld diameter of gebied)], klik op Bereiken [instelbereik van de meting], klik indien nodig op Objecten splitsen. Als u de helderheid wilt aanpassen, klikt u op Helder [treshold aanpassen]. Klik vervolgens op Tellen [rode knop].
- Als u gegevens wilt exporteren, klikt u op Gegevenstabel | Statistieken | Exporteren naar Excel. Teken in de spreadsheetsoftware grafieken met de vereiste statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ten eerste hebben we een analyse uitgevoerd van een standaardmarkering van detectie van DNA-DSB's, γH2AX-foci in darmkankercellen, niet-uitgestraald en bestraald met de neutronen gemengde straal. γ-H2AX foci verschijnen als afzonderlijke fluorescerende stippen en tonen de vorming van DNA-DSB's (aangezien elke γ-H2AX fluorescerende stip één DSB vertegenwoordigt) (zie figuur 1).
Figuur 1: Representatieve beelden van patronen van γ-H2AX foci in darmkankercellen van de cellijn HCT-116 (zonder straling) en na neutronen-gemengde straalbestraling. Neutronenstraal bestraling werd uitgevoerd bij een dosis van 2,6 Gy in cellen die de dag ervoor met BPA (N+BPA) werden behandeld. (A) Het linkerpaneel vertegenwoordigt de DAPI-kleuring van kernen. Het rechterpaneel, groene foci (Alexa 488), komt overeen met de immunodetection van γ-H2AX. De gele pijl geeft spoor aan van α-deeltje dat de kern kruist (schaalbalk = 10 μm). (B) Representatieve diagrammen ter illustratie van de waargenomen toename van de omvang van radio-geïnduceerde foci. Het gemiddelde van γ-H2AX foci diameter werd automatisch uitgevoerd door Image-Pro software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Interessant is dat in bestraalde cellen met de neutronen gemengde straal (N+BPA) bij een dosis van ongeveer 2,6 Gy (1,33 Gy (γ) + 1,26 Gy (N)), we hogere diameterniveaus van γ-H2AX foci(figuur 1B)waargenomen. Bovendien werd een enkel spoor van hoog LET α-deeltje gedetecteerd (vanwege de nucleaire reactie van BNCT) die de kernen van de cel kruisen (gele pijl) (figuur 1A). Verschillende soorten straling kunnen verschillende effecten veroorzaken: hoe hoger de LET-straling, hoe complexer DNA-DSB's, hoe groter de γ-H2AX foci en de hogere gebiedsniveaus van reparatie-eiwitten zichtbaar als door straling geïnduceerde foci18.
Daarom hebben we niveaus van representatieve reparatieeiwitten van DNA-PKcs (van NHEJ-reparatieroute) en Rad52 (vanaf HR-traject) getest door immunofluorescentiemicroscopie in dezelfde omstandigheden, die niet eerder werd uitgevoerd in het geval van BNCT-straal. We waren in staat om de hoge gemiddelde waarde van de foci diameter van DNA-PKcs bij DNA-pauzes te detecteren na een neutronenmix in vergelijking met controlecellen (geen straling) (zie figuur 2).
Figuur 2: Representatieve beelden van patronen van DNA-PKcs en Rad52 reparatie foci in darmkankercellen van de cellijn HCT-116 (zonder straling) en na neutronen-gemengde straal bestraling. Neutronenstraal bestraling werd uitgevoerd bij een dosis van 2,6 Gy in cellen die de dag ervoor met BPA (N+BPA) werden behandeld. (A) Het linkerpaneel vertegenwoordigt de DAPI-kleuring van kernen. Het middelste paneel vertegenwoordigt de detectie van door straling geïnduceerde foci. Het rechterpaneel is de samengevoegde afbeelding. (B) Representatieve diagrammen ter illustratie van de waargenomen toename van de omvang van radio-geïnduceerde foci. Het gemiddelde van Rad52 en DNA-PKcs foci diameter werd automatisch uitgevoerd met behulp van de beeldanalyse software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In dit geval hebben we geclusterde DNA-DSB's in bestraalde HCT-116 cellen waargenomen door de neutronengemixte straal, omdat DNA-PKcs specifiek is voor complexere foci. In bestraalde cellen, per neutronengedeleïnede, werden deze foci alleen in de celkern waargenomen als complexer, groter en geclusterd met een hogere intensiteit(figuur 2A,B). In het geval van Rad52 was het effect niet zo sterk als voor DNA-PKcs, wat de dominantie van het NHEJ-pad in dit type straling aangeeft. Bovendien worden op basis van de literatuurgegevens complexe DSB's langzaam hersteld en wordt DNA-PKcs alleen aangeworven voor langer levende complexe DSB's, wat aangeeft dat de neutronenmixstraal leidt tot de vorming van complexe DSB's en reparatie via DNA-PKcs, maar er is meer onderzoek nodig op moleculair niveau om deze eerder verkregen resultaten te bevestigen22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De frequenties van foci, immunochemisch gekleurd voor γ-H2AX en 53BP1 worden vaak gebruikt in de radiobiologie en worden geassocieerd met DNA-DSB-nummer en worden beschouwd als efficiënte en gevoelige markers voor het toezicht op de inductie en reparatie van DNA-DSB's19. De co-kleuringsprocedure van γ-H2AX en 53BP1 is een standaardprocedure voor de detectie van DNA-DSB's. Vorming van γ-H2AX foci wordt geassocieerd met de aanwerving van 53BP1, een regulator van de DNA-schaderespons23. Verschillende cellijnen kunnen echter variëren in de achtergrondniveaus van γ-H2AX /53BP1 foci 11. Het is aangetoond dat γ-H2AX foci reparatiefactorenaantrekt 18, waardoor een hogere concentratie reparatie-eiwitten in de buurt van een DSB-locatie wordt verzameld. Hoe complexer DNA-DSB's, hoe groter de γ-H2AX foci en hoe hoger de niveaus van reparatie eiwitten. Het activeert een cascade van reparatie trajecten, als reparatie factoren zich ophopen in een hogere concentratie in een DSB-site, ze zijn gemakkelijk detecteerbaar met behulp van specifieke antilichamen en het voorgestelde protocol maakt het mogelijk om ze gemakkelijk te visualiseren. Hier tonen we een methodologie om de biologische effecten op cellulair niveau voor BNCT-therapie te bestuderen, de impact van de neutronenmixstraal op DNA-reparatie met behulp van immunofluorescentietechniek in menselijke darmkankercellen. De auteurs ontwikkelden en introduceerden stapsgewijze betrouwbare protocol met specifieke antilichamen voor het opsporen van DNA-hersteltrajecten op basis van immunofluorescente kleuring met een antilichaam dat specifiek is voor herstelfactoren van NHEJ en HRR-traject en waargenomen door straling geïnduceerde foci (RIF). Bovendien stellen de auteurs het gebruik voor van HCT-116 darmkankercellijn als standaardcellijn voor DNA-schadeanalyse en als controlecellijn voor de test van DNA-herstelantilichamen omdat deze cellijn zelf rijk is aan DSB's foci. DNA-DSB's zijn gemakkelijk detecteerbaar, en verschillende cellijnen, met name kankercellen zoals de cervicale cellijn vertegenwoordigen verschillende achtergrondniveaus van H2AX foci, en intensiteit24.
Er zijn twee belangrijke kritieke stappen in het protocol, fixatie van cellen en immunostaining procedure. De auteurs raden de fixatie van cellen in 70% ethanol als het behoudt cellen voor een lange tijd, en het is geïncubeerd in de vriezer niet meer dan een paar weken. Ook is deze stap van cruciaal belang omdat dit een pauzepunt kan zijn nadat de bestralingsprocedure is uitgevoerd, bijvoorbeeld in een andere instelling/gebouw/een andere dag. Een andere kritieke stap is de juiste concentratie van het antilichaam. De auteurs hebben in de tabel de geteste concentraties van primaire en secundaire antilichamen bijgevoegd.
De gepresenteerde procedure biedt een stap-voor-stap protocol om betrouwbare resultaten te verkrijgen, maar sommige parameters kunnen de resultaten van de experimenten veranderen, zoals de juiste keuze van gebruikte antilichamen, verschillende reagentia die worden gebruikt voor de fixatie- en permeabilisatiestappen, tijd van incubatiemen, kritiek percentage reagentia, wasstappen, werken in het donker en de juiste fluorescerende microscoop. De auteurs leggen uit hoe u betrouwbare en herhaalbare resultaten verkrijgen in de notities.
Een kleine beperking van deze techniek is om toegang te hebben tot de stralingsbron zoals neutronenbron, maar het protocol kan worden gebruikt als een algemeen protocol voor de detectie van DNA-reparatietrajecten verkregen na verschillende soorten straling en kan worden behandeld als universeel protocol voor verschillende soorten straling, bijvoorbeeld, het vergelijken van low-LET en high-LET stralingsreparatie traject activeringen.
Wij bieden een universele, kant-en-klare methodologie die op cellulair niveau kan worden gebruikt om biologische effecten te analyseren in het kader van BNCT-therapie. In BNCT wordt niet-radioactief boor-10 (bijvoorbeeld na behandeling met 4-Borono-L-fenylalanine, BPA – boorleveringsmiddel) bestraald met thermische neutronen met een lage energie en als gevolg van de nucleaire reactie alfadeeltjes en lithium-7 kernen met hoge LET wordengeproduceerd 25,26. Daarom kan ons protocol nuttig zijn voor de analyse van biologische effecten op cellulair niveau ook voor de straling vertegenwoordigd door andere hoge LET-balken zoals protonen gebruikt in protonstraaltherapie27, en koolstof-ionen gebruikt in hadrontherapie28. We hebben geconstateerd dat meer gedetailleerd onderzoek nodig is op het gebied van high-LET straling en gemengde stralen, en kennis van het DNA-herstelproces is nodig om effectieve anti-kanker therapieën te ontwikkelen, daarom hebben we een protocol ontwikkeld dat onderzoek mogelijk maakt naar straling-geïnduceerde DNA-schaderespons geactiveerd door de neutroneng gemengde straal. Bovendien kan de immunofluorescentiemethode voor de detectie van DNA-schaderespons en DNA-herstel een potentiële methode zijn voor het beoordelen en detecteren van tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Neutronen-gemengde straal bestaande uit neutronen / gammastraling werd benaderd vanuit de Maria onderzoeksreactor in het National Centre for Nuclear Research in Polen. K.M.O. werd ondersteund door het National Science Centre, Polen (Miniatura 2) grant no. #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
