Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

يساهم ميكروفون الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر في الفوعة في بروتينات الغشاء الخارجي في السالمونيلا المعوية

Published: January 27, 2021 doi: 10.3791/61808
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2, 3, 1,2
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

تم استخدام نظام إعادة التركيب بوساطة λ-Red لإنشاء متحولة حذف لميكروفون RNA صغير غير مشفر.

Abstract

يعد الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNA) عاملا جديدا لتنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ. يمكن لنوع من sRNA MicC ، المعروف في الإشريكية القولونية والسالمونيلا التيفيموريوم ، قمع التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي. لمزيد من التحقيق في وظيفة تنظيم micC في Salmonella Enteritidis ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis 50336 ، ثم قمنا ببناء micC المتحور 50336Δ بواسطة نظام إعادة التركيب القائم على λ Red والطافر المكمل 50336Δ micC / p micC الذي يحمل البلازميد المؤتلف pBR322 الذي يعبر عن micC. أظهرت نتائج qRT-PCR أن نسخ ompD في 50336Δ micC كان أعلى بمقدار 1.3 مرة من ذلك في سلالة النوع البري ، في حين أن نسخ ompA و ompC في 50336ΔmicC كان أعلى بمقدار 2.2 ضعف و 3 أضعاف من تلك الموجودة في سلالة النوع البري. أشارت هذه إلى أن micC يقمع تعبير ompA و ompC. في الدراسة التالية ، تم الكشف عن إمراضية 50336ΔmicC من قبل كل من الفئران المصابة Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع والدجاج البالغ من العمر 1 يوم. أظهرت النتائج أن LD 50 من سلالة النوع البري 50336 ، والطافرات 50336Δ micC و 50336Δ micC / pmicC للفئران Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع كانت 12.59 CFU و 5.01 CFU و 19.95 CFU على التوالي. كانت LD 50 من سلالات الدجاج البالغ من العمر يوما واحدا 1.13 × 109 CFU و 1.55 × 10 8 CFU و2.54 × 10 8 CFU ، على التوالي. وأشارت إلى أن حذف الميكروفون يعزز ضراوة S. Enteritidis في الفئران والدجاج عن طريق تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي.

Introduction

يبلغ طول الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNAs) 40-400 نيوكليوتيدات ، والتي لا تشفر البروتينات بشكل عام ولكن يمكن نسخها بشكل مستقل في الكروموسومات البكتيرية1،2،3. يتم تشفير معظم sRNAs في المناطق بين الجينات (IGRs) بين مناطق ترميز الجينات وتتفاعل مع mRNAs المستهدفة من خلال إجراءات إقران القواعد ، وتنظم التعبير الجيني المستهدف على مستوى ما بعد النسخ 4,5. يلعبون أدوارا تنظيمية مهمة في استقلاب المواد ، وتخليق بروتين الغشاء الخارجي ، واستشعار النصاب ، والتعبير الجيني للفوعة5.

