Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61602
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1, 2,3, 1, 1, 2,3, 1, 1,4
1Université de Strasbourg, Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Summary

Vi beskriver her en protokoll for å karakterisere protein-protein interaksjoner mellom to svært forskjellige uttrykte proteiner i live Pseudomonas aeruginosa ved hjelp av FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stammer konstruksjoner, bakterier immobilisering, imaging og post-imaging dataanalyse rutiner.

Abstract

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i celler. Fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) kombinert med Förster resonans energioverføring (FRET) gir nøyaktig informasjon om PPIer i levende celler. FLIM-FRET er avhengig av å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av FLIM-bildet, og gir kvantitativ og nøyaktig informasjon om PPIer og deres romlige cellulære organisasjoner. Vi foreslår her en detaljert protokoll for FLIM-FRET målinger som vi brukte til å overvåke PPIer i live Pseudomonas aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner uttrykt med svært forskjellige kopinumre for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske trekk ved PPIer. Denne protokollen beskriver i detalj alle nødvendige trinn for PPI-karakterisering - fra bakterielle mutantkonstruksjoner opp til den endelige analysen ved hjelp av nylig utviklede verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for en enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data.

Introduction

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i cellene1. Rollene til PPIer varierer basert på proteinsammensetning, affinitetsfunksjoner og steder i cellene2. PPIer kan undersøkes via ulike teknikker3. For eksempel er co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust og billig teknikk som vanligvis brukes verktøy for å identifisere eller bekrefte PPIer. Det kan imidlertid være utfordrende å studere PPIer når de interagerende proteinene har lave uttrykksnivåer eller når interaksjonene er forbigående eller relevante bare i bestemte miljøer. Studere PPI forekommer mellom de forskjellige enzymer av pyoverdin banen i P. aeruginosa krever at undertrykkelse av den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet for å tillate uttrykk for alle proteiner av pyoverdin banen som skal uttrykkes i cellen4,5,6. Denne felles reguleringen for alle proteinene i banen resulterer i be stunduttrykk i cellen som forventes å fremme deres interaksjoner. Mangfoldet i størrelse, natur, uttrykksnivåer og antall proteiner av denne metabolske veien gjør det vanskelig for studier i rekonstituerte systemer6. Å utforske PPIer i deres cellulære miljø er derfor avgjørende for å forstå proteinenes biologiske funksjoner i sin opprinnelige sammenheng.

Bare få metoder, inkludert fluorescens tillater å utforske PPIer i levende celler7. Blant de forskjellige fluorescensparametrene som kan måles, er fluorescensens levetid (det vil si den gjennomsnittlige tiden en fluorofor forblir i sin opphissede tilstand før du sender ut et foton) sannsynligvis en av de mest interessante parametrene å utforske i levende celler. Fluorescensens levetid for en fluorofor er svært følsom for miljøet, og FLIM kan derfor gi kjemisk eller fysisk informasjon om fluoroforomgivelsene8. Dette inkluderer tilstedeværelsen av Förster resonans energioverføring (FRET) som kan oppstå i nærvær av en "acceptor" av fluorescens som ligger i kort avstand av en fluorescens "donor". Energioverføring resulterer i betydelig forkortelse av donorfluorescens levetid (figur 1A), noe som gjør Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en kraftig tilnærming til å utforske protein-proteininteraksjoner direkte i levende celler. FLIM kan i tillegg gi romlig informasjon om hvor interaksjonene finner sted i cellene7,8. Denne tilnærmingen er ekstremt kraftig for å undersøke PPIer i situasjoner der merking med fluoroforer av de to samhandlende partnerne er mulig.

For fret å skje - kritiske forhold på avstanden mellom to fluoroforer er nødvendig8,9. De to fluoroforene bør ikke være fjernt fra hverandre med mer enn 10 nm. Derfor må det tas advarsler når du utformer FLIM-FRET-eksperimenter for å sikre at donoren og akseptoren av fluorescens har en sjanse til å bli plassert nær hverandre i det interagerende komplekset. Selv om dette kan virke begrensende, er det faktisk en sann fordel som avstandsavhengighet av FRET sikrer at to merkede proteiner som gjennomgår FRET må fysisk samhandle (Figur 1A). Vanskelighetene med å få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis samhandle) er derfor ikke et problem ved hjelp av FLIM-FRET.

Figure 1
Figur 1: FLIM-FRET analyse prinsipp. Hver piksel av FLIM-FRET flerdimensjonalt bilde inneholder informasjon om fluorescensforfall registrert på dette stedet (#counts = antall oppdagede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske representasjonen av FLIM-bildet er vanligvis en falsk fargelevetid kodet 2D-bilde (venstre). En reduksjon i donorens gjennomsnittlige fluorescens levetid - sett av en endring i fargeskalaen - kan observeres i nærvær av FRET og er informativ om tilstedeværelsen av PPI-er i dette romlige området. (B)Overlapping mellom donorutslippsspekteret og akseptorabsorpsjonsspekteret er nødvendig for at FRET skal forekomme. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Et annet krav til FRET er at donorens utslippsspektrum og absorpsjonsspektraet til akseptoren skal overlappe8 (figur 1B). Fluorescens eksitasjon av donor bør være på bølgelengder som bidrar svært lite til direkte fluorescens eksitasjon av acceptor. Ikke alle kombinasjoner av fluoroforer er mulige, og vi anbefaler i tillegg å fortrinnsvis bruke donorer med monoexponential fluorescens forfall for å lette FLIM-FRETtolkninger 10. Flere par fluorescensproteiner oppfyller disse kravene, inkludert det populære eGFP-mCherry-paret11 (for en gjennomgang av paletten av tilgjengelig fluorescerende protein FRET-par se12,13).

FLIM-FRET gjør det mulig å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av et FLIM-bilde (figur 1A). Det finnes to hovedteknikker for å bestemme fluorescensens levetid som varierer i oppkjøp og analyse: frekvensdomene (FD)14 og tidsdomenet (TD). TD FLIM er mer utbredt og utføres ved hjelp av en pulserende belysning kombinert med ulike mulige deteksjonskonfigurasjoner, inkludert gating metoder15,strekkamera16 eller tidsrelrelert enkelt foton telling (TCSPC)teknikker 8. For både FD- og TD-teknikker måles ikke fluorescenslevetid direkte, men krever en analyse av de målte dataene for å estimere levetiden(e) eller tilstedeværelsen av interaksjoner. For TCSPC-teknikker er den mest brukte analysen avhengig av å montere forfallene med enkle eller multi eksponentielle funksjoner ved hjelp av minst firkantede iterative re-convolutions som minimerer den vektede summen av rester.

Til slutt kan FLIM-FRET utføres både ved hjelp av enkelt foton eller multiphoton eksitater. Den siste har flere fordeler som å redusere autofluorescence og fotoskader ut av fokalplanet. Multiphoton excitations tillater også en lengre eksitasjonsdybde hvis du arbeider i tykke 3D-prøver8. Tvert imot er enkelt foton eksitasjon vanligvis mer effektiv som to-foton absorpsjon tverrsnitt av fluorescerende proteiner er begrenset17.

Her foreslår vi en protokoll for FLIM-FRET målinger av PPI-er i live P. aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) uttrykt med svært forskjellige antall kopier for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske egenskaper ved PPIer. PvdA- og PvdL-proteiner er involvert i pyoverdinbiosyntese. PvdA er en L-ornitin N5-oksygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine fra L-ornitin ved hydroksylering (PvdA) og formylering (PvdF)18. PvdL er et ikke-ribosomalt peptidsyntese (NRPS) enzym bestående av fire moduler. Den første modulen katalyserer akylering av myristisk syre. Den andre modulen katalyserer aktiveringen av L-Glu og dens kondens til myristic-coA. Deretter kondenserer den tredje modulen en L-Tyr aminosyre som deretter isomerized i D-Tyr. Til slutt binder den fjerde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyre for å danne den acylaterte tripeptidE L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL er dermed ansvarlig for syntesen av de tre første aminosyrene i pyoverdinforløperen. Samspillet mellom PvdA-protein med PvdL er overraskende da PvdL, tvert imot PvdI og PvdJ, ikke har en modul som er spesifikk for L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine. Denne interaksjonen tyder på at alle enzymene som er ansvarlige for pyoverdinforløperbiosyntesen, er ordnet i store forbigående og dynamiske multi-enzymatiske komplekser19,20.

I denne rapporten forklarer vi i detalj hvordan man konstruerer bakteriestammene som uttrykker opprinnelig de to interagerende eGFP- og mCherry-merkede proteinene. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET-celleavbildning. Til slutt foreslår vi en trinnvis veiledning for bildeanalyse, inkludert et nylig utviklet verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data. Med denne rapporten ønsker vi å overbevise ikke bare eventyrlystne, men de fleste biologer om at FRET-FLIM er en tilgjengelig og kraftig teknikk som kan løse sine spørsmål om PPI direkte i det innfødte mobilmiljøet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruksjon

  1. Forsterke med to PCR (PCR1 og 3) DNA-sekvenser (bruk genomisk DNA av P. aeruginosa PAO1) av 700 basepar oppstrøms og nedstrøms av regionene som tilsvarer innsettingsstedet i P. aeruginosa genom med high-fidelity DNA polymerase. Legg til begrensningsområder i primere i blått og grønt, og legg til en overlappende sekvens med mCherry til primere i rødt (figur 2).
    1. For PvdA merket ved C-endestasjonen med eGFP, forsterk 700 bp-regionen oppstrøms i forhold til stoppkodonen av primerne i blått, og forsterke 700 bp nedstrøms regionen som inneholder stoppkodonen med primerne i grønt.
    2. For PvdL merket ved N-endestasjonen med mCherry, forsterke 700 bp-regionen oppstrøms til PvdL genet, inkludert startkodon, av primere i blått, og forsterke 700 bp nedstrøms regionen med primere i grønt.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over PCR strategi og plasmids konstruksjon som brukes til bygging av PvdA-mCherry. Se tekst for detaljer - pvdA koder et enzym involvert i biosyntesen til siderophore pyoverdin, en sekundær metabolitt involvert i jernoppkjøp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Forsterk eGFP-kodings-DNA (uten start og stopp kodoner) med primere i rødt med High-Fidelity DNA-polymerase.
  2. Rens PCR-produktene på en PCR-oppryddingskolonne (Materials tabell).
  3. Bland overlappende PCR-produkter i equimolar ratio og utfør en annen PCR ved hjelp av primere med begrensningssted som brukes til PCR 1 og 3 (grønn og blå i figur 2).
  4. Trekk PCR-produktet i agarose-1x TAE (Tris-Base Acetate EDTA pH 8.0) gel, kutt det tilsvarende båndet og trekk ut ampliconen med et PCR-oppryddingssett (Materialsekk).
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.
  5. Digest PCR amplicon og pEXG2 plasmid ved hjelp av tilsvarende begrensning enzymer21.
  6. Ligate plasmid og sett inn med T4 DNA ligase ved hjelp av 90 ng av plasmid og molekylært forhold 1:1 (plasmid:insert).
  7. Forvandle plasmider konstruksjon i kjemisk kompetente celler E. coli TOP10 celler ved å blande ligation produkt og 100 μL av TOP10. Inkuber den kompetente bakterien/plasmidblandingen på isen i 30 min før du fortsetter med et 42 °C varmesjokk i 60 s. Deretter legger du røret på is i 10 min.
  8. Tilsett 1 ml lysogeny buljong (LB) til bakteriene og inkuber ved 37 °C i 1 time.
  9. Plate 100 μL bakterier på LB agar som inneholder 15 μg / ml gentamicin.
  10. Inkuber over natten ved 37 °C.
  11. Screen tilstedeværelsen av innsatsen av kolonien PCR: fra en isolert transformant koloni, plukke opp et minutt mengde bakterier som skal legges til en PCR blanding som inneholder primere hybridisere på plasmid på en slik måte at tilstedeværelsen av amplicon kunne oppdages ved å kjøre produktet på en agarose gel (DNA polymerase). Fra samme koloni som brukes til PCR, overføre en liten mengde bakterier på en frisk plate som inneholder 15 μg / ml gentamicin som skal isoleres og brukes til plasmid ekstraksjon. Til slutt isolerer og renser du plasmiden (Materialsekk) og kontroller innsatsen ved å sekvensere.
  12. Oppbevar TOP10-bakteriene som inneholder plasmiden i LB med 20 % glyserol i 1,5 ml mikrorør ved -80 °C og den rensede plasmiden ved -20 °C i 1,5 ml rør.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her

2. Fluorescerende merkeinnsetting i det kromosomale genomet til P. aeruginosa (figur 3)

  1. Grow P. aeruginosa,TOP10 og E. coli hjelper bakterier, hver og en i 5 ml LB uten antibiotika ved 30 ° C under orbital risting overnatten 22. Generer fluorescerende tag innsetting i genomet til P. aeruginosa ved å overføre plasmid fra E. coli TOP10 til PAO1-stammen og integrere plasmiden i genomet ved homolog rekombinasjon. En annen overfartshendelse som eksponerer vektoren, genererer den tilsvarende mutanten.
  2. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600 nm)av bakteriekulturen og bland en lik mengde P. aeruginosa (500 μL, OD600 nm = 1,0) med E. coli TOP10 pEXG2 (500 μL, OD600 nm = 1,0) og E. coli HB101 pRK600 hjelper (500 μL, OD600 nm = 1,0) på 1,5 ml mikrorør.
  3. Sentrifuge 5 min ved 9300 x g for å pellet bakteriene.
    MERK: Nettbaserte verktøy kan brukes til å konvertere sentrifugal g-kraft til rotasjon per minutt (rpm) for å justere sentrifugehastigheten.
  4. Hold bakteriell pellet og kast supernatanten.
  5. Resuspend pellet inneholder bakterier i 50 μL lb.
  6. Plate et sted (~ 50 μL) av blandingen på midten av LB agar (forvarm ved 37 ° C) og inkuber 5 t ved 37 ° C.
  7. Skrap flekken med en steril inokulasjonssløyfe og resuspend i 1 ml LB.
  8. Plate 100 μL av denne bakterielle suspensjonen på LB agar som inneholder 10 μg/ml kloramfenikol for å eliminere E. coli (E. coli TOP10 pEXG2 og E. coli HB101 pRK600 hjelper er følsomme for kloramfenikol, men P. aeruginosa er naturlig motstandsdyktig) og 30 μg/ml gentamicin og inkubere 2 dager ved 37 °C.
  9. Resuspend en koloni i 1 ml LB og inkuber ved 37 ° C under orbital risting 4t.
  10. Sentrifuge 3 min ved 9300 x g og kast 950 μL supernatant. Resuspend pellet i 50 μL lb og isolere blandingen på LB agar som inneholder sukrose og uten NaCl.
  11. Inkuber over natten ved 30 °C.
  12. Spot isolerte kolonier på LB agar og LB agar som inneholder 15 mg / ml gentamicin for å kontrollere gentamicinfølsomheten.
  13. Kontroller eGFP- eller mCherry-innsettingen av PCR-kolonier (DNA-polymerase) og sekvensering ved hjelp av bestemte primere.

Figure 3
Figur 3: Protokoll for bygging av P. aeruginosa stammer ved fluorescerende tag innsetting. Se tekst for mer informasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Pyoverdin måling

  1. Dyrke bakterier i 5 ml LB ved 30 ° C under orbital risting over natten.
  2. Pellet bakterier ved sentrifugering, vask og vokse dem i 5 ml SM (Succinate Medium, sammensetning: 6 g∙L−1 K2HPO4, 3 g∙L−1 KH2PO4, 1 g∙L−1 (NH4)2 SO4, 0,2 g∙L L-1 MgSO4,7 H2O og 4 g∙L-1 natriumsuknatt med pH justert til 7,0 ved å tilsette NaOH) ved 30 °C under orbital risting over natten. SM er et jernberøvet medium - fraværet av jern vil aktivere uttrykket av proteinene i pyoverdinbanen som normalt undertrykkes i nærvær av jern.
  3. Mål OD600 nm og fortynne bakterier igjen i frisk SM medium ved OD600 nm = 0,1 og vokse dem ved 30 ° C under orbital risting over natten.
  4. Mål OD600 nm for å bestemme mengden bakterier i hver prøve.
  5. Forbered en kvarts cuvette som inneholder 100 μL P. aeruginosa kultur og komplett til 1 ml SM (900 μL). Forbered en kvarts cuvette som inneholder 1 ml SM medium (blank).
  6. Bruk et UV-synlig spektrofotometer, mål absorbansen på maksimalt absorpsjonstopp. Ved pH 7.0 vil maksimal absorpsjon av pyoverdin forekomme ved ~400 nm. Bestem pyoverdinkonsentrasjonen (apoform) i prøven ved hjelp av Øl-Lambert-loven ved hjelp av en molarutryddelseskoeffisient ved 400 nm e = 19 000 M-1∙cm-1.
    MERK: Pyoverdin kan kvantifiseres i absorpsjonsområdet fra ~0,1 til ~1 (avhengig av UV-synlig spektrofotometer) der absorbansen nesten øker med konsentrasjon.

4. Bakterier kultur og betingelser for celler å uttrykke PvdA, PvdL og PvdJ

  1. På dag 1, inokulere et rør med 5 ml LB fra riktig glyserol lager av bakterier og vokse bakterier over natten ved 30 ° C ved 200 rpm i en orbital shaker inkubator.
  2. På dag 2, pellet celler ved sentrifugering på 3000 x g i 3 min og kast supernatant.
  3. Resuspend cellene i 10 ml SM.
  4. Gjenta trinn 4.2-4.3 én gang og dyrke bakterier i SM over natten ved 30 °C 200 o/min.
  5. På dag 3 fortynner du 1/10 bakteriekulturen i frisk SM.
  6. Vokse fortynnede bakterier igjen over natten på samme forhold.
    MERK: Tilstedeværelsen av pyoverdin kan oppdages visuelt når den farger i gulgrønne de voksende mediene. Det viser at uttrykket av proteinene i pyoverdinbanen er aktivert og at enzymer av interesse uttrykkes i cellene.

5. Fremstilling av agarose pad (Figur 4)

  1. Plasser et mikroskopglasssklie på en flat horisontal overflate. Ordne to glass-lysbilder toppet med to lag med tape på hver side av den første lysbildet.
    MERK: Hold et 1-2 mm mellomrom mellom de tre justerte lysbildene for å hindre at den meleterte agarose til slutt sprer seg på lysbildene med tape.
  2. Pipette og hell en dråpe på 70 μL på 1% smeltet agarose på glass-slide. Legg til et fjerde lysbilde øverst for å flate agarosedråpen og trykk forsiktig ned. Vent litt.
  3. Ta av det øvre lysbildet og slipp med en pipette ca 3 μL bakterier i 3 til 4 flekker på forskjellige steder på agarose pad.
  4. Dekk med en mikroskopi glassdekslerlip (for eksempel en 22x22 mm #1,5 tykkelse).
    MERK: Flathet og tykkelse på dekkglassene er viktig for å arbeide med to-foton eksitater. Presisjonsdeksler med kontrollert jevn flathet og lav autofluorescence er vanligvis et godt valg.
  5. Fest dekkslippen med smeltet parafin for å forsegle dekkglasset på glassglideren. Start med å feste de fire hjørnene av dekkslippen.

Figure 4
Figur 4: Agarose pad forberedelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Bildebehandling med et to-foton mikroskopioppsett

MERK: Vi bruker et hjemmelaget to-foton eksitasjonsskanning invertert mikroskop med et 60x 1.2NA vann nedsenkingsmål som opererer i avskanningsoppsamlingsmodus. To-foton eksitasjon bølgelengde er satt til 930 nm. Den leveres av en Ti:Sapphire laser (80 MHz repetisjonshastighet, ≈ 70 fs pulsbredde) som arbeider ved 10-20 mW. Fluorescens fotoner ble samlet inn gjennom en 680 nm kort pass filter og en 525/50 nm band-pass filter før de ble rettet til en fiber-koblet skred fotodiode koblet til en tid-korrelert enkelt foton telling (TCSPC) modul. Mikroskopet er også utstyrt med en overføring fluorescens lampe. Flere FLIM-FRET-mikroskoper er nå kommersielt tilgjengelige, og mange bildefasiliteter er utstyrt med oppsett som kan utføre FLIM-FRET-målinger.

  1. Bruk fluorescenslampen til å fokusere målet på monolayer av bakterier i prøven og velg områder av interesse.
  2. Kontroller at eksitasjonslaserlukkeren er lukket og at det infrarøde lyset som kommer fra laseren er blokkert og ikke kommer inn i mikroskopet.
    Forsiktig: Forsiktig oppmerksomhet og konstant årvåkenhet bør gis arbeider med IR pulserende lasere som laserlyset ikke kan sees av øynene, men noen og selv forbigående direkte utstilling eller laser refleksjon kan være svært skadelig og skape irreversible øyeskader. Se de lokale lasersikkerhetsprosedyrene og -opplæringen før du bruker mikroskopioppsett.
  3. Plasser mikroskopisklien på scenen med dekkglassene vendt mot målet.
  4. Kontroller at lysrørlampen er PÅ.
  5. Drei filterkuertårnet for å velge eGFP-kuben og åpne lysrørslukkeren.
  6. Send fluorescenslyset mot mikroskopets okular.
    Forsiktig:Sørg for at passende filtre kastes i lysbanen for å kaste direkte eksitasjonslys som kommer fra lysrør som kan skade øynene.
  7. Fokuser målet på bakterier ved hjelp av mikroskopknappen.
  8. Velg et interesseområde i prøven ved å oversette den ved hjelp av joysticken som styrer det motoriserte stadiet
    MERK: Fokusering er lettere med svært fluorescerende prøve slik at fluorescensen kan ses direkte med øynene.
  9. Bytt eksitasjonen for 2PE laser for FLIM-FRET målinger.
  10. Send fluorescensutslippsbanen tilbake mot detektoren.
  11. Skru tilbake filterkubetårnet for å velge for den diktodiske kuben for 930 nm laseren.
  12. Sett laserkraften til 20 mW.
  13. Angi størrelsen på interesseområdet til 30 μm. Denne operasjonen justerer spenningen som drifter galvospeilene og definerer omfanget av bevegelsene deres (figur 5).
  14. Slå på detektoren og begynn å skanne prøven - start- og stoppknappene som styrer skanningen, kontrollerer også åpningen og lukkingen av laserlukkeren både av sikkerhetsmessige årsaker og for å begrense fotoblen av prøven (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Skjematisk representasjon av grensesnittet til mikroskopkontrollprogramvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Juster eventuelt fokuset ved å flytte mikroskopets fine fokusknapp litt.
  2. Velg synsfeltet for bildebehandling ved å flytte fint scenen fra datagrensesnittet. Dette kan gjøres på oppsettet ved å flytte korset på bildet i mikroskopkontrollprogramvaren (Figur 5) som vil definere det nye midten av bildet og trykke Flytt stage. Et godt synsfelt for oppkjøp tilsvarer et bilde med 10-30 immobile bakterier, alle riktig fokusert (alle bakterier er på samme plan). Hvis du er interessert i å trekke ut enkeltceller FLIM-FRET data, sørg for at bakterier er godt individualisert (bildesegmentering vil være mye enklere).
  3. Åpne SPCM-programvaren (kommersiell programvare for datainnsamling) og kontroller at fotonenes tellefrekvens ikke er for høy for å unngå opphopningseffekt som kan påvirke livstidsmålinger. Senk om nødvendig laserintensiteten for å holde fotontallet lav (rundt 1 % av laserrepetisjonsraten).
    MERK: Pile-Up-effekten beskriver effekten av fotoner som går tapt med høye fotonantallsrater på grunn av dødstiden til TCSPC-enhetene (Time Correlated Single Photon Counting). Hvis Pile-Up oppstår, blir den målte gjennomsnittlige levetiden kunstig kortere med muligens en ekstra kortere komponent som kan vises i forfallet på grunn av oversamplingen av de raskt emitterende fotonene.
  4. Juster anskaffelsesparametere, inkludert innhentingstiden (vanligvis 60 til 180 s er nødvendig for å samle nok fotoner).
  5. Trykk på Start-knappen og vent til oppkjøpet er fullført.
  6. Lagre dataene.
  7. Slutt å skanne prøven og slå av detektoren.
  8. Velg et annet synsfelt i eksempelet, og gjenta trinn 6.14-6.22 eller bilde et nytt mikroskopilysbilde ved å gjenta trinn 6.1-6.22.
    MERK: P. aeruginosa kan leve og dele i opptil 6-8 timer ved romtemperatur på agaroseputen (tilsvarende til slutt ~ 4 doblingstid ved 20 ° C). Ideelt sett må du ikke vente for lenge med å utføre FLIM-FRET-måling for å unngå å observere en pute som er helt dekket av bakterier.

7. Dataanalyse

Figure 6
Figur 6: Hovedpanelet i dataanalysevinduet til SPCImage-programvaren. Intensitetsbilde (blå boks), livstidsbilde (lilla boks), livstidshtogram (øverst til høyre), forfallskurve i valgt posisjon (grønn boks) og forfallsparametere i valgt posisjon (cyanboks) av et representativt PvdA-eGFP-forfall registrert i live P. aeruginosa ved hjelp av et bh SPC830-oppkjøpskort på et hjemmelaget Two-Photon Excitation-FLIM-FRET-oppsett. Den eksperimentelle forfallkurven til pikselen pekte i bildet ovenfor, dens mono eksponentielle passform (rød kurve) som dekonvoluterer forfallet fra sin beregnede instrumentelle responsfunksjon (grønn kurve) kan ses i det grønne panelet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Grunnleggende analyse
    1. Kjør SPCImage-programvaren.
    2. Importer den lagrede SPCM-filen. Intensitetsbildet vises på venstre øvre panel av programvaren ( Figur6 blå boks).
    3. Undersøk forfallskurvevinduet (Figur 6 grønn boks) som viser forfallsdataene som tilsvarer pikselen som er valgt i intensitetsbildet (Figur 6 blå boks). Fotonnumrene for hver gang kanalen vises som blå prikker og forfallets passform trekkes som en rød linje. Vær oppmerksom på at etter at du har lastet inn dataene, vises den lyseste pikselen på bildet. Flytt det blå korset over bildet for å undersøke piksler med lavere intensitet. Forfallsvinduet oppdateres automatisk ved hver nye pikselposisjon.
      MERK: Måling av instrumentell responsfunksjon (IRF) for et laserskanningssystem er svært vanskelig. En IRF beregnet fra den stigende kanten av fluorescensforfallkurvene i FLIM-dataene kan brukes til forfallsoverføring. Dette er alternativet som er gjort som standard i SPCimage (Figur 6 grønn kurve).
    4. Juster tilpasningsområdet ved å flytte start- og sluttkanalene på tilpasningsboksen (T1 og T2 i den grønne boksen). T1 bør starte på de første kanalene i den stigende forfallet og T2 definere den siste kanalen på slutten av forfallet og kan velges som en av de siste kanalene i forfallet med en rekke fotoner over fotonene teller offset (det vil si nivåene av fotoner telles før forfallet stiger).
    5. Velg hyllen ved å endre hylleverdien. Kurveforfallet integrerer fotontellingen av den valgte pikselen sammen med et område på i piksler rundt markørposisjonen som er definert av bin-parameteren (øke bining vil øke antall fotoner i forfallet og kan være nyttig for å nå fotonantallet som kreves for multieksponentielle modeller).
    6. Juster terskelverdien. Piksler som ikke har minst én kanal med en rekke fotoner høyere enn terskelverdien, inkluderes ikke i tilpasningsprosedyren. Selvfølgelig jo høyere antall piksler som passer, jo lenger analysen.
      MERK: FLIM-data kan inneholde et enormt antall piksler og tidskanaler. De siste versjonene av programvaren tillater bruk av GPU (Graphics Processor Unit) for å behandle et stort antall piksler parallelt, noe som reduserer behandlingstidene massivt. Det kan være interessant å justere binning og terskelparametere ved hjelp av bilder som tilsvarer bakterier konstruksjoner viser den laveste fluorescens intensitet (f.eks, med bakterielle stammer med de laveste uttrykksnivåer). Dette vil sikre at de relevante forfallene som er observert i disse prøvene, oppfyller filtreringskriteriene og vil bli inkludert i analysen. Disse parametrene kan deretter brukes til alle bilder.
    7. Juster om nødvendig forfallsparametrene (cyan boks). La skiftet variere, det meste av tiden scatter og offset kan festes til null hvis en titt på forfall funksjoner viser at deres bidrag er ubetydelig. Forskyvningen kan anslås å se på de første kanalene i forfallet - merk at avbildning i lang tid på grunn av lav fluorescens i prøven vanligvis resulterer i ikke-null forskyvning. Spredning skjer for det meste i tykke prøver og kan betraktes som ubetydelig ellers.
    8. Før du kjører passformen, velger du tilpasningsalgoritmen. Åpne vinduet algoritmeinnstillinger i Vis/skjul modellalternativer. Velg algoritmen for maksimal sannsynlighetsestimering (MLE) (figur 7A).
    9. Kjør tilpasningen av bildet ved å klikke Beregn | Forfallsmatrise. Når det er fullført, vises det livstidskodede FLIM-bildet i det totale bildepanelet (Figur 6 lilla boks).
      MERK: I forfallskurvevinduet (Figur 6 grønn boks) er det mulig å se levetidsverdien som tilsvarer hver piksel av bildet ved å flytte det blå korset.
      MERK: Hvis du vil behandle et stort antall lignende FLIM-datafiler automatisk, kan en satsvis behandlingsmodus brukes.
    10. Sjekk kvaliteten på passformen ser på rester (ideelt fordelt tilfeldig rundt 0) og en Chi kvadratverdi nær 1.
    11. Monterte data kan eksporteres i forskjellige formater. Hvis du vil eksportere filer i txt-filer, går du til | Eksporter. Velg Velg alle i vinduet Eksportalternativer (Figur 7B), og klikk deretter Eksporter.
    12. Endelig lagre analysefilen. Analysefiler lagres som *.img-filer og kan åpnes på nytt direkte i SPCImage.
      MERK: Spesielt tilfeller av ubalanserte donor/acceptor-mengder kan FLIM-FRET avsløre underpopulasjoner i en blanding av interagerende proteinkomplekser - spesielt når konsentrasjonene til de to partnerne er svært forskjellige, noe som resulterer i blandinger av komplekse og frie arter. Ikke-interagerende arter (preget av et forfall som ligner på donorens forfall) kan diskrimineres fra å samhandle de som antar en romlig invarians av donorens livstidskomponenter på tvers av datasettet. På samme måte kan ikke-stoichiometriske interagerende komplekser med enten flere givere eller mer akseptor av fluorescens dannes. Fluorescensforfallene av slike komplekser er vanligvis vanskelige å tolke. En FLIM diagram plot kan brukes til å gi kritisk informasjon om stoichiometry og binding modus av PPIer20,23. FLIM diagram plottet er en grafisk representasjon av den korteste levetid komponent som en funksjon av sin amplitude. Den kan brukes til å visualisere piksler med lignende forfall signaturer. For å trekke slike representasjoner må eksperimentell fluorescensforfall utstyres med en to eksponentiell modell. Følgende trinn kan være en veiledning gjennom denne prosessen.
    13. Start med å analysere dataene til donor bare konstruksjon. Det vil tillate å bestemme levetidsverdien til giveren. Ideelt sett måle denne verdien over flere bilder registrert under samme forhold som donor / acceptor konstruksjoner for å hente en robust levetid verdi for giveren.
    14. Når det er bestemt, passer fluorescensforfall av donor / acceptor konstruksjoner med en to-eksponentiell modell. I parameterboksen cyan decay (figur 6)setter du antall komponenter til 2. Løs t2(ps)-parameteren til den robuste levetidsverdien til giveren som ble bestemt i trinn 1, og merk av i boksen for å fikse denne parameteren.
      MERK: Det er viktig å fikse den langvarige levetiden τ2 for å begrense overmontering, for å forbedre montering konvergens, og for å oppnå mer pålitelige to eksponentielle passformparametere 24,25,26.
    15. Lagre *img-filen og eksporter data som *.asc-filer som i trinn 7.1.11.

Figure 7
Figur 7: (A) Algoritmeinnstillinger for montering av forfall med eksponentielle modeller. Velge MLE (algoritme med maksimal sannsynlighet eller maksimal sannsynlighetsestimering, MLE) som vinduet for alternativer for tilpasningsmodell og (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Avansert analyse av FLIM-bildene i R
    1. Installer R (https://cran.r-project.org) og RStudio (https://rstudio.com) om nødvendig.
    2. Åpne RStudio og opprett et nytt prosjekt.
    3. Flytt all analyse *.asc-fil i en mappe kalt "data" i prosjektets hovedmappe.
    4. Åpne en ny skriptfil (eller åpne det supplerende skriptet FLIM_analysis. R).
    5. Installer den dedikerte flimDiagRam-pakken for flim dataanalyse https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Ring pakken i arbeidsområdet. (Se varselet HowTo_FlimDiagRam)
      MERK: Installasjon av pakker må bare gjøres én gang. Når pakkene er installert, kan de kalles fra en ny R-økt. Nedlasting av R-pakker fra github krever installasjon av 'devtools'-pakken. Installasjonen av "devtools" kan ta flere minutter. FlimDiagRam-pakken kan brukes til å representere parametere og distribusjoner av FLIM-dataene, for å trekke ut FLIM-data på nivå med enkelt individualiserte celler, for å sammenligne FLIM-resultater på tvers av forhold eller belastninger og utforske FLIM-data ved hjelp av avanserte visualiseringsverktøy som FLIM-diagramplottet.
    6. Bruk den trinnvise kommenterte koden, og dataene gjøres tilgjengelige for selvstendig å gjengi alle undertallene som presenteres i delen Representative resultater nedenfor. Denne opplæringen finner du i varselet HowTo_FlimDiagRam på https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. Koden kan enkelt transponeres for å analysere dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Empiriske kumulative fordelingsfunksjoner (ecdf) av fluorescenslevetid målt for de forskjellige bakteriestammene er vist i figur 8. Hvis FRET oppstår, flyttes ecdfs mot kortere levetid (figur 8A,8B). Legg merke til at når samspillet mellom de to proteinene resulterer i lang avstand mellom de to fluoroforene, kan det ikke oppstå fret (figur 8C). Denne situasjonen kan ikke skilles fra fraværet av samhandling mellom de to partnerne i FLIM. Det er derfor viktig, når inter-fargestoff avstand ikke kan forutsies fra molekylære modeller eller kjente arkitekturer av komplekset, å vurdere merking proteiner på forskjellige posisjoner for å maksimere sjansene for å undersøke samspillet. På samme måte, på grunn av den store forskjellen i proteinuttrykk mellom PvdA (høyt uttrykt) og det ikke-ribosomale peptidsyntetase PvdL (få kopier per celler), resulterer ikke det samme PvdA/PvdL-komplekset i lignende FLIM-FRET-data. Faktisk kan ubalanserte stoichiometries komplisere tolkningen av FLIM-FRET-data. Avhengig av hvilket protein som er merket med donoren, fører ubalanserte stoichiometrier til forskjeller i bidraget til det frie sammenlignet med de bundne donormerkede proteinene i den registrerte fluorescensens levetidsfordeling (figur 8A,8B).

Figure 8
Figur 8: Illustrasjon av endringer som forekommer i donor gjennomsnittlig fluorescens livstidsfordeling som svar på FRET (enkelt eksponentiell modell). Representasjon av interaksjonene mellom PvdL (grå form) med PvdA (blå form) (A og B) eller PvdJ (gul form) (C) proteiner merket med eGFP (grønn) eller mCherry (rød) fluorescerende proteiner. De empiriske kumulative distribusjonsfunksjonene (lavere grafer) kan tydelig fremheve forskjellene mellom fluorescensens levetidsfordelinger. (A)I nærvær av et overskudd av PvdA merket med donor av fluorescens, er gjennomsnittlig levetidsfordeling av eGFP-donorer dominert av givere som ikke gjennomgår FRET, men også integrere levetiden til de få donorene som gjennomgår FRET med mCherry-PvdL. I dette tilfellet er levetidsfordelingen av blandingen (grønn-oransje kurve) nær levetidsfordelingen av den samme blandingen dannet med bare umerket PvdL (grønn kurve). (B)Hvis merkingsrekkefølgen endres og et overskudd av PvdA merket med akseptorer er til stede, er gjennomsnittlig levetidsfordeling styrt av overføringsartene, inkludert muligens donorer som gjennomgår FRET med flere akseptorer (oransje kurve). Denne fordelingen er derfor svært forskjellig fra det samme komplekset dannet med umerket PvdA (grønn kurve). (C)Hvis det ikke oppstår fret fordi proteiner ikke samhandler eller fordi interfargeavstanden er for stor i komplekset, er endringer i levetidsfordelingen nesten overliggende for donorens (sammenlign den lysegrønne kurven som tilsvarer fluorescensens levetidsfordeling av PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL med den grønne kurven som tilsvarer PvdJ-eGFP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Diagramplottet kan brukes til å gi kritisk informasjon om stoichiometry som vist i figur 9. I PvdA-eGFP/mCherry PvdL-muteringen er mengden donormerket PvdA mye høyere enn mengden mCherry PvdL. Blant alle givere som finnes i prøven, er det bare noen få av dem som samhandler med PvdL. I motsetning til den gjennomsnittlige FLIM-verdifordelingen gir FLIM-diagramplottet bare den spesifikke informasjonen i forfallskomponenten til donorene som gjennomgår FRET. I figur 9Akan en enkelt tau1-verdi sentrert på ~ 2,3 ns observeres, noe som representerer ca 30-40% av arten i blandingen. Enkelt tau1-verdien antyder at hver PvdA-eGFP-donor bare kan overføre med én mCherry PvdL-godkjenner.

Fra omvendt merking (PvdA-mCherry/ eGFP PvdL), forventes de fleste av eGFP PvdL-proteinene å samhandle med PvdA-mCherry, på grunn av det lave antallet PvdL sammenlignet med PvdA. Dette bekreftes av alpha1-verdiene som flyttes mot høyere verdier. Videre ble tau1-verdiene mye mer fordelt (figur 9B) med åpenbaring av kortvarige arter med levetid så lavt som ~ 1,5 ns. Dette tyder på at ytterligere overføringer oppstår i forhold til situasjonen i figur 9A og dermed at flere PvdA proteiner kan binde seg til en enkelt PvdL protein. Som et resultat, for hvert kompleks, vil eGFP levetid avhenge av antall og distribusjon av mCherry proteiner som eGFP overfører energi. Samlet sett tyder dataene på at hvert PvdL-protein kan samhandle med flere PvdA-proteiner

Figure 9
Figur 9: FLIM diagram plotter i tilfelle overkant av givere (A) eller akseptorer (B) og flere bindende nettsteder. FLIM-diagramplottet gir den spesifikke informasjonen i forfallskomponenten til donoren som gjennomgår FRET hentet ved hjelp av en to eksponentiell passform. I PvdA-eGFP/mCherry-PvdL mutant (A)observeres en enkelt tau1-verdi, og amplituden gitt av den spredte posisjonen til datapunktene på den horisontale aksen er informativ om populasjonen av givere engasjert i FRET. I PvdA-mCherry/eGFP-PvdL-systemet (B)er tau1-verdiene mye mer fordelt, noe som indikerer at ett PvdL-protein (grå form) kan samhandle med flere PvdA-proteiner (blå form). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FLIM-FRET gir noen viktige fordeler fremfor intensitetsbasert FRET-bildebehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter av fluorofor. Som en konsekvens er det ikke avhengig av lokale konsentrasjoner av fluoroforer heller ikke på intensiteten av lysutseelse. Fluorescensens levetid påvirkes også dårlig av fotobleking. Det er spesielt interessant å vise PPI-er i celler der lokale proteinkonsentrasjoner kan være svært heterogene i de subcellulære rommene eller regionene. FLIM-FRET er også interessant i alle situasjoner der konsentrasjonen av komplekset er lav fordi uttrykksnivåene av begge proteinene eller av et av proteinene er lave.

I sammenheng med PPIer er FRET-mekanismene som er ansvarlige for forkortelsen av levetiden, og derfor er informasjon om interaksjonens natur vanskelig å utlede med tanke på bare gjennomsnittlig levetid. Faktisk kan en forkortelse av gjennomsnittlig levetid skyldes en høy andel av artene som samhandler med moderat FRET, eller på motsatt side av en lav andel givere som samhandler på kort avstand med acceptor. Denne situasjonen er enda mer komplisert når komplekser med ubalanserte stoichiometries dannes. Grafiske visualiseringsverktøy som tillater representasjon av flere dimensjoner (når det gjelder diagramplottet tau1, alfa og ) kan være nyttig for å gi kritisk informasjon om arten av kompleksene som dannes. Alternative grafiske representasjoner av dataene, som phasor basert analyse27,28 foreslår en grafisk representasjon av rå FLIM data i en vektor plass, er også interessant i denne sammenhengen.

Å velge hvordan du skal tagge proteiner av interesse er et viktig punkt for vellykkede FLIM-FRET eksperimenter.   Mest kritisk, koder bør ikke endre eller endre samspillet mellom proteiner. Dessverre, bortsett fra i sjeldne tilfeller hvor strukturene i proteinene er kjent eller kan forutsies, er man i de fleste tilfeller tvunget til å prøve-og-feil tilnærminger. Tolkninger av FLIM-FRET i fravær av energioverføring har derfor alltid å vurdere muligheten for at etiketter kan endre samspillet. Av denne grunn kan FLIM-FRET ses som en bekreftende teknikk i den forstand at hvis en interaksjon observeres, bør den eksistere i fravær av etikett. Avhending av en ekstern funksjonell avlesning - som å kontrollere at produksjonen av pyoverdin av muterte stammer som uttrykker dobbelt merkede proteiner, ligner på ville typestammer - er spesielt nyttig for å tolke FLIM-FRET-resultater.

Bildebehandling er ikke en metode med høy gjennomstrømming for å oppdage PPIer og har så langt blitt utnyttet for å bekrefte mistenkte eller forventede PPIer. I denne bekreftende konteksten er det fornuftig å skyve analysen for å trekke ut fra dataene så mye informasjon som mulig for å få dypere forståelser av mekanismene som er involvert i PPI. Noen forsøk utføres29,30,31 for å slå FLIM-FRET oppsett tilpasset screening strategier. Utvikling av avansert lett tilgjengelig og automatisert analyse vil sikre muligheten til å behandle den store mengden data produsert av screeningmetoder med høy gjennomstrømning. I denne sammenheng kan tilpasningsprosedyrer ved hjelp av minst kvadratiske metoder som krever høy tellingsstatistikk, være dårlig tilpasset for å estimere FRET. En rekke alternative metoder er utviklet16,32, inkludert ikke-passende metoder (gjennomgått i Padilla-Parra et al. 2011 33). Disse metodene varierer i beregningshastighet, minimalt antall fotoner som kreves for riktig analyse, nøyaktighet, kompleksitet og type data som effektivt kan behandles. Teknikker som den minimale fraksjonen av interagerende donor34 eller phasor tilnærming35,36,37 har potensial til å utføre høyhastighets oppkjøp i FRET-FLIM og fortsatt være kvantitative for å behandle store mengder data eller til og med for å nå videohastighetshastigheter.

Kravet om å konstruere fluorescerende merket protein som ikke perturb de innfødte funksjonene til proteinene i celler er en stor bekymring for å skalere opp hastigheten og antall PPI utforsket. Alternative nye merkingsstrategier, for eksempel basert på fluorogene sonder med småmolekyler 38,kan 39 være en måte å omgå denne kritiske begrensningen på. Avhending av fluorescerende sonder som er kompatible med FLIM-FRET og i stand til å merke andre cellekomponenter (som nukleinsyrer eller membran) vil også utvide arten av interaksjonene FLIM-FRET kan karakterisere.

I en nær fremtid tror vi at det største gjennombruddet på FLIM-FRET-feltet vil skyldes innovasjon i databehandling. Metoder som komprimert sensing40 bør muliggjøre effektiv og nøyaktig rekonstruksjon av FLIM bilde fra sparsomme forfall data - muligens på raskere oppkjøpet rate som ville tillate å utføre sanntid FLIM-FRET på rask endring prosess. På samme måte vil maskinlæring brukt på FLIM-data om pikselklassifisering eller regresjon, denoising eller signalgjenoppretting tillate fremragende bilderekonstruksjon og analyse som ytterligere vil øke interessen for FRET-FLIM-metoder41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Dr Ludovic Richert for hans verdifulle hjelp til FLIM datainnsamling og for teknisk vedlikehold og utvikling av FLIM-oppsettet. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN er finansiert av Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM er takknemlig til Institut Universitaire de France (IUF) for støtte og gi ekstra tid til å være dedikert til forskning. IJS og JG anerkjenner Institute on Drug Delivery of Strasbourg for sin økonomiske støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
525/50 nm band-pass filter F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter F75-680, AHF, Germany
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL ThermoFisher Scientific EP0714
E. coli TOP10 Invitrogen C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm Knitel glass MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL ThermoFisher Scientific F530S
Lysogeny broth (LB) Millipore 1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) Sigma-Aldrich 10034-99-8
Microscope slides (25×75mm) Knitel glass MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.50
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel 740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Sodium Succinate (Disodium) Sigma-Aldrich 14160
SPCImage, SPCM software Becker & Hickl
Sterile inoculating loop Nunc 7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL ThermoFisher Scientific 15224017
TCSPC module SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL Falcon 352070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
  3. Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
  4. Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
  5. Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
  6. Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
  7. Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
  8. Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
  9. Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
  10. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
  11. Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
  12. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
  14. Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
  15. Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
  16. Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
  18. Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
  19. Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
  20. Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
  21. Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
  22. Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
  23. Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
  24. El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
  25. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
  26. Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
  27. Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  28. Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
  29. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
  31. Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
  32. Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
  33. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
  34. Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  35. Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
  36. Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
  37. Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
  38. Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, Elsevier Inc. (2013).
  39. Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
  40. Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
  41. Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
  42. Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).

Tags

Biologi Utgave 162 FRET-FLIM protein-protein interaksjoner Pseudomonas aeruginosa bakterier avbildning fluorescens
FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., … More

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y., Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.. J. Vis. Exp. (162), e61602, doi:10.3791/61602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter