Summary
Große Tiermodelle spielen eine wesentliche Rolle in der präklinischen Transplantationsforschung. Aufgrund seiner Ähnlichkeiten mit dem klinischen Aufbau bietet das in diesem Artikel beschriebene Schweinemodell der orthotopischen Nieren-Autotransplantation eine hervorragende in vivo-Einstellung für die Erprobung von Organkonservierungstechniken und therapeutischen Interventionen.
Abstract
Im gegenwärtigen Zeit der Organtransplantation mit kritischem Organmangel werden verschiedene Strategien eingesetzt, um den Pool der verfügbaren Allografts für Nierentransplantationen (KT) zu erweitern. Obwohl die Verwendung von Allografts aus erweiterten Kriterien Spender (EKD) den Mangel an Organspendern teilweise lindern könnte, tragen EKD-Organe ein potenziell höheres Risiko für schlechtere Ergebnisse und postoperative Komplikationen. Dynamische Organkonservierungstechniken, Modulation der Ischämie-Reperfusion und Konservierungsverletzungen sowie Allograft-Therapien stehen im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses, um die Allograft-Nutzung und die Patientenergebnisse in KT zu verbessern.
Präklinische Tierversuche spielen eine wesentliche Rolle in der translationalen Forschung, insbesondere in der Medizinprodukte- und Arzneimittelentwicklung. Der große Vorteil des orthotopischen Transplantationsmodells für Schweine gegenüber Ex-vivo- oder Kleintierstudien liegt in den chirurgisch-anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten mit dem klinischen Umfeld. Dies ermöglicht die Untersuchung neuer therapeutischer Methoden und Techniken und gewährleistet eine erleichterte klinische Übersetzung der Befunde. Dieses Protokoll bietet eine umfassende und problemorientierte Beschreibung des orthotopischen Nieren-Autotransplantationsmodells, bei dem eine Konservierungszeit von 24 Stunden und telemetrieüberwacht werden. Die Kombination ausgeklügelter Operationstechniken mit hochstandardisierten und modernsten Methoden der Anästhesie, Tierhaltung, perioperativer Nachverfolgung und Überwachung gewährleistet die Reproduzierbarkeit und den Erfolg dieses Modells.
Introduction
Seit der ersten erfolgreichen transplantation von identischen Zwillingen durch identische Zwillinge im Jahr 1954, durchgeführt von der Pioniergruppe des Nobelpreisträgers Joseph Murray1, hat sich die Nierentransplantation (KT) als Hauptstütze der Behandlung von Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium (ESRD)entwickelt 2. KT zeigt im Vergleich zur Dialyse2überlegene langfristige klinische Ergebnisse und Lebensqualität. Kurz- und langfristige Überlebensraten nach KT verbessert kontinuierlich, aufgrund von Fortschritten in chirurgischen Techniken, Organkonservierung, immunsuppressive Therapie, und kritische Pflege, daher KT wurde weit verbreitet auf globaler Ebene2,3,4.
Aufgrund der kritischen Organknappheit besteht eine ständig wachsende Kluft zwischen Allograft-Angebot und Nachfrage3,5,6. Im Jahr 2018 warteten in Deutschland rund 12.031 Patienten auf KT, allerdings konnten aufgrund des extremen Organmangels für Transplantation7nur weniger als 20% (2.291 Patienten) eine Spenderniere erhalten. Leider ist in den letzten Jahrzehnten nicht nur die absolute Zahl der Organspender, sondern auch die allgemeine Qualität der für die Transplantation angebotenen Allografts zurückgegangen8,9. Eine zunehmende Tendenz wurde in der Anzahl der vorbeschädigten oder "marginalen" Nierenallografts beobachtet, die für die Transplantation akzeptiert werden mussten10. Die Verwendung von ECD-Allografts kann Wartezeiten und Wartelistenmorbidität und Mortalität reduzieren, es ist jedoch mit einer erhöhten Inzidenz von transplantatbedingten Komplikationen wie primäre Transplantat-Nichtfunktion (PNF) und/oder verzögerte Transplantatfunktion (DGF)8,9,10verbunden. Weitere Forschung ist wichtig, um allograft Nutzung zu optimieren, erweitern Sie den Spenderpool und schützen und rekonditionieren marginale Allografts, die letztlich die Patientenergebnisse verbessern können3,6.
Aufgrund der ressourcenintensiven und komplexen Natur großer Tiertransplantationsmodelle werden zahlreiche Studien mit Kleintieren oder in ex vivo Einstellungen11,12,13,14,15durchgeführt. Obwohl diese Modelle wichtige wissenschaftliche Daten liefern können, ist die Übersetzung dieser Erkenntnisse in den klinischen Rahmen oft begrenzt. Das Schweinemodell der orthotopischen Nieren-Autotransplantation ist ein bewährtes und reproduzierbares Modell, das es ermöglicht, neue innovative Behandlungsansätze in einer klinisch relevanten In-vivo-Einstellung zu testen, mit potenziell längeren Nachbeobachtungszeiten und reichlich Möglichkeiten für eine sich wiederholende Probenentnahme16,17. Über den Vorteil der vergleichbaren Größe hinaus, die eine relativ direkte Übersetzung in den klinischen Rahmen (insbesondere für die Entwicklung von Medizinprodukten und die Dosierung von Arzneimitteln), die chirurgisch-anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten in Bezug auf Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) und Nierenschäden ermöglicht, unterstützen die Verwendung dieses Modells in der translationalen Forschung17,18,19. Dieses Modell bietet auch eine ausgezeichnete Ausbildungsmöglichkeit, um junge Transplantationschirurgen auf die technischen Herausforderungen der klinischen Organtransplantationvorzubereiten 20.
Es gibt auch mehrere Unterschiede im Vergleich zur menschlichen Einstellung und verschiedene technische Modifikationen des Modells können in der Literatur gefunden werden16,17,19,20,21. Dieser Artikel beschreibt ausführlich technische Details, Fallstricke und Empfehlungen, die helfen können, das Modell der orthotopischen Nieren-Autotransplantation zu etablieren. Die beschriebene Telemetrie- und Videoüberwachungsmethode sowie unsere speziell konzipierte Wohnanlage ermöglichen eine nahaufnahmeende Schwerebeurteilung und klinische Beobachtung der Tiere. Die Verwendung eines perkutanen Harnkatheters und ausgewiesener Schweinejacken bietet die Möglichkeit einer detaillierten Beurteilung der Nierenfunktion ohne die Verwendung von Stoffwechselkäfigen. Diese technischen Modifikationen werden als mögliche Lösungen beschrieben, um den modernen Herausforderungen des 3R-Prinzips (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) gerecht zu werden und Tierversuche mit großen Tiermodellen zu verbessern22.
Protocol
Die vorliegende Studie wurde nach den Grundsätzen der ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) Guidelines23konzipiert. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und dem Bundesgesetz zum Schutz von Tieren durchgeführt. Der vollständige ethische Vorschlag wurde von den zuständigen Behörden (Regierungsausschuss für Tierpflege und Nutzung, LANUV NRW - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen", Recklinghausen, Protokoll-ID: 81-02.04.2018.A051) genehmigt. Alle Tiere in dieser Studie wurden nach den Grundsätzen des "Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (8. Auflage, NIH-Veröffentlichung, 2011, USA) und der Richtlinie 2010/63/EU über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, human gepflegt (Amtsblatt der Europäischen Union, 2010). Weibliche deutsche Landrassenschweine wurden aus einer hygienisch optimierten Barrierezuchtanlage (Heinrichs GbR, Heinsberg, Nordrhein-Westfalen) gewonnen. Abbildung 1 zeigt die Zusammenfassung des beschriebenen Versuchsprotokolls.
1. Tiere und Gehäuse
- Verwenden Sie weibliche deutsche Landrasse Schweine (oder vergleichbar) für dieses Protokoll. Die Tiere 14 Tage vor der ersten Operation (Telemetrieimplantation) zur Akklimatisierung in die Forschungseinrichtung bringen und in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Barriereumgebung mit einem 12 h-Licht- und Dunkelzyklus unterbringen ( Abbildung 2).
- Montieren Sie zwei Telemetrieempfänger an der Decke des Raumes, wodurch die registrierten Daten direkt an einen PC im Beobachtungsraum übertragen werden können. Stellen Sie sicher, dass die Tiere bei den regelmäßigen Besuchen der Tierärzte und des zuständigen Tierpflegers (alle 8 h und auf Abruf) visuell beobachtet werden.
HINWEIS: Darüber hinaus wurde in diesem Experiment ein Echtzeit-Kameramaterial mit integrierter Wärmebildkamera verwendet, die mit dem lokalen Netzwerk verbunden ist. Einzelheiten der in dieser Studie verwendeten Wohnanlage sind in Abbildung 2dargestellt.
2. Grundtechniken und gemeinsame Verfahren
- Fasten Sie die Tiere über Nacht vor der Operation.
- Prämedizipation durch eine anfängliche intramuskuläre Injektion von Azaperon (4 mg/kg) und Atropin (0,1 mg/kg), gefolgt von einer Injektion von Ketamin (15 mg/kg) 10 min später.
- Nach der Vormedikation das Tier wiegen und direkt aus der Unterkunft in den zentralen Anästhesie-Vorbereitungsraum der OR-Einrichtung überführen.
- Kanülieren Sie eine der großen Ohradern mit einem 18 G peripheren Venenkatheter. Überwachen Sie das Tier mit einem Standard-EKG und Pulsoxymetrie.
- Initiieren Sie die Anästhesie mit Propofol (3 mg/kg).
- Setzen Sie die Stimmbänder mit einem Laryngoskop aus und legen Sie ein 7,5 mm Endotrachealrohr ein. Die Manschette wird nach den Empfehlungen des Herstellers mit Luft verstopft.
- Setzen Sie ein oro-gastric Drainagerohr ein, um Flüssigkeit und Luft aus dem Magen zu entfernen.
- Setzen Sie einen Harnkatheter über die Harnröhre ein.
- Anschließend die Haut im Bereich des chirurgischen Schnitts beschneiden.
- Tragen Sie die Augensalbe auf, um das Trocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern.
- Nach orotrachealer Intubation die Anästhesie mit Isofluran (endexpiratorische 1,45-2,0 Vol.%) und Fentanyl (3 -7,5 g/kg/h) aufrecht erhalten.
- Stellen Sie eine aktive intraoperative Temperaturregelung des Tieres durch ein Heizpad und mit erwärmter Luft sicher. Legen Sie eine Rektalsonde ein, um die Körpertemperatur zu überwachen (Zieltemperatur 36,5 °C - 37,5 °C).
- Verabreichen Sie antibiotika-prophylaxe mit Cefuroxim (35 mg/kg i.v.). Infuse Ringer Lösung bei 4 ml/kg/h und erhöhen Sie nach Hautschnitt auf 8 ml/kg/h. Verabreichen Sie eine prophylaktische Dosis von Pantoprazol (40 mg i.v.) über die Ohrvene Zugang.
- Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter sterilen Bedingungen nach den allgemeinen Prinzipien der chirurgischen Asepsis und Antisepsis. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Povidon-Jod-Lösung und decken Sie es mit chirurgischen Vorhängen ab.
3. Telemetrieimplantation
- Bereiten Sie das Tier auf eine Operation vor, indem Sie die in Abschnitt 2 des Protokolls beschriebenen Schritte durchführen und die richtige Anästhesie durch eine abnehmende Herzfrequenz und einen Mangel an bewusster Bewegung des Tieres bestätigen.
- Sammeln Sie Blut- und Urinproben, um einzelne Basiswertwerte des Labors zu bestimmen.
- Markieren Sie die Einschnittstellen mit einem permanenten Marker.
- Um den arteriellen Sensor des Telemetrietransponders zu implantieren, führen Sie einen 3-4 cm Schnitt in der Leistengegend durch. Expose und sezieren Sie die Arterie in einer 360° Art und Weise.
- Mit einer Overholt-Klemme durch zwei Gefäßschlaufen unterhalb der Arterie ziehen und mit Mückenklemmen befestigen.
- Nach einer Arteriotomie mit #11 Klingenskalpell, setzen Sie den arteriellen Sensor ein. Schließen Sie die Arteriotomie mit 5-0 Polypropylen-Nähte mit einzelnen Knoten Nähten und sichern Sie den arteriellen Sensor mit einer dieser Nähte.
- Machen Sie einen 3-4 cm großen Schnitt an der linken Flanke des Tieres und erstellen Sie einen subkutanen Beutel für den Transponder durch stumpfe Zerlegung.
- Tunneln Sie den Telemetrietransponder an die Flanke und fixieren Sie ihn an der Muskelfaszie (3-0 Polypropylen, Einzelknoten). Tunneln Sie die roten und weißen EKG-Elektroden auf die rechte und linke Seite des Thorax. Machen Sie zwei 1 cm Schnitte und sichern Sie die Elektroden im Muskelgewebe, um ein gutes EKG-Signal mit einzelnen KnotenNähten (3-0 Polyglactin) zu gewährleisten.
- Beginnen Sie mit der Registrierung von Telemetriedaten und überprüfen Sie die verschiedenen Signale (z. B. vom Transponderkörper selbst registrierte Körpertemperatur, arterielle Blutdruck- und EKG-Signale).
- Schließen Sie die Schnitte in der Leistengegend, auf der linken Flanke und die beiden kleinen thorakalen Schnitte mit Muskel- und subkutanen Nähten (3-0 Polyglactin) und schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Monofilament-Naht (z.B. 2-0 Prolen).
- Verwenden Sie ein Sprühfoliendressing, um die Einschnittstellen zu versiegeln.
- Zu diesem Zeitpunkt bereiten Sie das Tier darauf vor, eine ausgewiesene Schweinejacke zu tragen, die das Tier für den Rest des Untersuchungszeitraums trägt. Ersetzen Sie Jacken nach jedem chirurgischen Eingriff durch eine saubere Jacke.
HINWEIS: Um stabile Basisdaten aufzuzeichnen, werden Telemetrie-Transponder 14 Tage vor der Indexoperation implantiert (linke Nephrektomie, siehe auch Diskussion).
4. Nephrektomie und Nierentransplantat-Retrieval
- Bereiten Sie das Tier auf eine Transplantat-Retrieval-Operation vor, die den in Abschnitt 2 beschriebenen Verfahren folgt.
- Nach der Induktion der Anästhesie kann die äußere Jugularvene nulate. Nach der sterilen Desinfektion des Operationsfeldes erfolgt auf der rechten Seite in der Jugularnut ein 4 cm Schnitt.
- Sezieren Sie subkutanes Gewebe und Muskel, um die äußere juguläre Vene zu belichten.
- Belichten und sezieren Sie die Vene in einer 360°-Manier.
- Mit einer Overholt-Klemme durch zwei Gefäßschlaufen unterhalb der Vene ziehen und mit Mückenklemmen befestigen.
- Tunneln Sie den Jugularkatheter auf den Rücken des Tieres. Positionieren Sie dafür das Schwein auf der linken Seite. Verwenden Sie die Seldinger-Methode, um den Jugularkatheter einzufügen.
- Schließen Sie die Öffnung an der Vene und sichern Sie den Katheter mit 5-0 Polypropylen-Nähte.
- Schließen Sie den Schnitt in zwei Schichten (z.B. 3-0 Polyglactin für den Muskel und subkutan und 2-0 Polypropylen für die Haut).
- Sichern Sie den Katheter mit mehreren Nähten (2-0 Polypropylen) an der Haut.
- Testen Sie den jugularen Venenkatheter auf freie Aspiration und Injektion. Anschließend schalten Sie die intravenöse Linie von der Ohrvenenkanüle auf die zentrale venöse Linie.
- Nach chirurgischer Desinfektion und Drapat, führen Sie eine mediane Laparotomie, um den Bauch zu öffnen (25-30 cm). Verwenden Sie einen Standard-Bauchretraktor, um das chirurgische Feld zu belichten.
- Verwenden Sie nasse und warme Bauchtücher, um den Dickdarm und den kleinen Darm zu bedecken. Bitten Sie den zweiten Assistenten, den Darm in die Richtung des rechten Hemi-Abdomens zu halten, das die Niere und ihre Gefäßstrukturen freilegt.
