Summary
No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.
Abstract
El propósito del manuscrito es proporcionar un protocolo paso a paso para realizar microscopía de inmunofluorescencia para estudiar la respuesta de daño de ADN inducida por radiación inducida por el haz mixto de neutrones-gamma utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Específicamente, la metodología propuesta se aplica para la detección de la activación de proteínas de reparación que se pueden visualizar como focos utilizando anticuerpos específicos para roturas de doble cadena de ADN (ADN-DSB). Los focos de reparación del ADN fueron evaluados por inmunofluorescencia en células de cáncer de colon (HCT-116) después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones. Los ADN-DSB son las lesiones más genotóxicas y se reparan en células de mamíferos por dos vías principales: vía de unión final no homóloga (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR). Las frecuencias de los focos, inmunoquímicamente manchadas, para los marcadores de uso común en radiobiología como el H2AX, 53BP1 están asociadas con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para monitorear la inducción y reparación de ADN-DSB. Se estableció que los focos de la serie H2AX atraen proteínas de reparación, lo que llevó a una mayor concentración de factores de reparación cerca de un OSD. Para monitorear el daño del ADN a nivel celular, se planeó un análisis de inmunofluorescencia para la presencia de focos de proteína de reparación representativos de ADN-PKcs de la vía NHEJ y Rad52 de la vía HRR. Hemos desarrollado e introducido un protocolo de tinción de inmunofluorescencia fiable para la detección de la respuesta de daño del ADN inducida por radiación con anticuerpos específicos para factores de reparación de las vías NHEJ y HRR y focos observados por radiación (RIF). La metodología propuesta se puede utilizar para investigar la proteína de reparación que está altamente activada en el caso de la radiación de haz mezclado con neutrones, lo que indica el dominio de la vía de reparación.
Introduction
No se ha determinado completamente la respuesta al daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para realizar la detección de focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia, por ejemplo, en la línea celular del cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.
La radiación ionizante (IR) induce una multitud de tipos diferentes de daño del ADN (ADN-DSB, DNA-SSB, daño a la base de ADN) de los cuales las roturas de doble cadena de ADN son las lesiones de ADN más genotóxicas1. Las roturas no reparadas pueden causar la muerte celular, mientras que las roturas mal reparadas aumentan la probabilidad de reordenamiento cromosómica, mutagénesis y pérdida de información genética decisiva. Las vías de respuesta al daño que responden a los DSB incluyen vías de reparación del ADN como la unión final no homóloga (NHEJ), un mecanismo que requiere Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, y DNA ligasse IV como factores clave2,,3,4,5,6. En los mamíferos, la segunda vía principal de reparación del ADN es la vía de reparación de recombinación homóloga (HRR) que requiere componentes clave - la familia del gen de la epistasis Rad52 - Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 y Rad587. Rad51 y Rad54 son factores clave de recombinación humana implicados en mecanismos de reparación relacionados con el estrés de replicación y roturas de ADN en eucariotas. Curiosamente, se observó que la regulación descendente de la vía HRR mejora la vía NHEJ que es propensa a errores apuntando a la relevancia de la vía de RRHH para la estabilidad del genoma8.
El primer paso de la formación de los DSB es la fosforilación de la histona de la serie H2AX en ser-139 por Ataxia telangiectasia mutated kinase (ATM) de la familia PI3 quinasa7,8. Curiosamente, la fosforilación H2AX se puede visualizar fácilmente mediante la técnica de inmunofluorescencia como focos (focis de H2AX) utilizando anticuerpos específicos para H2AX6fosforilado. Existe una relación de 1:1 entre el número de DSB y los focos de H2AX, por lo tanto, el marcador DSB, -H2AX, se estudia extensamente a través de la caracterización de la formación de focos, tamaño, y cantidad6,7,8,9,10,11. La formación de focos de la serie H2AX conduce al reclutamiento y acumulación de proteínas de respuesta al daño del ADN (DDR) y factores modificadores de la cromatina, tales como 53BP1 (proteína de unión p53 1), MDC1 (mediador del punto de control de daño del ADN), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, y muchos otros factores de reparación formando así factores de radiación inducidas por la radiación (RIF). Todas estas proteínas se co-localizan con el valor de H2AX a través de la unión directa o indirecta1,11,12.
Es importante detectar el daño y la reparación del ADN con una prueba sensible adecuada, por lo tanto, se presta más atención al desarrollo de técnicas de alta precisión13. En el contexto de los estudios de daño y reparación del ADN, la metodología es crucial para la detección sensible del daño del ADN genómico, la descripción de la categoría de daño y la cuantificación de los mecanismos de daño y reparación del ADN13. Para detectar células individuales con ADN dañado, el ensayo de cometas se utiliza comúnmente en estudios radiobiológicos14. Otros métodos citogenéticos disponibles reconocen aberraciones cromosómicas, incluyendo dicéntricos, translocaciones, fragmentos alcéricos, anillos y aberraciones de tipo cromático, y daño cromosómico micronúcleo (Mn). El método más utilizado en radiobiología, especialmente en la dosimetría biológica, es el ensayo cromosómica dicéntrica debido a su alta especificidad para la radiación15. Por ejemplo, la PCR, un método molecular clásico, no puede reconocer el tipo de daño de ADN detectado. En este caso, los métodos inmunométricos pasan el nivel de sensibilidad porque las reacciones son específicas entre el antígeno y el anticuerpo. Las imágenes de inmunofluorescencia proporcionan evidencia visual para la aparición de diferentes proteínas en focos distintos en respuesta a agentes dañinos del ADN como la radiación ionizante16. Sin embargo, los niveles de activación del daño y los niveles de ARNm de las proteínas de reparación son fácilmente detectables por PCR en tiempo real, que es un método cuantitativo adecuado para estudios moleculares posteriores en el contexto de la respuesta al daño del ADN17.
Teniendo en cuenta que los focos de H2AX atraen los factores de reparación18, para monitorear el daño y la reparación del ADN a nivel celular, hemos desarrollado un procedimiento de tinción de inmunofluorescencia fiable, basado en el análisis de la reparación representativa de focis proteicos de la vía NHEJ (DNA-PKcs) y Rad52 de la vía HRR.
Aquí, proponemos el uso de inmunodetección para estas proteínas como el procedimiento eficiente y sensible para el seguimiento de la inducción y reparación del ADN-DSB. Hasta ahora, no ha habido datos disponibles sobre ADN-DSB basados en focos de proteínas de reparación a nivel celular después de la irradiación de19haz mixto de neutrones para BNCT, excepto los marcadores de 53BP1 y H2AX y 53BP1. Sugerimos la adaptación de la línea celular de cáncer de colon HCT-116, ya que es rica en focos DSB, como una línea celular estándar para el análisis de daños en el ADN, porque los RF son fácilmente detectables. Esta línea celular adherente es fácil de mantener y adecuada para los procedimientos de irradiación. El procedimiento propuesto se basa en una gran cantidad de estudios previos relacionados con el procedimiento general de inmunofluorescencia de la tinción de H2AX. Sin embargo, incluye todos los detalles relativos a la selección de anticuerpos apropiados con diluciones probadas para cada proteína representativa perteneciente a cada vía de reparación. Además, describe la utilización de un haz único mezclado con neutrones utilizado en la terapia BNCT. Sin embargo, recomendamos ampliar los estudios con ambos métodos, la tinción de inmunofluorescencia en primer lugar y luego, con análisis moleculares de alto costo como se realizó anteriormente4,,17.
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Protocol
1. Preparación del cultivo celular y configuración experimental
- Mantener las células de cáncer de colon humano, HCT-116 según lo recomendado por el proveedor, en monocapas en frascos de cultivo de 75 cm2 que contienen 10 ml de 5a medio modificado de McCoy formulado, complementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de solución antimicicótica antibiótica.
- Células de cultivo en un ambiente humidificado de 5% de CO2 a 37oC hasta el 70% de la confluencia con una renovación media cada 2 a 3 días.
- Para obtener el haz BNCT (por ejemplo, haz de neutrones más 10BPA) y el efecto BNCT de matar las células cancerosas como partículas pesadas y depositar la mayor parte de su energía dentro de las células cancerosas que contienen boro, el día antes de la irradiación, añadir agente de administración de boro al medio de cultivo celular – por ejemplo, 10BPA, 4-Borono-L-fenilalanina (10 g 10B/mL, 0.925 mM final) 12–16 h (absorción máxima de boro) antes de la irradiación, como se estudió previamente para las células de colon de cáncer y las células cancerosastiroideas 20,,21 .
NOTA: Si utiliza otra línea celular, para la que no existen datos en el caso del estudio BNCT, pruebe la absorción de boro para cada línea celular para obtener una concentración óptima de boro. Mida la absorción celular 10BPA mediante espectroscopia de emisión óptica plasmática acoplada inductivamente (ICP-OES) realizada por el grupoDagrosa 21. - Después de 12-16 h de entrega de boro, aspirar el medio y lavar las células con 10 ml de 1x PBS. A continuación, pruebe las células añadiendo 2 ml de solución de Tripppsin-EDTA a las células e incubar durante 5 minutos a 37 oC para mejorar el desprendimiento celular. Cuando las células comiencen a desprenderse, detenga la acción de la tripsina agregando 10 ml de medio completo.
- Aspirar la suspensión celular en el tubo de 15 ml y contar las células utilizando un contador de células automatizado agregando 10 l de 0,4% de azul tripano a 10 ml de células, mezclar y alicuar 10 l en una diapositiva de conteo. Diluir la suspensión celular a una concentración de 1 x 106 células/ml del medio. Aliquot 1 ml de la suspensión celular por criotubo.
- Preparar dosímetros termoluminiscentes (TLD) para la medición de dosis de rayos gamma y láminas de oro para las fluencies de neutrones y fijar los TLD a los criotubos o matraz de cultivo celular antes de la irradiación.
- Irradiar las 1 x 106 células/ml con el haz mezclado con neutrones a un flujo térmico de neutrones mínimo recomendado de 5,9 x10 11 (n/cm-2 minx 1)4 en frascos de cultivo o criotubos dependiendo de las capacidades de la instalación.
NOTA: Configure el tiempo de irradiación antes de obtener el flujo de neutrones recomendado. - Después de la irradiación, semilla 1 ml de células irradiadas (1 x 106 células/ml) en cubreobjetos de 22 x 22 mm en placas Petri de 35 mm o 6 placas de pozo, suplemento con 2 ml de medio requerido. Incubar células durante un máximo de 3 h a 37oC en un ambiente humidificado de 5% deCO2 para que se adhieran a los cubreobjetos. Observe la unión de las células de vez en cuando bajo un microscopio invertido con objetivo 20x.
NOTA: Para las células HCT-116 la densidad mínima es de 600.000 celdas a la semilla. Para un procedimiento de tinción posterior rápido, utilice portaobjetos de cámara, reduzca la densidad celular en consecuencia.
2. Fijación de las células
- Después de la irradiación e incubación de las células, retire el medio de las células conectadas y lave las células una vez con 2,5 ml de PBS.
- Fijar celdas con 1 ml de etanol al 70% durante 10 min en RT.
NOTA: Alternativamente, utilice 1%-3.7% de paraformaldehído (PFA) para la fijación según lo recomendado anteriormente19. El protocolo está en pausa aquí. Almacene las células fijas en etanol en un congelador a -20 oC durante no más de unas semanas para un análisis posterior y la tinción de inmunofluorescencia.
3. Permeabilización de las células
- Después de la fijación, retire el etanol de la placa Petri y lave con 2,5 ml de 1x PBS.
NOTA: No deje que las células se sequen entre los pasos de enjuague. - Agregue suavemente 1 ml del 0,2% de Triton X-100/PBS para cubrir los cubreobjetos con las células de los platos Petri.
- Incubar durante 5 min en RT.
- Lavar las células 3x con 2,5 ml de 1x PBS.
NOTA: Aumente el porcentaje de Tritón X-100 en PBS hasta un 0,5% si es necesario (más focos detectables, dependiendo de la línea celular probada). Realice lavados adicionales con PBST (PBS con 0,5% de interpolación) para evitar la unión inespecífica. - Paso de permeabilización de bloque con 1 ml de 2% de BSA (fracción búrica bovina V albúmina) diluida en PBS e incubar durante un mínimo de 30 min o 1 h con 1% de BSA.
NOTA: Este paso se puede omitir y depende del tipo de anticuerpo utilizado. Alternativamente, utilice 5% FBS como se recomienda en la referencia4.
4. Tinción de inmunofluorescencia
- Añadir la cantidad adecuada de anticuerpos primarios (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs y Anti-Rad52) diluidos en PBS con BSA (2% Fracción Suero Bovino V V) según lo recomendado (ver Tabla 1 con diluciones recomendadas) (100 l es necesario por muestra).
| Anticuerpo primario | Función | Dilución recomendada | almacenamiento [C] |
| Anti-ɣ-H2AX | detección de ADN-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | detección de RF de proteína DNA-PKcs pertenecientes a NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | detección de RITO de proteína Rad52 pertenecientes a HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anticuerpo secundario | A oscuras | ||
| anti-ratón IgG FITC | focos ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Cabra Anti-Conejo IgG H&L (Alexa Fluor 488) | para los focos de proteínas de reparación NHEJ y HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabla 1: Diluciones recomendadas y notas para el uso de anticuerpos utilizados en la sección 4.
- Cubra el plato Petri para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina hidratada con agua destilada e incubar durante 30 minutos a 37oC en la incubadora.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La incubación se puede realizar a 4oC durante la noche. - Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
NOTA: No deje que la diapositiva se seque durante los pasos de enjuague. - Añadir la cantidad adecuada de anticuerpos secundarios (antiratón IgG FITC, Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) diluido en PBS con BSA (ver Tabla 1) (se necesitan 100 l por muestra). Para esto y los siguientes pasos funcionan en la oscuridad.
- Cubra el plato Petri de nuevo para mantener la humedad en una caja de plástico con lignina hidratada e incubar durante 30 minutos como mínimo a 37oC en la incubadora.
- Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
- Añadir 100 l de DAPI diluido en PBS a una concentración final de 1 g/ml para contrarrestar los núcleos.
- Incubar en breve, durante un máximo de 2 minutos en RT.
- Después de la incubación realizar 3 lavados con 2,5 ml de PBS.
- Retire el PBS y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior del medio de montaje, evitando la formación de burbujas de aire y bordes de sellado del cubreobjetos con esmalte de uñas. Espere hasta que el barniz se seque y pinte el cubreobjetos alrededor.
- Espere el endurecimiento del medio de montaje (hasta 3 h) antes del análisis de imagen bajo microscopía de fluorescencia.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los toboganes de vidrio en una caja de plástico a 4 oC en la oscuridad.
5. Adquisición y análisis de imágenes
- Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia bajo el objetivo 100x con aceite de inmersión.
- Analizar los focos en los núcleos con un microscopio de fluorescencia equipado con los siguientes filtros para: Alexa Fluor 488: excitación/emisión (nm): 496/519, color de emisión verde; DAPI: excitación/emisión (nm): 358-461, color de emisión azul.
NOTA: El análisis de DSB a lo largo de pistas de una sola partícula puede requerir una microscopía avanzada como microscopía de escaneo láser confocal con mayor resolución.
- Analizar los focos en los núcleos con un microscopio de fluorescencia equipado con los siguientes filtros para: Alexa Fluor 488: excitación/emisión (nm): 496/519, color de emisión verde; DAPI: excitación/emisión (nm): 358-461, color de emisión azul.
- Guarde las imágenes adquiridas y procese con el software de imagen adecuado, por ejemplo, ImageJ o Image Pro3,,20.
NOTA: Se recomienda el uso de macros y plugins individuales desarrollados para el análisis automático o el desarrollo/compra de software bioinformático individual. - Si utiliza el software Image-Pro para el análisis de focos, procese imágenes en archivos TIFF: seleccione El botón Recuento/Tamaño y, a continuación, haga clic en Tipos [elija el tipo de medida (por ejemplo, diámetro o área)], haga clic en Rangos [establecer rango de la medida], haga clic en Dividir objetos si es necesario. Para ajustar el brillo, haga clic en Brillo [ajustar desajuste]. A continuación, haga clic en Recuento [botón rojo].
- Para exportar datos, haga clic en Tabla de datos ? Estadísticas ? Exportar a Excel. En el software de hoja de cálculo, dibuje gráficos con el análisis estadístico requerido.
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Representative Results
En primer lugar, realizamos un análisis de un marcador estándar de detección de ADN-DSB, focos de H2AX en células de cáncer de colon, no irradiados e irradiados con el haz mezclado con neutrones. Los focos H2AX aparecen como puntos fluorescentes distintos y muestran la formación de ADN-DSB (ya que cada punto fluorescente de H2AX representa un solo DSB) (véase la Figura 1).
