Summary
Denne protokol beskriver en reporter analyse for at studere reguleringen af mRNA oversættelse i enkelt oocytter under in vitro modning.
Abstract
Begivenheder i forbindelse med oocytkernemodning er blevet godt beskrevet. Men meget mindre er kendt om de molekylære veje og processer, der finder sted i cytoplasmaet som forberedelse til befrugtning og erhvervelse af totipotens. Under oocytmodning afhænger ændringer i genekspression udelukkende af oversættelse og nedbrydning af moderens messenger RNA'er (mRNA'er) snarere end af transskription. Udførelsen af oversættelsesprogrammet spiller derfor en central rolle i etableringen af oocyt udviklingskompetence til at opretholde embryoudvikling. Dette papir er en del af et fokus på at definere programmet for moderens mRNA oversættelse, der finder sted under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang. I dette metodedokument fremlægges en strategi for undersøgelse af reguleringen af oversættelsen af mål mRNA'er under in vitro oocyt modning. Her er en Ypet reporter smeltet til de 3 'uoversatte region (UTR) af genet af interesse og derefter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenyleret mRNA kodning for mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Ved at bruge time-lapse mikroskopi til at måle reporter akkumulering, er oversættelse satser beregnes ved forskellige overgange under oocyt meiotisk modning. Her er protokollerne for oocytisolation og injektion, time-lapse-registrering og dataanalyse blevet beskrevet ved hjælp af Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reporter som et eksempel.
Introduction
En fuldt udvokset pattedyr oocyt gennemgår hurtige ændringer i forberedelsen til befrugtning og erhvervelse af totipotency. Disse ændringer er afgørende for at opretholde embryonal udvikling efter befrugtning. Selv om de begivenheder, der er forbundet med nuklear modning er relativt godt beskrevet, meget mindre er kendt om de molekylære processer og veje i oocyt cytoplasma. I de sidste faser af oocytmodningen er oocytter transskriptionsløst tavse, og genekspressionen er helt afhængig af mRNA-oversættelse og -nedbrydning1,2. Syntesen af proteiner, der er kritiske for udviklingskompetence, er derfor afhængig af et program med tidsindvis oversættelse af langlivede mRNA'er, der er blevet syntetiseret tidligere under oocytvækst1,3. Som en del af et fokus på at definere dette program af moderens mRNA oversættelse udført under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang, præsenterer dette papir en strategi for at studere aktivering og undertrykkelse af oversættelsen af målet maternelle mRNA'er i enkelt oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metode er YPet åben læseramme klonet opstrøms for 3 'UTR af udskriften af interesse. Dernæst er mRNA'er, der kodning denne reporter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenylerede mRNA'er kodning mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Reporter akkumulering måles under in vitro oocyt meiotisk modning ved hjælp af time-lapse mikroskopi. Akkumulering af gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres af det plateauede niveau af den co-injicerede mCherry. Efter dataindsamlingen beregnes omregningshastighederne for forskellige tidsintervaller under in vitro oocytmet meiotisk modning ved at beregne hældningen af kurven opnået ved kurvetilpasning.
Denne tilgang giver et værktøj til eksperimentelt at bekræfte ændringer i oversættelsen af udvalgte endogene mRNA'er. Desuden gør denne metode det lettere at karakterisere de lovgivningsmæssige elementer, der styrer oversættelsen under oocytmeiotisk modning ved at manipulere cis-regulatoriske elementer i 3' UTR af mål mRNA4,5,6. Manipulation af poly(A) halelængden giver også indsigt i adenylase/deadenylaseaktivitet i oocytter5. Mutagenesis af cis-virkende elementer eller RNA immunoprecipitation kan bruges til at studere interaktioner med cognate RNA bindende proteiner6,7. Derudover kan denne metode bruges til at identificere væsentlige komponenter i oversættelsesprogrammet, der er kritiske for oocyte udviklingskompetence ved at måle mål 3 'UTR oversættelse i modeller forbundet med nedsat oocyt kvalitet 8,9,10. Denne metode papir præsenterer et repræsentativt eksperiment, hvor denuded oocytter af 21-dages gamle C57/BL6 mus er blevet mikro-injiceres med en Ypet reporter smeltet til 3 'UTR af IL-7. Opsætningen og protokollen for oocytinjektion, time-lapse-registrering og dataanalyse er blevet beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgsprocedurerne med dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee fra University of California i San Francisco (protokol AN182026).