MicC عبارة عن نسخة صغيرة من الحمض النووي الريبي مكونة من 109 نيوكليوتيد موجودة في الإشريكية القولونية والسالمونيلا المعوية المصلية التيفيموريوم ، والتي يمكن أن تنظم تعبير بروتين الغشاء الخارجي المتعدد مثل OmpC و OmpD و OmpN و Omp35 و Omp366،7،8،9. ينظم MicC التعبير عن OmpC عن طريق تثبيط ارتباط الريبوسوم بزعيم ompC mRNA في المختبر ويتطلب مرافقة Hfq RNA لوظيفته في الإشريكية القولونية6. في السالمونيلا التيفيموريوم ، يسكت MicC ompD mRNA عبر ازدواج الحمض النووي الريبي ≤12-bp داخل تسلسل الترميز (الكودونات 23-26) ثم يزعزع استقرار mRNA7 داخل النوكلية. يتم مساعدة عملية التنظيم هذه بواسطة بروتين المرافق Hfq10. OmpC هو بروتين غشاء خارجي وفير كان يعتقد أنه مهم في البيئات التي كانت فيها تركيزات المغذيات والسموم عالية ، كما هو الحال في الأمعاء6. بورين OmpD هو بروتين الغشاء الخارجي الأكثر وفرة في السالمونيلا التيفيموريوم ويمثل حوالي 1 ٪ من إجمالي بروتين الخلية11. يشارك OmpD في الالتزام بالبلاعم البشرية والخلايا الظهارية المعوية12. يقوم MicC أيضا بقمع التعبير عن كل من OmpC و OmpD porins. ويعتقد أن MicC قد ينظم الفوعة. لاستكشاف الجينات المستهدفة الجديدة التي ينظمها MicC ودراسة وظيفة تنظيم الفوعة ل micC ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis (SE) 50336 ، ثم قمنا ببناء الطافر 50336ΔmicC والطافر المكمل 50336ΔmicC / p micC. تم فحص الجينات المستهدفة الجديدة بواسطة qRT-PCR. تم الكشف عن ضراوة 50336ΔmicC من قبل الفئران والتهابات الدجاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المجلس القومي للبحوث. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة يانغتشو على جميع التجارب والإجراءات المطبقة على الحيوانات (SYXK2016-0020).

1. السلالات البكتيرية والبلازميدات وظروف الثقافة

  1. استخدم البكتيريا والبلازميدات المدرجة في الجدول 1.
  2. استزرع البكتيريا في مرق LB أو على ألواح أجار LB عند 37 درجة مئوية ، في وجود 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين (Amp) عند الاقتضاء.
  3. تستخدم سلالات الاستزراع التي تحتوي على بلازميدات حساسة لدرجة الحرارة لحذف البناء الطافر عند 30 درجة مئوية.

2. استنساخ جين micC من S. سلالة الأمعاء 50336

  1. استنادا إلى تسلسل المنبع والمصب لجين micC ل S. سلالة التيفيموريوم SL1344 ، تصميم الاشعال vmicC-F و vmicC-R لتضخيم جزء يحتوي على جين micC بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي SE50336 كقالب.
  2. امزج 5 ميكرولتر من 10x PCR العازلة للتفاعل ، 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 mM) ، 1 ميكرولتر من بادئات vmicC-F و vmicC-R ، على التوالي ، 5 ميكرولتر من القالب ، 1 ميكرولتر من Taq DNA polymerase و 35 ميكرولتر من ddH2O معا لتفاعل البوليميراز المتسلسل.
  3. استخدم شروط تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 53 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 25 دورة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. تسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على تسلسل جين micC .

3. بناء متحولة حذف micC

ملاحظة: تم إنشاء متحور الميكروفون السلبي لسلالة السالمونيلا المعوية 50336 باستخدام إعادة التركيب بوساطة λ-Red كما هو موضح سابقا13،14. يتم سرد الاشعال المستخدمة في الجدول 2.

  1. تضخيم كاسيت الكلورامفينيكول الذي يحتوي على شظايا التماثل من جين micC .
    1. صمم البادئات micC-F و micC-R لتضخيم كاسيت الكلورامفينيكول (Cm) من البلازميد pKD3 ، بما في ذلك امتدادات التماثل 50 bp من 5 'و 3' من جين micC .
    2. استخراج بلازميد pKD3 كقالب PCR.
    3. امزج 5 ميكرولتر من محلول تفاعل تفاعل PCR 10x ، 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 mM) ، 1 ميكرولتر من مواد أولية micC-F و micC-R ، على التوالي ، 5 ميكرولتر من القالب ، 1 ميكرولتر من بوليميراز Taq DNA و 35 ميكرولتر من ddH2O معا كخليط تفاعل PCR
    4. تضخيم كاسيت Cm بشروط تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 52 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 10 دورات ؛ 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 63 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 25 دورة ، وتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    5. كشف حجم منتج PCR عن طريق هلام الأغاروز الكهربائي. تنقية واستعادة منتج PCR مع مجموعة استعادة هلام الحمض النووي ، وتحديد تركيز الحمض النووي بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
      تنبيه: يجب إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتين. تم تخفيف أول منتج PCR بنسبة 1: 200 واستخدامه كقالب لتفاعل البوليميراز المتسلسل الثانوي ، للقضاء على تداخل إعادة التركيب الإضافية بواسطة بلازميد pKD3.
  2. بناء 1ش سلالة المؤتلف 50336ΔmicC :: cat
    1. امزج 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE50336 مع 5 ميكرولتر من بلازميد pKD46 بشكل موحد واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. صدم الخليط أعلاه بالحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، وانقل الخليط بسرعة إلى ثلج لمدة 2 دقيقة لتحويل بلازميد pKD46 إلى SE50336. غربلة المستعمرات الإيجابية عن طريق الاستزراع طوال الليل عند 30 درجة مئوية على لوحة مقاومة أمبير (50 ميكروغرام / مل).
    2. أضف 30 mM L-arabinose إلى SE50336 / pKD46 ، وحث التعبير المؤتلف بواسطة ثقافة اهتزاز 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم تحضير الخلايا المختصة.
    3. امزج 100 نانوغرام من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى (الخطوة 3.1) و 40 ميكرولتر من الخلايا المختصة SE50336 / pKD46 في كوب صدمة كهربائية (على سبيل المثال ، Bio-Rad). قم بإجراء تحويل الصدمة الكهربائية باستخدام معلمات الجهد 1.8 كيلو فولت ، النبض 25 μF والمقاومة 200 Ω.
    4. بعد التحول الكهربائي ، انقل الخليط إلى 1 مل من وسط SOC وثقافة اهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم قم بتلطيخ الخليط على صفيحة LB مقاومة سم (34 ميكروغرام / مل) ومزرعة عند 37 درجة مئوية طوال الليل لفحص المستعمرة الإيجابية.
    5. استزرع المستعمرة الإيجابية أعلاه عند 42 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قم بفحص المستعمرة الحساسة ل Amp (50 ميكروغرام / مل) ولكنها مقاومة ل Cm (34 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على سلالة المؤتلف الأولى بدون pKD46.
  3. تحديد سلالة المؤتلف 1st 50336ΔmicC :: Cat.
    1. استخراج 50336ΔmicC::Cat الحمض النووي الجيني كقالب PCR. استخدم نفس مكونات تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما في الخطوة 2.1. نفذ تفاعل PCR بنفس الشروط كما في الخطوة 2.1.
    2. الكشف عن حجم منتج PCR عن طريق الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز وتسلسل منتج PCR.
  4. إنشاء متحولة الحذف 50336ΔmicC.
    1. إلكتروبورات 100 نانوغرام من البلازميد pCP20 إلى 40 ميكرولتر من 50336ΔmicC::خلايا Cat المختصة بمعلمات الجهد 1.8 كيلو فولت ، النبض 25 μF والمقاومة 200 Ω ، محولات موجبة للشاشة على كل من Amp (50 ميكروغرام / مل) و Cm (34 ميكروغرام / مل) لوحة مقاومة عند 30 درجة مئوية.
    2. انقل فوق المحولات الموجبة إلى LB غير مقاوم واستزرعها طوال الليل عند 42 درجة مئوية ، ثم اعزل المستعمرات الفردية على صفيحة LB عند 37 درجة مئوية. حدد المستعمرة الحساسة لكل من Amp و Cm. هذا الطافر هو متحولة حذف الميكروفون SE50336ΔmicC.
    3. تحقق منميكروفون 50336Δ بواسطة PCR.
      1. استخراج 50336ΔmicC الحمض النووي الجينومي كقالب PCR. امزج 5 ميكرولتر 10x من محلول تفاعل PCR ، 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 mM) ، 1 ميكرولتر من التمهيدي vmicC-F ، 1 ميكرولتر من التمهيدي vmicC-R ، 5 ميكرولتر من القالب ، 1 ميكرولتر من Taq DNA polymerase و 35 ميكرولتر من ddH2O معا ل PCR.
      2. استخدم شروط تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 53 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 25 دورة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

4. بناء سلالة الميكروفون المكملة

  1. تصميم الاشعال pBR-micC-F و pBR-micC-R مع مواقع تقييد NheI و SalI.
    1. تضخيم جين micC كامل الطول مع تسلسلات الجناح باستخدام خليط تفاعل تفاعل PCR الذي يحتوي على 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي SE50336 كقالب ، وبادئات 1 ميكرولتر من pBR-micC-F و 1 ميكرولتر من pBR-micC-R كبادئات ، 5 ميكرولتر 10x PCR عازلة للتفاعل ، 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مللي مول) ، 2 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 مللي مول) و 35 ميكرولتر من ddH2O.
    2. استخدم شروط تفاعل تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 52 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 25 دورة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تنقية واستعادة المنتج PCR.
  2. هضم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل والبلازميد pBR322 على التوالي باستخدام إنزيم التقييد NheI و SalI ، وربطهما باستخدام T4 ligase عند 16 درجة مئوية طوال الليل للحصول على البلازميد pBR322-micC.
  3. قم بتحويل pBR322-micC إلى الخلايا المختصة SE50336ΔmicC ، وفحص المحول الإيجابي للحصول على السلالة التكميلية SE50336ΔmicC / pmicC. استخراج البلازميد pBR322-micC من سلالة مكملة والتحقق منه عن طريق تقييد هضم الإنزيم والتسلسل.

5. عزل الحمض النووي الريبي وكمية PCR في الوقت الحقيقي

  1. ثقافة SE50336 و 50336ΔmicC و 50336ΔmicC / pmicC في LB متوسطة بين عشية وضحاها عند 24 درجة مئوية مع زراعة اهتزاز 180 دورة في الدقيقة إلىOD 600 من 2.0. جمع الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام كاشف تريزول. احتضان 50 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المعزول مع 2 ميكرولتر من DNaseI و 6 ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة الحمض النووي. تحديد كمية الحمض النووي الريبي عن طريق سحب 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى مقياس الطيف الضوئي الدقيق.
  3. تخليق cDNA
    1. استخدم 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA في 20 ميكرولتر من نظام تفاعل النسخ العكسي (4 ميكرولتر من 5x buffer ، 1 ميكرولتر من مزيج إنزيم RT ، 1 ميكرولتر من مزيج RT التمهيدي ، 10 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 4 ميكرولتر من ddH2O). احتضان نظام التفاعل أعلاه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم عند 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان.
  4. تصميم الاشعال على أساس تسلسل الجينات المستهدفة ompA و ompC و ompD. قم بإجراء النسخ العكسي - PCR باستخدام مجموعة كاشف RT. تحتوي مكونات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على 2.5 ميكرولتر من 10x تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 1 ميكرولتر من خليط dNTP (2.5 mM) ، و 1 ميكرولتر من الجين المستهدف (ompA أو ompC أو ompD) ، و 2.5 ميكرولتر من القالب ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز Taq DNA و 17.5 ميكرولتر من ddH2O.
    1. استخدم شروط تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ؛ 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لمدة 25 دورة ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة RT-PCR الخضراء SYBR في أداة RT-PCT في ثلاث نسخ.
    1. استخدم مكونات تفاعل تفاعل PCR التالية: 10 ميكرولتر من 2x SYBR buffer ، 0.4 ميكرولتر التمهيدي الأمامي والتمهيدي العكسي على التوالي ، 0.4 ميكرولتر من RoxDye II ، 2 ميكرولتر cDNA و 6.8 ميكرولتر من RNase Free H2O.
    2. استخدم شروط تفاعل PCR التالية: تمسخ مسبق عند 95 °C لمدة 1 دقيقة لدورة واحدة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 34 ثانية لمدة 40 دورة.
    3. تطبيع جميع البيانات إلى الجين المرجعي الداخلي gyrA. استخدم طريقة 2-Δ ΔCT لقياس البيانات15.

6. مقايسات الفوعة

  1. ثقافة SE50336 و 50336ΔmicC و 50336ΔmicC / pmicC في المرحلة الثابتة المتوسطة إلى المبكرة LB (OD600 من 2-3) عند 24 درجة مئوية ، والحصاد عن طريق الطرد المركزي ، وتخفيفه إلى CFU mL-1 المناسب في PBS المعقم.
  2. بالنسبة لعدوى الفئران ، قم بتخفيف السلالات المستزرعة إلى 10 CFU / 200 μL و 102 CFU / 200 μL و 103 CFU / 200 μL معلقات متدرجة. تصيب مجموعات من خمسة فئران Balb / c عمرها 6-8 أسابيع لكل سلالة عن طريق الحقن تحت الجلد. حقن المجموعة الضابطة ب 200 ميكرولتر من المحلول الملحي الفسيولوجي.
  3. بالنسبة لالتهابات الدجاج ، قم بتخفيف ثلاث سلالات إلى 107 CFU / 200 ميكرولتر ، 108 CFU / 200 ميكرولتر و 109 CFU / 200 ميكرولتر معلقات متدرجة. تصيب مجموعات من عشرين دجاجة عمرها 1 يوم لكل سلالة عن طريق الحقن تحت الجلد.
  4. مراقبة علامات المرض وموت التجارب يوميا. احسب LD50 (متوسط الجرعة المميتة) 14 د بعد الإصابة كما هو موضح سابقا16. معالجة البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات.
  5. في مجموعات العدوى ، اجمع القلب والكبد والطحال والرئة والكلى من الكتاكيت الميتة حديثا. تزن 0.5 غرام من الأنسجة المذكورة أعلاه بشكل منفصل وطحنها بعملية معقمة. تمييع عينات الطحن تدريجيا ، ونشرها على لوحة LB والثقافة لمدة 8-10 ساعات عند 37 درجة مئوية. سجل كمية سلالات السالمونيلا المستعمرة في أنسجة الفرخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بناء ميكروفون 50336Δ المتحور والسلالة المكملة 50336Δ micC / pmicC
أشارت نتيجة استنساخ جين micC إلى أن هذا الجين يتكون من 109 bp تظهر هوية 100٪ مع هوية S. التيفيموريوم. استنادا إلى بيانات التسلسل ، تم إنشاء متحولة الحذف 50336ΔmicC والطافر المكمل 50336ΔmicC / pmicC بنجاح. بالتفصيل ، أظهرت نتائج التسلسل أنه تم تضخيم شريط مقاومة 1.1 كيلو بايت سم واستخدامه لبناء المؤتلف الأول. تم التحقق من صحة 1st المؤتلف 50336ΔmicC::cat بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات vmicC-F و vmicC-R مع حجم نطاق متوقع يبلغ حوالي 1200 bp من منتجات PCR مع إدخال Cm مقارنة ب 279 bp من منتجات PCR في سلالة النوع البري (الشكل 1). في إعادة التركيب الثانية ، تم التخلص من كاسيت Cm بواسطة pCP20. أكدت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل جنبا إلى جنب مع التسلسل أن متحولة الميكروفون إيزوجينيك قد تم بناؤها بنجاح وسميت باسم 50336ΔmicC (الشكل 1).

ينظم MicC التعبير الجيني ompA و ompC و ompD
لتحديد أهداف MicC ، تم تحليل التعبير عن جينات ompA و ompC و ompD في سلالات SE 50336 و 50336ΔmicC و 50336ΔmicC / p micC بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي باستخدام gyrA كمعيار داخلي طبيعي. أظهرت النتائج أن نسخ ompA و ompC في 50336ΔmicC زاد بحوالي 2.2 ضعف و 3 أضعاف من تلك الموجودة في سلالة النوع البري ، بينما زاد ompD في 50336ΔmicC بشكل طفيف (1.3 ضعف) من ذلك في سلالة النوع البري (الشكل 2). وأشار إلى أن micC يمكن أن يقمع تعبير ompA و ompC و ompD. ربما كان OmpA جينا مستهدفا جديدا محتملا ينظمه micC مباشرة.

يؤدي حذف micC إلى تحسين S. ضراوة الأمعاء في الفئران والدجاج
أجرينا فحوصات LD50 لتحديد تأثير حذف micC على S. ضراوة الأمعاء في الفئران والدجاج. بعد إصابة الفئران Balb / c البالغة من العمر 6-8 أسابيع ب 103 CFU من كل من السلالات الثلاث ، لاحظنا أن معظم الفئران المصابة ب 50336ΔmicC أظهرت التراخي أو عدم الشهية أو الإسهال بعد 48 ساعة من الإصابة ، ويبدو أنها تموت على التوالي بعد 96 ساعة من الإصابة. بينما أظهرت الفئران المصابة بسلالة WT و 50336ΔmicC / pmicC الأعراض المذكورة أعلاه بعد 72 ساعة من الإصابة ، وكانت ميتة بعد 120 ساعة من الإصابة. تم حساب LD50s 7 د بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن LD50 من سلالة WT 50336 و 50336ΔmicC و 50336ΔmicC / pmicC للفئران كانت 12.59 و 5.01 و 19.95 CFU على التوالي. وأشار إلى أن ضراوة الطافرة 50336ΔmicC عززت 2.5 ضعف مقارنة ب WT في الفئران (الجدول 3). بعد إصابة الدجاج البالغ من العمر يوما واحدا ب 109 CFU من كل من السلالات الثلاث ، أظهر معظم الدجاج احتقان معوي وإسهال بعد 10 ساعات من الإصابة. عند الإصابة ب 108 CFU ، أظهر الدجاج المصاب ب 50336ΔmicC معدل وفيات أعلى ، مقارنة بسلالة WT و 50336ΔmicC / pmicC. تم حساب LD50s لمدة 14 يوما بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن LD 50 من سلالة WT 50336 و 50336ΔmicC و 50336ΔmicC / pmicC للدجاج كانت 1.13×109 و 1.55×108 و2.54×10 8 CFU على التوالي. وأشارت إلى أن حذف الميكروفون يعزز أيضا ضراوة S. الأمعاء في الدجاج. تم استرداد جميع السلالات الثلاث من S. Enteritidis من الكبد والطحال والأعور من الدجاج المصاب.

Figure 1
الشكل 1: التحقق من تفاعل البوليميراز المتسلسل لمتحولات 50336ΔmicC مع البادئات vmicC-F و vmicC-R. تم الحصول على منتج PCR 280 bp عندما كان الجينوم من النوع البري 50336 كقالب (الحارة 1). عندما تم إدخال جين كاسيت Cm في جينوم S. Enteritidis ، تم التحقق منالميكروفون المؤتلف الأول 50336Δ :: cat بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل وتم الحصول على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل 1100 bp (الحارة 2). تم استئصال جين الكاسيت Cm لميكروفون 50336Δ :: cat عن طريق إدخال ناقل التعبير عن FLP recombinase pCP20 وتم الحصول على الميكروفون المؤتلف الثاني 50336Δ والتحقق منه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الحارة 3). M: علامة الكتلة الجزيئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 

Figure 2
الشكل 2: تم تحديد تغيرات الطيات في مستوى mRNA لجينات ompA و ompC و ompD في ميكروفون 50336 Δ الطافر وتكملة السلالة 50336Δmic / p بواسطة RT-PCR الكمي مقارنة بالسلالة البرية. تم إجراء المقايسات في ثلاث نسخ. تم استخدام طريقة 2-ΔΔCT لتحديد كمية البيانات. * يشير إلى اختلاف ذو دلالة إحصائية مقارنة بالسلالة البرية (p<0.05) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سلالات / البلازميدات الخصائص مراجع
سلالات
CMCC (B) 50336 السالمونيلا المعوية سيروفار Enteritidis من النوع البري NICPBP ، الصين
50336Δميكروفون micC متحولة ناقصة هذه الدراسة
50336Δميكروفون / pmicC 50336Δميكروفون يحمل pBR- micC (أمبيرص) هذه الدراسة
البلازميدات:
pKD3 سمص ؛ سم كاسيت تيبلات [13]
pKD46 Ampr, λتعبير أحمر مؤتلف [13]
pCP20 أمبير ص ، سمص ؛ تعبير FLP recombinase [13]
pBR-micC pBR322 يحمل جين micC الكامل (Ampr) هذه الدراسة
pGEM-T سهل ناقلات الاستنساخ ، أمبيرص تاكارا
pMD19 تي بسيط ناقلات الاستنساخ ، أمبيرص تاكارا

الجدول 1. السلالات البكتيرية والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة.

التمهيدي التسلسل (5'-3') حجم المنتج (bp)
ميكروف-إف TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCTCG 1114
micC -R TGGAAAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG
vmicC -F AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT 279/140
vmicC -R TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA
pBR-micC-F CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC 434
pBR-micC-R CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC
ompA-F ACTGAACGCCCTGAGCTTTA 177
ompA-R ACACCGGCTTCATTCACAAT
OMPC-F AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG 187
OMPC-R CGCTGACGAACACCTGTATG
OMPD-F ACGGTCAGACTTCGCATAGG 184
OMPD-R TGTTGCCACCTACCTAACA
جيرا-ف GCATGACTTCGTCAGAACCA 278
gyrA-R GGTCTATCAGTTGCCGGAAG

الجدول 2. الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة

سلالات LD 50 للفئران (CFU) تحسين الطي LD 50 للدجاج (CFU) تحسين الطي
س. إنتريتيديس 50336 12.59 1 1.13×109 1
50336Δميكروفون 5.01 2.51 1.55×108 7.29
50336Δميكروفون / عميكروفون 19.95 0.63 2.54×108 4.45
السيطرة السلبية 0 / 0 /

الجدول 3. خصائص الفوعة من S. سلالات Enteritidis 50336 في الفئران والدجاج

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

س. Enteritidis هو أحد مسببات الأمراض الاختيارية المهمة داخل الخلايا التي يمكن أن تصيب الدجاج الصغير وتنتج أعراضا من التهاب الأمعاء إلى العدوى الجهازية والموت17,18. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب S. Enteritidis التهابات كامنة في الدجاج البالغ والناقلات المزمنة تلوث منتجات الدواجن ، مما يؤدي إلى العدوى التي تنقلها الأغذية في البشر19. الآلية المسببة للأمراض من S. Enteritidis لا يزال بحاجة إلى مزيد من التحقيق. حتى الآن ، تم العثور على بعض sRNAs مثل IsrJ و SroA و IsrM تؤثر على ضراوة السالمونيلا 20،21،22،23. تم تحديد جين micC الصغير غير المشفر للحمض النووي الريبي في العديد من البكتيريا المعوية مثل الإشريكية القولونية والسالمونيلا التيفيموريوم والسالمونيلا بونجوري والشيغيلة المرنة6،7،24. هنا ، وجدنا أن تسلسل micC في S. كان Enteritidis 50336 هو نفسه الموجود في S. التيفيموريوم. يشير إلى أن MicC هو sRNA محافظ في البكتيريا المعوية.

للتحقق مما إذا كان MicC يتوسط الفوعة في S. Enteritidis للحيوانات وتحديد أهداف MicC ، قمنا ببناء متحولة الحذف 50336ΔmicC والطافر المكمل 50336ΔmicC / pmicC للتعبير عن micC بنجاح. أشارت نتائج qRT-PCR إلى أن micC يمكن أن يقمع تعبير ompA و ompC. من المحتمل أن يكون OmpA هدفا جديدا محتملا ل MicC. يمكن ل sRNA RybB قمع تخليق OmpA عن طريق الاقتران الأساسي مع المناطق غير المترجمة 5 '(5' UTRs) للهدف ompA mRNA25. يسهل MicA sRNA أيضا الاضمحلال السريع ل ompA mRNA عن طريق الاقتران المضاد للإحساس بشكل مشابه ل RybB25,26. ما إذا كان MicC يستخدم آلية تنظيم مماثلة لتنظيم ompA غير معروف ولا يزال يتعين دراسته في المستقبل القريب. في الإشريكية القولونية ، أدى حذف MicC إلى زيادة التعبير عن ompC من 1.5 إلى 2 ضعف. أظهرت دراسة أخرى أن MicC ثبت أنه يثبط ارتباط الريبوسوم ب ompC mRNA 5' زعيم6. بالإضافة إلى ذلك ، وجد فايفر أن OmpC كان الأهداف الرئيسية ل MicC7. من المفترض أن ينظم MicC ompC في آلية مماثلة في S. Enteritidis مع ذلك في الإشريكية القولونية و S. التيفيموريوم. إلى جانب OmpA و OmpC ، يمكن ل MicC أيضا قمع تعبير OmpD. أظهرت النتائج أن نسخ ompD في 50336ΔmicC قد زاد قليلا (1.3 ضعف) عن ذلك في سلالة النوع البري. بناء على النتائج المذكورة أعلاه ، أظهر أن MicC يمكنه قمع نسخ mRNAs المستهدفة المتعددة (ompA و ompC و ompD) في S. المعوية. MicC ليس الوحيد sRNA الذي يمكنه تنظيم أهداف متعددة. تعمل بعض sRNAs مثل RybB و DsrA و GcvB و RNAIII و RyhB أيضا على أهداف متعددة25،27،28،29،30،31. نظرا لأن sRNAs تنظم الأهداف من خلال آلية إقران القواعد لتحقيق تفاعلات هدف sRNA32 ، فمن الممكن أن ترتبط المناطق الفرعية المحفوظة أو مجالات sRNAs بأهداف مختلفة.

الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام هو واجهة رئيسية في تفاعلات المضيف والممرض. OmpA و OmpC و OmpD كلها بروتينات غشاء خارجي مهمة وفيرة. يلعب OmpC دورا مهما في البيئة البغيضة مثل الأمعاء6. يشارك OmpD في الالتزام بالبلاعم البشرية والخلايا الظهارية المعوية12. كان يعتقد أن تغيير تعبير OMPs الناجم عن حذف MicC يمكن أن يؤثر على ضراوة S. Enteritidis ، و MicC المتراكمة في خلايا المرحلة الثابتة وخاصة في ظل ظروف النمو التي يسببها جينات الفوعة Salmonella SPI-1 و SPI-27. يعتقد أن MicC مرتبط بالفوعة في السالمونيلا ، بينما تم إجراء تجارب العدوى الحيوانية للكشف عن ضراوة MicC. أظهرت النتائج أن LD50 من الطفرات 50336ΔmicC للدجاج البالغ من العمر 1 يوم والفئران Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع قد انخفض بشكل واضح مقارنة مع سلالة النوع البري. وأشارت إلى أن حذف ميك سي عزز فوعة S. Enteritidis في الفئران والدجاج. من المفترض أن تؤدي زيادة تعبير OmpA و OmpC و OmpD ، والذي ينتج عن حذف MicC ، إلى تعزيز الفوعة في S. المعوية.

ينظم MicC سلبا S. ضراوة الأمعاء في الفئران والدجاج ربما عن طريق خفض تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي الرئيسية OmpA و OmpC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 31972651 و 31101826) ، ومؤسسة جيانغسو لعلوم التعليم العالي (رقم 14KJB230002) ، ومختبر الدولة الرئيسي للتكنولوجيا الحيوية البيطرية (رقم SKLVBF201509) ، ومنحة مؤسسة علوم الطبيعة في يانغتشو (رقم YZ2014019) ، وهو مشروع ممول من تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 167 ، السالمونيلا المعوية ، MicC ، التنظيم ، الفوعة ، بروتينات الغشاء الخارجي
يساهم ميكروفون الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر في الفوعة في بروتينات الغشاء الخارجي في <em>السالمونيلا</em> المعوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang,… More

Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter