Article de méthode

Protocole d’immunohistochimie et de distribution in situ de l’ARN au sein de l’embryon précoce de drosophile

DOI :

10.3791/61776

⸱

6 mai 2022

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1National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China/CGDB, Shaanxi Normal University College of Life Sciences, 2Shaanxi Key Laboratory of Ischemic Cardiovascular Disease, Shaanxi Key Laboratory of Brain disorders, Institute of Basic & Translational Medicine, Xi'an Medical University, 3Ohio State University College of Medicine, 4Hematology-Oncology Division, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 5University of Pennsylvania ULAR, 6University of Maryland School of Medicine, 7Columbia University Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole pour la détection et la localisation de la protéine embryonnaire et de l’ARN de la drosophile , de la collecte à la pré-intégration et à l’intégration, à l’immunocoloration et à l’hybridation in situ de l’ARNm.

Résumé

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La signalisation de libération de calcium induite par le calcium (CICR) joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques. Toutes les activités cellulaires, de la prolifération cellulaire et de l’apoptose, du développement et du vieillissement, à la plasticité synaptique neuronale et à la régénération, ont été associées aux récepteurs de la ryanodine (RyRs). Malgré l’importance de la signalisation calcique, le mécanisme exact de sa fonction au début du développement n’est pas clair. En tant qu’organisme à courte période gestationnelle, les embryons de Drosophila melanogaster sont des sujets d’étude de premier ordre pour étudier la distribution et la localisation des protéines associées au CICR et de leurs régulateurs au cours du développement. Cependant, en raison de leurs embryons riches en lipides et de leur chorion riche en chitine, leur utilité est limitée par la difficulté de monter des embryons sur des surfaces en verre. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pratique qui améliore considérablement l’attachement de l’embryon de drosophile sur des lames et des méthodes détaillées pour une histochimie, une immunohistochimie et une hybridation in situ réussies. La méthode de revêtement de lame de gélatine d’alun chromé et la méthode de pré-intégration d’embryons augmentent considérablement le rendement dans l’étude de la protéine embryonnaire de drosophile et de l’expression de l’ARN. Pour démontrer cette approche, nous avons étudié DmFKBP12 / Calstabin, un régulateur bien connu de RyR au début du développement embryonnaire de Drosophila melanogaster. Nous avons identifié DmFKBP12 dès le stade syncytial du blastoderme et rapporté le schéma d’expression dynamique de DmFKBP12 au cours du développement: d’abord en tant que protéine uniformément distribuée dans le blastoderme syncytial, puis en se localisant préalablement dans la couche inférieure du cortex pendant le blastoderme cellulaire, avant de se distribuer dans l’architecture neuronale primitive et de digestion pendant la phase à trois couches gemmes au début de la gastrulation. Cette distribution peut expliquer le rôle essentiel que joue RyR dans les systèmes d’organes vitaux qui proviennent de ces couches: le ganglion sous-œsophagien et supra-œsophagien, le système nerveux ventral et le système musculo-squelettique.

Introduction

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La signalisation de libération de calcium induite par le calcium (CICR) joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, tels que la fonction vasculaire squelettique / lisse et cardiaque, la prolifération cellulaire et l’apoptose, le développement, le vieillissement, la plasticité synaptique neuronale et la régénération1,2,3,4,5,6 . Les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) sont des acteurs majeurs de la voie de signalisation du calcium contrôlée par leurs régulateurs la protéine kinase A (PKA), la protéine kinase II dépendante de la Ca2+/calmoduline (CaMKII), les protéines de liaison FK506 (FKBPs), la calséquestrine (CSQ), la triadine et la junctine1,2,3,4,5,6 . Une expression humaine anormale et des mutations dans ces protéines peuvent entraîner une physiologie pathologique telle que des arythmies7 et une prolifération oncogène8,9.

