Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

FLIM-FRET Mätningar av Protein-Protein interaktioner i levande bakterier.

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61602
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1, 2,3, 1, 1, 2,3, 1, 1,4
1Université de Strasbourg, Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Summary

Vi beskriver här ett protokoll för att karakterisera protein-protein interaktioner mellan två mycket-olika uttryckta proteiner i levande Pseudomonas aeruginosa med hjälp av FLIM-FRET mätningar. Protokollet omfattar bakteriestamkonstruktioner, bakteriemmobilisering, bildbehandling och dataanalysrutiner efter avbildning.

Abstract

Protein-protein interaktioner (protonpumpshämns) styr olika viktiga processer i celler. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) kombinerat med Förster resonansenergiöverföring (FRET) ger korrekt information om protonpumpshämmningar i levande celler. FLIM-FRET bygger på att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av FLIM bilden, vilket ger kvantitativ och korrekt information om protonpumpshämmmare och deras rumsliga cellulära organisationer. Vi föreslår här ett detaljerat protokoll för FLIM-FRET mätningar som vi tillämpas för att övervaka protonpumpshämma i levande Pseudomonas aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner uttryckt med mycket olika kopia nummer för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner av protonpumpshämmare. Detta protokoll beskriver i detalj alla nödvändiga steg för PPI-karakterisering - med utgångspunkt från bakteriell mutant konstruktioner upp till den slutliga analysen med hjälp av nyligen utvecklade verktyg som ger avancerade möjligheter visualisering för en enkel tolkning av komplexa FLIM-FRET data.

Introduction

Protein-protein interaktioner (protonpumpsh:er) styr olika viktiga processer i cellerna1. Rollerna för protonpumpshämmmare skiljer sig åt baserat på proteinsammansättning, affinitetsfunktioner och platser icellerna 2. Protonpumpshämmmare kan undersökas via olika tekniker3. Till exempel är co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust och billig teknik som vanligen används verktyg för att identifiera eller bekräfta protonpumpshämmningar. Att studera protonpumpshämnare kan dock vara utmanande när de interagerande proteinerna har låga uttrycksnivåer eller när interaktionerna är övergående eller endast relevanta i specifika miljöer. Studera protonpumpshämmningar som förekommer mellan de olika enzymer av pyoverdin vägen i P. aeruginosa kräver att förtrycket av den allmänna järn-co-factored förtryckande Fur är lättad att låta uttrycket av alla proteiner i pyoverdin väg som skall uttryckas icellen 4,5,6. Denna gemensamma förordning för alla proteiner i vägen resulterar i tid uttryck i cellen förväntas främja deras interaktioner. Mångfalden i term av storlek, natur, uttrycksnivåer och antalet proteiner av denna metaboliska väg gör det svårt att studera i rekonstituerade system6. Utforska protonpumpshämmmare i deras cellulära miljö är därför avgörande för att ytterligare förstå de biologiska funktionerna hos proteiner i sitt hemland sammanhang.

Endast få metoder inklusive fluorescens tillåter att utforska protonpumpshämns i levande celler7. Bland de olika fluorescens parametrar som kan mätas, fluorescens livstid (dvs. den genomsnittliga tiden en fluorophore kvar i sitt upphetsade tillstånd innan avger en foton) är sannolikt en av de mest intressanta parametrar att utforska i levande celler. Fluorescenslivslängden för en fluorofor är mycket känslig för sin miljö och FLIM kan därför ge kemisk eller fysikalisk information angående den fluorophoreomgivningen 8. Detta inkluderar förekomsten av Förster resonans energiöverföring (FRET) som kan uppstå i närvaro av en "acceptor" av fluorescens som ligger på ett kort avstånd av en fluorescens "givare". Energiöverföring resulterar i betydande förkortning av givaren fluorescens livstid (Figur 1A), vilket gör Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) en kraftfull metod för att utforska protein-protein interaktioner direkt i levande celler. FLIM kan dessutom ge rumslig information om var interaktionerna sker i cellerna7,8. Detta tillvägagångssätt är extremt kraftfullt för att undersöka protonpumpshämnare i situationer där märkning med fluoroforer hos de två samverkande partnerna är möjlig.

För FRET att inträffa - kritiska förhållanden på avståndet mellan två fluoroforer krävs8,9. De två fluoroforerna bör inte vara långt från varandra med mer än 10 nm. Därför måste försiktighetsåtgärder tas vid utformningen av FLIM-FRET-experiment för att säkerställa att givaren och accepteraren av fluorescens har en chans att vara placerade nära varandra i det samverkande komplexet. Även om detta kan tyckas begränsande, är det i själva verket en sann fördel som avstånd-beroende av FRET säkerställer att två märkta proteiner som genomgår FRET måste fysiskt interagera (Figur 1A). Svårigheterna att få tydliga svar om PPI i colocalization experiment (två colocalized proteiner kanske inte nödvändigtvis interagerar) är därför inte ett problem med hjälp av FLIM-FRET.

Figure 1
Figur 1: FLIM-FRET-analysprincip. Varje pixel av den flerdimensionella bilden FLIM-FRET innehåller information om fluorescensförfall som spelats in på just denna plats (#counts = antal upptäckta fotoner i kanalen t). (A) Den klassiska representationen av FLIM bilden är oftast en falsk-färg livstid kodad 2D bild (vänster). En minskning av givarens genomsnittliga fluorescenslivs livstid - vilket ses av en förändring i färgskalan - kan observeras i närvaro av FRET och är informativ om förekomsten av protonpumpshämmningar i detta rumsliga område. (B) Överlappning mellan givaremissionsspektrumet och acceptorabsorspekten är nödvändig för att FRET ska kunna inträffa. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Ett andra krav för FRET är att givarens emissionsspektrum och acceptorns absorptionsspektra ska överlappa8 (figur 1B). Fluorescensutexcitation av givaren bör vara på våglängder som bidrar mycket lite till direkt fluorescens excitation av acceptorn. Inte alla kombinationer av fluoroforer är möjliga och vi rekommenderar dessutom att företrädesvis använda givare med monoexponentiell fluorescens sönderfall för att underlätta FLIM-FRET tolkningar10. Flera par av fluorescens proteiner uppfyller dessa krav, inklusive den populära eGFP-mCherry par11 (för en översyn på paletten av tillgängliga fluorescerande protein FRET par se12,13).

FLIM-FRET gör det möjligt att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av en FLIM bild (Figur 1A). Det finns två stora tekniker för att bestämma fluorescens livstid som skiljer sig i förvärv och analys: frekvens-domän (FD)14 och time-domän (TD). TD FLIM är mer utbredd och utförs med hjälp av en pulsad belysning i kombination med olika möjliga detekteringskonfigurationer inklusive gating methods15, streak camera16 eller time-correlated single photon counting (TCSPC)techniques 8. För både FD- och TD-tekniker mäts inte fluorescenslivslängden direkt utan kräver en analys av de uppmätta data för att uppskatta livstid(arna) eller förekomsten av interaktioner. För TCSPC-tekniker bygger den mest använda analysen på att försära sönderfallen med enstaka eller multi exponentiella funktioner med hjälp av minst kvadratiska iterativa återkonvolutioner som minimerar den viktade summan av rester.

Slutligen kan FLIM-FRET utföras både med hjälp av enstaka foton- eller multifotonexciteringar. Den senaste har flera fördelar som att minska autofluorescens och photodamage ur fokalplanet. Multiphoton excitations tillåt också en längre excitation djup om arbetar i tjocka 3D-prover8. Tvärtom är enda foton excitation oftast effektivare som två-foton absorption tvärsnitt av fluorescerande proteiner är begränsade17.

Här föreslår vi ett protokoll för FLIM-FRET mätningar av protonpumpshämmningar i levande P. aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner (PvdA och PvdL) uttryckt med mycket olika antal kopior för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner i protonpumpshämtton. PvdA och PvdL proteiner är involverade i pyoverdine biosyntes. PvdA är en L-ornitin N5-oxygenas och syntetiserar L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine från L-ornitin genom hydroxylation (PvdA) och formylation (PvdF)18. PvdL är ett icke-ribosomal peptid syntes (NRPS) enzym som består av fyra moduler. Den första modulen katalyserar acylation av myristic syra. Den andra modulen katalyserar aktiveringen av L-Glu och dess kondens till den myristiska-coA. Sedan kondenserar den tredje modulen en L-Tyr aminosyra som sedan är omeriseras i D-Tyr. Slutligen binder den fjärde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyra för att bilda den acylated tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL är därmed ansvarig för syntesen av de tre första aminosyrorna av pyoverdin föregångaren. Interaktionen mellan PvdA-protein med PvdL är förvånande eftersom PvdL, tvärtom mot PvdI och PvdJ, inte bär en modul som är specifik för L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. Denna interaktion tyder på att alla enzymer som ansvarar för pyoverdin föregångaren biosyntesen är ordnade i stora övergående och dynamiska multi-enzymatiska komplex19,20.

I denna rapport förklarar vi i detalj hur man konstruerar bakteriestammarna uttrycker natively de två interagerande eGFP och mCherry märkta proteiner. Vi beskriver också provberedning och förutsättningar för effektiv FLIM-FRET-cellavbildning. Slutligen föreslår vi en steg-för-steg handledning för bildanalys inklusive ett nyligen utvecklat verktyg som ger avancerade visualiseringsmöjligheter för okomplicerad tolkning av komplexa FLIM-FRET-data. Med detta betänkande vill vi övertyga inte bara äventyrliga utan de flesta biologer att FRET-FLIM är en tillgänglig och kraftfull teknik kunna ta itu med sina frågor om protonpumpshämmmare direkt i den inhemska cellulära miljön.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruktion

  1. Förstärka genom två PCR (PCR1 och 3) DNA-sekvenserna (använd genomiskt DNA av P. aeruginosa PAO1) av de 700 basparen uppströms och nedströms av de regioner som motsvarar insättningsstället i P. aeruginosa genom med high-fidelity DNA-polymeras. Lägg till begränsningsplatser till primers i blått och grönt och lägg till en överlappande sekvens med mCherry till grundställen i rött (Bild 2).
    1. För PvdA märkt vid C-ändstationen med eGFP, förstärka 700 bp regionen uppströms i förhållande till stopp kodon av primers i blått, och förstärka 700 bp nedströms regionen som innehåller stopp kodon med primers i grönt.
    2. För PvdL märkt vid N-ändstationen med mCherry, förstärka 700 bp regionen uppströms till PvdL genen, inklusive start kodon, av primers i blått, och förstärka 700 bp nedströms regionen med primers i grönt.

Figure 2
Figur 2: Översikt över PCR strategi och plasmider konstruktion som används för byggandet av PvdA-mCherry. Se text för detaljer - pvdA kodar ett enzym som deltar i biosyntesen av siderophore pyoverdine, en sekundär metabolit som deltar i järn förvärv. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Förstärka eGFP-kodnings-DNA(utan start- och stoppkodon) med primers i rött med High-Fidelity DNA-polymeras.
  2. Rena PCR-produkterna på en PCR-renspalt (Table of Materials).
  3. Blanda överlappande PCR-produkter i ekviarförhållande och utför en andra PCR med hjälp av grund- och primrar med begränsningsplats som används för PCR 1 och 3 (grönt och blått i figur 2).
  4. Migrera PCR-produkten i Agarrose-1x TAE (Tris-Base Acetat EDTA pH 8.0) gel, kapa motsvarande band och extrahera amplikonen med en PCR clean up kit (Table of Materials).
    OBS: Protokollet kan pausas här.
  5. Digest PCR amplicon och pEXG2 plasmid med hjälp av motsvarande restriktionsenzym21.
  6. Ligate plasmid och infoga med T4 DNA ligase med hjälp av 90 ng av plasmid och molekylära förhållandet 1:1 (plasmid:insert).
  7. Förvandla plasmider konstruktion i kemiskt kompetenta celler E. coli TOP10 celler genom att blanda ligering produkt och 100 μL av TOP10. Inkubera den kompetenta bakterien/plasmidblandningen på is i 30 min innan du fortsätter med en 42 °C värmechock i 60 s. Sedan lägger du röret på is i 10 min.
  8. Tillsätt 1 mL lysogeny buljong (LB) till bakterierna och inkubera vid 37 °C i 1 h.
  9. Plate 100 μL bakterier på LB agar innehållande 15 μg/mL gentamicin.
  10. Inkubera över natten vid 37 °C.
  11. Skärm förekomsten av insatsen genom koloni PCR: från en isolerad transformant koloni, plocka upp en minut mängd bakterier som skall läggas till en PCR-blandning som innehåller primers hybridisering på plasmiden på ett sådant sätt att närvaron av amplicon kunde upptäckas genom att köra produkten på en agarosgel (DNA-polymeras). Från samma koloni som används för PCR överför du en liten mängd bakterier på en färsk platta innehållande 15 μg/mL gentamicin för att isoleras och användas för utvinning av plasmid. Slutligen, isolera och rena plasmid (Tabell of Materials) och verifiera insatsen genom sekvensering.
  12. Förvara TOP10-bakterier som innehåller plasmiden i LB med 20 % glycerol i 1,5 mL mikrorör vid -80 °C och den renade plasmiden vid -20 °C i 1,5 mL-rör.
    OBS: Protokollet kan pausas här

2. Lysrörstagsättning i kromosomgenomet av P. aeruginosa (figur 3)

  1. Odla P. aeruginosa, TOP10 och E. coli hjälpare bakterier, var och en i 5 mL lb utan antibiotika vid 30 °C under orbital skakar över natten22. Generera fluorescerande tag insättning i genomet av P. aeruginosa genom att överföra plasmid från E. coli TOP10 i PAO1 stammen och integrera plasmid i arvsmassan genom homolog rekombination. En andra korsning-over händelse excising vektorn generera motsvarande mutant.
  2. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600 nm) för bakteriekulturen och blanda en lika stor mängd P. aeruginosa (500 μL, OD600 nm = 1,0) med E. coli TOP10 pEXG2 (500 μL, OD600 nm = 1,0) och E. coli HB101 pRK600 helper (500 μL, OD600 nm = 1,0) i 1,5 mL mikrorör.
  3. Centrifugera 5 min vid 9 300 x g för att pelleta bakterierna.
    OBS: Onlineverktyg kan användas för att omvandla centrifugal g-kraft till rotation per minut (varvtal) för att justera centrifughastigheten.
  4. Behåll bakteriepelleten och kassera supernatanten.
  5. Resuspend pelleten som innehåller bakterier i 50 μL av LB.
  6. Platta en fläck (~50 μL) av blandningen på mitten av LB-agar (förvärma vid 37 °C) och inkubera 5 h vid 37 °C.
  7. Skrota platsen med en steril inokuleringsslinga och resuspend i 1 mL LB.
  8. Plate 100 μL av denna bakterie suspension på LB agar som innehåller 10 μg/mL kloramfenikol för att eliminera E. coli (E. coli TOP10 pEXG2 och E. coli HB101 pRK600 helper är känsliga för kloramfenikol men P. aeruginosa är naturligt resistenta) och 30 μg/mL gentamicin och inkubera 2 dagar vid 37 °C.
  9. Resuspend en koloni i 1 mL LB och inkubera vid 37 °C under omloppsbanor skakar 4h.
  10. Centrifugera 3 min vid 9 300 x g och kassera 950 μL supernatant. Resuspend pelleten i 50 μL lb och isolera blandningen på LB-agar som innehåller sackaros och utan NaCl.
  11. Inkubera över natten vid 30 °C.
  12. Spot isolerade kolonier på LB agar och LB agar som innehåller 15 mg/mL gentamicin för att kontrollera gentamicin känslighet.
  13. Verifiera infogningen eGFP eller mCherry genom PCR-kolonier (DNA-polymeras) och sekvensering med hjälp av specifika primers.

Figure 3
Figur 3: Protokoll för konstruktion av P. aeruginosa-stammar genom fluorescerande taginsättning. Se text för detaljer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

3. Pyoverdine mätning

  1. Odla bakterier i 5 mL lb vid 30 °C under omloppsbanor skakar över natten.
  2. Pelletbakterier genom centrifugering, tvätta och odla dem i 5 mL av SM (Succinate Medium, sammansättning: 6 g∙L−1 K2HPO4, 3 g∙L−1 KH2PO4, 1 g∙L−1 (NH4)2 SO4, 0.2 g∙L−1 MgSO4, 7 H2O och 4 g∙L−1 natriumsuccinat med pH justerat till 7,0 genom att lägga till NaOH) vid 30 °C under omloppsbanor som skakar över natten. SM är ett järn-berövat medium - avsaknaden av järn kommer att aktivera uttrycket av proteinerna i pyoverdinvägen som normalt förträngs i närvaro av järn.
  3. Mät OD600 nm och späd bakterier igen i färskt SM-medium vid OD600 nm = 0,1 och odla dem vid 30 °C under omloppsbanor om natten.
  4. Mät OD600 nm för att bestämma mängden bakterier i varje prov.
  5. Bered en kvarts cuvette innehållande 100 μL av P. aeruginosa kultur och komplett till 1 mL SM (900 μL). Förbered en kvarts cuvette som innehåller 1 mL SM medium (blank).
  6. Med hjälp av en UV-synlig spektrofotometer, mät absorbansen vid maximalt av absorptionstoppen. Vid pH 7,0 kommer den maximala absorptionen av pyoverdin att ske vid ~400 nm. Bestäm pyoverdinkoncentrationen (apo-form) i prov med hjälp av Beer-Lambert-lagen med hjälp av en molarutdöetisk extinktionskoefficient vid 400 nm e = 19 000 M-1∙cm-1.
    OBS: Pyoverdine kan kvantifieras i absorbansens spänna från ~0,1 till ~1 (beroende på UV-Synlig spektrofotometer) i vilken absorbansen linjärt ökar med koncentration.

4. Bakterieodling och villkor för att celler ska uttrycka PvdA, PvdL och PvdJ

  1. Dag 1, inokulera ett rör med 5 mL lb från lämpligt glycerollager av bakterier och odla bakterier över natten vid 30 °C vid 200 rpm i en orbital shaker inkubator.
  2. Dag 2, pelletceller genom centrifugering vid 3 000 x g i 3 min och kasserar supernatanten.
  3. Resuspend cellerna i 10 mL av SM.
  4. Upprepa steg 4.2-4.3 en gång och odla bakterier i SM över natten vid 30 °C 200 rpm.
  5. På dag 3, späd 1/10 bakteriekulturen i färsk SM.
  6. Växa utspädda bakterier igen över natten vid samma förhållanden.
    OBS: Förekomsten av pyoverdine kan detekteras visuellt eftersom det färger i gul-grön den växande media. Det visar att uttrycket av proteinerna i pyoverdinvägen har aktiverats och att enzymer av intresse uttrycks i cellerna.

5. Beredning av agarospad (figur 4)

  1. Placera ett mikroskop glas-slide på en plan horisontell yta. Ordna två glas-diabilder toppad med två lager av tejp på varje sida av den inledande bilden.
    OBS: Håll ett 1-2 mm utrymme mellan de tre justerade objektglasen för att förhindra att den meleterade agarosen till sprids på objektglasen med självhäftande tejp.
  2. Pipett och häll en droppe på 70 μL av 1% smält agaros på glas-slide. Lägg till en fjärde bild på toppen för att platta till agarosdropparet och tryck ner försiktigt. Vänta ungefär en minut.
  3. Ta av den övre bilden och släpp med en pipett ca 3 μL bakterier i 3 till 4 fläckar på olika platser på agarospaden.
  4. Täck med en mikroskopi glasöverdrag (till exempel en 22x22 mm #1,5 tjocklek).
    OBS: Planhet och tjocklek på täcken är viktiga för att arbeta med två-foton excitations. Precisionsskydd med kontrollerad jämn planhet och låg autofluorescens är oftast ett bra val.
  5. Fixera täcket med smält paraffin för att försegla täcket på glasrutschkanen. Börja med att fixera de fyra hörnen på täcket.

Figure 4
Bild 4: Agarospadpreparering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

6. Bildbehandling med en två-foton mikroskopi setup

OBS: Vi använder en hemgjord två-foton excitation scanning inverterad mikroskop med en 60x 1.2NA vatten nedsänkning mål som verkar i avskannade fluorescens insamling läge. Två-foton excitation våglängd är inställd på 930 nm. Den tillhandahålls av en Ti:Sapphire-laser (80 MHz repetitionshastighet, ≈ 70 fs pulsbredd) som arbetar vid 10-20 mW. Fluorescens fotoner samlades in genom en 680 nm kort passera filter och en 525/50 nm band-pass filter innan de riktas till en fiber-kopplade lavin foto-diod ansluten till en tid-korrelerade enda foton räkna (TCSPC) modul. Mikroskopet är också utrustat med en transmissionsfluorescenslampa. Flera FLIM-FRET mikroskop är nu kommersiellt tillgängliga och många bildbehandlingsanläggningar är utrustade med uppställningar kunna utföra FLIM-FRET mätningar.

  1. Använd fluorescenslampan för att fokusera målet på monolayer av bakterier i provet och välj regioner av intresse.
  2. Kontrollera att excitationslaserluckan är stängd och att det infraröda ljuset som kommer från lasern är blockerat och inte kommer in i mikroskopet.
    Försiktighet: Noggrann uppmärksamhet och ständig vaksamhet bör ges arbetar med IR pulsade lasrar som laserljuset inte kan ses av ögon men någon och även övergående direkt utläggning eller laser reflektion kan vara extremt skadliga och skapa oåterkalleliga ögat skador. Se de lokala lasersäkerhetsrutinerna och utbildningen innan du använder mikroskopiuppställningar.
  3. Placera mikroskopi bilden på scenen med coverslips inför målet.
  4. Kontrollera att fluorescenslampan är PÅ.
  5. Vrid filterkubtornet för att välja eGFP-kuben och öppna lysrörsavslutaren.
  6. Skicka fluorescensljuset mot okularet i mikroskopet.
    Varförsiktig : Se till att lämpliga filter slängs i ljusbanan för att kassera direkt excitationsljus som kommer från fluorescenslampan som kan skada ögonen.
  7. Fokusera målet på bakterier med hjälp av mikroskopvreden.
  8. Välj en region av intresse i provet genom att översätta det med hjälp av joysticken som styr den motoriserade scenen
    OBS: Fokusering är lättare med mycket fluorescerande prov gör att fluorescensen kan ses direkt med ögon.
  9. Växla excitationen för 2PE-lasern för FLIM-FRET-mätningar.
  10. Skicka fluorescensutsläppsvägen tillbaka mot detektorn.
  11. Vrid tillbaka filterkubtornet för att välja för den dichroiska kuben för 930 nm-lasern.
  12. Ställ in lasereffekten på 20 mW.
  13. Ställ in storleken på den region av intresse till 30 μm. Denna operation justerar spänningen som driver galvo-speglarna och definierar räckvidden för deras rörelser (Bild 5).
  14. Slå på detektor och börja skanna provet - start- och stoppknapparna som styr skanningen styr även öppningen och stängningen av laserluckan både av säkerhetsskäl och för att begränsa fotoblekningen av provet (Bild 5).

Figure 5
Figur 5: Schematisk representation av gränssnittet för mikroskopkontrollprogramvara. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Om det behövs, justera fokus genom att något flytta mikroskopet fina fokus ratten.
  2. Välj synfält för bildtagning genom att flytta fint scenen från datorns gränssnitt. Detta kan göras på inställningen genom att flytta korset på bilden i mikroskop styrprogramvaran (Bild 5) som kommer att definiera det nya mitten av bilden och trycka på Flytta scenen. Ett bra synfält för förvärv motsvarar en bild med 10-30 orörliga bakterier, alla korrekt fokuserade (alla bakterier är på samma plan). Om intresserad av att extrahera enstaka celler FLIM-FRET data, se till att bakterier är väl individualiserade (bild segmentering kommer att bli mycket enklare).
  3. Öppna PROGRAMVARAN SPCM (kommersiell programvara för datainsamling) och kontrollera att fotoner räkna ränta är inte för hög för att undvika pile-up effekt som kan påverka livstidsmätningar. Om det behövs, sänka ner laserintensiteten för att hålla fotonantal låg (runt 1% av laserrepetitionshastigheten).
    OBS: Pile-Up effekt beskriver effekterna av fotoner förlorade vid höga foton räkna priser på grund av dödtid av Time Korrelerade Single Photon Counting (TCSPC) enheter. Om Pile-Up inträffar blir den uppmätta genomsnittliga livstiden artificiellt kortare med eventuellt ytterligare en kortare komponent som kan dyka upp i sönderfallet på grund av översampling av de snabbt avgivande fotonerna.
  4. Justera förvärvsparametrar inklusive insamlingstiden för förvärv (normalt 60 s till 180 s krävs för att samla in tillräckligt med fotoner).
  5. Tryck på Start-knappen och vänta tills förvärvet har slutförts.
  6. Spara data.
  7. Sluta skanna provet och stäng av detektorn.
  8. Välj ett annat synfält i stickprov och upprepa steg 6.14-6.22 eller avbilda en ny mikroskopibild genom att upprepa steg 6.1-6.22.
    OBS: P. aeruginosa kan leva och dela upp till 6-8 timmar i rumstemperatur på agarospaden (motsvarande vid sista ~ 4 fördubblingstid vid 20 ° C). Helst vänta inte för länge med att utföra FLIM-FRET-mätning för att undvika att observera en pad helt täckt med bakterier.

7. Dataanalys

Figure 6
Bild 6: Huvudpanelen i dataanalysfönstret i SPCImage-programvaran. Intensitetsbild (blå ruta), livstidsbild (lila ruta), livstidshistogram (övre högra), sönderfallskurva vid vald position (grön ruta) och sönderfallsparametrar vid vald position (cyan-box) av ett representativt PvdA-eGFP-förfall som spelats in i live P. aeruginosa med hjälp av ett bh SPC830-förvärvskort på ett hembakat Two-Photon Excitation-FLIM-FRET-setup. Den experimentella sönderfallskurvan för pixeln pekade i ovanstående bild, dess mono-exponentiella passform (röd kurva) dekonvolutera sönderfallet från dess beräknade instrumentala svarsfunktion (grön kurva) kan ses i den gröna panelen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Grundläggande analys
    1. Kör SPCImage-programvaran.
    2. Importera den sparade SPCM-filen. Intensitetsbilden visas på den vänstra övre panelen av programvaran ( Bild6 blå ruta).
    3. Undersök fönstret för rötkurva (figur 6 grön ruta) som visar de sönderfallsdata som motsvarar den pixel som är vald i intensitetsbilden (Figur 6 blå ruta). Fotonnumren för varje gångkanal visas som blåa prickar och förfallets passning ritas som en röd linje. Observera att efter inläsning av data programvaran visar den ljusaste pixel av bilden. Flytta det blå korset över bilden för att undersöka pixlar med lägre intensitet. Förfallsfönstret kommer automatiskt att uppdateras vid varje ny pixelposition.
      OBS: Mätning av IRF-systemets instrumentala responsfunktion (Instrumental Response Function) är mycket svårt. En IRF beräknad från den stigande kanten av fluorescens förfall kurvor i FLIM data kan användas för sönderfall deconvolution. Detta är det alternativ som görs som standard i SPCimage (Bild 6 grön kurva).
    4. Justera inpassningsområdet genom att flytta monteringsboxens start- och slutkanaler (T1 och T2 i den gröna lådan). T1 bör börja vid de första kanalerna i den stigande förfall och T2 definiera den sista kanalen i slutet av förfall och kan väljas som en av de sista kanalerna i förfalla med ett antal fotoner ovanför fotoner räkna offset (dvs, nivåerna av fotoner räknas innan förfall stiger).
    5. Välj lagerplats genom att ändra lagerplatsvärdet. Kurvförfall integrerar fotonräkningen av den markerade pixeln tillsammans med ett område med i pixlar runt markörens position som definieras av bin-parametern (öka binning kommer att öka antalet fotoner i sönderfallet och kan vara till hjälp för att nå fotonen räknas som krävs för flera exponentiella modeller).
    6. Justera värdet Tröskelvärde. Pixlar som inte har minst en kanal med ett antal fotoner som är högre än tröskelvärdets värde kommer inte att ingå i passningsproceduren. Naturligtvis ju högre antalet pixlar för att passa, desto längre analys.
      OBS: FLIM-data kan innehålla enormt många pixlar och tidskanaler. De sista versionerna av programvaran tillåter att använda GPU (Graphics Processor Unit) för att bearbeta ett stort antal pixlar parallellt, vilket massivt minskar bearbetningstider. Det kan vara intressant att justera binning och tröskel parametrar med hjälp av bilder som motsvarar bakterier konstruktioner uppvisar den lägsta fluorescens intensitet (t.ex. med bakteriestammar med de lägsta uttrycksnivåerna). Detta kommer att säkerställa att de relevanta sönderfall som observerats i dessa prover kommer att uppfylla filtreringskriterierna och kommer att ingå i analysen. Dessa parametrar kan sedan användas för alla bilder.
    7. Justera vid behov sönderfallsparametrarna (cyanboxen). Låt skiftet variera, det mesta av tiden scatter och offset kan fastställas till noll om en titt på sönderfallsfunktionerna visar att deras bidrag är försumbar. Förskjutningen kan uppskattas titta på de första kanalerna i sönderfallet - observera att bildbehandling under lång tid på grund av låg fluorescens i provet vanligtvis resulterar i icke-noll förskjutning. Spridning sker mestadels i tjocka prover och kan anses försumbar annars.
    8. Innan du kör passformen, välj passande algoritm. Öppna fönstret för algoritminställningar i Visa/dölj modellalternativ. Välj MLE-algoritm (Maximum Likelihood Estimation) (bild 7A).
    9. Kör bildens passning genom att klicka på Beräkna | Decay-matris. När den är klar visas livstidskodade FLIM bilden i livstid bildpanelen (Bild 6 lila rutan).
      OBS: På fönstret för sönderfallskurvan (Bild 6 grön ruta) är det möjligt att se det livstidsvärde som motsvarar varje bildpunkt i bilden genom att flytta det blå korset.
      OBS: för att bearbeta ett stort antal liknande FLIM datafiler automatiskt, kan ett batch-bearbetningsläge användas.
    10. Kontrollera kvaliteten på passformen titta på rester (helst fördelas slumpmässigt runt 0) och en Chi kvadrat värde nära 1.
    11. Monterade data kan exporteras i olika format. Om du vill exportera filer i txt-filer går du till Fil | Exportera. I fönstret Exportera alternativ ( Bild7B) väljer du Markera alla och klickar sedan på Exportera.
    12. Slutligen spara analysfilen. Analysfiler sparas som *.img filer och kan öppnas igen direkt i SPCImage.
      OBS: I synnerhet fall av obalanserad givare/acceptormängder kan FLIM-FRET avslöja delpopulationer i en blandning av samverkande proteinkomplex - särskilt när koncentrationerna av de två partnerna är mycket olika, vilket därmed resulterar i blandningar av komplexa och fria arter. Icke-interagerande arter (kännetecknas av ett förfall mycket lik givaren endast förfall) kan diskrimineras från interagerande dem antar en rumslig invarians av givaren livstid komponenter över datamängden. På samma sätt kan icke-stökiometriska interagerande komplex med antingen fler givare eller mer acceptor av fluorescens bildas. Fluorescensförfallen av sådana komplex är oftast svåra att tolka. En FLIM-diagram plot kan användas för att ge kritisk information om stökiometri och bindningsläge avprotonpumpshämma 20,23. FLIM-diagrammets tomt är en grafisk representation av den kortaste livstidskomponenten som en funktion av sin amplitud. Den kan användas för att visualisera pixlar med liknande förfallssignaturer. För att dra sådana representationer måste experimentella fluorescensförfall utrustas med en två exponentiell modell. Följande steg kan vara en guide genom den här processen.
    13. Börja med att analysera data av givaren endast konstruktion. Det kommer att möjliggöra fastställande av givarens livstidsvärde. Helst mäta detta värde över flera bilder som registrerats i samma villkor som givaren / acceptor konstruktioner att hämta en robust livstid värde för givaren.
    14. När den väl bestämts, passa fluorescens sönderfall av givare / acceptor konstruktioner med en två-exponentiell modell. I parameterrutan cyan decay (Bild 6), ställer du in antalet komponenter till 2. Fix t2(ps) parameter till den robusta livstidsvärdet för givaren bestäms i steg 1 och markera rutan för att åtgärda den här parametern.
      OBS: Det är viktigt att fixa den långlivade livstid τ2 för att begränsa över-passande, för att förbättra passande konvergens, och att få mer tillförlitliga två-exponentiell passform parametrar24,25,26.
    15. Spara filen *img och exportera data som *.asc-filer som i steg 7.1.11.

Figure 7
Bild 7: (A) Algoritminställningar för montering av sönderfallen med exponentiella modeller. Välja MLE (maximal sannolikhet algoritm eller maximal sannolikhet uppskattning, MLE) som passar modell, och (B) exportalternativ fönster. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Avancerad analys av FLIM-bilderna i R
    1. Installera R (https://cran.r-project.org) och RStudio (https://rstudio.com) om det behövs.
    2. Öppna RStudio och skapa ett nytt projekt.
    3. Flytta all analys *.asc-fil i en mapp som heter "data" i projektets huvudmapp.
    4. Öppna en ny skriptfil (eller öppna den kompletterande skripten FLIM_analysis. R).
    5. Installera det dedikerade flimDiagRam-paketet för flim dataanalys https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Anropa paketet på arbetsytan. (Se meddelandet HowTo_FlimDiagRam)
      OBS: Installation av paket måste göras endast en gång. När paket har installerats kan de anropas från alla nya R-session. Ladda ner R-paket från github kräver att installera 'devtools' paket. Installationen av 'devtools' kan ta flera minuter. Den flimDiagRam paketet kan användas för att representera parametrar och distributioner av FLIM data, att extrahera FLIM data på nivån för enstaka individualiserade celler, att jämföra FLIM resultat över villkor eller stammar och att utforska FLIM data med hjälp av avancerade visualiseringsverktyg som FLIM diagram tomt.
    6. Använd den stegvisa kommenterade koden och uppgifterna görs tillgängliga för att självständigt återge alla de underfigurer som presenteras i avsnittet Representativa resultat nedan. Denna handledning finns i meddelandet HowTo_FlimDiagRam på https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. Koden kan lätt transponeras för att analysera data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Empiriska kumulativa fördelningsfunktioner (ecdf) av fluorescenslivstiderna mätt för de olika bakteriestammarna visas i figur 8. Om FRET förekommer förskjuts ecdfsna mot de kortare livslängderna (figur 8A,8B). Observera att när interaktionen mellan de två proteinerna resulterar i ett långt avstånd mellan de två fluoroforerna, kan ingen FRET förekomma (Bild 8C). Denna situation kan inte särskiljas från frånvaron av interaktion mellan de två partnerna i FLIM. Det är därför viktigt, när inter-dye avstånd inte kan förutsägas från molekylära modeller eller kända arkitekturer av komplexet, att överväga märkning av proteiner på olika positioner för att maximera chanserna att sondera interaktionen. På samma sätt leder samma PvdA-komplex inte till samma PvdA/PvdL-komplex på grund av den stora skillnaden i proteinuttryck mellan PvdA (högt uttryckt) och icke-ribosomal peptidsyntetas PvdL (få kopior per celler). I själva verket kan obalanserad stökiommetrier komplicera tolkningen av FLIM-FRET data. Beroende på vilket protein som är märkt med givaren leder obalanserade stökimetrier till skillnader i bidraget från det fria jämfört med de bundna givarmärkta proteinerna i den registrerade fluorescensens livstidsfördelning (Figur 8A,8B).

Figure 8
Figur 8: Illustration av förändringar som sker i givaren betyder fluorescens livstidsfördelning som svar på FRET (enda exponentiell modell). Framställning av interaktionerna av PvdL (grå form) med PvdA (blå form) (A och B) eller PvdJ (gul form) (C) proteiner märkta med eGFP (grön) eller mCherry (röda) fluorescerande proteiner. De empiriska kumulativa fördelningsfunktionerna (lägre grafer) kan tydligt belysa skillnaderna mellan livslängden för fluorescensfördelningar. (A) I närvaro av ett överskott av PvdA märkt med givaren av fluorescens, medelvärdet livstidsfördelning av eGFP givare domineras av givare som inte genomgår FRET men också integrera livstiden för de få givare som genomgår FRET med mCherry-PvdL. I denna situation är blandningens livstidsfördelning (grön-orange kurva) nära livstidsfördelningen för samma blandning som bildas med enbart omärkt PvdL (grön kurva). (B) Om märkningsordningen ändras och ett överskott av PvdA märkt med acceptorer förekommer, styrs medellivstidsfördelningen av den överlåtande arten, inklusive eventuellt donatorer som genomgår FRET med flera acceptorer (orange kurva). Denna fördelning skiljer sig därför mycket från samma komplex som bildas med omärkt PvdA (grön kurva). (C) Om ingen FRET uppstår på grund av att proteiner inte interagerar eller på grund av att mellanfärgningsavståndet är för stort i komplexet, är förändringarna i livstidsfördelningen nästan överlagbara med den för givaren enbart (jämför den ljusgröna kurvan som motsvarar den fluorescensiska livstidsfördelningen för PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL till den gröna kurva som motsvarar PvdJ-eGFP). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Diagramriten kan användas för att ge kritisk information om stökiometrin som ses i figur 9. I PvdA-eGFP/mCherry PvdL mutant, mängden givare-märkt PvdA är mycket högre än mängden mCherry PvdL. Bland alla givare som finns i provet, endast ett fåtal av dem interagerar med PvdL. I motsats till den genomsnittliga FLIM värdefördelning, FLIM diagrammet tomt ger endast den specifika information som ingår i förfall komponent av de givare som genomgår FRET. I figur 9A, ett enda tau1 värde centrerad på ~ 2,3 ns kan observeras, som representerar cirka 30-40% av arterna i blandningen. Den enda tau1 värde tyder på att varje PvdA-eGFP givaren kan endast överföra med en mCherry PvdL acceptor.

Från den omvända märkningen (PvdA-mCherry/eGFP PvdL) förväntas de flesta av eGFP PvdL-proteinerna interagera med PvdA-mCherry, på grund av det låga antalet PvdL jämfört med PvdA. Detta bekräftas av de alfa1-värden som förskjuts mot högre värden. Dessutom blev tau1-värdena mycket mer fördelade (Figur 9B) med uppenbarelse av kortlivade arter med livstider så låga som ~1,5 ns. Detta tyder på att ytterligare överföringar sker jämfört med situationen i figur 9A och därmed, att flera PvdA proteiner kan binda till ett enda PvdL protein. Som ett resultat, för varje komplex, eGFP livstid kommer att bero på antalet och fördelningen av mCherry proteiner som eGFP är att överföra energi. Sammantaget tyder data på att varje PvdL-protein kan interagera med flera PvdA-proteiner

Figure 9
Figur 9: FLIM-diagramdiagram vid överskjutande av donatorer (A) eller acceptorer (B) och flera bindningsplatser. Den FLIM diagram tomt ger den specifika informationen i sönderfall komponent av givaren genomgår FRET hämtas med hjälp av en två-exponentiell passform. I PvdA-eGFP/mCherry-PvdL mutant (A), en enda tau1 värde observeras och dess amplitud ges av spridda position av datapunkterna på den horisontella axeln är informativ om befolkningen av givare som bedriver FRET. I PvdA-mCherry/eGFP-PvdL-systemet (B) är tau1-värdena mycket mer fördelade, vilket indikerar att ett PvdL-protein (grå form) protein kan interagera med flera PvdA-proteiner (blå form). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FLIM-FRET erbjuder några viktiga fördelar jämfört med intensitetsbaserad FRET-avbildning. Fluorescens livstid är en inneboende parameter av fluorophore. Som en följd är det inte beroende av lokala koncentrationer av fluoroforer varken på intensiteten av ljuset excitation. Fluorescenslivslängden påverkas dessutom också dåligt av foto-blekning. Det är särskilt intressant att bevisa protonpumpshämtton i celler där lokala proteiner koncentrationer kan vara mycket heterogena i hela de subcellulära fack eller regioner. FLIM-FRET är också intressant i alla situationer där koncentrationen av komplex är låg eftersom uttrycksnivåerna för båda proteinerna eller av ett av proteinerna är låga.

I samband med protonpumpshämmningar är fretmekanismerna som ansvarar för förkortande av livstiden och därför är det svårt att sluta sig till att det endast är den genomsnittliga livslängden. En förkortning av den genomsnittliga livstiden kan bero på att en stor andel arter interagerar med måttlig fret, eller på motsatsen till en låg andel donatorer som interagerar på kort avstånd med acceptorn. Denna situation är ännu mer komplicerat när komplex med obalanserad stökiommetrier form. Grafiska visualiseringsverktyg som gör det möjligt att representation av flera dimensioner (i fallet med diagrammet tomten tau1, alfa och ) kan vara användbart för att ge kritisk information om arten av de komplex som form. Alternativa grafiska representationer av data, som phasor baserad analys27,28 föreslå en grafisk representation av den råa FLIM data i en vektor utrymme, är också intressant i detta sammanhang.

Att välja hur man taggar de proteiner av intresse är en viktig punkt för framgångsrika FLIM-FRET experiment.   Mest kritiskt, taggar bör inte ändra eller ändra samspelet mellan proteiner. Tyvärr, utom i sällsynta fall där strukturerna av proteinerna är kända eller kan förutsägas, i de flesta fall man är tvungen att trial-and-error metoder. Tolkningar av FLIM-FRET i avsaknad av energiöverföring har därför alltid att överväga möjligheten att etiketter kan förändra interaktionen. Av denna anledning kan FLIM-FRET ses som en bekräftande teknik i den meningen att om en interaktion observeras, bör den finnas i avsaknad av etikett. Att göra sig av med en extern funktionell avläsning - som att kontrollera att produktionen av pyoverdin av de muterade stammarna som uttrycker dubbelt märkta proteiner liknar vilda typstammar - är särskilt användbart för att tolka FLIM-FRET-resultat.

Avbildning är inte en metod med hög genomströmning för att upptäcka protonpumpshämmare och har hittills utnyttjats för att bekräfta misstänkta eller förutsedda protonpumpshämtton. I detta bekräftande sammanhang, driver analysen att extrahera från data så mycket information som möjligt är vettigt att få djupare förståelse för de mekanismer som är inblandade i PPI. Vissa försök utförs29, 30,31för att vända FLIM-FRET uppställningar anpassade till screening strategier. Utveckla avancerade lättillgängliga och automatiserade analyser kommer att säkerställa möjligheten att bearbeta den stora mängden data som produceras av hög genomströmning screeningmetoder. I detta sammanhang kan monteringsprocedurer med minst kvadratiska metoder som kräver statistik med höga antal vara dåligt anpassade till uppskattning av FRET. En mängd alternativa metoder har utvecklats16,32, inklusive icke-passande metoder (ses över i Padilla-Parra et al. 2011 33). Dessa metoder skiljer sig åt i beräkningshastighet, minimalt antal fotoner som krävs för korrekt analys, noggrannhet, komplexitet och typ av data som kan bearbetas effektivt. Tekniker som den minimala fraktionen av interagerandegivare 34 eller phasortillvägagångssätt 35,36,37 har potential att utföra hög hastighet förvärv i FRET–FLIM och fortfarande vara kvantitativa att bearbeta stor mängd data eller ens att nå video-rate hastigheter.

Kravet på att konstruera fluorescerande märkt protein som inte stör de inhemska funktionerna hos proteinerna i celler är ett stort bekymmer för att skala upp hastigheten och antalet PPI utforskas. Alternativa nya märkningsstrategier, som till exempel bygger på fluorogena småmolekylsonder 38,39 kan vara ett sätt att kringgå denna kritiska begränsning. Bortskaffande av fluorescerande sonder kompatibel med FLIM-FRET och kunna märka andra cellkomponenter (som nukleinsyror eller membran) kommer också att bredda arten av de interaktioner FLIM-FRET kan karakterisera.

I en nära framtid tror vi att det största genombrottet inom FLIM-FRET-området kommer att bli ett resultat av innovation inom databehandling. Metoder som komprimerad avkänning40 bör möjliggöra effektiv och korrekt rekonstruktion av FLIM bild från glesa förfall data - eventuellt påskynda ytterligare förvärvsfrekvensen som skulle göra det möjligt att utföra realtid FLIM-FRET på snabb föränderlig process. På samma sätt kommer maskininlärning tillämpas på FLIM data angående pixel klassificering eller regression, denoising eller signal restaurering gör det möjligt enastående bild rekonstruktion och analys som kommer att ytterligare öka intresset för FRET-FLIM metoder41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner Dr Ludovic Richert för hans värdefulla stöd på FLIM datainsamling och för tekniskt underhåll och utveckling av FLIM setup. Detta arbete finansierades genom bidrag från Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieras av Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM är tacksam mot Institut Universitaire de France (IUF) för stöd och ge ytterligare tid att ägnas åt forskning. IJS och JG erkänner institutet för narkotikaleveranser i Strasbourg för dess ekonomiska stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
525/50 nm band-pass filter F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter F75-680, AHF, Germany
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL ThermoFisher Scientific EP0714
E. coli TOP10 Invitrogen C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm Knitel glass MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL ThermoFisher Scientific F530S
Lysogeny broth (LB) Millipore 1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) Sigma-Aldrich 10034-99-8
Microscope slides (25×75mm) Knitel glass MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.50
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel 740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Sodium Succinate (Disodium) Sigma-Aldrich 14160
SPCImage, SPCM software Becker & Hickl
Sterile inoculating loop Nunc 7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL ThermoFisher Scientific 15224017
TCSPC module SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL Falcon 352070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
  3. Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
  4. Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
  5. Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
  6. Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
  7. Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
  8. Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
  9. Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
  10. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
  11. Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
  12. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
  14. Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
  15. Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
  16. Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
  18. Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
  19. Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
  20. Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
  21. Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
  22. Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
  23. Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
  24. El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
  25. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
  26. Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
  27. Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  28. Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
  29. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
  31. Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
  32. Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
  33. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
  34. Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  35. Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
  36. Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
  37. Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
  38. Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, Elsevier Inc. (2013).
  39. Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
  40. Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
  41. Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
  42. Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).

Tags

Biologi FRET-FLIM protein-protein interaktioner Pseudomonas aeruginosa bakterier avbildning fluorescens
FLIM-FRET Mätningar av Protein-Protein interaktioner i levande bakterier.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., … More

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y., Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.. J. Vis. Exp. (162), e61602, doi:10.3791/61602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter