Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/61993
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York
* These authors contributed equally

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو توفير دليل مفصل خطوة بخطوة لتجميع البنى متعددة الجينات باستخدام نظام الاستنساخ المعياري القائم على استنساخ البوابة الذهبية. كما يقدم توصيات بشأن الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الأمثل استنادا إلى خبراتنا.

Abstract

تمكن طريقة استنساخ البوابة الذهبية من التجميع السريع لجينات متعددة في أي ترتيب يحدده المستخدم. ويستخدم نوع IIS تقييد الإنزيمات التي تقطع خارج مواقع الاعتراف بها وخلق تراكم قصيرة. يستخدم نظام الاستنساخ المعياري هذا (MoClo) سير عمل هرمي يتم فيه استنساخ أجزاء الحمض النووي المختلفة ، مثل المروجين وتسلسلات الترميز (CDS) والمنهيين ، لأول مرة في متجه إدخال. ناقلات دخول متعددة ثم تجميع في وحدات النسخ. ثم تتصل عدة وحدات نسخ ببللازميد متعدد الجينات. استراتيجية الاستنساخ البوابة الذهبية هي ميزة هائلة لأنها تسمح ندبة أقل، والاتجاه، والتجمع وحدات في رد فعل وعاء واحد. ويمكن سير العمل الهرمي عادة من الاستنساخ السهل لمجموعة كبيرة ومتنوعة من البنى المتعددة الجينات دون الحاجة إلى التسلسل خارج ناقلات الدخول. يتيح استخدام التسرب من البروتين الفلوري الفحص البصري السهل. يوفر هذا العمل بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة الاستنساخ المعياري للخمائر (MoClo). نعرض النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل لتجميع البلازميد متعدد الجينات ونقدم دليلا لفحص المستعمرات. وتنطبق استراتيجية الاستنساخ هذه إلى حد كبير على هندسة التمثيل الغذائي للخمائر وغيرها من الحالات التي يلزم فيها استنساخ البلازميد المتعدد الجينات.

Introduction

تهدف البيولوجيا التركيبية إلى هندسة النظم البيولوجية مع وظائف جديدة مفيدة للصناعات الصيدلانية والزراعية والكيميائية. تجميع أعداد كبيرة من شظايا الحمض النووي بطريقة عالية الإنتاجية هو تقنية أساسية في البيولوجيا الاصطناعية. مثل هذه العملية المعقدة يمكن أن تنهار إلى مستويات متعددة مع انخفاض التعقيد ، وهو مفهوم مستعار من العلوم الهندسية الأساسية1،2. في البيولوجيا التركيبية، عادة ما تتجمع شظايا الحمض النووي بشكل هرمي استنادا إلى الوظيفة: '1' مستوى الجزء: تشير "الأجزاء" إلى شظايا الحمض النووي ذات وظيفة محددة، مثل المروج، وتسلسل الترميز، والمنهي، وأصل النسخ المتماثل؛ و'2' العوامل التي يمكن أن تكون ذات طبيعة مختلفة. '2' مستوى وحدات النسخ: تتكون الوحدة من مروج وتسلسل ترميز ومنهي قادر على نسخ جين واحد؛ '3' المستوى المتعدد الجينات: يحتوي البلازميد المتعدد الجينات على عدة وحدات ثلاثية المستويات تتألف في كثير من الأحيان من مسار استقلابي كامل. هذا التجمع الهرمي رائدة من قبل المجتمع BioBrick هو المفهوم التأسيسي لتجميع مجموعات كبيرة من DNAs في البيولوجيا الاصطناعية3.

في العقد الماضي4،5،6،7، وقد سهلت تقنية استنساخ البوابة الذهبية بشكل كبير تجميع الحمض النووي الهرمي2. كما تم تطوير العديد من أساليب الاستنساخ متعددة الجزأة الأخرى ، مثل استنساخ جيبسون8، الاستنساخ المستقل عن الربط (SLIC)9، والاستنساخ القائم على الختان (USER)10، ورد فعل الدراجات ليغان (LCR)11، وفي إعادة دمج الجسم الحي (DNA Assembler)12،13، حتى الآن. ولكن استنساخ البوابة الذهبية هو طريقة مثالية لتجميع الحمض النووي لأنه مستقل عن التسلسلات الخاصة بالجينات ، مما يسمح بتجميع ندبة واتجاهية ووحدات في رد فعل وعاء واحد. يستفيد استنساخ البوابة الذهبية من إنزيمات تقييد IIS من النوع التي تتعرف على تسلسل غير باليندروميك لإنشاء تراكمات متداخلة خارج موقع التعرف2. ثم ينضم الليغاز إلى شظايا الحمض النووي الملدن للحصول على تجميع متعدد الأجزاء. وقد مكن تطبيق استراتيجية الاستنساخ هذه على نظام الاستنساخ المعياري (MoClo) من تجميع ما يصل إلى 10 شظايا الحمض النووي مع أكثر من 90٪ من المحولات التي تم فحصها والتي تحتوي على البناء المجمع بشكل صحيح4.

يوفر نظام MoClo مزايا هائلة عجلت بدورة التصميم والبناء والاختبار للبيولوجيا التركيبية. أولا، تمكن الأجزاء القابلة للتبديل الاستنساخ الجمعي من اختبار مساحة كبيرة من المعلمات بسرعة. على سبيل المثال، يتطلب تحسين المسار الأيضي عادة ركوب الدراجات من خلال العديد من المروجين لكل جين لتحقيق التوازن بين تدفق المسار. يمكن لنظام MoClo التعامل بسهولة مع مهام الاستنساخ المطلوبة. ثانيا، يحتاج المرء إلى تسلسل الجزء البلازميد ولكن عادة ليس TU أو البلازميدات متعددة الجينات. في معظم الحالات، الفحص عن طريق PCR مستعمرة أو تقييد الهضم كافية للتحقق على مستوى TU ومتعددة الجينات البلازميد. وذلك لأن استنساخ جزء البلازميد هو الخطوة الوحيدة التي تتطلب PCR، الذي يدخل في كثير من الأحيان الطفرات. ثالثا، نظام موكلو مثالي لبناء مسارات التمثيل الغذائي المعقدة متعددة الجينات. وأخيرا، بسبب التراكمات العالمية، يمكن إعادة استخدام الجزء البلازميدات ومشاركتها مع مجتمع الهندسة الحيوية بأكمله. حاليا، مجموعات موكلو متوفرة للنباتات14،15،5،16،17، الفطريات6،18،19،20،21،22، البكتيريا7،23،24،25،26،27، والحيوانات28،29. كما تم تقديم منصة MoClo متعددة المملكة مؤخرا30.

لSaccharomyces cerevisiae, وقد وضعت لي وآخرون6 مجموعة أدوات موكلو تنوعا, مورد ممتاز للمجتمع البيولوجيا الاصطناعية الخميرة. تأتي هذه المجموعة في شكل مريح من 96 بئرا وتحدد ثمانية أنواع من أجزاء الحمض النووي القابلة للتبديل مع مجموعة متنوعة من المروجين المميزين ، والبروتينات الفلورية ، والمنهيين ، وعلامات الببتيد ، وعلامات الاختيار ، وأصل النسخ المتماثل ، وأدوات تحرير الجينوم. تسمح مجموعة الأدوات هذه بتجميع ما يصل إلى خمس وحدات نسخ في بلازميد متعدد الجينات. هذه الميزات هي قيمة لهندسة التمثيل الغذائي الخميرة، التي يتم التعبير عن مسارات جزئية أو كاملة لإنتاج المواد الكيميائية المستهدفة. باستخدام هذه المجموعة، وقد الأمثل الباحثين إنتاج geraniol، linalool31،البنسلين32،حمض موكونيك33،النيلي34،وبيتالين35 في الخميرة.

هنا نقدم مفصلة، خطوة بخطوة بروتوكول لتوجيه استخدام مجموعة أدوات موكلو لتوليد مسارات متعددة الجينات للتعبير إما الظهارية أو الجينومية. من خلال الاستخدام المكثف لهذه المجموعة ، وجدنا أن القياس الدقيق لتركيزات الحمض النووي هو المفتاح لضمان توزيع الاعتدال لكل جزء في رد فعل البوابة الذهبية. ونحن نوصي أيضا ليغان الحمض النووي T4 على ليغاس الحمض النووي T7 لأن الأول يعمل بشكل أفضل مع أعداد أكبر من يتدلى36. وأخيرا، يجب إزالة أي مواقع اعتراف داخلية من BsmBI و BsaI أو تدجينها قبل التجميع. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن ينظر في تجميع أجزاء لإزالة مواقع داخلية متعددة وتحقيق الأمثل codon في وقت واحد. نحن نظهر كيفية استخدام مجموعة الأدوات هذه من خلال التعبير عن مسار من خمسة جينات لإنتاج β كاروتين والليكوبين في S. cerevisiae. نعرض كذلك كيفية ضرب موقع ADE2 باستخدام أدوات تحرير الجينوم من هذه المجموعة. تم اختيار هذه التجارب القائمة على الألوان لسهولة التصور. كما أننا نبين كيفية توليد بروتينات الاندماج وخلق طفرات الأحماض الأمينية باستخدام استنساخ البوابة الذهبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يمكن تقسيم بروتوكول الاستنساخ الهرمي المعروض في مجموعة الأدوات هذه إلى ثلاث خطوات رئيسية: 1. استنساخ جزء البلازميدات؛ 2. 2. استنساخ وحدات النسخ (TUs)؛ 3. استنساخ البلازميدات متعددة الجينات (الشكل 1). يبدأ هذا البروتوكول من تصميم التمهيدي وينتهي بتطبيقات البلازميد المستنسخ متعدد الجينات.

1. تصميم التمهيدي لاستنساخ الجزء plasmid (pYTK001):

  1. تصميم التمهيديات الأمامية والعكسية التي تحتوي على النيوكليوتيدات المحيطة TTT في نهاية 5 ،وهو موقع التعرف على BsmBI مع النيوكليوتيدات الإضافية (CGTCTCN) ، وهو تراكم 4-nucleotides (NT) تكملة لنواقل الإدخال ، موقع التعرف على BsaI مع النيوكليوتيدات إضافية (GGTCTCN)، و4-nt جزء محددة تراكم، بالإضافة إلى تسلسل قالب محدد (الشكل 2A). GoldenBraid 4.037 وغولدن موتاجينيسيس38 هي بعض من البرامج على الانترنت التي يمكن استخدامها لتصميم التمهيدي البوابة الذهبية محددة.
  2. إذا كانت مواقع التعرف على BsaI أو BsmBI موجودة في أي جزء ، فاستخدم خطوة تدجين لتحور هذه المواقع قبل تجميع Golden Gate39. للحصول على البلازميدات التكاملية (انظر الخطوة 4) ، تدجين أي موقع التعرف على NotI. لتدجين جزء مع موقع التعرف غير مرغوب فيه واحد، تقسيم الجزء إلى قسمين فرعيين بالقرب من موقع غير مرغوب فيه(الشكل 2A):
    1. تصميم التمهيدي الأمامي للقسم الفرعي الأول بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.1. ولكن تصميم التمهيدي العكسي مع موقع BsmBI و4-NT تراكم الجينات محددة فقط.
    2. تصميم التمهيدي الجزء الفرعي الثاني إلى الأمام مع موقع BsmBI وتراكم 4-nt الجينات محددة فقط أن يتداخل مع التمهيدي العكسي للجزء الفرعي الأول. تصميم التمهيدي العكسي للجزء الفرعي الثاني بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.1.
    3. أدخل الطفرة (الطفرات) المرغوبة إما في الاتجاه المعاكس (للخطوة 1.2.1) أو التمهيدي الأمامي (الخطوة 1.2.2) في المنطقة المحددة للجينات في التمهيدي.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن توليف جزء BsmBI-و BsaI-free و codon-optimized تجاريا. بالنسبة لتسلسلات الترميز (CDS) ، يمكن دمج طفرة مرادفة بسهولة في النيوكليوتيد الثالث من كودون الأحماض الأمينية. بالنسبة للمروجين والمنهيين ، ومع ذلك ، يوصى بالتحقق من نشاط المروج أو المنهي المتحول باستخدام مقايسة المراسل39. إذا كان هناك موقع تقييد غير مرغوب فيه قرب نهاية التسلسل ، يمكن أن يتحول باستخدام التمهيدي العكسي الأطول. إذا كانت هناك مواقع غير مرغوب فيها متعددة، قد يتم تنفيذ تولد موجهة من الموقع السماح تتحور مواقع متعددة40.
  3. أحيانا، دمج اثنين من البروتينات كجزء واحد مع رابط بين أمر مرغوب فيه(الشكل 2A). الرابط يساعد على ضمان السلامة الهيكلية للبروتينات الفرديةاثنين 41.
    1. التمهيدي الأمامي للجين الأول هو نفسه كما هو الحال في الخطوة 1.1. في التمهيدي العكسي، قم بتضمين موقع BsmBI، وتراكم خاص بالجينات 4-nt، وتسلسل رابط. يمكن أن يكون تراكم 4-nt إما الرابط أو النيوكليوتيدات القليلة الأولى للجين الثاني.
    2. بالنسبة للجين الثاني ، قم بتصميم التمهيدي الأمامي بحيث يحتوي على موقع التعرف على BsmBI وتراكم 4-nt مكمل للتمهيد العكسي للجين الأول. تصميم التمهيدي العكسي للجين الثاني كما هو الحال في الخطوة 1.1.
  4. لتضخيم الأجزاء عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)42، استخدم بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة لتضخيم الأجزاء إما من الحمض النووي الجينومي ، أو cDNA ، أو البلازميد. تحقق من منتج PCR على هلام agarose 1٪ يليه تنقية هلام. ينصح بشدة باستخدام الحمض النووي المنقى ، إذا كان تنقية الجل شاقا ، فاستخدم عمودا تدور على الأقل لتنقية منتج PCR.