Figura 1: Imágenes representativas de los patrones de los focos H2AX en células de cáncer de colon de la línea celular HCT-116 (sin radiación) y después de la irradiación de haz mezclado con neutrones. La irradiación de haz mezclado con neutrones se realizó a una dosis de 2,6 Gy en células tratadas el día anterior con BPA (N+BPA). (A) El panel izquierdo representa la tinción DAPI de núcleos. El panel derecho, los focos verdes (Alexa 488), corresponde a la inmunodetección de H2AX. La flecha amarilla indica la pista de partículas que cruzan el núcleo (barra de escala de 10 m). (B) Diagramas representativos que ilustran el aumento observado del tamaño de los focos radioinducidos. El software Image-Pro realizó automáticamente la media del diámetro de los focos H2AX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Curiosamente, en las células irradiadas con el haz mezclado con neutrones (N+BPA) a una dosis de aproximadamente 2,6 Gy (1,33 Gy ) + 1,26 Gy (N)), observamos niveles de diámetro más altos de los focos de H2AX(Figura 1B). Además, se detectó una sola pista de partículas LET altas (debido a la reacción nuclear de BNCT) cruzando los núcleos de la célula (flecha amarilla) (Figura 1A). Diferentes tipos de radiación podrían causar diferentes efectos: cuanto mayor sea la radiación LET, más complejos sean los ADN-DSB, mayores serán los focos H2AX y los niveles de área más altos de proteínas de reparación visibles como los focos inducidos por radiación18.
Por lo tanto, probamos los niveles de proteínas de reparación representativas de DNA-PKcs (de la vía de reparación NHEJ) y Rad52 (de la vía de HR) mediante microscopía de inmunofluorescencia en las mismas condiciones, que no se realizaba antes en el caso del haz BNCT. Pudimos detectar el alto valor medio del diámetro de los focos de los PCC de ADN en las roturas de ADN después de un neutron mezclado en comparación con las células de control (sin radiación) (ver Figura 2).
Figura 2: Imágenes representativas de patrones de ADN-PKcs y focos de reparación Rad52 en células de cáncer de colon de la línea celular HCT-116 (sin radiación) y después de la irradiación de haz mezclado con neutrones. La irradiación de haz mezclado con neutrones se realizó a una dosis de 2,6 Gy en células tratadas el día anterior con BPA (N+BPA). (A) El panel izquierdo representa la tinción DAPI de núcleos. El panel central representa la detección de focos inducidos por radiación. El panel derecho es la imagen combinada. (B) Diagramas representativos que ilustran el aumento observado del tamaño de los focos radioinducidos. La media del diámetro de los focis Rad52 y DNA-PKcs se realizó automáticamente utilizando el software de análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En este caso, hemos observado ADN-DSB agrupados en células IRRADIAdas HCT-116 por el haz mezclado con neutrones, ya que los PC de ADN son específicos para los focos más complejos. En las células irradiadas, por haz mezclado con neutrones, estos focos se observaron sólo dentro del núcleo celular como más complejos, más grandes y agrupados con mayor intensidad (Figura 2A,B). En el caso de Rad52, el efecto no fue tan fuerte como para los PC de ADN que indican el dominio de la vía NHEJ en este tipo de radiación. Además, sobre la base de los datos bibliísticos, los DSB complejos se reparan lentamente y los PC de ADN sólo se reclutan a los DSB complejos de mayor duración, lo que indica que el haz mezclado con neutrones conduce a la formación de DSB complejos y a la reparación a través de los PKS de ADN, sin embargo, se necesita más investigación a nivel molecular para confirmar estos resultados obtenidos previamente22.
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Discussion
Las frecuencias de los focos, teñidas inmunoquímicamente para los puntos de venta de las normas H2AX y 53BP1 se utilizan comúnmente en radiobiología y se asocian con el número DNA-DSB y se consideran marcadores eficientes y sensibles para supervisar la inducción y reparación de los ADN-DSB19. El procedimiento de co-tinción de los puntos de vista de los datos de la serie de residuos de H2AX y 53BP1 es un procedimiento estándar para la detección de ADN-DSB. La formación de los focos de H2AX se asocia con el reclutamiento de 53BP1, un regulador de la respuesta a los daños en el ADN23. Sin embargo, las diferentes líneas celulares pueden variar en los niveles de fondo de los focos de H2AX /53BP1 11. Se ha demostrado que los focos de la serie H2AX atraen los factores de reparación18,acumulando una mayor concentración de proteínas de reparación cerca de un sitio DSB. Cuanto más complejos sean los ADN-DSB, mayores serán los focos H2AX y mayores serán los niveles de proteínas de reparación. Activa una cascada de vías de reparación, si los factores de reparación se acumulan en una concentración más alta en un sitio DSB, son fácilmente detectables utilizando anticuerpos específicos y el protocolo propuesto permite visualizarlos fácilmente. Aquí demostramos una metodología para estudiar los efectos biológicos a nivel celular para la terapia BNCT el impacto del haz mezclado con neutrones en la reparación del ADN utilizando la técnica de inmunofluorescencia en células de cáncer de colon humano. Los autores desarrollaron e introdujeron un protocolo fiable paso a paso con anticuerpos específicos para detectar vías de reparación del ADN basadas en tinciones inmunofluorescentes con un anticuerpo específico para los factores de reparación de la vía NHEJ y HRR y los focos observados inducidos por la radiación (RIF). Además, los autores proponen el uso de la línea celular de cáncer de colon HCT-116 como una línea celular estándar para el análisis de daños en el ADN y como una línea celular de control para la prueba de anticuerpos de reparación de ADN porque esta línea celular es rica en focos DSBs. Los ADN-DSB son fácilmente detectables, y diferentes líneas celulares, especialmente las células cancerosas como la línea celular cervical representan diferentes niveles de fondo de los focos H2AX, y la intensidad24.
Hay dos pasos críticos principales en el protocolo, la fijación de las células y el procedimiento de inmunomancha. Los autores recomiendan la fijación de células en 70% etanol ya que preserva las células durante mucho tiempo, y se incuba en el congelador no más de unas pocas semanas. Además, este paso es crítico porque puede ser punto de pausa después de que se realice el procedimiento de irradiación, por ejemplo, en otra institución/edificio/otro día. Otro paso crítico es la concentración adecuada del anticuerpo. Los autores han adjuntado en la tabla las concentraciones probadas de anticuerpos primarios y secundarios.
El procedimiento presentado proporciona un protocolo paso a paso para obtener resultados fiables, sin embargo, algunos parámetros podrían cambiar los resultados de los experimentos, como la elección adecuada de los anticuerpos utilizados, diferentes reactivos utilizados para los pasos de fijación y permeabilización, tiempo de incubaciones, porcentaje crítico de reactivos, pasos de lavado, trabajo en la oscuridad y el microscopio fluorescente adecuado. Los autores explican cómo obtener resultados fiables y repetibles en las notas.
Una limitación menor de esta técnica es tener acceso a la fuente de radiación como la fuente de neutrones, sin embargo, el protocolo se puede utilizar como un protocolo general para la detección de vías de reparación del ADN obtenidas después de diferentes tipos de radiación y puede ser tratado como protocolo universal para varios tipos de radiación, por ejemplo, comparando la activación de vías de reparación de radiación de baja LET y alta LET.
Proporcionamos una metodología universal y lista para usar que se puede utilizar a nivel celular para analizar los efectos biológicos en el contexto de la terapia BNCT. En BNCT, el boro no radioactivo-10 (por ejemplo, después del tratamiento con 4-Borono-L-fenilalanina, BPA – agente de administración de boro) se irradia con neutrones térmicos de baja energía y como resultado de la reacción nuclear partículas alfa y núcleos de litio-7 con alto LET se producen25,,26. Por lo tanto, nuestro protocolo puede ser útil para el análisis de efectos biológicos a nivel celular también para la radiación representada por otros haces LET altos como protones utilizados en la terapia de haz de protones27, y iones de carbono utilizados en la terapia de hadrones28. Hemos observado que se necesita una investigación más detallada en el campo de la radiación de alta LET y los haces mixtos, y se requiere el conocimiento del proceso de reparación del ADN para desarrollar terapias eficaces contra el cáncer, por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo que permite investigar la respuesta al daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mezclado con neutrones. Además, el método de inmunofluorescencia de detección de la respuesta al daño del ADN y la reparación del ADN podría ser un método potencial para evaluar y detectar tumores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Desde el reactor de investigación Maria del Centro Nacional de Investigación Nuclear en Polonia se accedió al haz mixto de neutrones compuesto por radiación de neutrones/gamma. K.M.O. recibió el apoyo del Centro Nacional de Ciencias, Polonia (Miniatura 2) no #2018/02/X/NZ5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
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