Les FKBPs régulent la libération de calcium par le réticulaire endoplasmique (RE) par les RyRs. Ce processus est essentiel pour le mécanisme de contraction, et donc responsable de tout mouvement mécanique généré par la contraction de la myosine-actine par la libération de calcium induite par le calcium avec les RyRs1,2 embryonnaires. Dans les modèles murins, l’absence de RyR2 et de son régulateur FKBP12/Calstabin est invariablement mortelle, que ce soit pendant le développement embryonnaire ou au début de la période postnatale10,11,12. Les souris knock-out FKBP12/Calstabin présentent des malformations cardiaques critiques avec couplage excitation-contraction (EC) irrégulier et œdème cérébral au cours du développement embryonnaire. Cela indique que FKBP12/Calstabin joue un rôle essentiel dans la régulation de l’expression du canal RyR2, ce qui est important à la fois pour le développement cardiaque et cérébral10.

Des étincelles de calcium menées par RyR ont été initialement découvertes dans la phase de formation de zygotes d’œufs de Medaka fécondés13,14. Cependant, peu d’études ont été effectuées sur la fonction de la signalisation du calcium au début du développement embryonnaire. Chez Drosophila melanogaster, les résultats obtenus à partir de mutants DmFKBP12 S107 fournissent des preuves solides soutenant l’importance de ce gène pour le développement larvaire et une durée de vie saine, ce qui est attribué à sa fonction contre le stress oxydatif15,16. Récemment, nous avons identifié la localisation dynamique de la protéine FKBP12/Calstabin et de l’ARN messager au début du développement de Drosophila melanogaster17. En utilisant les approches décrites dans cette méthodologie, nous avons pu suivre l’expression de FKBP12/Calstabin chez D. melanogaster pendant le blastoderme syncytial (0-2 h), le blastoderme cellulaire (2-3 h), la gastrula précoce (3-12 h) et la gastrula tardive (12-24 h). Dans cet article, nous présentons les protocoles détaillés de chaque approche de l’étude précédente, y compris l’incorporation pré-embryonnaire pour la section classique de paraffine, le traitement de lame pré-revêtement pour les sections embryonnaires, la coloration histo-chimique et l’immunocoloration, et l’hybridation in situ de l’ARNm pour l’identification de l’expression génique.

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Protocole

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1. Préparation des assiettes de gélose à base de jus de raisin

  1. Ajouter 5 g de gélose et 5 g de saccharose à 150 mL d’eau distillée. Faites-le bouillir au micro-ondes jusqu’à ce que la gélose et le saccharose soient complètement dissous. Mélanger 50 mL de jus de raisin à 100% et la solution ensemble.
  2. Ajouter 1 mL d’acide propionique à 100 % pour obtenir la concentration finale à 0,5 % d’acide propionique. Verser 25 mL de la solution préparée dans chaque plaque. Une fois la gélose solidifiée, stocker le support à 4 °C.

2. Glissières de revêtement

  1. Prétraitez les glissières avec du détergent. Lavez les lames 3 fois avec de l’eau du robinet et une fois avec de l’eau distillée. Sécher ensuite les lames dans un four à 45 °C pendant 2 h.
  2. Immerger les lames dans environ 450 mL de solution d’acide sulfurique dichromate de potassium (20 g de dichromate de potassium, 40 mL d’eau distillée et 400 mL d’acide sulfurique concentré) pendant 24 heures. Lavez les lames 3 fois avec de l’eau du robinet et une fois avec de l’eau distillée.
    1. Sécher les lames dans un four à 45 °C pendant deux heures. Immerger dans de l’éthanol à 95% pendant plus de 2 h.
  3. Ajouter 0,5 g de sulfate de chrome et de potassium et 5 g de gélatine à 1 L d’eau distillée. Dissoudre au bain-marie à 60 °C avant utilisation. La gélatine d’alun chromé peut être conservée à 4 °C pendant de longues périodes.
  4. Déposer 10 μL de gélatine d’alun chromé sur la lame et couvrir complètement et uniformément toute la surface de la lame avec la solution. Placer la lame avec le côté gélatine vers le haut dans un four à 42 °C pendant 48 h. Les lames préparées peuvent être conservées à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Le revêtement complet est nécessaire. Pour la mouche des fruits et son embryon, cette approche de revêtement de lame semble plus efficace que l’enrobage de poly-lysine.

3. Intégration d’embryons de drosophiles

  1. Collecte d’embryons de drosophiles
    REMARQUE: Nous avons recueilli des embryons de drosophiles en quatre périodes de 0-2 heures (blastoderme syncytial), 2-3 heures (blastoderme cellulaire), 3-12 heures (gastrula précoce) et 12-24 heures (gastrula tardive)18. La proportion des principaux types d’embryons au cours de chaque période est indiquée dans le tableau 1.
    1. Placez 400 à 500 mouches dans une bouteille de collecte en plastique et couvrez la bouteille avec l’assiette de gélose au jus de raisin contenant de l’extrait de levure. Les embryons de drosophiles sont déposés sur la gélose à jus de raisin à température ambiante.
    2. Recueillir quatre périodes d’embryons, en ajoutant doucement 2 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) à chaque plaque pour faire flotter les embryons. Transférer environ 200 embryons dans un tube de centrifugeuse de 50 mL et le garder sur la glace pendant 2 minutes pour déposer les embryons.
  2. Pré-intégration
    1. Transférer 200 embryons de drosophiles dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Gardez le tube sur la glace pendant 2 minutes pour déposer les embryons, puis jetez soigneusement le surnageant avec une pipette. Ajouter 1 mL d’eau de Javel à 50 % dans le tube et agiter doucement pendant 2 min.
      REMARQUE: L’eau de Javel doit être préparée fraîche, et la quantité d’eau de Javel peut varier en fonction de la quantité d’embryons collectés.
    2. Recueillir doucement les embryons en les versant sur du papier filtre et les laver 3 fois avec 1 mL de PBS à chaque fois.
    3. Transférer les embryons avec du papier filtre à environ 5 mL de n-heptane.
    4. Transférer le mélange dans un tube de centrifugeuse frais de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de méthanol et agiter doucement. Prélever des embryons après sédimentation.
    5. Retirez le surnageant et lavez les embryons dans 1 mL de PBS 3 à 5 fois.
    6. Fixer les embryons avec 400 μL de solution de Bouin (71% d’acide picrique saturé, 24% de formol, 5% d’acide acétique) pendant 30 min. Lavez les embryons fixes 3 fois dans 1 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois.
    7. Pour agréger les embryons, transférez les échantillons dans un bouchon en caoutchouc et retirez le PBS.
    8. Préparer une solution d’agarose-PBS à 1,2 % et conserver la solution à 60 °C. Ajouter 200 μL de solution d’agarose-PBS à 1,2 % sur les embryons pour les fixer dans un bloc d’agar.
    9. Sortez le bloc du bouchon et stockez-le dans PBS.
      REMARQUE: Au cours de l’approche de pré-intégration, le pro-réchauffement est essentiel pour réussir. Nous suggérons fortement que les tubes de centrifugeuse et les embouts de micropipette, qui seront utilisés dans cette étape, soient complètement préchauffés avant de fonctionner.
  3. Intégration de paraffine
    1. Immergez le bloc de gélose préincorporé dans 35 % d’éthanol, 50 % d’éthanol, 75 % d’éthanol et 85 % d’éthanol pendant 15 min chacun. Puis tremper 2 fois dans 95% d’éthanol et 100% d’éthanol.
      NOTES: Environ 5-10x de volume de bloc de chacun suivi d’un fixateur gradué pendant 15-30 minutes est nécessaire en fonction du nombre d’embryons dans le bloc.
    2. Immerger le bloc embryonnaire dans une solution d’éthanol et de xylène à 100% (rapport 1:1) pendant 15 min.
    3. Transférer le bloc au xylène pendant 1 min pour rendre le tissu embryonnaire transparent.
    4. Immergez le bloc dans du xylène et de la paraffine (rapport 1:1) pendant 30 min.
    5. Immergez le bloc dans la paraffine I, la paraffine II et la paraffine III pendant 2 h à chaque fois.
    6. Remplissez la boîte d’intégration avec de la paraffine au préalable, puis transférez doucement et horizontalement le bloc dans le fond de la boîte d’intégration. Une fois que la paraffine s’est solidifiée naturellement, le bloc de paraffine solidifié peut être stocké à 4 °C.
      REMARQUES: L’échantillon pré-intégré peut être utilisé en cryosection en suivant les étapes suivantes. Une fois que les embryons sont pré-incorporés avec de l’agarose comme décrit ci-dessus, les échantillons sont simplement incorporés dans le composé OCT. Ensuite, la cryosection peut être effectuée selon le protocole de cryosection de routine. Par la suite, des approches de coloration régulières peuvent être utilisées sur les sections.

4. Coloration à l’hématoxyline-éosine

  1. Préparer des coupes d’embryons de drosophiles . Placer les sections préparées dans un four à 60 °C pendant 15 min, puis immerger les sections dans du xylène 2 fois pendant 10 min chacune. Immergez les sections une fois dans de l’éthanol et du xylène à 100% (rapport 1:1) pendant 2 min.
  2. Hydrater les sections dans 100% d’éthanol I, 100% d’éthanol II, 95% d’éthanol, 85% d’éthanol, 75% d’éthanol, 50% d’éthanol et dans de l’eau distillée pendant 3 min.
  3. Tacher les sections avec une solution d’hématoxyline pendant 2 min. Tremper les lames dans une solution d’alcool acide à 1 % (1 mL d’acide chlorhydrique, 100 mL d’éthanol à 70 %) rapidement et laver les lames dans de l’eau distillée.
  4. Trempez les lames dans 50% d’éthanol, 75% d’éthanol, 85% d’éthanol et 95% d’éthanol séquentiellement.
  5. Tacher les sections avec une solution d’éosine pendant 1 min.
  6. Déshydrater les lames en 95% éthanol I, 95% éthanol II, 95% éthanol III, 100% éthanol I, 100% éthanol II et 100% éthanol III pendant 1 min à chaque fois.
  7. Dégagez les lames en 100% xylène I, 100% xylène II et 100% xylène III pendant 5 min à chaque fois.
  8. Montez les glissières avec du baume neutre conformément aux instructions du fabricant.

5. Coloration périodique acide-argent à la méthénamine

  1. Déparaffiniser et hydrater les sections de paraffine de l’embryon de drosophile en eau distillée.
  2. Oxyder les sections dans 1% d’acide périodique pendant 15 min à température ambiante.
  3. Rincez les lames à l’eau distillée 3 fois pendant 1 min chacune.
  4. Incuber les lames dans environ 40 mL de solution de travail de méthénamine d’argent fraîchement filtrée (3% de méthénamine, 5% de nitrate d’argent, 5% de solution de borate de sodium) pendant 1 h et 20 minutes à 60 °C. Rincez ensuite les lames à l’eau distillée pendant 1 min.
  5. Tonifiez les lames avec du chlorure d’or à 0,2 % pendant 2 min, puis rincez les lames à l’eau distillée pendant 1 min.
  6. Placer les lames dans du thiosulfate de sodium à 3 % pendant 3 min, puis rincer les lames à l’eau distillée pendant 1 min.
  7. Contre-tache les lames dans l’hématoxyline pendant 30 s. Lavez les glissières à l’eau courante du robinet pendant 3 à 5 minutes.
  8. Déshydratez les lames en 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 95 % d’éthanol I, 95 % d’éthanol II, 95 % d’éthanol III, 100 % d’éthanol I et 100 % d’éthanol II pendant 5 min chacune.
  9. Dégagez les lames en 100% xylène I, 100% xylène II et 100% xylène III pendant 5 min chacune.
  10. Montez les glissières dans du baume neutre conformément aux instructions du fabricant.

6. Immunohistochimie

  1. Déparaffiniser et réhydrater des sections de paraffine de l’embryon de drosophile en PBS en suivant le protocole standard19.
  2. Traiter les lames avec 0,3% de H2O2 dans du méthanol pendant 10 min à température ambiante et éviter la lumière.
  3. Préchauffer le tampon de récupération d’antigène approprié à environ 100 °C dans un récipient avec les glissières dans le cuiseur à vapeur de légumes. Le récipient doit également avoir un couvercle. Placez les diapositives dans le conteneur. Fermez le couvercle du cuiseur à vapeur.
    1. Conservez le récipient dans le cuiseur à vapeur pendant 20 minutes à partir de ce point. Notez que le couvercle du récipient coulissant ne doit pas être entièrement serré afin que la vapeur d’eau puisse pénétrer pendant le processus de cuisson à la vapeur.
  4. Laissez les lames revenir à la température ambiante avant de les rincer doucement dans PBS-T (PBS avec Tween-20, pH 7,2) 3 fois pendant 5 min chacune, puis rincez les lames dans PBS 3 fois pendant 1 min chacune.
  5. Bloquez les lames avec 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS pendant 60 min à température ambiante.
  6. Incuber les lames avec un anticorps primaire (anti-FKBP12 à 1:1000) pendant la nuit à 4 °C ou à température ambiante pendant 4 h.
  7. Lavez les lames en PBS-T 4 fois pendant 5 minutes chacune.
  8. Appliquer les lames avec un polymère marqué HRP conjugué avec des anticorps secondaires (anti-Lapin, 1:5 000) pendant 90 min à température ambiante. Faites-le dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des photos.
  9. Lavez les lames en PBS-T 3 fois pendant 5 minutes chacune.
  10. Incuber les lames avec 5% de 3,3'-diaminobenzidine-tétrachlorhydrate (DAB) pendant 2 à 10 min jusqu’à ce que la couleur des produits de réaction soit appropriée au microscope.
  11. Contre-maintenir les lames dans l’hématoxyline pendant 30 s et laver les lames dans de l’eau distillée 2 fois pendant 5 min chacune.
  12. Déshydratez les lames en 50% d’éthanol, 70% d’éthanol, 90% d’éthanol, 95% d’éthanol et 100% d’éthanol pendant 1 min chacune.
  13. Dégagez les lames en 100% xylène I, 100% xylène II et 100% xylène III pendant 5 min chacune.
  14. Montez les glissières dans du baume neutre conformément aux instructions du fabricant.

7. Hybridation in situ

REMARQUE: Les coupes d’embryons de drosophiles ont été préparées avec de l’eau traitée à 0,01% de pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). Tous les accessoires utilisés pour l’hybridation in situ appliquent le traitement DEPC pendant la nuit à l’avance.

  1. Préparation de riboprobe
    1. Linéariser l’ADN modèle en coupant à un site enzymatique de restriction en aval de l’insert cloné à l’aide d’une enzyme de restriction qui crée des surplombs de 5'. Après linéarisation, purifier l’ADN modèle par extraction phénol/chloroforme et précipitation ultérieure d’éthanol. Utilisez des protocoles standard.
    2. Ajouter 1 μg d’ADN modèle purifié dans un tube de centrifugeuse sans RNase. Placez le tube de centrifugeuse sur de la glace. Ajouter suffisamment d’eau traitée au DEPC au volume total de 13 μL.
      1. Ajoutez ensuite les réactifs suivants dans l’ordre : 2 μL de 10x mélange de marquage NTP, 2 μL de 10x tampon de transcription, 1 μL d’inhibiteur protecteur de la RNase, 2 μL d’ARN polymérase SP6 ou d’ARN polymérase T7.
    3. Mélanger la réaction par pipetage et centrifuger rapidement. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
      REMARQUE: Des incubations plus longues n’augmentent pas le rendement en ARN marqué. Une rotation courte (~800 tr/min) appliquée sur le tube de réaction est essentielle avant de passer à l’étape suivante. Ce spin permettra à tout le contenu, qui pourrait générer à partir de l’incubation, de venir au fond du tube.
    4. Ajouter 2 μL de DNase I sans RNase pour éliminer l’ADN modèle et incuber pendant 15 min à 37 °C.
    5. Ajouter 2 μL de 200 mM d’EDTA (pH 8,0) pour arrêter la réaction.
      REMARQUE: Les sondes d’ARN marquées DIG peuvent être stockées à -15 à -25 ° C dans de l’éthanol pendant un an.
  2. Pré-hybridation de la section d’embryons de drosophiles
    1. Placer des sections d’embryon de drosophile dans un four à 42 °C pendant 48 h.
    2. Déparaffinez les lames dans du xylène à 100% pendant 10 min deux fois.
    3. Hydrater les lames en les immergeant séquentiellement dans 100% d’éthanol, 95% d’éthanol, 90% d’éthanol, 70% d’éthanol et 50% d’éthanol pendant 5 min.
    4. Incuber les lames dans du PBS pendant 5 min 3 fois pour retirer la solution fixatrice/solution de Bouin du tissu.
    5. Lavez les lames avec une solution de glycine/PBS de 100 mmol/L 2 fois pendant 5 min chacune.
    6. Lavez les diapositives avec PBS 2 fois pendant 5 minutes chacune.
    7. Incuber les lames avec 0,3% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min pour perméabiliser les membranes.
    8. Lavez les diapositives avec PBS 3 fois pendant 5 minutes chacune.
    9. Incuber les lames dans 15 μg/mL de protéinase K sans RNase pendant 30 minutes à 37 °C.
    10. Incuber les lames avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 3 min pour arrêter la digestion.
    11. Lavez les diapositives avec PBS 2 fois pendant 5 minutes chacune.
    12. Incuber les lames dans un tampon de triéthanolamine de 100 mM (pH 8,0) avec de l’anhydride acétique à 0,25 % (v/v) 2 fois pendant 5 min chacune.
    13. Ajouter de l’eau DEPC dans la chambre d’humidité de la glissière. Ajouter 20 μL de solution de pré-hybridation (contenant 100 μg/mL d’ADN de spermatozoïdes de saumon) sur les lames. Placez les glissières dans la chambre d’humidité de la glissière. Incuber les lames à 42 °C pendant 4 h.
      REMARQUE: Il est nécessaire de s’assurer de l’étanchéité du couvercle de la boîte humide et que la boîte humide est toujours maintenue dans une horizontale pour éviter la volatilisation et la déviation du tissu de la solution de pré-hybridation et de la solution d’hybridation suivie.
  3. Hybridation de la section d’embryons de drosophiles
    1. Retirer la solution de pré-hybridation et laver les lames avec 0,2x SSC (150 mM de chlorure de sodium, 15 mM de citrate de sodium, pH 7,0) 3 fois pendant 5 min chacune. Essuyez l’excès de 0,2x SSC autour des échantillons de tissus.
    2. Appliquer 30 μL de solution d’hybridation de sonde (contenant 2 à 6 ng de sonde d’ARN marquée à la digoxine en diluant dans une solution de pré-hybridation) avec une pipette. Incuber les lames dans la chambre d’humidité à glissière à 42 °C pendant environ 20 h.
      REMARQUE: Assurez-vous de l’étanchéité du capuchon comme suggestion de la dernière note. Sinon, l’assèchement causé par la fuite de pré-hybridation ou de pré-hybridation générera un arrière-plan sale, y compris pseudo-positif dans les diapositives.
  4. Hybridation
    1. Retirez la solution d’hybridation et lavez les lames avec 4x solution SSC 4 fois pendant 15 min chacune à 37 °C.
    2. Laver les lames dans une solution 2x SSC avec 20 μg/mL de RNase A pendant 30 min à 37 °C.
    3. Lavez les lames dans 1x solution SSC pendant 15 min à 37 °C.
    4. Laver les lames dans une solution de SSC 0,5x pendant 15 min à 37 °C.
    5. Laver les lames dans une solution de SSC 0,1x pendant 15 min à 37 °C.
    6. Lavez les diapositives avec PBS 3 fois pendant 5 minutes chacune.
    7. Laver les lames dans un tampon de lavage (100 mM d’acide maléique, 150 mM de NaCl, 0,3 % (v/v) Tween 20, pH 7,5) pendant 1 min.
    8. Incuber les lames dans 100 mL de solution bloquante fraîchement préparée (2% de sérum de mouton dans un tampon d’acide maléique sans Tween 20) pendant 30 minutes.
    9. Incuber les lames dans 20 mL de solution d’anticorps pendant 45 minutes.
      1. Centrifugez l’anticorps pendant 5 min à 10 000 tr/min dans le flacon d’origine avant chaque utilisation, et pipetez soigneusement la quantité nécessaire à partir de la surface. Diluer l’anti-digoxigénine-AP 1:5000 (150 mU/mL) dans une solution bloquante.
    10. Lavez les lames dans 100 mL de tampon de lavage 2 fois pendant 15 minutes chacune pour éliminer le conjugué d’anticorps non lié.
    11. Équilibrez les lames dans 20 mL de tampon de détection (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) pendant 2-5 min.
    12. Incuber les lames avec 10 mL de solution de substrat de couleur fraîchement préparée dans la chambre d’humidité de la glissière. La réaction commence en quelques minutes et est terminée après 16 h. Ne pas secouer ou mélanger pendant que la couleur se développe.
    13. Laver les lames avec 50 mL d’eau distillée pendant 5 min pour arrêter la réaction.
    14. Sécher l’échantillon pendant la nuit dans l’obscurité.
    15. Déshydratez les lames en 70% d’éthanol, 80% d’éthanol, 90% d’éthanol, 95% d’éthanol, 100% d’éthanol I et 100% d’éthanol II pendant 3 min chacune.
    16. Dégagez les lames en 100% xylène I, 100% xylène II et 100% xylène III pendant 20 min chacune.
    17. Montez les toboggans avec du baume neutre.
    18. Documentez les images et analysez-les avec la microscopie inversée et le logiciel du fabricant. Effectuer une analyse de la distribution à l’aide d’ImageJ en fonction de la densité du signal positif, soit le long de l’axe longitudinal, soit dans la zone différentielle des embryons.
      REMARQUE: Pendant l’incubation avec la solution de substrat de couleur fraîchement préparée à l’étape 7.4.12, la couleur de réaction peut être vue même à l’œil nu. Cette observation sur la façon dont le développement des couleurs peut être inspecté sous stéréoscope. Une fois que la couleur de réaction est raisonnable et que l’étape 7.4.13 peut être effectuée pour arrêter la réaction.

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Résultats

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Les figures décrivent les protocoles utilisés pour surmonter le défi de fixer des embryons de chorion à haute teneur en lipides et en chitine (tableau 1) à la surface de la lame de verre pour examen et expérimentation. En utilisant la méthode de revêtement de lames de gélatine d’alun chromé illustrée à la figure 1, nous avons amélioré la fixation des embryons de drosophiles à la surface des lames, tandis que la méthode de pré-incorporation d’embryons illust...

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Discussion

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La signalisation calcique médiée par les RyRs et les IP3R est une voie fondamentale dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des animaux vertébrés et invertébrés1,2,3,4. Chez l’homme, des mutations ponctuelles, telles que la mutation R4496C associée à la CPVT, dans le gène RyR2 entraînent une fuite de calcium du réticulum sarcoplasmique du cardiomyocyte, entraînant un dysfonct...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (#31771377 / 31571273 / 31371256), le programme de scientifique distingué étranger du ministère national de l’Éducation (#MS2014SXSF038), le Fonds de recherche des universités centrales du ministère national de l’Éducation (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45), et XZ est soutenu par le Fonds de thèse de doctorat exceptionnelle (#2019TS082 / 2019TS079), le programme clé du département de l’éducation provinciale du Shaanxi (#20JS138), le projet jeunesse du programme de recherche fondamentale en sciences naturelles du département provincial des sciences et de la technologie du Shaanxi (#2020JQ-885).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
-20° ; C RéfrigérateurMeiling Biologie & MédicalDW-YL270Utilisé pour le stockage régent-80
° ; C Réfrigérateur à ultra basse températureSérie ThermoForma 90Utilisé pour le stockage régent
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPréparation de plaques de gélose au jus de raisin
Anti-Digoxigénine-AP, Fragments FabRoche11093274910Pour la détection de composés marqués à la digoxigénine
Incubateur biochimiqueShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybridation
Solution de BouinRéactif chimique Sinopharm à Pékin69945460Centrifugeuse d’enrobage d’embryons de drosophile
Eppendorf540BH07808In-situ
Hybridation Tube à centrifugerDenvilleC-2170Collection d’embryons de drosophile
Chrome AlunSinopharm Réactif chimique à Lamesde revêtement10001018
Bain d’eau à température constanteJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCColoration à l’hématoxyline-éosine, immunohistochimie, hybridation in situ et coloration périodique à l’acide-argent méthénamine
Dako REAL Système de détection EnVisionDakoK5007Dans une réaction immunohistochimique ou une réaction d’hybridation in situ, il se lie à l’anticorps antigène primaire et la cible est marquée par coloration.
DEPCSigma-AldrichD5758d’hybridation in situ
RocheMarquage del’ARN 11093274910 avec diagoxigénine-UTP par transcription in vitro avec ARN polymérase SP6 et T7
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664Les stocks de Drosophila melanogaster mutant
Four de séchage électriqueTianjin Taiste Instruments101-0ABPour le revêtement des lames et l’incorporation de paraffine
EosinSigma-Aldrich230251Coloration à l’hématoxyline-éosine
Réactif chimique à l’éthanol Sinopharm à Pékin100092680l’enrobage de paraffine, la coloration à l’hématoxyline-éosine, l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et la coloration périodique à l’acide-argent et à la
méthénamineGélatineSinopharm Réactif chimique à Pékin10010328Lames de revêtement Chlorure
d’or Sigma-Aldrich379948Coloration périodique à l’acide-argent méthénamine
HématoxylineSigma-AldrichH3136Coloration à l’hématoxyline-éosine Kit de
purification de produit PCR haute puretéRoche11732668001Pour la purification des produits PCR
Boîte intelligente à température et humidité constantesNingbo Jiangnan InstrumentsHWS Pour l’entretien des mouches
LE AgaroseHyAgarose14190108029Pré-intégration du
méthanolSinopharm Réactif chimique à Pékin10014108Drosophila
Embryo Collection MicroscopeZEISSObserver.A1Coloration à l’hématoxyline-éosine, immunohistochimie, hybridation in situ et coloration périodique à l’acide-argent
Lames de microscopeMeVid Labware ManufacturingP105-2001Lames de revêtement
Gomme neutre Réactifchimique Sinopharm à Pékin10004160Coloration à l’hématoxyline-éosine Réactif
N-heptaneSinopharm à Pékin40026768embryon de drosophile Collection
Trancheuse de paroffineHuahai instrument scientifiqueHH-2508IIIem>In-situ Hybridation
ParaffineSinopharm Réactif chimique à Pékin69019461Paraffine
Intégration pH/mV MètreSartoriusPB-10Pour déterminer la valeur du pH d’une solution Nitrate d’argent
Sinopharm Réactif chimique à Pékin10018461Colorant périodique à l’acide et à l’argent
d’eau ultra-pureThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybridation
XylèneSinopharm à Pékin10023418Enrobage de paraffine
de Pékin Kit de marquage de l’ARN DIG chimique< Compteur Réactif chimique

Références

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  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
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Mots-clés

Hybridation in situHistochimieRev tement de lamesInclusion d embryonsDistribution des prot inesExpression de l ARNLocalisation de FKBP12Signalisation calcique

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