1. Forberedelse af medier
- Tilføj alle komponenter, som beskrevet i tabel 1, for at gøre den grundlæggende oocytsamlingsmedium og oocytmodningsmedium. For det grundlæggende indsamlingsmedium skal pH-vinduet indstilles til 7,4. For både indsamlings- og modningsmedium tilsættes 3 mg/mL bovin serumalbumin (BSA) og 1 μM cilostamid på brugsdagen.
2. Forberedelse af mRNA-kodning til Ypet-3' UTR og mCherry
- Få de 3 'UTR sekvenser af mRNA'er af interesse.
BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev sekvenser tidligere opnået fra mus oocyt cDNA. - Design primere til at forstærke målet 3 'UTRs fra oocyt cDNA og dele af pcDNA 3.1 vektor, der indeholder en Ypet kodning sekvens, V5-epitope tag, og en T7 promotor.
- Forstærk ved hjælp af et hi-fi DNA polymerase kit. Kør polymerase kædereaktion (PCR) produkter på en gel for at kontrollere, om fragmenterne har den korrekte størrelse, skæres ud af bands, og udtrække DNA fra gelen ved hjælp af en gel ekstraktion kit i henhold til producentens anvisninger.
- Sammensmelt PCR-fragmenterne med en vektor ved hjælp af et PCR-kloningssæt.
BEMÆRK: PCR-fragmenter blev inkuberet på is i 4 timer for at lette en mere effektiv rekombinationsproces. Dette er i strid med producentens anvisninger, som anbefaler en inkubationstid på kun 45 min. - Transfekt PCR fragmenter i kompetente 5-α Escherichia coli bakterier.
- Tilsæt blandingen og plasmid til bakterierne, og inkubat på is i 30 min.
- Blandingen og plasmidet opvarmes ved at placere blandingen i et vandbad ved 42 °C i 45 s og straks afkøles på is i 3 min.
- Der tilsættes 500 μL superoptimal bouillon med katabolitundertrykkelsesmedtryk (SOC) og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
- Spin ned på 7000 × g i 2 min, og fjern det meste af supernatanten. Resuspend og plade på en Luria Bouillon (LB) agar plade med passende udvælgelse antibiotikum.
BEMÆRK: Carbenicillin blev brugt i denne undersøgelse. - Inkuber natten over ved 37 °C. Kolonierne isoleres ved let at trykke på en pipettespids på en af kolonierne og placere den i 3 mL LB-medium med 100 μg/mL carbenicillin. Inkuber i 12-24 timer ved 37 °C.
- Plasmidernes DNA udtrækkes ved hjælp af plasmid-DNA-isolationssættet i overensstemmelse med producentens anvisninger, og sekvenserne bekræftes via DNA-sekventering.
- For Ypet/3' UTR:
- Fremstil en lineær PCR-skabelon til in vitro-transskribering. Brug en fremad primer opstrøms for Ypet sekvensen og en omvendt primer med 20 ekstra thymine rester. Se tabel 2 for sekvensen af Ypet/IL-7 3' UTR og sekvenserne af de forreste og omvendte primere.
BEMÆRK: Disse ekstra thyminrester vil tilføje oligo(A) til det lineære mRNA efter in vitro transskription. - In vitro transskriberer PCR-produktet ved hjælp af et T7-transskriptionssæt i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Purificer det resulterende komplementære RNA (cRNA) ved hjælp af et transskriberingsoprydningssæt i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Elute den rensede cRNA i RNAse-fri vand, måle koncentrationen og evaluere integriteten ved agarose elektroforese. Opbevares ved −80 °C.
- Fremstil en lineær PCR-skabelon til in vitro-transskribering. Brug en fremad primer opstrøms for Ypet sekvensen og en omvendt primer med 20 ekstra thymine rester. Se tabel 2 for sekvensen af Ypet/IL-7 3' UTR og sekvenserne af de forreste og omvendte primere.
- For mCherry:
- Fremstil en lineær PCR-skabelon til in vitro-transskription ved hjælp af et high-fidelity restriktionsenzym. brug restriktionsenzymet mfEI-HF, hvis du gentager dette eksempel. Fordøjes i en fordøjelsesbuffer natten over ved 37 °C.
- Kør en gel for at rense prøven, og ekstrakt det lineære DNA ved hjælp af en gel ekstraktion kit i henhold til producentens anvisninger.
- In vitro transskriberer PCR-produktet ved hjælp af et T7-transskriptionssæt i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Polyadenylat cRNA (150-200 nukleotider) ved hjælp af et poly(A) tailing kit i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
- Purificer det resulterende cRNA ved hjælp af et transskriberingsoprydningssæt i henhold til producentens anvisninger.
- Elute det rensede cRNA i RNAse-fri vand, mål mRNA-koncentrationer, og vurder meddelelsesintegriteten ved gelelektroforese. Opbevares ved −80 °C.
3. Forsøgsprocedure
BEMÆRK: Figur 1inserker en skematisk oversigt over mikroinjektion af oocyt og efterfølgende time-lapse-mikroskopi .
- Dag 1
- Intraperitoneally injicere 21-dages gamle mus med 5 IE af gravide hoppens serum gonadotropin at fremme follikel vækst til antral fase11.
- Dag 3
- Oocyte kollektion
- Ofre mus 44-48 timer efter grunding at indsamle æggestokkene, og læg dem i en plastik Petri parabol med grundlæggende oocyt indsamling medium.
- Åbn forsigtigt antralsækkene ved at lave et lille snit i follikelvæggen med en 26 G nål. Isoler intakte cumulus-lukkede oocytter (COCs) med flere lag cumulus celler ved hjælp af en mund-drevet glas pipette.
- Brug en mindre pipette (lidt større end oocyttens diameter), og aducer mekanisk COC'erne ved gentagen pipettering.
BEMÆRK: Alternativt kan du udføre mikroinjektion på intakte COC'er. - Ved hjælp af en større pipette aspireres de denuded oocytter og placeres i en petriskål med modningsmedium suppleret med 1 μM fosfordiesterasehæmmer, cilostamid, for at forhindre genoptagelse af meiotisk modning12. Placer skålen i inkubatoren i 2 timer for at lade oocytterne komme sig efter stress forårsaget af isolering af oocytterne fra folliklerne.
- Oocyt mikro-injektion
- Forbered injektionsnålene ved at placere et 10 cm langt borosilikatglaskapillærrør i en mekanisk aftrækker. For optimal injektion skal nålespidsen bøjes i en 45°-vinkel ved hjælp af en opvarmet glødetråd.
- Forbered polystyren retter med 20 μL dråber af grundlæggende oocyt opsamling medium, og dække dråber med let mineralsk olie.
- Forbered en reporterblanding ved at tilsætte 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR og 12,5 μg/μL mCherry. Forbered et større volumen og lav aliquots til fremtidige eksperimenter for at sikre lignende reporterkoncentrationer. Disse aliquots opbevares ved -80 °C. Ved optøning, første centrifuge aliquot i 2 min ved 20.000 x g, og overføre til en ny mikrocentrifuge rør.
BEMÆRK: Denne centrifugering forhindrer injektionsnålen i at blive tilstoppet af potentielle aggregater i reporterblandingen. - Injektionsnålen indlæses med kapillaritet med ca. 0,5 μL reporterblanding.
- Placer holdepipetten og den lastede injektionsnål i holderne, og placer den i dråben på oocytopsamlingsmediet. Indsug noget af mediet ind i holdepipetten.
- Åbn injektionsnålen ved forsigtigt at banke den mod holdepipetten.
- Placer oocytter i en dråbe af grundlæggende indsamling medium, og injicere 5-10 pL af reporter mix.
- Oocytterne inkuberes i modningsmediet med 1 μM cilostamid i 16 timer, så mCherry-signalet kan plateau.
- Forbered en petriskål, der skal bruges til time-lapse mikroskopi med mindst to 20 μL dråber modningsmedium til hver injiceret reporter: en dråbe med 1 μM cilostamide til kontrolprofase I-anholdt oocytter og en dråbe uden cilostamide til modning af oocytter. Dæk dråberne med let mineralsk olie og læg dem i inkubatoren.
- Time-lapse mikroskopi
- Efter forinkubation fjernes de injicerede oocytter fra inkubatoren og vaskes fire gange i modningsmedium uden cilostamide. Hold nogle oocytter i modningsmedium med 1 μM cilostamide som en profase I-arresteret oocytkontrolgruppe.
- Overfør de injicerede oocytter til deres respektive dråber på den tidligere forberedte time-lapse mikroskop skål. Klynge oocytterne ved hjælp af en lukket glaspipette (en lukket pipette kan fremstilles ved at holde spidsen i en flamme i et par sekunder).
BEMÆRK: Klyngedannelse af oocytterne hjælper med at forhindre deres bevægelse under optagelsen. - Skålen anbringes under mikroskopet, der er udstyret med et lysdiodebelysningssystem og et motoriseret trin, der er udstyret med et miljøkammer, der holdes ved 37 °C og 5% CO2. For at gentage denne undersøgelse skal du bruge følgende parametre: filtersæt: dichroic mirror YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-kanal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Emission (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Angiv de relevante indstillinger for time-lapse-eksperimentet (se Materialetabel for den software, der bruges i denne undersøgelse): Klik på Apps | Flerdimensionel anskaffelse. Vælg den første fane Hoved, og vælg timelapse, flere stadieplaceringerog flere bølgelængder.
- Vælg fanen Gem for at angive den placering, hvor eksperimentet skal gemmes.
- Vælg fanen Timelapse for at angive antallet af tidspoint, varighed og tidsinterval.
BEMÆRK: Varigheden af time-lapse-forsøget afhænger af de undersøgte dyrearter, da timingen af oocytmetiotisk modning varierer mellem arterne. I dette eksperiment med muse oocytter blev oocytter registreret hvert 15. minut i 16 timer. - Vælg fanen Fase. Tænd for brightfield, og find oocyternes position ved at åbne et nyt vindue ved at vælge Hent | Erhverve | Vis Live. Når oocytterne er placeret, skal du skifte tilbage til vinduet Multi dimensional Acquisition og trykke på + for at angive oocytternes placering.
- Vælg fanen Bølgelængder, og sæt 3 forskellige bølgelængder for brightfield (eksponering 15 ms), YFP (eksponering 150 ms for Ypet/IL7 3' UTR) og mCherry (eksponering 75 ms for Ypet/IL7 3' UTR).
BEMÆRK: Juster eksponeringen for hver Ypet/3' UTR-reporter baseret på niveauet for reporterakkumulering og det injicerede volumen. Sørg for, at YFP-signalet falder i midten af detektionsområdet ved forsøgets start for at forhindre undervurdering eller mætning i tilfælde af aktivering af oversættelse. For mCherry justeres eksponeringen for hvert parti mCherry, da signalet afhænger af antallet af adeninkerner, der blev tilføjet under polyadenyleringsproceduren. På grund af variationen i polyadenyleringseffektiviteten skal du bruge det samme parti mCherry i forskellige eksperimenter for at få en bedre sammenligning mellem eksperimenterne. - Start eksperimentet for tidsforskydning ved at klikke på Hent. Se figur 2 og supplerende fil for et eksempel på en time-lapse optagelse i en enkelt oocyt.
- Analyse af Ypet-3' UTR-oversættelse
- For denne analyse (se Tabel over materialer for den software, der anvendes i denne undersøgelse), udføre to region målinger for hver oocyte: oocyte selv-klik på ellipse region og omgiver oocyte-og en lille region tæt på oocyte, der skal anvendes til baggrund subtraktion-klik på rektangulær region.
BEMÆRK: Sørg for, at oocytterne ikke bevæger sig ud af det valgte område under tidsforskydningsregistreringen. Vær særlig opmærksom på placeringen af regionmålingen omkring polarkroppens ekstrudering, da dette forårsager bevægelse i oocytten og kan forvrænge optagelsen. - Eksporter områdemålingsdataene til et regneark ved først at klikke på Åbn log og derefter på Log data for at eksportere dataanalysesoftwaren.
- For hver enkelt oocyt og for alle målte tidspunkter skal baggrundsmålingen trækkes fra målingen af oocytområdet. Gør dette for YFP og mCherry bølgelængder separat.
- Tidspunktet for nedbrydning af germinalt vesikel (GVBD) og polær kropsekstrudering (PBE) registreres til senere brug.
BEMÆRK: Ekskluder modning af muse oocytter, når GVBD overstiger 2 timer. - Plot YFP og mCherry udtryk over tid for hver oocyte at tjekke for outliers.
BEMÆRK: Dette bør være en jævn kurve, hvis det ikke er dette kan indikere, at oocyt flyttet under optagelsen. - For hver enkelt oocyt skal du beregne det gennemsnitlige mCherry-udtryk for de sidste ti tidspunkter i optagelsen. For hvert tidspunkt skal du dividere YFP-udtrykket med det gennemsnitlige mCherry-udtryk for at korrigere for den injicerede diskenhed for at opnå et YFP/mCherry-forhold ved hvert tidspunkt for hver enkelt oocyt.
- Beregn oversættelseshastigheder for et bestemt tidsinterval ved at montere kurvens hældning efter lineær regression. Vurder forskellene i oversættelsesfrekvenser ved hjælp af statistisk slutning.
- For denne analyse (se Tabel over materialer for den software, der anvendes i denne undersøgelse), udføre to region målinger for hver oocyte: oocyte selv-klik på ellipse region og omgiver oocyte-og en lille region tæt på oocyte, der skal anvendes til baggrund subtraktion-klik på rektangulær region.
- Oocyte kollektion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denuded prophase I-anholdt oocytes af 21-dages gamle C57/BL6 mus blev injiceret med en reporter mix, der indeholder mRNA kodning af Ypet reporter smeltet til 3 'UTR af IL-7 og mRNA kodning mCherry. YFP og mCherry udtryk blev registreret i 39 oocytter, hvoraf 30 blev modnet, og 9 blev arresteret i prophase I som en negativ kontrol. Tre modne oocytter blev udelukket til analyse, fordi de enten havde en forsinket GVBD (N = 2) eller flyttede i skålen under optagelsen (N = 1). Figur 3 viser mCherry- og YFP-udtryk i profase I og modne oocytter. Figur 4 viser YFP-udtryk for modne oocytter korrigeret for plateaued mCherry-udtryk (gennemsnitligt mCherry-udtryk i de sidste 10 tidspunkter) for at korrigere for den injicerede diskenhed. Reporterens oversættelseshastigheder blev målt ved kurvetilpasning (lineær regression) YFP/mCherry-værdierne i profase I og i modne oocytter i løbet af de første 0-2 timer eller 8-10 timer efter cilostamidfrigivelsen (Figur 5A). Akkumuleringen af reporteren følger ikke et lineært mønster, som det fremgår af en signifikant forskel i oversættelseshastigheder mellem 0-2 timer og 8-10 timer efter cilostamidfrigivelse (p<0,0001; Figur 5B). Derfor indikerer disse resultater aktivering af IL-7 oversættelse under oocyt meiotisk modning.
Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsproceduren. Oligoadenylerede Ypet/3' UTR og polyadenylerede mRNA-kodnings-mCherry sprøjtes mikroindsprøjtet i denuded oocytter af 21-dages gamle C57/BL6 mus. Oocytter inkuberes i 16 timer i cilostamid indeholdende modningsmedium, så mCherry-signalet kan nå et plateau. Efter præinkubation startes en time-lapse-optagelse, hvor oocytter enten opbevares på medium med cilostamide for at skabe en profase I-arresteret kontrolgruppe eller frigives i cilostamidefrit medium til moden. Forkortelser: UTR = uoversat region; YFP = gult fluorescerende protein; fw primer = fremad primer; omdrejningsprimer = omvendt primer; Ampr = ampicillinresistens; polyA = polyadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = germinal vesikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempel på en enkelt oocyt time-lapse-optagelse. Brightfield-, YFP- og mCherry-optagelser af en enkelt oocyt, der injiceres med mRNA'er, der koder Ypet/Interleukin-7 3' UTR og polyadenyleret mCherry ved profase I, MI (6 timer efter cilostamideudgivelsen) og MII (15 timer efter cilostamideudgivelsen). Skalastang = 25 μm. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; GV = germinal vesikel; MI = metafase I; MII = metafase II. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: YFP- og mCherry-signaler optaget ved time-lapse-mikroskopi. YFP- og mCherry-signaler af oocytter injiceret med oligoadenyleret Ypet/IL7 3' UTR og polyadenyleret mRNA-kodning mCherry. Oocytes blev enten holdt på medium med cilostamid for at generere en profase I-anholdt kontrolgruppe (N = 9) eller frigivet i cilostamide-fri medium for at give mulighed for modning (N = 30). Data er individuelle oocytmålinger. Forkortelser: IL-7 = interleukin-7; YFP = gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: YFP-signal korrigeret for co-injiceret mCherry-niveau. YFP signaler prophase I-anholdt og modning oocytter blev korrigeret for injiceret volumen ved at dividere YFP signalet med den gennemsnitlige mCherry signal af de sidste 10 tid-point. Individuelle YFP/mCherry-forhold for (A) prophase I-arrested oocytes og (B) modning oocytter og middel ± standardfejl i de gennemsnitlige YFP/mCherry-forhold i (C) prophase I-arrested og (D) modning af oocytter. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; GVBD = opdeling af germinal vesikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Beregnede omregningshastigheder ved 0-2 timer og 8-10 h modning. 10 timer efter cilostamidfrigivelse og (B) oversættelseshastigheder (middel ± standardfejl i middelværdien) beregnet ved kurvetilpasning (lineær regression) YFP/mCherry-værdierne ved 0-2 timer og 8-10 timer efter cilostamidudgivelsen. Data blev analyseret ved hjælp af den uparrede tosidede t-test. *p < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:Eksempel på undertrykkelse af oversættelse: Oosp2. Re-analyseret data fra et eksperiment, hvor oocytter blev injiceret med Ypet-Oosp2 3 'UTR og polyadenyleret mRNA kodning mCherry. YFP-signaler om profase I-arrested (N=63) og modne oocytter (N=72) blev korrigeret for injiceret volumen ved at dividere YFP-signalet med det gennemsnitlige mCherry-signal for de sidste 10 tidspunkter. YFP- og mCherry-ekspressionsdata blev indhentet ved hjælp af en Xenon Arc-lampe i modsætning til IL-7-eksperimentet, hvor der blev anvendt en LED-lyskilde. Data repræsenterer middelværdien ± standardfejl i gennemsnittet af individuelle oocytmålinger og er tidligere offentliggjort i Luong et al. 5. Forkortelser: YFP = gult fluorescerende protein; Oosp2 = oocyt udskilles protein 2; UTR = uoversat region; IL-7 = interleukin-7; LED= lysdiode; GVBD = opdeling af germinal vesikel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Virkninger af eksponering for mikroinjektion og fluorescens på timingen af GVBD og PBE. Timing af GVBD og PBE af oocytter, der enten blev injiceret i mikroinsprøjtet og udsat for fluorescens (injiceret) eller ikke injiceret og ikke udsat for fluorescens (ikke injiceret). Data er individuelle oocytmålinger. Data blev analyseret ved hjælp af den uparrede tosidede t-test. *s<0,001. Forkortelser: GVBD = germinal vesikelopdeling; PBE= polar kropsekstrudering. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Grundlæggende oocyte kollektion medium | ||
| komponent | For 500 mL | |
| HEPES modificeret Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g | |
| Natriumbicarbonat | 252 mg | |
| Natrium pyruvat | 1,15 mL | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 mL | |
| Ultrapure destilleret vand (Invitrogen, 10977-015) | Op til 500 mL | |
| Modningsmedium | ||
| komponent | For 500 mL | |
| MEM alfa 1x | Op til 500 mL | |
| Natrium pyruvat | 1,15 mL | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | 5 mL | |
Tabel 1: Forberedelse af medierne. Liste over komponenter, der skal tilføjes for at forberede grundlæggende oocyte indsamling medium og oocyt modning medium.
| sekvens | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | 1984, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, SENEST A3-2001, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23. GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCGACCACATGAAGCAGCACTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CATCGGCGACGGCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCC 2. A) AT DER SKAL SKE EN NY FORORDNING OM BESKYTTELSE AF DE EUROPÆISKE SKABSSKABE OG OM INDFØRSTGØRELSE AF DE EUROPÆISKE SKABSSKABE, DER ER NØDVENDIGE FOR AT CCCTCTCCTCGTC GTCTACGCGTACCGGTCATCACCATTGAACAGGAC 1984, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, SENEST A3-2001, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23. 1984, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, KOMMISSIONEN MOD ITALIEN, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23. AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATAAAGATATATCAA 1984, S. 1773, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1989, 13.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, 1984, S. 1773, 1777, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989 1984, S. 1773, 1777, S. 1773, 1777, S. 1777, 1777, S. 1773, 1777, S. 1773, 1777, S. 1773, OG AF 17.12.1989, 1984, S. 1333, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, KOMMISSIONEN MOD ITALIEN, SML. 1979, S. 1773, PRÆMIS 23. 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1973, s. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 13.12.1989, S. 1333. 1984, s. 1973, s. 1973, s. 1777, og af 17.12.1989, s. 1333, og af 13.12.1989, s. 1333, og af 13.12.1989, 1984, S. 1973, S. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1773, 1777, S. 1777, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1773, 1777, S. 1777, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, SENEST 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1773, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, MIN 1984, s. 1773, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1989, PUNKT 2.1.122— 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1773, OG AF 17.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, S. 1333, OG AF 13.12.1989, 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, MIN 1984, S. 1333, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1989, 13.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 13.12.1989, MIN TAC MOD EN ANDEN AFTALE OM EN SÅDAN AFTALE, AT DER IKKE SKER NOGEN FORSKELSBEHANDLING PÅ GRUND AF VARER, HVIS DER ER FARE FOR, AT DER IKKE SKER FORSKELSBEHANDLING PÅ GRUND AF VARER, HVIS DER ER FARE FOR, AT DER KAN SKE EN FORSKELSBEHANDLING PÅ GRUND AFSKELSBEHANDLING PÅ GRUND AF VARER, DER ER ETABLERET I EN ANDEN 1984, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1973, S. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 17.12.1989, 1989, S. 1333, PRÆMIS 23. 1984, S. 1773, PRÆMIS 13, OG AF 17.12.1989, 13.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, MIN 1984, s. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 17.12.1989, 13.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 13.12.1989, KOMMISSIONEN MOD ITALIEN, SML. GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTTGATTTTGGCAAAATAAAGGATATTTT |
||||
| Fremad primer | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Omvendt primer | 1984, s. 1973, s. 1773, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, CCAAAATC |
||||
Tabel 2:Eksempel på reporter- og primersekvenser Sekvens af YFP/IL7 3'UTR-reporter og sekvenser af fremad- og omvendte primere, der blev brugt til at producere en lineær PCR-skabelon til in vitro-transskription.
Supplerende fil: Gul fluorescerende protein (YFP) og mCherry time-lapse optagelse. YFP- og mCherry-time-lapse-optagelser af en enkelt oocyt, der injiceres med mRNA'er, der koder Ypet/Interleukin-7 3' UTR og polyadenyleret mCherry. YFP-kanal (f.eks. S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry kanal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). Oocytterne blev registreret hvert 15. minut i 16 timer (7 billeder/ sekund). Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede metode beskriver en strategi for undersøgelse af aktivering og undertrykkelse af oversættelse af mål mRNA ved forskellige overgange under in vitro oocyt meiotisk modning. IL-7, en cytokin frigivet af oocyt, der kan være involveret i oocyt-cumulus cellekommunikation8,13, blev valgt med det formål at beskrive denne metode. IL-7 er kendt for at blive mere og mere oversat under oocyt modning8 og giver mulighed for god visualisering af translationel aktivering ved hjælp af denne metode. Hvis oversættelsen sker i konstant hastighed under hele eksperimentet, vil akkumulering af en journalist imidlertid følge et lineært mønster, og oversættelseshastighederne i begyndelsen og slutningen af eksperimentet vil være ens. Denne konklusion kan verificeres ved godhed i pasform (R) af en lineær regression gennem hele optagelsesintervallet. En undertrykkelse i reporter oversættelse vil præsentere sig selv som plateauing af YFP signal.
Et eksempel på undertrykkelse af 3 'UTR oversættelse, kan findes i undersøgelsen af Luong et al. 5, hvor forfatterne rapport undertrykkelse af Oocyte udskilles Protein 2 (Oosp2) under oocyt meiotic modning. Disse data er blevet analyseret igen og er vist i figur 6. De modne oocytter viser plateauing af YFP-signalet, hvilket indikerer undertrykkelse af oversættelse, mens den profasede I-anholdte kontrolgruppe følger et lineært mønster af reporterakkumulering, hvilket indikerer lignende oversættelseshastigheder i begyndelsen og slutningen af eksperimentet. Når man studerer undertrykkelse af oversættelse, er det især vigtigt at inkludere en prophase I-arresteret kontrolgruppe for at sikre, at plateauing af YPF-signalet ikke forklares ved et fald i oocytkvaliteten på grund af dårlige kulturforhold, hvilket bekræfter oocytternes levedygtighed. Akkumulering af reporter kan valideres ved kvantitative reverse-transskribering PCR ved hjælp af primere til YFP eller ved vestlige blotting ved at drage fordel af V5-epitop tag indgår i reporter i denne protokol.
Plateauing af YFP-signalet skyldes muligvis ikke kun aktiv reguleret undertrykkelse af oversættelse, men kan også forklares ved nedbrydningen af journalisten under oocytmeiotisk progression. Dette kan afspejle destabilisering af det endogene mRNA, som er afgørende for overgangen til embryonalt genomudtryk14,15,16. Denne mulighed kan verificeres ved at måle målgenudskriftsniveauer i prophase I-fasen vs. metafase II-fasen for at bekræfte mRNA'ernes stabilitet. Ved tilberedning af oocyt cDNA er det at foretrække at bruge tilfældig hexamer priming over oligo-dT priming. Sidstnævnte metode viser tilsyneladende forskelle i genudskriftsniveauer, der kan afspejle forskelle i poly(A) længden af disse udskrifter snarere end faktiske forskelle i udskriftsniveauer7.
Der er flere metoder til at studere genom-dækkende endogene mRNA oversættelse i mus oocytter. Disse metoder omfatter polysome profilering7,17,18 og RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Ribosome profilering er en anden metode til at studere genom-dækkende oversættelse, der er blevet brugt i gær, som er en anden model organisme, der bruges til at studere meiose21,22. Disse genomanalyser til undersøgelse af mRNA-oversættelse i musen kræver imidlertid brug af 150-200 oocytter pr. prøve, mens antallet af oocytter, der er til rådighed til analyse, normalt er begrænset. Den enkelt-oocyt analyse beskrevet heri for at vurdere oversættelsen af 3 'UTR af målet mRNA supplerer genom-dækkende analyser af oversættelse, da det giver mulighed for karakterisering af elementer af 3 'UTR, der regulerer oversættelsesprogrammet under oocyte meiotisk modning4,5,6. Tidligere blev luciferase-baserede assays brugt til at vurdere oversættelsen af de 3' UTR af målmRNA'er 10,20,23, da det er en meget følsom metode, der kun kræver et par oocytter pr. prøve; oocytterne skal dog lystes for at detektere mængden af luciferase i en prøve.
Andre har brugt en 3 'UTR / grøn fluorescerende protein (GFP) reporter til at vurdere GFP ophobning i levende mus oocytter4. I disse forsøg blev der imidlertid kun anvendt to tidspunkter: begyndelsen af inkubationen (prophase I) og slutningen af inkubationen (metafase II). Dette mindsker i høj grad effekten af målingerne og øger risikoen for fejl. Kinetiske data giver nøjagtige målinger baseret på satser (flere punkter) og definerer nøjagtigt det tidspunkt, hvor translationel aktivering eller undertrykkelse finder sted. Desuden kan undertrykkelse af oversættelse ikke vurderes på disse enkelte tidspunkter, hvilket kan føre til en unøjagtig konklusion. Derfor blev denne metode justeret ved at anvende time-lapse mikroskopi til at vurdere Ypet/3' UTR reporter akkumulering under hele in vitro modning af mus oocytter5,6,9. Ved at bruge denne strategi er det muligt at studere oversættelse ved forskellige overgange under oocytmodning.
Der er flere vigtige aspekter ved denne metode at overveje. For det første, de anvendte journalister omfatter en oligo (A) hale, hvis udeladelse reducerer reporter akkumulering. Dette kan skyldes både nedsat oversættelse samt reporter mRNA destabilisering24,25. Under præinkubationen i prophase I justeres oversættelsen af en oligoadenyleret sonde for at afspejle oversættelseshastigheden for det endogene mRNA5. For det andet er det vigtigt at indse, at en stigning i antallet af optagelser eller varigheden af fluorescenseksponering potentielt kan fremkalde fototoksicitet og derved forringe oocytkvaliteten. Selv om det nuværende eksperiment anvendte 15 minutters intervaller, kan prøveudtagningshastigheden nedsættes, når der skal anvendes en høj fluorescenseksponering i tilfælde af lavt reporterudtryk.
For at begrænse mængden af fototoksicitet blev der brugt en kold LED-lyskilde, som kræver en kortere excitation26. For at vurdere potentielle fototoksicitetseffekter i oocytterne blev timingen af GVBD og PBE sammenlignet i oocytter, der enten blev mikroinjiceret og udsat for fluorescens eller ikke injiceret og ikke udsat for fluorescens. Kombinationen af eksponering for mikroinjektion og fluorescens viste sig at forsinke GVBD (p<0,001) en smule, mens timingen af PBE var den samme (figur 7).
Denne metode er blevet anvendt til at undersøge translationelle reguleringselementer i 3' UTR under in vitro oocyte meiotisk modning. På samme måde kan det også bruges til at studere funktionelle 5' UTR-elementer, der er væsentlige for regulering af oversættelse eller til at studere oversættelse under in vitro oocytbefrugtning. Selv om denne metode er blevet anvendt på humane oocytter og muse oocytter, gælder den også for andre dyrearter. Da denne reporteranalyse udføres i enkelte oocytter, er den specielt velegnet til brug i monoovulatoriske arter, hvor antallet af oocytter, der er tilgængelige til analyse, er begrænset. I modsætning til at bruge denuded oocytter, en anden anvendelse af denne teknik er injektion af reporter i cumulus-lukkede oocytter, som cumulus celler spiller en stor rolle i reguleringen af translationelle program8,10,27. Det bør dog tages i betragtning, at cumulus-lukkede oocytter er mere tilbøjelige til at bevæge sig væk fra registreringsplanet under forsøget sammenlignet med denuded oocytter på grund af bevægelsen af cumuluscellerne under COC-ekspansion. Dette kan resultere i en større andel af oocytter, der skal udelukkes fra analyse. I fremtiden kan der bruges cellesporingssoftware, der er i stand til at spore x-, y- og z-positionerne for oocytterne i dråben, hvilket kan løse dette problem.
Afslutningsvis repræsenterer den beskrevne enkelt oocyte reporter assay en strategi for at undersøge translationel program udført på oocyte-til-zygote overgang. Øget viden om dette translationelle program kan give vigtige fingerpeg om molekylær regulering af oocyt udviklingsmæssige kompetence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello blev støttet af et stipendium fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans blev støttet af et Rubicon-stipendium fra Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