- Öffnen Sie die Peritonealschicht und sezieren Sie die linke Niere und den Harnleiter von jedem anhaftenden Gewebe mit der monopolaren Kautery, bipolaren Zangen und feinen Scheren.
- Ligate und teilen Sie den linken Harnleiter (3-0 Polyglactin) so dass ein mindestens 10 bis 12 cm langes Segment.
- Vervollständigen Sie die Sezieren der linken Nierenvene(en) und arterien, um ihren Ursprung aus minderwertigen Vena cava bzw. Aorta.
HINWEIS: Vermeiden Sie Verletzungen und Das Öffnen der großen Lymphgefäße in diesem anatomischen Bereich. Beachten Sie auch eine mögliche Verletzung der Azygo-Lumbar-Vene, die sich mit der Nierenvene in der Nähe ihres Ursprungs aus der Vena cava verbindet. - Sezieren und liganieren Sie die Azygo-Lumbeine zwischen zwei Ligaturen (3-0 Polyglactin).
- Bereiten Sie sich auf die Rückentisch-Sektion mit einer Schüssel Eis und einer sterilen Abdeckung vor.
- Um die Transplantatniere zu bergen, klemmen Sie die Nierenarterie und die Nierenvene in der Nähe der Aorta und der Vena cava mit Gefäßklemmen. Entfernen Sie das Nierentransplantat, indem Sie die Gefäße mit einer Schere in der Nähe der Klammern schneiden und dann die Niere an das Hintertischteam übergeben.
- Schließen Sie den Stumpf der Nierenarterie mit einer 5-0 Polypropylen-Nähte. Schließen Sie die Nierenvene mit einer zweilagigen kontinuierlichen Naht mit 5-0 Polypropylen. Entfernen Sie die Gefäßklemmen.
- Nach der Überprüfung des Bereichs auf Blutungen oder lymphatische Leckage, schließen Sie den Bauch in 4 Schichten.
HINWEIS: Peritoneum: 3-0 Polyglactin laufende Naht; Faszien: 0 Polyglactin laufende Naht; subkutane Schicht: 3-0 Polyglactin laufende Naht; Haut: Hauthefter nach Nierenentnahmeoperation, um das Wiederöffnen des Bauches am nächsten Tag zu erleichtern und 2-0 Polypropylen-Einzelknotennähte nach dem Transplantationsverfahren für den endgültigen Abschluss. - Nach dem Auftragen von sterilem Wundverband, geben Sie das Tier in die Unterkunft zurück und lassen Sie sich nach endotrachealer Extubation erholen. Bei postoperativer Analgesie verwenden Sie Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) intramuskulär alle 8 h bis zur Automatischen Transplantation.
5. Rücktisch und Organkonservierung
- Nach dem Transplantat-Retrieval kann die Nierenarterie sofort mit einem standardmäßigen 14 G (orange) peripheren Katheter nuonieren und mit einem aus 3-0 Polyglactin hergestellten Tourniquet fixieren.
- Spülen Sie die Niere mit kalter Organkonservierungslösung.
- Nach dem Spülen mit 500 ml Organkonservierungslösung die arterielle Kanüle entfernen, das Nierentransplantat in sterile Organbeutel wickeln und in Organkonservierungslösung mit einer Zielkälte-Ischämische Zeit (CIT) von 24 h bei 4 °C mit einem computergesteuerten Kühlkreislauf aufbewahren.
HINWEIS: Es wird eine kurze Nachkonservierungsspülung mit 500 ml normaler Salinelösung mit 4 °C empfohlen.
6. Kontralaterale Nephrektomie und orthotopische Nieren-Autotransplantation
- Passen Sie während der Operation des Empfängers die Prämedikation und die Erstanästhesie an den eingeschränkten Nierenstoffwechsel an und vermeiden Sie die Verwendung von Ketamin. Die Induktion erfolgt mit Propofol (3-5 mg/kg i.v.), Midazolam (0,25 mg/kg i.v.) und Atropin (0,1 mg/kg i.m.). Danach ist die präoperative Zubereitung mit den in Abschnitt 2 beschriebenen Verfahren identisch.
- Halten Sie die Anästhesie mit Isofluran (endend expiratorische 1,45-2.0 Vol.%) und Fentanyl (3 - 7,5 g/kg/h) und Propofol (2 - 4 mg/kg/h) aufrecht.
- EKG, Pulsoximetrie, Rektaltemperatur und die Funktion des Telemetrietransponders überprüfen und kontinuierlich überwachen.
HINWEIS: Strenge Anästhesie und Blutdruckkontrolle ist während des Implantationsverfahrens von entscheidender Bedeutung. - In seltenen Fällen, in denen das über dem Telemetrie-Transponder registrierte arterielle Blutdrucksignal aufgrund der Supine-Position des Tieres nicht zufriedenstellend ist, legen Sie einen weiteren arteriellen Katheter mit perkutaner Punktion und der Seldinger-Technik in die rechte Oberschenkelarterie.
- Nach sterilem Drapieren, öffnen Sie die mediane Laparotomie wieder und setzen Sie das operationschirurgische Feld mit dem Bauchretraktor aus. Der Dickdarm und der kleine Darm werden auf der linken Seite des Bauches platziert, um die intakte rechte Niere freizulegen.
- Ähnlich wie beim Spenderverfahren, sezieren Sie die kontralaterale Niere und ihre Gefäße aus dem umgebenden Gewebe. Sezieren Sie die rechte Nierenvene und Nierenarterie in Richtung des Nierenhilums, um eine ausreichende Gefäßlänge für Anastomose zu gewährleisten.
- 5 min vor dem Gefäßspannen Natrium-Heparin intravenös injizieren (100 I.U./ kg).
- Klemmen Sie die rechte Nierenarterie und die rechte Nierenvene mit Gefäßklemmen. Die rechte Niere wird entfernt. Die Gefäße werden vor dem Start der Anastomosen auf Integrität überprüft.
- Legen Sie die erhaltene Transplantatniere in den Bauch und beginnen Sie die venösen und arteriellen Anastomosen.
- Von diesem Zeitpunkt an halten Sie den mittleren arteriellen Druck über 80-90 mm Hg, um eine gute frühe Durchblutung des Nierentransplantats nach der Reperfusion zu gewährleisten. Erreichen Sie dies teilweise durch ein angemessenes Volumenmanagement und teilweise durch die Verabreichung von Noradrenalin (0,1 - 1,0 g/kg/min als kontinuierliche Infusion unter Verwendung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz zur Überwachung der Effizienz).
- Führen Sie End-to-End-Anastomose der Nierenvene durch:
- Nachdem Sie zwei Eckstiche mit 5-0 Polypropylen platziert haben, benähen Sie die Rückwand kontinuierlich.
- Binden Sie den Schädel-Eck-Stich und binden Sie ihn zusammen mit dem Faden, der für die Rückwand verwendet wird.
- Nachdem Sie die Rückwand fertig gemacht haben, verwenden Sie den Schädel-Eckstich, um die Vorderwand in kranio-kaudale Richtung zu nähen. Spülen Sie die Vene mit aheparinisierter Saline-Lösung (100 I.U./mL). Binden Sie den kaudalen Eckstich.
HINWEIS: Bei einem Größenkonflikt zwischen Spender- und Empfängerseite kann ein kleiner Wachstumsfaktor verwendet werden, um eine breite und ausreichende Anastomose zu gewährleisten. Es gibt viele mögliche Variationen der Porcine Renal Venenzweige. Bei komplexer venöser Anatomie ist ein modifizierter Anastomoseansatz erforderlich (siehe Abbildung 3).
- Führen Sie die End-to-End-Anastomose der Nierenarterie durch:
- Verwenden Sie einen 6-0 Polypropylen-Schädel-Eckstich, um die arterielle Anastomose durchzuführen. Das Platzieren eines weiteren kaudalen, stützenden Eckstichs, der später entfernt wird, ist optional.
- Mit der Fallschirmtechnik die Rückwand kontinuierlich befestigen. Nach der Ankunft an der kaudalen Ecke entfernen Sie den zweiten Eckstich (falls zutreffend).
- Die Vorderwand mit dem anderen Ende der doppelbewaffneten 6-0 Polypropylen-Nähte befestigen. Spülen Sie die Arterie mit einer heparinisierten Saline-Lösung (100 I.U./mL). Binden Sie die beiden Fäden an der kaudalen Ecke.
- Zeichnen Sie die Zeit auf, die für die Durchführung beider Anastomosen mit einer zielwarmen Ischämiezeit von <40 min benötigt wird.
- Reperfuse die Niere durch Öffnen der venösen Gefäßklemme und anschließend der arteriellen Klemme. Überprüfen Sie, ob erhebliche Blutungen auftreten.
- Wenn keine signifikanten Blutungen aus den Anastomosen beobachtet werden, packen Sie das Nierentransplantat aus und gießen Sie warme normale Herz-Saline-Lösung in den Bauch, der das reperfused Transplantat bedeckt.
- Positionieren Sie das Transplantat bei Bedarf neu, um eine homogene Reperfusion zu gewährleisten und Staus zu vermeiden.
- Papaverin topisch an der Außenseite der Nierenarterie und der arteriellen Anastomose (5 ml unverdünnt) verabreichen.
- Nach der Reperfusion 250 ml 20% Glukoselösung infusionieren, um eine osmotische Diät zu induzieren, gefolgt von der Verabreichung einer Einzeldosis von 80 mg Furosemid.
HINWEIS: Danach kann die anfängliche Urinproduktion beobachtet werden. - Um die Harnentwässerung zu gewährleisten, passieren Sie einen 12 französischen pädiatrischen Urinkatheter durch die Bauchwand der rechten Flanke des Tieres, retroperitoneal.
- Den Katheter im Harnleiter mit Ligaturen (2-0 Polyglactin) sichern und den Katheter mit 2 ml Saline blockieren. Weitere Nähte werden verwendet, um den Harnleiter an das Peritoneum der Bauchwand (2-0 Polypropylen) anzupassen und zu sichern. Der Katheter ist auch mit mindestens zwei Einzelnenknotennähten (2-0 Polypropylen) an der Haut befestigt.
- Schließen Sie die Peritonealschicht über der Niere, um eine Verrenkung des Nierentransplantats und das Verknicken der Vaskulären (3-0 Polyglactin) zu verhindern.
- Schließen Sie den Bauch in einer ähnlichen 4-Schicht-Manier, wie zuvor für den Transplantat-Retrieval beschrieben.
- Nach Dem Bauchverschluss die Normothermie auf dem ODER-Tisch beibehalten.
HINWEIS: Der mittlere arterielle Blutdruck sollte über 80 mm Hg gehalten werden, bis das Tier wach ist und sich in einer anfälligen Position befindet. - Verwenden Sie nach dem Bauchverschluss den Farb-Doppler-Ultraschall, um eine ausreichende arterielle und venöse Durchblutung des Nierentransplantats zu gewährleisten (Abbildung 4). Überwachen Sie das Tier genau, bis es vollständig wach ist und kann spontan gehen und trinken. Die Tiere erhalten während der Erholungsphase 1 L Ringer-Lösung.
- Anschließend kehren Sie das Tier in seine Box in der Unterkunft zurück.
7. Follow-up, Beispiel und Datenerhebung
- Geben Sie den Tieren Wasser ad libitum, sobald sie spontan trinken können. Bieten Sie feste Nahrung vom postoperativen Tag 1.
- Bei postoperativer Analgesie Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) intramuskulär alle 8 h für 72 h verabreichen, Pantozol (40mg i.v.) einmal täglich für 72 h geben. Antibiotika-Behandlung (Cefuroxim 35 mg/kg i.v. 2x täglich) und Thromboseprophylaxe (500 mg Acetylsalicylsäure ab dem postoperativen Tag 1) während des gesamten Beobachtungszeitraums bis zum Ende des Experiments.
HINWEIS: Wenn Blutungskomplikationen auftreten, wird Aspirin abgesetzt. - Registrieren Sie kontinuierliche Telemetriedaten während des beobachtungszeitraums. Stellen Sie sicher, dass die Tiere mindestens alle 8 Stunden vom Tierarzt und/oder von einem erfahrenen Veterinärtechniker besucht werden und ihr klinischer Zustand anhand eines Merkblattes bewertet wird, das als Grundlage für die vorzeitige Beendigung des Experiments verwendet wird, wenn dies aufgrund des klinischen Zustands des Tieres erforderlich ist.
HINWEIS: Diese sogenannten humanen Endpunktkriterien sind wie zuvor beschrieben24definiert. - Führen Sie die tägliche Probenentnahme mit der zentralen venösen Linie und dem perkutanen Harnkatheter durch. Harnbeutel (2.000 ml) 2x täglich wechseln.
- Nach der Probenentnahme oder der Verabreichung von Flüssigkeiten oder Medikamenten, blockieren Sie den zentralen venösen Katheter mit heparinisierter Salinelösung (100 I.U./ml) zwischen jedem Einsatz, um Okklusion zu vermeiden und ihn mit einer neuen sterilen Kappe zu bedecken.
- Nach der entsprechenden Beobachtungszeit von 5 bis 7 Tagen opfern Sie die Tiere in tiefer Anästhesie nach Relaparotomie, Probenentnahme und Explantation des Nierentransplantats. Das Opfer wird mit einer einmaligen Injektion von Pentobarbital (50 - 60 mg/kg i.v.) durchgeführt.
HINWEIS: In Übereinstimmung mit dem 3R-Prinzip können die verbleibenden Organe und Gewebe der geopferten Tiere für verschiedene Ex-vivo-Forschungs- und Bildungszwecke in hauseigenen Instituten verwendet werden.
Representative Results
Unsere Gruppe verfügt über mehrjährige Erfahrung mit festen Organtransplantationsmodellen bei kleinen und großen Tieren und nutzte das orthotopische Nieren-Autotransplantationsmodell, das reproduzierbare Ergebnisse in verschiedenen experimentellen Umgebungen16,25,26,27. Je nach Versuchsaufbau empfehlen wir die Durchführung von 3 bis 5 Autotransplantationen als Vorversuche, die eine ausreichende Lernkurve des gesamten Experimentalteams gewährleisten. In der gegenwärtigen Umgebung waren 5 Transplantationen erforderlich, um einen Chirurgen auszubilden, mit 8 Jahren vorheriger experimenteller und 5 Jahren klinischer chirurgischer Erfahrung auf dem Gebiet der Transplantationschirurgie, bei der Durchführung dieser Experimente. Dies kann je nach der vorherigen Exposition des Chirurgen gegenüber diesen Techniken variieren.
Im Rahmen dieses Protokolls werden die Ergebnisse einer Reihe von 5 orthotopischen Orthotop-Experimenten zur Autotransplantation von Poren auf der Nieren demonstriert. Die Transponderimplantation war bei jedem Tier mit ausreichendtelemetriesignalen während des beobachtungszeitraums erfolgreich (außer einem Tier mit partieller Transponderfunktionsstörung). Das Messer-zu-Haut-Intervall für die Transponderimplantation betrug 85 min ± 5 min (Tabelle 1). Nach der Transplantation sanieren sich alle Tiere gut in der Unterkunft. Das Messer-zu-Haut-Intervall für die Retrieval-Chirurgie betrug 135 min ± 32 min (davon ca. 30-45 min für das Einsetzen, Tunneln und Sichern des Jugularkatheters). Die linke Niere wurde in einem kalten Wasserbad mit einer Ziel-Kalt-Ischämie-Zeit von 24 h (24 h ± 30 min) gelagert. Am nächsten Tag, nach Anästhesieinduktion und Relaparotomie, wurde die kontralaterale (rechte) Niere entfernt, gefolgt von der orthotopischen Autotransplantation des kalt gelagerten linken Nierentransplantats, wie zuvor beschrieben. Das Messer-zu-Haut-Intervall für die Autotransplantationsoperation betrug 168 min ± 27 min (einschließlich der Explantation der rechten Niere). Warme Ischämie Zeit war 34 min ± 7 min. Jedes implantierte Nierentransplantat hatte eine minimale, aber direkte Urinproduktion nach der Reperfusion. Nach dem Bauchverschluss zeigte der Farb-Doppler-Ultraschall in allen Fällen zufriedenstellende arterielle und venöse Perfusion der Niere (Abbildung 4). Alle Tiere erholten sich von der Anästhesie und während des Beobachtungszeitraums wurden keine signifikanten Komplikationen beobachtet. Tägliche Blut- und Urinproben wurden entnommen. Alle Schweine waren während der Nachbeobachtung in gutem klinischen Zustand und wurden nach 5 Tagen geopfert. Serumkreatinin- und Kaliumwerte erreichten ihren Höhepunkt auf POD3-4. Der pH-Wert des Blutes liegt im normalen Bereich (Abbildung 5). Der Urinausgang wurde in den ersten vier postoperativen Tagen auf Normalwerte zurückgewonnen. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen wurde am Ende des Nachbeobachtungszeitraums leicht erhöht (Abbildung 5). Die Körpertemperatur, gemessen durch kontinuierliche Telemetrieüberwachung, zeigte während des postoperativen Zeitraums leichte Schwankungen.
Abbildung 1:Studienflussdiagramm und Protokoll. Verwendete Abkürzungen: POD-postoperativer Tag; EKG-Elektrokardiographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tierhaltungsanlage mit Echtzeit- und kontinuierlicher Telemetrieüberwachung von bis zu 6 Tieren. (A) Schematische Blaupause unserer Anlage geeignet für die Unterbringung und Telemetrieüberwachung von bis zu 6 Tieren. Die Größe der einzelnen Halteboxen wurde auf der Grundlage der Richtlinien der EU-Richtlinie 2010/63 und des Anhangs A ETS 123 ermittelt. (B) Tierraum für die Unterbringung von 6 Tieren. (C) Beobachtungsraum mit einem PC, der für die kontinuierliche Registrierung von Telemetriedaten verwendet wird. (D) Echtzeit-Video und wärmendes Material der Tiere. (E) Individueller Betrieb, der den akustischen und olfaktorischen Kontakt der Tiere mit ihren Begleitern gewährleistet, um soziale Isolation zu vermeiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Orthotopische Nieren-Autotransplantation und anatomische Variationen und Rekonstruktionsmöglichkeiten. (A,B) Die Schritte des orthotopischen Nieren-Autotransplantationsmodells im Falle einer "Standard"-Gefäßanatomie. (C) Variante 1: Während eine größere Vene mit der Spenderniere kommt, gibt es zwei Venen auf der Empfängerseite. Management: Die kleinere Vene wird durch eine Ligatur geschlossen und die Anastomose wird Ende zu Ende zwischen den Nierenvenen durchgeführt. (D) Variante 2: Während eine größere Vene mit der Spenderniere kommt, gibt es kein geeignetes Empfängergefäß auf der kontralateralen Seite (z. B. Größenabweichung). Management: Ende der Seite Anastomose der Nierenvene zur unteren Vena cava. (E) Variante 3: zwei ähnliche Adern auf beiden Seiten. Management: Rekonstruktion durch zwei venöse Anastomosen. (F) Variante 4: Während zwei ähnlich große Venen mit der Spenderniere kommen, gibt es kein geeignetes Empfängergefäß auf der kontralateralen Seite. Management: Ende der Seitlichen Anastomose der Nierenvene zur unteren Venenhöhle bei zwei Nierenvenen. (G) Variante 5: Eine Spenderniere kommt mit einer Vene, die eine frühe Bifurkation zeigt, während es eine große Vene auf der kontralateralen Seite gibt. Management: Ende bis Ende anastomosis des kurzen gemeinsamen Kanals der Spender-Nierenvene mit einer großen Vene auf der Empfängerseite. (H) Variante 6: Während die Spenderniere mit einer einzigen Nierenvene mit einer frühen Bifurkation kommt, gibt es kein geeignetes Empfängergefäß auf der kontralateralen Seite. Management: Ende der Seite Anastomose des kurzen gemeinsamen Kanalderdes der Spender Nierenvene zur unteren Vena cava. Diese Abbildung zeigt eine Handvoll der häufigeren Variationen und ist statistisch nicht umfassend in Bezug auf alle Variationen, die bei deutschen Landrassenschweinen möglich sind. Verwendete Abkürzungen: KG-Nierentransplantat; RK-rechte Niere; IVC-untere Vena cava; AO-aorta Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Farb-Doppler-Ultraschallbilder, direkt nach orthotopischer Nieren-Autotransplantation und Bauchverschluss. (A) Farbdoppler-Ultraschall wird direkt nach der Implantation der Niere und des Bauchverschlusses durchgeführt, um eine gute arterielle und venöse Perfusion des Nierentransplantats zu gewährleisten und auf mögliche iatrogene Gefäßverknickungen zu untersuchen. Ultraschall wurde auch täglich und auf Abruf verwendet, basierend auf der klinischen Leistung des Tieres auf verschiedene Probleme zu untersuchen. (B-E) Repräsentative Ultraschallbilder eines Nierentransplantats nach der Implantation. Das Bild des Nierentransplantats mit und ohne Farbe Doppler (B,C) zeigt eine ausgezeichnete arterielle (D) und venöse Perfusion (E). Diese Abbildung zeigt repräsentative Bilder vom selben Tier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Laborbefunde und Telemetriedaten des orthotopischen Nieren-Autotransplantationsmodells mit einer kalten Ischämiezeit von 24 h. (A) Serumkaliumwerte (B) Serumkreatininwerte (C) pH (D) Weiße Blutkörperchen (WBC) (E) Urinausgang. (F) Durchschnittliche Körpertemperatur, die während des Beobachtungszeitraums bei vier aufeinanderfolgenden Nierentransplantationen durch telemetrische Überwachung erfasst wurde (keine Daten des5. Tieres aufgrund einer partiellen Transponderfunktionsstörung). Verwendete Abkürzungen: POD-postoperativer Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Beispiele für mögliche perioperative Komplikationen und Fallstricke. (A-C) Postoperative Überlastung des transplantierten Nierentransplantats auf POD3 nach orthotopischer Kindey-Autotransplantation. (D) Der Grund für die Überlastung wurde als Katheterknickaufgrund aufgrund einer aufgehellten Naht auf der Ebene der Haut identifiziert. Nach der Nachjustierung der Naht löste sich die Staus fast vollständig in 24 h. (E) Hier wird ein anderes Nierentransplantat auf POD2 nach orthotopischer Nieren-Autotransplantation gezeigt. Asterix (*) zeigt eine Flüssigkeitssammlung um den Unterpol des Transplantats (blutige Sammlung vs. Lymphocele). Aufgrund unserer Technik mit Verschluss des Peritoneums über der Niere sind diese Sammlungen aufgrund der vorteilhaften Auswirkungen der lokalen Kompression in der Regel selbstbegrenzend. Die Tiere sollten im Hinblick auf den lokalen Befund, die Anzeichen von Blutungen oder Infektionen genau überwacht werden. (F) Qualifizierter Farb-Doppler-Ultraschall, der täglich (und auf Abruf) in der Wohnanlage durchgeführt wird, hat neben seiner akademischen Nutzung (z.B. Dokumentation, Registrierung arterieller Widerstandsindizes) eine entscheidende diagnostische Rolle bei der Erkennung potenzieller Komplikationen in der frühen subklinischen Phase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Experimentelle Aufgabe/Schritt | Tage | Zeit (min) | Chirurg | Veterinärreferent | Veterinärtechniker | Labortechniker | Doktorand | gesamt |
| Nr | ||||||||
| Präopreative Pflege | D-29 bis D-15 | K.a. | 1 | 1 | 1 | 3 | ||
| Telemetrie-Implantationschirurgie | D-15 | 85±5 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5 |
| Postoperative Pflege nach Telemetrie-Implantation | D-15 bis D-1 | K.a. | 1 | 1 | 1 | 3 | ||
| Graft Retrieval Chirurgie | D-1 | 135±32 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 8 |
| Nieren-Autotransplantationschirurgie | D 0 | 168 ±27 | 1 | 2 | 1 | 2 | 2 | 8 |
| Postoperative Pflege nach Nieren-Autotransplantation | D 0 bis D5 | K.a. | 2 | 1 | 2 | 5 | ||
| Opfere | D 5 | K.a. | 2 | 1 | 1 | 4 |
Tabelle 1. Beschreibung der erforderlichen Humanressourcen und Zeitpläne für die Durchführung verschiedener experimenteller Schritte des Schweinenieren-Autotransplantationsmodells.
Discussion
Das Schweinemodell von KT ermöglicht die Untersuchung neuartiger therapeutischer Ansätze und Medizinprodukte in einer klinisch relevanten Großtiereinstellung15,17,21. Die anatomischen, pathophysiologischen und chirurgisch-technischen Ähnlichkeiten zwischen dem Schweine- und dem Humanumfeld können die klinische Interpretation von Daten und die schnelle Übersetzung der Befunde und Techniken in klinische Tests15,16,17,18,19,21erleichtern.
Das Modell der orthotopischen Nieren-Autotransplantation entspricht nicht nur dem 3R-Prinzip, indem es die Anzahl der benötigten Tiere im Vergleich zur Allo-Transplantation reduziert, z.B. kein separates Spendertier erforderlich ist, sondern bietet auch eine einzigartige Gelegenheit, die Auswirkungen von IRI und Erhaltungsverletzungen ohne die verwirrenden Auswirkungen der immunologischen Reaktion und der immunsuppressiven Medikamente17,21zu untersuchen.
Leichte Änderungen des Protokolls ermöglichen die Modellierung eines breiten Spektrums klinischer Situationen. Um KT mit Einer Spende nach Kreislauftod (DCD) Nieren nachzuahmen, werden Gefäßstrukturen für 30 bis 60 min in situ vor nierenretrieval geklemmt, während längere kalte Ischämiezeiten (24 Stunden und länger) angewendet werden können, um umfangreiche Erhaltungsverletzungen16,17,28,29zu modellieren.
Obwohl das Schweine-KT-Modell chirurgisch weniger anspruchsvoll ist als solide Organtransplantationsmodelle bei Kleintieren (z.B. Ratten und Mäuse)26, gibt es mehrere technische Aspekte und Fallstricke, die berücksichtigt werden müssen, um die Ergebnisse zu verbessern und spezifische Komplikationen zu vermeiden17.
Wenn die großen Lymphgefäße um die minderwertige Vena cava und die Aorta während der Transplantatentnahme oder Implantation aufgrund technischer Fehler oder anatomischer Variationen nicht vermieden werden, kann dies zu einer hochverdaitten lymphatischen Fistel und postoperativen Bauchflüssigkeitssammlung, Infektion und möglicherweise technischem Versagen führen. Lymphgefäße sollten während der Operation vollständig vermieden oder mit 5-0 oder 6-0 Polypropylen-Nähten geschlossen werden. Es ist ratsam, auch die Verwendung von bipolaren oder anderen Gerinnungsvorrichtungen im Falle von lymphatischen Leckagen zu vermeiden. Es führt in der Regel zu einer Verschlechterung der Situation. Im Falle einer schwachen lymphatischen Leckage, hat unser Team eine gute Erfahrung mit der Anwendung von fibrin-basierten Kollagen-Patches (z.B. Tachosil)30, aber ihre hohen Kosten begrenzt ihre Anwendung in dieser Einstellung.
Im vorliegenden Protokoll zeigen wir einen transperitonealen Ansatz für die Nierenentnahme und Autotransplantation. Dies ist ein großer technischer Unterschied im Vergleich zur klinischen Situation, wo Nierentransplantate in der Regel in die Iliac Fossa mit einem extraperitonealen Ansatz implantiert werden. Obwohl die meisten Gruppen einen transperitonealen und einen orthotopischen Ansatz im Schweinemodell verwenden, ist eine heterotopische Transplantation in die Iliasfossa auch bei Schweinen31möglich. Aufgrund des relativ geringen Durchmessers der äußeren Iliasarterie bei 30-40 kg Schweinen und seiner Neigung zum Vasospasmus ist es jedoch manchmal schwierig, die end-to-side Anastomose der Nierenarterie zur äußeren Iliasarterie31durchzuführen. In Bezug auf die Tatsache, dass wir die linke Niere über einen transperitonealen Ansatz abrufen, um eine nachfolgende Autotransplantation durchzuführen, ist es besser möglich, die Implantation durchzuführen, indem wir den gleichen Schnitt wieder öffnen und einen straigtforward orthotopischen Ansatz verwenden, insbesondere dass es pro Protokoll auch erforderlich ist, die native rechte Niere zu entfernen, um sicherzustellen, dass sich das Tier mit nur einer vorbeschädigten Artey erholt. Die umfassende Beschreibung aller möglichen technischen Varianten des Modells geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus und wurde von anderen in umfassenden Review-Artikeln31zusammengefasst.
Die Verdrängung des transplantierten Nierentransplantats und das daraus resultierende Knicken der vaskulären Anastomosen sind eine Hauptursache für das Versagen im Schweine-KT-Modell, was aufgrund einer chirurgischen Komplikation schnell zu Gefäßverschluss und vollständigem Versagen des Experiments führt. Um dies zu vermeiden, schließen wir nach der Autotransplantation die Peritonealschicht über der Niere mit einer laufenden Naht mit 3-0 Polyglactin. Darüber hinaus wird der Farbdoppler-Ultraschall direkt nach der Implantation der Niere und des Bauchverschlusses durchgeführt, um eine gute arterielle und venöse Perfusion des Nierentransplantats zu gewährleisten. Ultraschall wird auch täglich und auf Abruf verwendet, basierend auf der klinischen Leistung des Tieres, um Nierenperfusion, postrenale Probleme (z. B. Obstruktion oder Knicking des Harnkatheters) und Flüssigkeitssammlung aufgrund lymphatischer Fistel, Blutungen oder Infektionen zu untersuchen (Abbildung 4 und Abbildung 6).
Da 24 Stunden kalte Ischämie oft zu funktionellen Beeinträchtigungen und verzögerter Transplantatfunktion führt, können die Tiere eine medizinische Therapie auf Abruf benötigen, wenn dies vom Veterinäramt als notwendig erachtet wird. Dies kann eine Infusionstherapie mit 5% Glukose- und/oder Ringer-Lösung, die über die zentrale venöse Linie verabreicht wird, Furosemidbolus-Injektionen (bei Oligurie/Anurie je nach klinischem Zustand und Laborergebnissen, 60-80 mg Bolus-Injektionen bis zu 200 mg/Tag) und die orale Verabreichung von Natriumpolystyrolsulfonat (Resonium A) bei schwerer Hyperkalämie32. Um eine experimentelle Voreingenommenheit zu vermeiden, muss der für die tierärztliche Betreuung der Tiere nach der Transplantation zuständige Veterinärbeamte für die angewandte Behandlung und Gruppierung geblendet werden.
Obwohl die Anatomie der Nierenarterie bei deutschen Landrassenschweinen mit meist einer Arterie recht einfach zu rekonstruieren ist, gibt es ein breites Spektrum anatomischer Variationen der Renalvenenzweige, die während der venösen Rekonstruktion eine gewisse chirurgische Kreativität erfordern. Häufig verbinden sich zwei (oder mehr) renale Venenzweige auf verschiedenen Ebenen zwischen dem Nieren-Hilum und dem unteren Vena-Cava. Die am häufigsten beobachteten Variationen und die möglichen Rekonstruktionsmöglichkeiten17 sind in Abbildung 3dargestellt.
Nach dem ersten chirurgischen Eingriff (Tag -15, Telemetrie-Implantation) erhalten alle Tiere eine Schweinejacke, die sie während des gesamten Versuchszeitraums tragen. Dies bietet einen ausgezeichneten Schutz vor Unfallverletzungen und Verwerfungen der implantierten Katheter und bietet Platz für die Lagerung der Urinsammelbeutel. Die Verwendung dieser Jacken ist auch eine praktikable Lösung, um die Notwendigkeit von metabolischen Käfigen für die Bewertung der Kreatinin-Clearance als Verfeinerungsmethode nach dem 3R-Prinzip zu beseitigen.
Unsere Wohnanlage integriert den Einsatz von Telemetrie und videobasierter perioperativer Überwachung. Obwohl diese Methoden die regelmäßigen Besuche des Veterinärbeamten und der Techniker nicht ersetzen können, erleichtern sie schnelle Interventionen und verbessern die Schwerebewertung, um unsere versuchsweisen Rahmenbedingungen für die Zukunft weiter zu verfeinern. Es gibt ein breites Spektrum an Indikationen für die Verwendung eines implantierbaren Telemetriegerätes in großen Tiermodellen33. Obwohl eine genaue Überwachung der klinischen Paramter nach größeren Operationen wie EKG, Blutdruck, Temperatur als Standard in der menschlichen klinischen Einstellung einer chirurgischen Intensiv- und Zwischenstation angesehen wird, wird in der experimentellen Chirurgie Überwachung meist eingestellt, wenn das Tier aus der Anästhesie aufwacht33,34,35. Daher bietet die Telemetrie eine praktikable Möglichkeit für die kontinuierliche Überwachung dieser Tiere. Wir glauben, dass all diese Daten zur früherkennung einer möglichen postoperativen Komplikation genau und rechtzeitig beitragen (z. B. hämorrhagischer Schock oder Sepsis, die durch steigende Temperatur, Hypotonie und Tachykardie nachgewiesen werden). Dies kann ein rechtzeitiges Eingreifen erleichtern (z. B. Einführung einer therapeutischen Antibiotikatherapie, Flüssigkeitssubstitution, Absetzen der Antikoagulation oder Opfer des Tieres, um Leiden zu vermeiden). Neben diesem "Echtzeit"-Überwachungsaspekt konzentriert sich unsere Gruppe derzeit auf die Schwerebeurteilung und Verfeinerung von Tierversuchen36,37,38. Die retrospektive Analyse einer großen Menge gesammelter Telemetriedaten in diesen Experimenten kann es uns ermöglichen, die Schwere dieser Art von chirurgischen Eingriffen besser zu sratifizieren und die perioperative Versorgung (z. B. Analgesie) bei Labortieren zu optimieren.
In Bezug auf die implantierbare Telemetrie wird ein Zeitraum von mindestens 12 Tagen nach der Implantation des Messsystems empfohlen, um stabile und optimale Messdaten (basierend auf persönlicher Kommunikation) zu gewährleisten. Nachdem wir dieses Problem mit verschiedenen Herstellern diskutiert hatten, die Telemetrielösungen für große Tiere sowie mit anderen Forschungsgruppen, die diese Systeme in verschiedenen experimentellen Umgebungen nutzten, zur Verfügung stellten, beschlossen wir, einen Zeitraum von 14 Tagen zwischen Telemetrieimplantation und Nierentransplantation zu integrieren. In den früheren Tagen können abweichungen aufgrund der Bewegung des Tieres auftreten, da die Narben- und Heilungsprozesse noch unvollständig sind.
Trotz seiner Vorteile hat das oben beschriebene Modell gewisse Einschränkungen. Die Komplexität und die erforderlichen Ressourcen und die erforderliche Infrastruktur sind die wichtigsten Einschränkungen des Modells. Das zeitaufwändige Versuchsprotokoll, komplexe Techniken und intensive perioperative Nachverfolgung erfordern die Verfügbarkeit einer signifikanten Wohn- und ODER-Kapazität und erfordern die Beteiligung eines größeren Teams, einschließlich Doktoranden, Chirurgen, Veterinärbeamten und Technikern (Tabelle 1). Daher ist es auf der Grundlage unserer empirischen Beobachtungen in der Regel nicht machbar, mehr als zwei Verfahren pro Tag durchzuführen. Ein weiterer Nachteil des Schweinemodells gegenüber Kleintiermodellen ist die begrenzte Möglichkeit mechanistischer und molekularbiologischer Untersuchungen. Im vorliegenden Protokoll wurden nur 5 Tage Follow-up gemeldet. Dies war geeignet, um die wichtigsten experimentellen Merkmale des Modells zu demonstrieren, aber diese relativ kurze Nachbeobachtung kann nicht ausreichen, um bestimmte spezifische Forschungsfragen zu beantworten (z. B. langfristige Wiederherstellung der Funktion vs. akute Schäden). Daher kann eine projektbezogene Verlängerung der Folgemaßnahmen erforderlich sein. Dieses Manuskript beschreibt unsere aktuelle "Best-Practice" in der experimentellen Einstellung der orthotopischen Nieren-Autotransplantation. Während bestimmte Schritte zur erfolgreichen Etablierung dieses Modells obligatorisch sind, sind kleinere Aspekte (z. B. die intraoperative Verwendung eines Blasenkatheters, arterielle Katheterplatzierung zur Femoral vs. Karotisarterie) fakultativ und können nach Ermessen der Ermittler vermieden/verändert werden. Beschreibung und Begründung jedes einzelnen methodischen Aspekts würden den Rahmen dieses Protokolls sprengen und wurden an anderer Stelle erörtert31. Schließlich ist es auch schwierig, die genaue klinische Situation von ECD KT im Schweinemodell zu replizieren, wo ältere Spender, Allografts mit akuten Nierenverletzungen und Spender mit multiplen Komorbiditäten und chronischen Krankheiten wie Bluthochdruck, Diabetes mellitus oder Arteriosklerose einen großen Teil des marginalen Spenderpools ausmachen8,9.
Ungeachtet der oben genannten Einschränkungen sowie der technischen und logistischen Herausforderungen bietet dieses etablierte und reproduzierbare Großtiermodell von KT eine einzigartige Gelegenheit, neuartige Therapien und Techniken zur Verbesserung der Organkonservierung und der klinischen Ergebnisse zu untersuchen und stellt eine hervorragende Plattform für jüngere Chirurgen dar, um Organtransplantationstechniken in einem großen Tiermodell zu beherrschen.
Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Pascal Paschenda, Mareike Schulz, Britta Bungardt, Anna Kümmecke für die gekonnte technische Unterstützung.
Die Autoren erklären die Finanzierung zum Teil aus dem START-Programm der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (#23/19 bis Z.C.), aus der B.Braun-Stiftung, Melsungen, Deutschland (BBST-S-17-00240 bis Z.C.), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; FÜR-2591, BIS 542/5-1, BIS 542/6-1; 2016 an R.T. und SFB/TRR57, SFB/TRR219, BO3755/3-1, BO3755/6-1 bis P.B.) und das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: STOP-FSGS-01GM1901A bis P.B.), ohne Beteiligung der Geldgeber an Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Manuskripterstellung oder Veröffentlichungsentscheidung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia materials, drugs and medications | |||
| Aspirin 500mg i.v., powder for solution for injection | Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany | 4324188 | antiplatelet agents |
| Atropine sulfate solution for injection, 100mg | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany | 1821288 | parasympatholytic agent, premedication |
| Bepanthen ointment for eyes and nose | Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany | 1578675 | eye ointment |
| BD Discardit II syringes, 2ml, 5ml, 10ml,20ml | Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany | 300928, 309050,309110, 300296 | syringes |
| BD Micolance 3 (20G yellow) Cannula | Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany | 305888 | venous catheter |
| BD Venflon Pro Safety (20G pink) | Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany | 4491101 | venous catheter |
| Buprenorphine (Buprenovet) | Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany | 794-996 | analgesia |
| Cefuroxime 750mg, powder for preparing injection solution | FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany | J01DC02 | antibiotics |
| Covidien Hi-Contour, Endotracheal Tube 7,5 with Cuffed Murphy Eye | Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany | COV-107-75E | endotracheal Tube |
| FENTANYL 0,5 mg Rotexmedica solution for injection | Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany | 4993593 | opioide analgetic agent |
| Furosemide-ratiopharm 250 mg/25 ml solution for injection | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | 1479542 | loop diuretics |
| Glucose 5% solution for infusion (500ml, 250ml) | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 3705273,03705422 | infusion fluid |
| Glucose 20% solution for infusion | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 4164483 | osmotic diuresis |
| Heparin-Sodium 5000 I.E./ml | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 15782698 | anticoagulant |
| Isoflurane-Piramal (Isoflurane) | Piramal Critical Care Deutschland GmbH, Hallbergmoos, Germany | 9714675 | volatile anaesthetic agent |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride) 10% | Medistar Arzneimittelvertrieb GmbH, Ascheberg, Germany | 0004230 | general anaestetic agent |
| MIDAZOLAM 15mg/3ml | Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany | 828093 | hybnotica, sedative agent |
| NaCl 0,9% solution for infusion (500ml,1000ml) | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 864671.8779 | infusion fluid |
| Norepinephrine (Arterenol) | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt, Germany | 16180 | increase in blood pressure |
| Organ preservation solution (e.g. HTK) | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany | should be decided based on preference and experimental design | organ preservation |
| Pantoprazole 40mg/solution for injection | Laboratorios Normon,Madrid, Spain | 11068 | proton pump inhibitor |
| Paveron N 25mg/ml solution for injection (Papaverine Hydrochloride) | LINDEN Arzneimittel-Vertrieb-GmbH, Heuchelheim, Germany | 2748990 | spasmolytic agent for vasodilatation |
| Pentobarbital (Narcoren) | Boehringer Ingelheim vetmedica GmbH, Ingelheim, Germany | 1,204,924,565 | used for euthanasia |
| Propofol 1% (10mg/ml) MCT Fresenius | FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany | 654210 | general anaesthetic agent |
| Ringer solution | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 1471411 | infusion fluid |
| Sterofundin ISO solution for infusion (1000ml) | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 1078961 | Infusion fluid |
| Stresnil (Azaperone) 40mg/ml | Elanco | 797-548 | sedative |
| Urine catheter ruffle 12CH | Wirutec Rüsch Medical Vertriebs GmbH, Sulzbach, Germany |
RÜSCH-180605-12 | transurethral urinecatheter |
| Surgical materials | |||
| Appose ULC Skin Stapler | Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany | 8886803712 | skin stapler |
| Cavafix Certo 375 | B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany | 4153758 | central venous catheter |
| EMKA Easytel +L-EPTA Transponder | emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France | L-EEEETA 100 | telemetry transponder |
| EMKA Reciever and Data Analyzer System | emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France | Reviever | telemetry receiver |
| Feather Disposable Scapel (11)(21) | Feather, Japan | 8902305.395 | scapel |
| Prolene 2-0, blue monofil VISI-BLACK, FS needle | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | EH7038H | skin |
| Prolene 3-0,blue monofil,FS1 needle | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | EH7694H | skin |
| Prolene 5-0 (simply angulated, C1 needle) blue monofil VISI-BLACK | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | EH7227H | vascular |
| Prolene 5-0 (double armed, C1 needle) 60cm | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | KBB5661H | vascular |
| Prolene 6-0 (double armed, C1 needle) 60cm | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | EH7228H | vascular |
| Sempermed derma PF Surgical Gloves Seril Gr. 7, 7.5, 8 | Semperit investment Asia Pte Ltd, Singapore | 4200782,4200871,4200894 | surgical gloves |
| Sentinex® PRO Surgical Gowns Spunlace XL 150cm | Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied, Germany | 19302 | surgical gown |
| Tachosil | Takeda Pharma Vertrieb GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | MAXI 9,5 x 4,8 cm | haemostasis |
| Telasorp Belly wipes (green 45x45cm) | PAUL HARTMANN AG,Heidenheim, Germany | 4542437 | abdominal towel |
| Pediatric urine catheter | Uromed Kurt Drews KG, Oststeinbeck, Germany | PZN 03280856 | used for the uretero-cutaneus stoma |
| VICRYL- 0 MH Plus | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | V324 | fascial closure |
| VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 75cm | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | W9114 | subcutaneous suture, peritoneal suture, |
| VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 4*45cm | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | V780 | subcutaneous suture, peritoneal suture, |
| VICRYL - ligatures Sutupak purple braided, 3-0 | Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany | V1215E | threats for ligature |
| 3M™ Standard Surgical Mask 1810F | 3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany | 3M-ID 7000039767 | surgical mask |
| Surgical instruments | |||
| Anatomical forceps Standard | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | PZ0260 | anatomical forceps |
| Atraumatic tweezers steel, De Bakey Tip 1,5mm 8" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | GF0840 | anatmical atraumatic forceps |
| Bipolar forceps 16 cm straight, Branch 0,30 mm pointed, universal fit | Bühler Instrumente Medizintechnik GmbH,Tuttlingen, Germany | 08/0016-A | biopolar forceps |
| Bulldog clamp atraumatic,curved, De bakey 78 mm, 3" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | GF0900 | bulldog clamps |
| DE BAKEY-SATINSKY vascular clamp 215mm | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | GF1661 | vascular clamp |
| Dissecting scissors Mayo,250 mm, 10" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | SC2232 | Scissors for dissection |
| Dissecting scissors Metzenbaum-Fino, 260 mm, 101/4" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | SC2290 | Scissors for dissection |
| Draeger CATO Anesthetic machine with PM8050 Monitor | Dräger, Drägerwerk AG & Co. KGaA, Lübeck, Germany | 106782 | Ventilation System |
| Fine Tweezers, ADSON 180 mm | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | ADSONPZ0571 | fine forceps |
| Gosset abdomenal wall spreader | CHIRU-INSTRUMENTE, Kaierstuhl,Germany | 09-621512 | abdominal retractor |
| HALSTEAD MOSQUITO,curved, surgical 125mm | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | KL2291 | mosquite clamps |
| HF surgical device ICC 300, Electrocautery | Erbe Elektromedizin Gmbh; Tübingen, Germany | 20132-043 | cautery, biopolar |
| MICRO HALSTED-MOSQUITO 100mm, curved | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | KL2187 | mosquite clamps |
| Micro steel needle holder straight 0,5mm, with spring lock | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | MN1324D | microsurgical needle holder |
| Microsurgical/watermaker tweezers LINZ 150mm 6" Ergo round handle | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | MN0087 | fine microsurgical forceps |
| needle holder Mayo-hegar,190 mm, 71/2" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | NH1255 | needle holder |
| Overhold Slimline Fig. 0 8 1/2" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | KL4400 | overholds |
| Sterile Gauze 10X10 | Paul HaRTMANN AG,Heidenheim, Germany | 401725 | sterile gauze |
| Suction tip OP-Flex Handpiece Yankauer | Pfm Medical AG, Köln, Germany | 33032182 | suction |
| surgical forceps Standard 5 3/4" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | PZ1260 | surgical forceps |
| surgical scissors standard pointed-blunt (thread/cloth scissors)175 mm, 7" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | SC1522 | surgical Scissors |
| Titanit vascular scissors POTTS-SMITH,185 mm, 71/4"60° | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | SC8562 | Pott scissors |
| Tunneling instrument | Marina Medical Instruments Inc,Davies,US | MM-TUN06025 | subcutaneous tunneling |
| Vessel loops | Medline International Germany GmbH,Kleve, Germany | VLMINB | hold and adjust the vessel |
| Wound spreaders Weitlander, Stump,110 mm, 41/4" | ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany | WH5210 | wound care |
| Further material | |||
| Heating pad | Eickemeyer - Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen, Germany | 648050 MHP-E1220 |
maintain body temperature during surgery |
| Laryngoscope, customized | Wittex GmbH, Simbach, Germany | 333222230 | expose the vocal cord |
| Rectal temperature probe | Asmuth Medizintechnik, Minden, Germany | ASD-RA4 | measure body temperature |
| Spray wound film | Mepro-Dr. Jaeger und Bergmann GmbH, Vechta, Germany | 2830 | keep sterile condition |
| Sterile organ bag | Raguse Gesellschaft für medizinische Produkte, Ascheberg, Germany | 800059 | organ preservation |
| swine jacket small, adult Landrasse swine 30-50kg, customized for Emka Telemetry and urinary catheterization | Lomir Biomedical Inc., United Kingdom | SS J1LAPMP | swine jackets to pretect implanted catheters and store urine bag |
| Ultrasound device, Sonosite Edge-II | FUJIFILM SonoSite GmbH, Frankfurt, Germany | V21822 | ultrasound and color Doppler |
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