2. استنساخ أجزاء في متجه الدخول (pYTK001) لإنشاء جزء plasmids (الشكل 2B)

  1. لإعداد مزيج رد فعل البوابة الذهبية ، أضف 20 fmol من كل منتج PCR وناقل الإدخال (pYTK001) ، و 1 ميكرولتر من 10X T4 ligase buffer ، و 0.5 ميكرولتر من Esp3I (ايزوشيزمر عالي الكفاءة من BsmBI) ، و 0.5 ميكرولتر من T4 ligase. أضف ddH2O ليصل إجمالي الحجم إلى 10 ميكرولتر.
  2. لإعداد رد فعل الاستنساخ، قم بتشغيل البرنامج التالي في دراجة حرارية: 25-35 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الهضم) و 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الربط)، يليه عملية هضم نهائية عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وعطل الإنزيم عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يوصى ب 35 دورة من الهضم/الربط عند استنساخ عدة قطع من الحمض النووي في ناقل الدخول في وقت واحد، على سبيل المثال، أثناء استنساخ جينات الاندماج أو تدجين جين.
  3. تحويل مزيج التفاعل بأكمله إلى سلالة DH5α أو ما يعادلها Escherichia القولونية الخلايا المختصة كيميائيا عن طريق الصدمة الحرارية. ويوصى بتحويل كامل المنتج المستنسخ 10 ميكرولتر إلى 35 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا (2 × 105 cfu/mL ، يتم حساب cfu من تحويل 5 نانوغرام pYTK001 إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة). تنتشر على لوحة مرق lysogeny (LB) مع 35 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (Cm). حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. بعد 16-18 ساعة، واتخاذ لوحة من الحاضنة والحفاظ على لوحة في 4 درجة مئوية لحوالي 5 ساعة للسماح للمجلد السوبر البروتين الفلوري الأخضر (sfGFP) تطوير للون أخضر أكثر كثافة.
  5. لتسهيل الفحص، ضع اللوحة على الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو محول ترانسيوميناتور الضوء الأزرق. وsfGFP التي تحتوي على المستعمرات فلوريس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  6. المستعمرات الخضراء سلبية لأنها تحتوي على pYTK001 غير المصقول. المستعمرات البيضاء إيجابية على الأرجح. الاستنساخ عادة ما تكون ناجحة إذا كان هناك ~ 30-100 ٪ المستعمرات البيضاء. إجراء مزيد من الفحص لعدد قليل من المستعمرات البيضاء إما عن طريق PCR مستعمرة أو تقييد الهضم (إنزيم المقترحة: BsaI-HFv2).
  7. تنقية البلازميدات من عدد قليل من المستعمرات الصحيحة المحتملة وتأكيد التسلسلات عن طريق تسلسل سانجر.

3. تجميع جزء plasmids في "كاسيت" البلازميدات

ملاحظة: يحتوي كاسيت بلازميد على وحدة نسخ معرفة من قبل المستخدم (TU) تتكون من مروج وCDS ومنهي. يسمح شريط كاسيت بلازميد بالتعبير عن جين واحد. إذا كان سيتم تجميع plasmids كاسيت في البلازميد متعدد الجينات، ثم الخطوة الأولى هي لتحديد عدد وترتيب TUs في البلازميد متعدد الجينات. هذه ستحدد الموصلات التي لاستخدامها في plasmids كاسيت منذ الموصلات ربط TUs في البلازميد متعدد الجينات. يجب أن يكون الموصل الأيسر ل TU الأول ConLS، ويجب أن يكون الموصل الأيمن ل TU الأخير ConRE. وسوف تتداخل مع ConLS 'وConRE' من البلازميدات متعددة الجينات. وينبغي أن تكون بقية الموصلات في الترتيب العددي المتزايد. على سبيل المثال، إذا كان البلازميد متعدد الجينات يحتوي على أربع وحدات ثلاثية التوليفات، فإن تركيبات الموصل ستكون ConLS-TU1-ConR1 وConL1-TU2-ConR2 وConL2-TU3-ConR3 وConL3-TU4-ConRE(الشكل 1).

  1. قبل تجميع وحدات النسخ ، يوصى بتجميع ناقل وسيط مع الأجزاء الستة التالية: الموصل الأيسر ، وتسرب sfGFP (pYTK047) ، والموصل الأيمن ، وعلامة اختيار الخميرة ، وأصل الخميرة للتكرار والجزء البلازميد مع mRFP1 ، وأصل الإشريكية القولونية والجين المقاوم للأمبيسلين (pYTK083) (الشكل 3).
    1. تنقية البلازميدات الستة المذكورة أعلاه. سجل تركيزاتها باستخدام مطياف UV-Vis أو المقايسة القائمة على الفلورسينس وتمييع كل بلازميد مع ddH2O بحيث يحتوي 1 ميكرولتر على 20 fmol من الحمض النووي. حساب تركيز ضرس الحمض النووي باستخدام آلة حاسبة على الانترنت.
      ملاحظة: من المهم جدا لقياس تركيزات الحمض النووي بدقة وpipet على وجه التحديد للجمعية للعمل، وخاصة بالنسبة للجمعيات مع plasmids جزء خمسة إلى سبعة. ويمكن أن تتسبب الأخطاء الصغيرة في تركيز الحمض النووي لكل بلازميد في انخفاض كبير في كفاءة الاستنساخ.
    2. إضافة 1 ميكرولتر من كل بلازميد، 1 ميكرولتر من 10X T4 ليغاز العازلة، 0.5 ميكرولتر من BsaI-HFv2 (نسخة فعالة للغاية من BsaI)، و 0.5 ميكرولتر من T4 ليغانس. تشكل وحدة التخزين إلى 10 ميكرولتر عن طريق إضافة ddH2O.
    3. لإعداد رد فعل الاستنساخ ، قم بتشغيل البرنامج التالي في thermocycler: 25-35 دورة من 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الهضم) و 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الربط). حذف الهضم النهائي والحرارة خطوات تعطيل المواقع BsaI تحتاج إلى الاحتفاظ بها في ناقلات وسيطة (الشكل 3).
    4. قم بتحويل مزيج التفاعل بالكامل إلى سلالة DH5α أو خلايا E. coli المختصة الأخرى. تنتشر على لوحة LB مع 50 ميكروغرام / مل كاربينسيلين (Cb) أو الأمبيسلين. حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: كاربينسيلين هو التناظرية مستقرة من الأمبيسلين.
    5. بعد 16-18 ساعة ، أخرج اللوحة من الحاضنة. لوحة سوف تحتوي على كل من المستعمرات الحمراء الشاحبة والخضراء شاحب (الأرقام 6C و 6D). حافظ على اللوحة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 ساعة تقريبا للسماح ل mRFP1 وsfGFP بالنضج. استخدم الأشعة فوق البنفسجية أو محول الضوء الأزرق لتحديد المستعمرات الخضراء، التي تحتوي على المتجه الوسيط الصحيح المحتمل.
    6. خط من المستعمرات الخضراء على لوحة LB + Cb واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، متتالية مرة أخرى على لوحة LB + سم واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تحتوي المستعمرات التي تنمو على لوحات LB + Cm على بلازميدات مجمعة بشكل خاطئ لأنه يتم الاحتفاظ بناقلات جزء مقاومة Cm.
    7. اختيار المستعمرات التي لا تنمو على لوحة LB + سم وإجراء الهضم تقييد (الإنزيمات المقترحة: BsaI-HFv2، Esp3I) لتأكيد البلازميد تجميعها بشكل صحيح. بدلا من ذلك، استخدم PCR مستعمرة للفحص.
  2. بمجرد أن يتم تجميع المتجه الوسيط بنجاح ، فإن الخطوة التالية هي تجميع وحدات النسخ. هذا التجميع من 4 قطع مع الأجزاء التالية: المتجه الوسيط، المروج، CDS، والمنهي.
    1. تنقية plasmids جزء أربعة. سجل تركيزاتها وتمييع كل من البلازميد بحيث يحتوي 1 ميكرولتر على 20 fmol من الحمض النووي.
    2. لإعداد مزيج التفاعل، اتبع الخطوة 3.1.2.
    3. لإعداد رد فعل الاستنساخ، اتبع الخطوة 2.2.
    4. تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى DH5α أو ما يعادلها E. القولونية الخلايا المختصة ولوحة على LB + Cb. حضانة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. بعد 16-18 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة. سوف تظهر المستعمرات الخضراء البيضاء والشاحبة (الشكلان 6E و 6F). الحفاظ على لوحة في 4 درجة مئوية لحوالي 5 ساعة للسماح للsfGFP ناضجة. استخدم الأشعة فوق البنفسجية أو محول الضوء الأزرق لتحديد المستعمرات البيضاء غير الفلورية. هذه تحتوي على وحدات النسخ الصحيح المحتمل.
    6. خط بها وتنمو 8-10 المستعمرات البيضاء وأداء PCR مستعمرة. تنقية البلازميدات من المستعمرات التي اختبار إيجابية من PCR مستعمرة. تنفيذ تقييد الهضم (إنزيم المقترحة: Esp3I) لمزيد من تأكيد التجمع.
      ملاحظة: تسلسل وحدات النسخ عادة غير ضروري لأن الاستنساخ ينطوي على تقييد الهضم فقط وربط. وقد تم تأكيد جميع تسلسلات الاهتمام على مستوى plasmid جزء.

4. تجميع الكاسيت البلازميدات في البلازميدات "متعددة الجينات":

ملاحظة: تسمح البلازميدات متعددة الجينات بالتعبير عن أكثر من جين واحد. اعتمادا على تطبيق المصب، يمكن أن تكون البلازميدات متعددة الجينات متماثلة أو تكاملية. البلازميدات المستنسخة لها أصل الخميرة من النسخ المتماثل. ولذلك، فإنه يمكن الحفاظ عليها بشكل ثابت عندما يقسم خلية الخميرة. البلازميدات التكاملية ليس لديها أصل الخميرة من النسخ المتماثل. بدلا من ذلك، لديهم 5 'و 3' أسلحة الشوم السماح لدمج جينات متعددة في loci محددة من الجينوم من خلال إعادة التركيب متجانسة.

  1. بالنسبة للبلازميدات متعددة الجينات، قم بتجميع ناقل وسيط أولا.
    1. لتجميع ناقلات وسيطة متماثلة(الشكل 4A)،تجميع الأجزاء الستة التالية: الموصل الأيسر (ConLS'pYTK008)، التسرب sfGFP (pYTK047)، الرابط الأيمن (ConRE'-pYTK072)، علامة اختيار الخميرة، أصل الخميرة من النسخ المتماثل، وplasmid جزء مع mRFP1، وهو أصل كولاي E. من النسخ المتماثل، والجين المقاوم للكاناميسين (pYTK084).
      1. للتجميع، اتبع الخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.3.
      2. تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى DH5α أو ما يعادلها E. القولونية الخلايا المختصة، ولوحة على LB بالإضافة إلى 50 ميكروغرام / مل kanamycin (كم). حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      3. للفحص المستند إلى اللون الأحمر/الأخضر، اتبع الخطوة 3.1.5.
      4. لفحص misassemblies، خط وتنمو المستعمرات الخضراء على لوحة LB + كم. ثم اتبع الخطوة 3.1.6.
    2. بالنسبة لنواقل الجينات المتعددة التكاملية(الشكل 4B)،حدد الموضع الجينومي المثير للاهتمام أولا، ثم قم بتصميم ما يقرب من 500 زوج أساسي من أذرع 5 و 3'homology لدمجها في ذلك الموضع.
      1. استنساخ الأسلحة 5 'و 3'homology من الحمض النووي الجينوم الخميرة في دخول ناقلات pYTK001. اتبع الخطوتين 1 و2.
      2. تجميع plasmids السبعة التالية: الموصل الأيسر (ConLS'pYTK008)، التسرب sfGFP (pYTK047)، والموصل الأيمن (ConRE'pYTK072)، علامة اختيار الخميرة، الذراع 3'homology، وplasmid جزء مع mRFP1، E. القولونية الأصل من النسخ المتماثل، والجين مقاومة الكاناميسين (pYTK090)، وذراع 5'homology.
      3. للتجميع والفحص، اتبع الخطوة 4.1.1.
  2. تجميع البلازميد متعدد الجينات
    1. تنقية البلازميدات من ناقلات وسيطة تم الحصول عليها في الخطوة 4.1 وplasmids كاسيت من الخطوة 3. سجل تركيزاتها باستخدام مطياف UV-Vis أو المقايسة المستندة إلى الفلورسينس. تمييع كل في DDH2O بحيث 1 ميكرولتر لديه 20 فومول الحمض النووي.
    2. أضف 1 ميكرولتر من المتجه الوسيط، و1 ميكرولتر من كل وحدة نسخ، و1 ميكرولتر من 10x T4 ليغاز المخزن المؤقت، و0.5 ميكرولتر من Esp3I، و0.5 ميكرولتر من T4 ligase. رفع مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر من استخدام ddH2O.
    3. لإعداد رد فعل الاستنساخ، اتبع الخطوة 2.2.
    4. تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى DH5α أو ما يعادلها E. القولونية الخلايا المختصة، ولوحة على LB + كم. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. قم بإجراء الفحص الأخضر/الأبيض كما في الخطوة 3.2.5.
    6. تنقية البلازميدات من عدد قليل من المستعمرات البيضاء وإجراء عمليات الهضم تقييد. باستخدام إنزيم نوتي-HF ينصح لأن هناك موقعين نوتي في E. القولونية الأصل وKm اختيار جزء علامة، على التوالي(الشكل 4B). إذا كان البلازميد المجمع كبيرا جدا ، فيمكن اختيار موقع تقييد آخر لمزيد من التأكيد. بدلا من ذلك، الشاشة مع PCR مستعمرة قبل الشروع في تقييد الهضم.

5. تطبيق البلازميدات متعددة الجينات للتعبير الجيني الكروموسومي أو القائم على البلازميد

  1. دمج البلازميد متعدد الجينات في جينوم الخميرة للتعبير الجيني الكروموسومي (الشكل 5)
    1. تصميم دليل الجيش الملكي النيبالي (gRNA) للجراد المطلوب. باستخدام موارد متعددة عبر الإنترنت، مثل Benchling و CRISPRdirect43و CHOPCHOP44،يوصى بتحديد الحد الأقصى للخصوصية على الهدف.
    2. استنساخ توليفها 20-nt gRNA في pCASplasmid 45 عن طريق استنساخ جيبسون. linearize بلازميد pCAS بواسطة PCR باستخدام عكس ربط الزوج التمهيدي إلى 3 'من ريبوزيم HDV و 5 ' من tracrRNA على التوالي (الشكل 5). بدلا من ذلك، استنساخ الحمض النووي الريبي في البلازميد التسرب sgRNA (pYTK050) وتجميع البلازميد التسرب في plasmid كاسيت مع الرابطات. ثم تجميع CAS9 TU مع الجزء Cas9 plasmid (pYTK036). وأخيرا، تجميع CAS9 TU وSgRNA TU في البلازميد متعدد الجينات المستنسخة.
    3. linearize 5-15 ميكروغرام من البلازميد متعدد الجينات التكاملية مع 1 ميكرولتر من انزيم نوتي-HF بين عشية وضحاها. تحويل 1 ميكروغرام من pCAS-gRNA وplasmid متعدد الجينات التكاملية الخطية إلى S. cerevisiae. إعداد الخلايا المختصة باستخدام إما مجموعة تحويل الخميرة المتاحة تجاريا أو اتباع البروتوكول من قبل Geitz وشيستل، 200746.
      ملاحظة: من غير الضروري تنقية البلازميد متعدد الجينات الخطي بعد هضم NotI.
    4. بيليه الخلايا بعد الانتعاش، والتخلص من supernatant، وغسل مع كمية متساوية من الماء. لوحة خلايا الخميرة على المتوسطة الاصطناعية كاملة (CSM) لوحة التسرب أو الخميرة استخراج بيبتون dextrose المتوسطة (YPD) لوحة مع المضادات الحيوية، اعتمادا على علامة الخميرة انتقائية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة يومين لتشكيل المستعمرات. في حالة عدم ملاحظة مستعمرة، احتضان لمدة يوم إلى يومين إضافيين في 30 درجة مئوية.
    5. مستعمرات الخميرة الشاشة للتكامل من قبل مستعمرة PCR47.
    6. لعلاج pCAS ، قم بالخروج من المستعمرة مع التكامل الصحيح على لوحة YPD غير انتقائية. تنمو عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. خط مستعمرة واحدة من لوحة YPD على لوحة YPD جديدة. مرة أخرى، تنمو عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها. خط مستعمرة من لوحة YPD الثانية إلى YPD بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل nourseothricin ، علامة اختيار pCAS. علاج ناجح يحدث عندما تفشل خلايا الخميرة في النمو على لوحة انتقائية.
      ملاحظة: إذا لم يتم علاج pCAS plasmid في جولتين من YPD غير انتقائية، خط مرة أخرى على YPD جديدة لجولات أخرى 1-2.
  2. تحويل البلازميد متعدد الجينات المستنسخ للتعبير الجيني القائم على البلازميد
    1. تحويل 100 نانوغرام-1 ميكروغرام نقية متعددة الجينات البلازميد إلى S. cerevisiae الخلايا المختصة.
    2. خلايا الخميرة لوحة مباشرة بعد التحول على لوحة التسرب CSM أو YPD بالإضافة إلى لوحة المضادات الحيوية، اعتمادا على علامة اختيار الخميرة المستخدمة. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للمستعمرات لتشكيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا نتائج أربعة plasmids متعددة الجينات المستنسخة لإنتاج β كاروتين (الأصفر) والليكوبين (الأحمر). تم بناء بلازميد متعدد الجينات التكاملي لتعطيل موقع ADE2 ، والمستعمرات منها حمراء.

استنساخ CDSs في متجه الإدخال (pYTK001)
تم تضخيم ERG20 من جينوم الخميرة والجينات الكاروتينويد الثلاثة crtE، crtYB، crtI من pLM49448 في ناقل الدخول pYTK001 كما هو موضح. تم استنساخ المروجين الخميرة pENO2، pTIP1، pPYK1 وpPDC1 والمنهيين tTDH2، tHSP26، tADH2، tACS2 كجزء plasmids. وأدخلت طفرة نقطة في CrtYB (G247A) لإنتاج الليكوبين وتم إنشاء بناء الانصهار BTS1-ERG20 لتوجيه أفضل وسيطة prenyl إلى الكاروتينات. ويبين الشكلان 6 ألف و6ب لوحة تمثيلية للاستنساخ الناجح لجزء من البلازميد، ويقدمان مثالا على الفحص الأخضر/الأبيض، حيث يحتمل أن يكون 90.35 ± 4.22 في المائة من مجموع المستعمرات صحيحا (أبيض).

تجميع وحدات النسخ (كاسيت بلازميدات)
قبل تجميع كاسيت بلازميد ، تم الانتهاء من تصميم البلازميد متعدد الجينات. وبالنسبة ل TUs الكاروتينويد الأربعة، تم استنساخ أربعة ناقلات وسيطة ذات موصلات مختلفة أولا بعد الخطوة 3.1. ويبين الشكلان 6C و 6D لوحة تمثيلية من تجميع ناجح للناقل الوسيط ويقدمان مثالا على الفحص الأحمر/الأخضر، حيث كان 17.56 ± 3.32٪ من مجموع المستعمرات إيجابيا (أخضر). على الرغم من أن هذه النسبة منخفضة نسبيا ، إلا أن الفحص يسهله إلى حد كبير الفلورسينس الأخضر.

بعد ذلك، تم تجميع وحدات TUs ل BTS1-ERG20 وERG20 وcrtE وcrtYB وcrtYB (G247A) وcrtI بعد الخطوة 3.2 (الجدول 1). يظهر الشكلان 6E و6F لوحة تمثيلية لتجميع ناجح ل TUs ويقدمان مثالا على طريقة الفحص الأخضر /الأبيض ، مع 65.02 ± 4.99٪ من إجمالي المستعمرات إيجابية (أبيض).

تجميع البلازميدات متعددة الجينات
وتم تجميع أربعة بلازميدات متعددة الجينات متماثلة وواحدة متكاملة. لتكاثر متعدد الجينات البلازميدات، ERG20، BTS1-ERG20، crtE، crtYB، crtYB (G247A) وcrtI تم تجميعها في أربع مجموعات مختلفة، وخلق أربعة البلازميدات: اثنين β كاروتين واثنين لإنتاج الليكوبين(الجدول 2). وكانت نسبة المستعمرات التي يحتمل أن تكون صحيحة (خضراء) لاستنساخ النواقل الوسيطة 1.83 ± 0.15 فيالمائة (الشكلان 7 ألف و7ب). على الرغم من أن هذا العدد يبدو منخفضا ، إلا أن الفحص أصبح سهلا من خلال الكشف عن الفلورسينس الأخضر(الشكل 7B). وبمجرد استنساخ البلازميد الوسيط، كان معدل نجاح تجميع البلازميدات متعددة الجينات (البيضاء) من الوسيط 93.77± 1.65٪(الشكلان 7C و 7D). ويبين الشكلان 7E و7F تجميعا دون المستوى الأمثل للبلازميدات المتعددة الجينات، حيث كانت أعداد المستعمرات الإيجابية (البيضاء) ضئيلة. بعد التحول إلى الخميرة، نمت المستعمرات المنتجة β كاروتين (الأصفر) والليكوبين (الأحمر) في اليوم الثالث. أربع مستعمرات من كل لوحة كانت ملطخة على لوحات جديدة ونمت لمدة يومين آخرين. ويبين الشكلان 8A و8B أن دمج BTS1-ERG20 يوجه المزيد من الجيرانيل- بيروفوسفات نحو إنتاج الكاروتينويد، كما يتضح من الألوان الداكنة من استخدام ERG20 وحده. عند استخراج49 وتحديد كمي من الكاروتينات عن طريق الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف مع معايير أصيلة، وينظر إلى أن الانصهار من BTS1-ERG20 يؤدي إلى إنتاج 0.729 ميكروغرام / ملغ β كاروتين، وهو ما يزيد ~ 35 أضعاف من 0.021 ميكروغرام / ملغ β كاروتين التي تنتجها سلالة مع ERG20 وحدها. وبالمثل ، فإن إنتاج الليكوبين هو ~ 16.5 أضعاف أعلى في سلالة مع BTS1 - ERG20 (1.126 ميكروغرام / ملغ) مقارنة مع ERG20 (0.068 ميكروغرام / ملغ) وحدها(الشكل 8C).

المستنسخة متعددة الجينات plasmids تحولت إلى الخميرة مع (أ) BTS1 - ERG20 الانصهار TU و (ب) ERG20 TU. على كل لوحة، والخميرة على الجانب الأيسر لديه البلازميدات التي تحتوي على CRTE TU، crtYB TU و CRTI TU لإنتاج β-كاروتين والخميرة على الجانب الأيمن لديه البلازميدات التي تحتوي على CRTE TU، crtYB (G247A)TU، وCRTI TU لإنتاج الليكوبين.

لplasmid التكاملية، وConLS'، sfGFP التسرب، ConRE'، HIS3 (علامة اختيار الخميرة)، ADE2 5 'و 3' تم تجميع الأسلحة homology بعد الخطوة 4.1.2. وكانت الأسلحة 5 'و 3'homology 500 نقطة أساس وبصرف النظر، وحذف ~ 180 الأحماض الأمينية بعد التكامل. بالإضافة إلى ذلك ، كان الذراع 5 'homology ستة codons وقف نحو نهايتها 3'. أدي ADE2 تحور أدى إلى المستعمرات الحمراء50. تم استخدام ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 واتبعت الخطوة 5.1 للتكامل الجينومي. بعد 3-4 أيام ، لوحظت المستعمرات الحمراء على لوحة YPD + 100 ميكروغرام / مل نورسيوتريسين ، مما يشير إلى أن ADE2 قد تعطلت بنجاح (الأرقام 8D و 8E).

Figure 1
الشكل 1:نظرة عامة على التجميع متعدد الجينات. الجمعية تجري على ثلاثة مستويات. In0 المستوى 1، وCDS، أو أي جزء آخر، يتم تضخيمها من الجينوم أو توليفها، ومن ثم استنساخها في ناقلات إدخال pYTK001 باستخدام إنزيم BsmBI (أو Esp3I). ColE1: E. القولونية أصل النسخ المتماثل; CmR: الكلورامفينيكول الجينات المقاومة. في المستوى 2، يتم تجميع وحدة النسخ (TU) التي تحتوي على مروج وCDS ومنهي باستخدام إنزيم BsaI. في المستوى 3، يتم تجميع ما يصل إلى خمس وحدات نسخ في بلازميد متعدد الجينات باستخدام إنزيم BsmBI (أو Esp3I). يمكن أن يكون البلازميد متعدد الجينات إما متماثلا أو تكامليا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصميم التمهيدي والاستنساخ من plasmids جزء. (أ) تصميم التمهيدي لتضخيم الأجزاء الفردية، وتدجين الجينات أو خلق الطفرات نقطة، وتجميع البروتينات الانصهار. وتشمل التمهيديات BsmBI وBsaI الاعتراف وقطع المواقع وMoClo معلقة للتجميع السليم. يتم تمثيل تراكمات موكلو على النحو 1، 2، 3، 4، و 5، 6، 7، 8. التمهيديات الداخلية للتدجين أو خلق بروتين الانصهار يحتوي على BsmBI ولكن ليس مواقع BsaI. وتراكمات لهذه هي تسلسلات داخلية مخصصة (NNNN وN'N'N'N' باللون الأرجواني). يتم تضمين محطة "ttt" لهضم الإنزيم الأمثل. GOI: جين الفائدة. (ب)استنساخ أجزاء مكبرة في ناقلات إدخال pYTK001 باستخدام BsmBI (أو Esp3I). وتؤدي التراكمات التكميلية إلى دمج الجزء وإزالة موقع الاعتراف ب BsmBI. ColE1: E. القولونية أصل النسخ المتماثل; CmR: الكلورامفينيكول الجينات المقاومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تجميع وحدة النسخ. لتجميع plasmids TU، ينصح تجميع ناقل وسيطة لتسهيل التجميع TU combinatorial. لتجميع المتجه الوسيط، استنسخ Con LX (X: أحد الموصلات اليسرى الخمسة)، والتسرب من sfGFP، وCON RY (Y: أحد الموصلات اليمنى الخمسة)، وORI الخميرة (أصل النسخ المتماثل)، وجزء علامة الخميرة في ناقل التسرب mRFP1 باستخدام إنزيم BsaI. البلازميد المتوسط مقاوم للأمبيسلين. يتم الاحتفاظ بمواقع التعرف على BsaI لاستنساخ TU plasmid. لاستنساخ TU plasmid، يتم تجميع المروج، CDS، والمنهي في ناقلات وسيطة باستخدام BsaI. وسيكون لTU المستنسخة مواقع BsmBI في منطقتي ConLX وConRY للخطوة التالية متعددة الجينات التجميع. وTU المستنسخة هي أيضا مقاومة للأمبيسلين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم ConLX (موصل الأيسر) مروج الاقراص المدمجه فاصل ConRY (الموصل الأيمن)
BTS/ERG20 تو هل pENO2 BTS1/ERG20 tTDH2 R1
ERG20 تو هل pENO2 ERG20 tTDH2 R1
crtE تو L1 pTIP1 crtE tHSP26 R2
crtYB تو L2 pPDC1 crtYB tADH2 R3
crtYBG247A تو L2 pPDC1 crtYBG247A tADH2 R3
crtI تو L3 pPYK1 crtI tACS2 اعاده

الجدول 1: وحدات النسخ المستخدمة في هذه الدراسة. تم تضخيم المروجين والمنهيين من S. cerevisiae. BTS1 (geranylgeranyl ثنائي الفوسفات synthase) وERG20 (فارنسيل بيريوسفات synthetase) تم تضخيمها من S. cerevisiae. الجينات crtE (geranylgeranyl ثنائي الفوسفات synthase), crtYB (ثنائي الوظائف الليكوبين سيكلاسي / فيتوين synthase), وcrtI (فيتوين desaturase) كانت من Xanthophyllomyces dendrorhous.

Figure 4
الشكل 4: متعدد الجينات plasmid التجمع. (أ) تجميع البلازميد النسخ المتماثل. ويشمل تجميع ناقلات وسيطة متماثلة استنساخ LS Con'، التسرب sfGFP، وCON RE'، وORI الخميرة، وعلامة الخميرة، وأصل كولاي E. وعلامة على ناقلات التسرب mRFP1 باستخدام إنزيم BsaI. يقدم موقعا ConLS وConRE مواقع التعرف على BsmBI إلى المتجه. يمكن فحص التجميعات الصحيحة المحتملة من خلال البحث عن مستعمرات خضراء على طبق انتقائي مع الكاناميسين. ويمكن بعد ذلك استنساخ وحدات TUs التي تم تجميعها سابقا في المتجه الوسيط باستخدام إنزيم BsmBI. يحتوي هذا البلازميد على الخميرة ORI مما يسمح لها بالتكاثر في مضيف الخميرة. (ب) تجميع البلازميد التكاملي. تجميع ناقلات وسيطة تكاملية تشمل استنساخ كون LS'، التسرب sfGFP، وCON RE'، ذراع 5 'homology، ذراع 3 'الأوهام، علامة الخميرة، وE. القولونية الأصل وعلامة في ناقلات التسرب RFP باستخدام إنزيم BsaI. يجب أن تظهر التجميعات الصحيحة باللون الأخضر على طبق انتقائي مع الكاناميسين. يمكن استنساخ وحدات النسخ التي سبق صنعها في ناقل وسيط متماثل باستخدام إنزيم BsmBI. هذا المتجه ليس لديه ORI الخميرة وسيتم دمجها في الموضع المستهدف من خلال CRISPR وإعادة التركيب متجانسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم TU1 TU2 TU3 TU4 حاصل الضرب
ب/إي-β كاروتين BTS1/ERG20 crtE crtYB crtI β كاروتين
B/E-الليكوبين BTS1/ERG20 crtE crtYBG247A crtI الليكوبين
β كاروتين ERG20 crtE crtYB crtI β كاروتين
الليكوبين الإلكتروني ERG20 crtE crtYBG247A crtI الليكوبين

الجدول 2: البلازميدات متعددة الجينات المستخدمة في هذه الدراسة.

Figure 5
الشكل 5: كريسبر التكامل. (أ)CRISPR ومساعد استنساخ البلازميد. وpCAS plasmid يحتوي على الإندونوكليا Cas9 والمكونات (tRNA المروج، SNR52 المنهي، HDV ريبوزيم، وتراكرنا) للتعبير الأمثل عن الجيش الملكي النيبالي. استنساخ pCAS + gRNA plasmid عن طريق تجميع الحمض النووي الريبي الاصطناعية مع pCAS خطي باستخدام استنساخ جيبسون. (ب)CRISPR ساعد التكامل الجيني. الخطوة 1: التحويل المشترك: تم تحويل pCAS + gRNA إلى خميرة مع البلازميد التكاملي الذي يحتوي على الجين (الجينات) ذات الاهتمام (GOI) ، وهي علامة انتقائية الخميرة ، ومنطقة 5 و 3 'homology التي تستهدف الموضع الجينومي. للتكامل الأمثل، linearize البلازميد التكاملي مع نوتي. الخطوة 2: التكامل في الموضع المستهدف: زراعة الخميرة المحولة على طبق انتقائي لعلامة الخميرة ، إما مضاد حيوي أو أوكستروفيك. إجراء كتابة جينية لتأكيد التكامل. الخطوة 3: علاج pCAS + gRNA plasmid عن طريق streaking الخميرة على لوحة غير انتقائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6:لوحات تمثيلية لمتجه الدخول واستنساخ مستوى وحدة النسخ في الإشريكية القولونية. لوحات تمثيلية من الاستنساخ الناجح لجين في ناقلات دخول pYTK001 تحت (أ) الضوء المرئي و (ب) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الإيجابية هي مستعمرات بيضاء وسلبية خضراء. نسبة المستعمرات الإيجابية عموما هو 90.35 ± 4.22 ٪. التجميع الناجح للمتجه الوسيط لتجميع مستوى وحدة النسخ واختيار الأخضر / الأحمر تحت (C) الضوء المرئي و (D) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الإيجابية خضراء. نسبة المستعمرات الإيجابية عموما هي 17.56 ± 3.32 ٪. التجميع الناجح لوحدة النسخ من المتجه الوسيط وفحص الأخضر / الأبيض تحت (E) الضوء المرئي و (F) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الإيجابية هي مستعمرات بيضاء وسلبية خضراء. نسبة المستعمرات الإيجابية عموما هي: 65.02 ± 3.32 ٪. والبيانات مستمدة من ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: لوحات تمثيلية من استنساخ البلازميد متعدد الجينات في الإشريكية القولونية. تجميع المتجه الوسيط لتجميع متعدد الجينات واختيار الأحمر / الأخضر تحت (أ) الضوء المرئي و (ب) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الإيجابية هي مستعمرات خضراء وسلبية حمراء. تبلغ نسبة المستعمرات الإيجابية بشكل عام 1.83 ± 0.15٪. تجميع ناجحة من TUs متعددة من ناقلات المتوسطة واختيار الأخضر / الأبيض (C) تحت الضوء المرئي و (D) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الإيجابية بيضاء. نسبة المستعمرات الإيجابية عموما هو 93.77 ± 1.65٪. تجميع دون المستوى الأمثل من البلازميد متعدد الجينات تحت (E) الضوء المرئي و (F) ضوء الأشعة فوق البنفسجية. عدد المستعمرات الإيجابية لا يكاد يذكر. والبيانات مستمدة من ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: لوحات تمثيلية من البلازميدات التكاملية والمستنسخة في الخميرة. المستنسخة متعددة الجينات plasmids تحولت إلى الخميرة مع (أ) BTS1 - ERG20 الانصهار TU و (ب) ERG20 TU. على كل لوحة، والخميرة على الجانب الأيسر لديه البلازميدات التي تحتوي على CRTE TU، crtYB TU و CRTI TU لإنتاج β-كاروتين والخميرة على الجانب الأيمن لديه البلازميدات التي تحتوي على CRTE TU، crtYB (G247A)TU، وCRTI TU لإنتاج الليكوبين. (ج)تحديد كميا β كاروتين والليكوبين من استخراج الخميرة مع أربعة البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس. تم تسجيل الامتصاص الأقصى في 450 نانومتر و 470 نانومتر β كاروتين والليكوبين على التوالي. وقد أجري القياس الكمي المطلق باستخدام معاييرأصلية (الشكل التكميلي S3). الانصهار من BTS1-ERG20 يؤدي إلى إنتاج ~ 35 أضعاف أعلى β كاروتين و ~ 16.5 أضعاف أعلى الليكوبين بالمقارنة مع ERG20 وحدها. لوحات تمثيلية لتعطيل الموضع ADE2 عن طريق دمج البلازميد التكاملي متعدد الجينات مع الحمض النووي الريبي وليس الحمض النووي المساعد(D)ومع الحمض النووي الريبي وplasmid التكاملية متعددة الجينات كما الحمض النووي المساعد(E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد التكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر مجموعة الاستنساخ القائمة على MoClo التي طورها Lee et al. موردا ممتازا للتجميع السريع لوحدات النسخ من واحد إلى خمسة في بلازميد متعدد الجينات إما للتكرار أو الاندماج في جينوم الخميرة. استخدام هذه المجموعة يلغي اختناق الاستنساخ المستهلكة للوقت التي توجد في كثير من الأحيان للتعبير عن جينات متعددة في الخميرة.

اختبرنا خمسة شروط مختلفة لدورات الهضم / الربط لاستنساخ البوابة الذهبية مع ربط الحمض النووي T4. وجدنا أن 30 دورة من الهضم في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وربط في 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها خطوة الهضم النهائي في 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وخطوة تعطيل البروتين في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أدى إلى 99.5٪ المستعمرات التي يحتمل أن تكون صحيحة في تجميع 4 قطع (الشكل التكميلي S1 والجدول S3). الربط عند 16 درجة مئوية يضمن نشاط الربط الأمثل وتراكم العلة. الهضم النهائي عند 50 درجة مئوية يمنع المنتجات المهضومة من إعادة الربط. تم اتباع هذه الدورة لجميع ردود فعل التجميع ما لم ينص على خلاف ذلك.

كما وجدنا بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى اهتمام خاص لتحقيق أفضل النتائج. نوصي بشدة بتجميع ناقلات وسيطة مع التسرب sfGFP قبل تجميع وحدات النسخ. من الناحية النظرية ، يمكن استنساخ جميع الأجزاء السبعة في ناقلات الإشريكية القولونية مع mRFP1 ، يليها فحص أحمر / أبيض. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يتطور اللون mRFP1 ببطء شديد ، ومن الصعب التمييز بين مستعمرات الإشريكية القولونية الحمراء الشاحبة والصفراء الشاحبة تحت الضوء المرئي. كما يمتص sfGFP في نطاق الأشعة فوق البنفسجية52، وذلك باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو ترانزيوميناتور الضوء الأزرق يسهل فحص المستعمرات الخضراء الزاهية. أيضا، استنساخ ناقل وسيط يسمح بتجميع أكثر سهولة من مختلف المروج، CDS، ومجموعات المنهي، مما يتيح إنشاء مكتبة combinatorial أسهل، منذ تجميع مع أربعة أجزاء عادة ما يؤدي إلى مستعمرات أكثر إيجابية من التجمع مع أجزاء أكثر. يظهر الشكل التكميلي S2 انخفاضا تدريجيا في نسبة المستعمرات الصحيحة المحتملة من 6 قطع إلى تجميع من 8 قطع.

يجب قياس تركيزات جميع الأجزاء بدقة لضمان تركيز متساوي الكائنات لكل جزء. عادة ما يكون قياس الأجزاء باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية كافيا ولكن الطرق الأكثر حساسية، مثل المقايسات المستندة إلى الفلورسينس، قد تعطي نتائج أفضل. الفشل في تحديد جميع الأجزاء بدقة غالبا ما يؤدي إلى كفاءة تجميع منخفضة. وينبغي للمرء أن يختار Esp3I عالية الكفاءة وBsaI -HFv2، على التوالي. لاحظنا أن T4 يعمل بشكل جيد لكل من يتدلى في عدة وتراكمات مخصصة ضرورية لدمج جزأين، وهو ما يتفق مع الأدب36،على الرغم من أن الورقة الأصلية أوصت T7 ligase6. زيادة عدد الدورات يمكن أن تزيد من عدد المستعمرات الصحيحة المحتملة إلى حد ما. على سبيل المثال، 25 دورة من الهضم والربط كافية لتجميع ثلاثة إلى أربعة أجزاء ولكن 30-35 دورات تعطي نتائج أفضل لمزيد من الأجزاء.

استراتيجية MolClo مفيدة على طرق التجميع البديلة متعددة الجزاء8و9و10و11و12 لأنها تسمح بالاستنساخ المعياري ومتعدد الاستخدامات للغاية. ومع ذلك ، فإن القيد الأساسي هو خطوة التدجين لأن الأجزاء تحتوي في بعض الأحيان على مواقع BsmBI أو BsaI أو NotI متعددة. تحور جميع الأجزاء يمكن أن تكون مضيعة للوقت. في هذه الحالة، يمكن للمرء أن النظر في توليف CDS دون هذه المواقع تقييد. ومع ذلك ، بالنسبة للمروجين والمنهيين ، قد يؤدي تحور حتى النيوكليوتيدات الواحدة إلى تغيير وظائفهم. ولذلك، من المستحسن التحقق من صحة نشاط هذه الأجزاء باستخدام المقايسة مراسل39. وهناك قيد آخر هو أن هذه المجموعة تسمح فقط ما يصل إلى خمس وحدات النسخ في البلازميد متعدد الجينات. إذا رغبت في المزيد من وحدات النسخ ، فقد يتم إنشاء موصلات إضافية عن طريق تحديد مجموعة من المعلقات المتوافقة للغاية36.

توفر المجموعة 27 مروجا وستة منهيين وسبع علامات لاختيار الخميرة ومصدرين للخميرة من النسخ المتماثل. يمكن استنساخ الأجزاء المخصصة ، مثل المروجين والمنهيين ، سواء كانت أصلية أو اصطناعية ، في متجه الإدخال بعد هذا البروتوكول. وقد استخدمت مجموعة MoClo الخميرة في المقام الأول للإفراط في التعبير عن مسارات التمثيل الغذائي متعدد الجينات لإنتاج المواد الكيميائية ذات القيمة العالية في الخميرة. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول عندما يتم المرغوب مفاتيح مختلفة للدوائر البيولوجية في الخميرة. وهناك أيضا إمكانات هائلة لتطبيق هذه المجموعة للتحقيق في الأسئلة البيولوجية الأساسية حول التفاعلات البروتين البروتين، وتوطين البروتين، وأنشطة الانزيم. وعموما، فإن هذا البروتوكول مرن للغاية وموثوق به ويمكن أن يدعم أي استنساخ صعب في بيولوجيا الخميرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث لجامعة ولاية نيويورك (الجائزة رقم: 71272) وجائزة IMPACT للجامعة في بافالو (الجائزة رقم: 000077).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Glass beads RPI research products 9831 For lysing yeast cells
Bacto Agar BD & Company 214010 Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone BD& Company 211677 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2 New England Biolabs R3733S a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin Fisher Bioreagents 4800-94-6 Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol Fisher Bioreagents 56-75-7 Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His Sunrise Sciences 1006-010 Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose Fisher Chemical D16-500 Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD & Company 291940 Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix Promega U1515 dNTPs for PCR
Esp3I New England Biolabs R0734S a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit Zymo Research T2001 For yeast transformation
Hexanes Fisher Chemical H302-1 For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin Fisher Bioreagents 25389-94-0 Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller Fisher Bioreagents BP1425-2 Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller Fisher Bioreagents BP1426-2 Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene Cayman chemicals NC1142173 For lycopene quantification
MoClo YTK Addgene 1000000061 Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England Biolabs T1010L For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000c For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF New England Biolabs R3189S Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate Goldbio N-500-100 Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X) New England Biolabs B0518S Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494 Addgene 100539 Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette Thermo Electron 10050801 For quantifing carotenoids
T4 ligase New England Biolabs M0202S Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler BIO-RAD 1851148 For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer Bullet Blender Model: BBX24 For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Genesys 150 For quantifing carotenoids
Yeast Extract Fisher Bioreagents BP1422-500 Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene Alfa Aesar AAH6010603 For β-carotene quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 168، موكلو، Saccharomyces cerevisiae،الهندسة الأيضية، تعبير heterologous، CRISPR، تحرير الجينوم
التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z.… More

Mukherjee, M., Caroll, E., Wang, Z. Q. Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning. J. Vis. Exp. (168), e61993, doi:10.3791/61993 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter