Summary
Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.
Abstract
Gebeurtenissen in verband met nucleaire rijping van oöcyten zijn goed beschreven. Er is echter veel minder bekend over de moleculaire paden en processen die plaatsvinden in het cytoplasma ter voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Tijdens de rijping van de oöcyt zijn veranderingen in genexpressie uitsluitend afhankelijk van de vertaling en afbraak van maternal messenger RNAs (mRNAs) in plaats van van transcriptie. De uitvoering van het vertaalprogramma speelt daarom een sleutelrol bij het vaststellen van oöcytontwikkelingscompetentie om de embryoontwikkeling te ondersteunen. Dit artikel maakt deel uit van een focus op het definiëren van het programma van maternale mRNA-vertaling dat plaatsvindt tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang. In dit methodedocument wordt een strategie gepresenteerd om de regulering van de vertaling van doelmaBO's tijdens de rijping van in vitro oöcyt te bestuderen. Hier wordt een Ypet-verslaggever gefuseerd met het 3' onvertaalde gebied (UTR) van het interessegen en vervolgens micro-geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNA-codering voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Door time-lapse microscopie te gebruiken om de accumulatie van verslaggevers te meten, worden vertaalsnelheden berekend bij verschillende overgangen tijdens de oöcytmeiotische rijping. Hier zijn de protocollen voor oöcytisolatie en injectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse beschreven, met behulp van de UTR-verslaggever Ypet/interleukine-7 (IL-7)-3' als voorbeeld.
Introduction
Een volgroeide zoogdierocyt ondergaat snelle veranderingen in de voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Deze veranderingen zijn essentieel om de embryonale ontwikkeling na de bevruchting te ondersteunen. Hoewel de gebeurtenissen die gepaard gaan met nucleaire rijping relatief goed worden beschreven, is er veel minder bekend over de moleculaire processen en paden in het oöcytcytoctoplasma. Tijdens de laatste stadia van de rijping van de oöcyt zijn oöcytcellen transcriptief stil en is de genexpressie volledig afhankelijk van mRNA-vertaling en afbraak1,2. De synthese van eiwitten die van cruciaal belang zijn voor ontwikkelingscompetentie is daarom gebaseerd op een programma van getijde vertaling van langlevende mRNAs die eerder zijn gesynthetiseerd tijdens oöcytgroei1,3. Als onderdeel van een focus op het definiëren van dit programma van maternale mRNA-vertaling uitgevoerd tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang, presenteert dit artikel een strategie om de activering en onderdrukking van de vertaling van doel maternale mRNAs in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro meiotische rijping te bestuderen.
Bij deze methode wordt het YPet open leesframe gekloond vóór de 3' UTR van het transcript van belang. Vervolgens worden mRNAs die coderen voor deze reporter micro geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNAs die coderen voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Reporter accumulatie wordt gemeten tijdens in vitro oöcyt meiotische rijping met behulp van time-lapse microscopie. De accumulatie van geel fluorescerend eiwit (YFP) en mCherry wordt geregistreerd in individuele oöcyten en YFP-signalen worden gecorrigeerd door het plateauniveau van de co-geïnjecteerde mCherry. Na het verkrijgen van gegevens worden de omrekeningssnelheden berekend voor verschillende tijdsintervallen tijdens de in vitro oöcytmeiotische rijping door de helling van de curve te berekenen die wordt verkregen door curve-fitting.
Deze aanpak biedt een hulpmiddel om veranderingen in de vertaling van geselecteerde endogene mRNAs experimenteel te bevestigen. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de karakterisering van regulerende elementen die de vertaling tijdens de oöcytmeiotische rijping regelen door cis-regulerende elementen van de 3' UTR van doelmaRNAs4,5,6temanipuleren . Manipulatie van de poly(A) staartlengte geeft ook inzicht in adenylase/deadenylase activiteit in oöcyten5. Mutagenese van cis-acterende elementen of RNA-immunoprecipitatie kan worden gebruikt om interacties met cognate RNA-bindende eiwitten6,7te bestuderen . Bovendien kan deze methode worden gebruikt om essentiële componenten van het vertaalprogramma te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkelingscompetentie van oöcyt door doel 3' UTR-vertaling te meten in modellen die verband houden met verminderde oöcytkwaliteit 8,9,10. Dit methodedocument presenteert een representatief experiment waarbij gedenudeerde oöcyten van 21 dagen oude C57/BL6 muizen micro-geïnjecteerd zijn met een Ypet reporter gefuseerd met de 3' UTR van IL-7. De installatie en het protocol voor oöcytinjectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse zijn beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentele procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië in San Francisco (protocol AN182026).
1. Voorbereiding van media
- Voeg alle componenten toe, zoals beschreven in tabel 1,om het basismedium voor het verzamelen van oöcyten en het rijpingsmedium voor oöcyten te maken. Stel voor het basisinzamelingsmedium de pH in op 7,4. Voeg voor zowel het verzamel- als het rijpingsmedium op de dag van gebruik 3 mg/ml runderserumalbumine (BSA) en 1 μM cilostamide toe.
2. Voorbereiding van mRNA-codering voor Ypet-3' UTR en mCherry
- Verkrijg de 3′ UTR-sequenties van de mRNAs van belang.
OPMERKING: Voor deze studie werden eerder sequenties verkregen uit muisocyt cDNA. - Ontwerp primers om de doel 3' UDR's te versterken van oöcyt cDNA en delen van de pcDNA 3.1 vector met een Ypet codeervolgorde, V5-epitoop tag en een T7 promotor.
- Versterk met behulp van een high-fidelity DNA polymerase kit. Voer de polymerasekettingreactie (PCR)-producten uit op een gel om te controleren of de fragmenten de juiste grootte hebben, knip de banden uit en haal het DNA uit de gel met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Smelt de PCR-fragmenten aan een vector met behulp van een PCR-kloonkit.
OPMERKING: PCR-fragmenten werden gedurende 4 uur op ijs geïncubeerd om een efficiënter recombinatieproces te vergemakkelijken. Dit is in strijd met de instructies van de fabrikant, die een incubatietijd van slechts 45 minuten aanbevelen. - Transfecte PCR-fragmenten in competente 5-α Escherichia coli-bacteriën.
- Voeg de mix en plasmide toe aan de bacteriën en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Verwarm de schok van het mengsel en plasmide door het mengsel gedurende 45 s in een waterbad op 42 °C te plaatsen en onmiddellijk gedurende 3 minuten op ijs af te koelen.
- Voeg 500 μL Super Optimal bouillon met Catabolite repression (SOC) medium toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Draai 2 minuten op 7000 × g en verwijder het grootste deel van het supernatant. Resuspend en plaat op een Luria Bouillon (LB) agarplaat met het juiste selectie antibioticum.
OPMERKING: Carbenicillin werd gebruikt in deze studie. - Incubeer 's nachts bij 37 °C. Isoleer de kolonies door lichtjes op een pipetpunt op een van de kolonies te drukken en deze in 3 ml LB-medium te plaatsen met 100 μg/ml carbenicilline. Incubeer gedurende 12-24 uur bij 37 °C.
- Extraheer het DNA van de plasmiden met behulp van de plasmide DNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant en bevestig de sequenties via DNA-sequencing.
- Voor Ypet/3' UTR:
- Produceer een lineaire PCR-sjabloon voor in vitro transcriptie. Gebruik een voorwaartse primer stroomopwaarts van de Ypet-sequentie en een omgekeerde primer met 20 extra thymineresten. Zie tabel 2 voor de volgorde van Ypet/IL-7 3' UTR en de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde primers.
OPMERKING: Deze extra thymineresiduen voegen oligo(A) toe aan het lineaire mRNA na in vitro transcriptie. - In vitro transcriberen van het PCR-product met behulp van een T7 transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuiver het resulterende complementaire RNA (cRNA) met behulp van een transcriptieopruimingskit volgens de instructies van de fabrikant.
- Elute de gezuiverde cRNA in RNAse-vrij water, meet de concentratie en evalueer de integriteit door agarose elektroforese. Bewaren bij −80 °C.
- Produceer een lineaire PCR-sjabloon voor in vitro transcriptie. Gebruik een voorwaartse primer stroomopwaarts van de Ypet-sequentie en een omgekeerde primer met 20 extra thymineresten. Zie tabel 2 voor de volgorde van Ypet/IL-7 3' UTR en de sequenties van de voorwaartse en omgekeerde primers.
- Voor mCherry:
- Produceer een lineaire PCR-sjabloon voor in-vitrotranscriptie met behulp van een high-fidelity restrictie-enzym; gebruik het restrictie-enzym mfEI-HF als u dit voorbeeld repliceert. Verteren in een spijsverteringsbuffer 's nachts bij 37 °C.
- Voer een gel uit om het monster te zuiveren en extraheer het lineaire DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- In vitro transcriberen van het PCR-product met behulp van een T7 transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Polyadenylaat de cRNA (150-200 nucleotiden) met behulp van een poly(A) tailing kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Zuiver het resulterende cRNA met behulp van een transcriptieopruimingskit volgens de instructies van de fabrikant.
- Elute de gezuiverde cRNA in RNAse-vrij water, meet mRNA-concentraties en evalueer de berichtintegriteit door gelelektroforese. Bewaren bij −80 °C.
3. Experimentele procedure
OPMERKING: Figuur 1geeft een schematisch overzicht van oöcytmicro-injectie en daaropvolgende time-lapse microscopie .
- Dag 1
- Intraperitoneally injecteren 21-daagse muizen met 5 IE van zwangere merrie serum gonadotropine ter bevordering van de follikelgroei naar de antrale fase11.
- Dag 3
- Oocyte collectie
- Offer muizen 44-48 uur na het priming om de eierstokken te verzamelen en plaats ze in een plastic petrischaal met basismiddel voor het verzamelen van oöcyten.
- Open de antrale follikels voorzichtig door een kleine snee in de follikelwand te maken met een naald van 26 G. Isoleer intacte cumulus-gesloten oöcyten (COC's) met verschillende lagen cumuluscellen met behulp van een mondbediende glazen pipet.
- Gebruik een kleinere pipet (iets groter dan de diameter van de oöcyt) en denude de COC's mechanisch door herhaaldelijk pipetten.
OPMERKING: U kunt ook micro-injectie uitvoeren op intacte COC's. - Gebruik een grotere pipet, aspireer de gedenudeerde oöcyten en plaats ze in een petrischaal met rijpingsmedium aangevuld met 1 μM van de fosfodiësteraseremmer, cilostamide, om hervatting van de meiotische rijping te voorkomen12. Plaats de schaal gedurende 2 uur in de incubator om de oöcyten te laten herstellen van de stress veroorzaakt door isolatie van de oöcyten uit de follikels.
- Oöcyt micro-injectie
- Bereid de injectienaalden voor door een 10 cm lange borosilicaatglas capillaire buis in een mechanische trekker te plaatsen. Voor een optimale injectie buigt u de naaldpunt in een hoek van 45° met behulp van een verwarmd filament.
- Bereid polystyreengerechten met 20 μL druppels basisocytverzamelingsmedium en bedek de druppels met lichte minerale olie.
- Bereid een reportermix voor door 12,5 μg/μL Ypet-3' UTR en 12,5 μg/μL mCherry toe te voegen. Bereid een groter volume voor en maak aliquots voor toekomstige experimenten om vergelijkbare reporterconcentraties te garanderen. Bewaar deze aliquots bij -80 °C. Bij het ontdooien, centrifugeer eerst de aliquot gedurende 2 minuten op 20.000 x gen breng over op een nieuwe microcentrifugebuis.
OPMERKING: Deze centrifugeer zal voorkomen dat de injectienaald verstopt raakt door potentiële aggregaten in de reportermix. - Laad de injectienaald met capillariteit met ongeveer 0,5 μL reportermix.
- Plaats de houdpipet en de geladen injectienaald in de houders en plaats deze in het druppeltje oöcytopvangmedium. Aspireer een deel van het medium in de holdingpipet.
- Open de injectienaald door deze voorzichtig tegen de pipet te tikken.
- Plaats oöcyten in een druppel basisinzamelingsmedium en injecteer 5-10 pL van de reportermix.
- Incubeer de oöcyten in het rijpingsmedium met 1 μM cilostamide gedurende 16 uur om het mCherry-signaal te laten plateauen.
- Bereid een petrischaaltje dat zal worden gebruikt voor time-lapse microscopie met ten minste twee druppeltjes rijpingsmedium van 20 μL voor elke geïnjecteerde verslaggever: één druppel met 1 μM cilostamide voor controle profase I-arrested oöcyten en één druppel zonder cilostamide voor rijpende oöcyten. Bedek de druppels met lichte minerale olie en plaats ze in de incubator.
- Time-lapse microscopie
- Verwijder na de pre-incubatie de geïnjecteerde oöcyten uit de incubator en was ze vier keer in rijpingsmedium zonder cilostamide. Bewaar sommige oöcyt in rijpingsmedium met 1 μM cilostamide als een profase I-arrested oöcyt controlegroep.
- Breng de geïnjecteerde oöcyten over in hun respectieve druppels op de eerder bereide time-lapse microscoopschotel. Cluster de oöcyten met behulp van een gesloten glazen pipet (een gesloten pipet kan worden voorbereid door de punt een paar seconden in een vlam te houden).
OPMERKING: Het clusteren van de oöcyten helpt hun beweging tijdens de opname te voorkomen. - Plaats de schotel onder de microscoop uitgerust met een lichtgevende diodeverlichtingssysteem en een gemotoriseerd podium uitgerust met een milieukamer die op 37 °C en 5% CO2wordt gehouden. Gebruik de volgende parameters om deze studie te repliceren: filterset: dichroïsche spiegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; YFP-kanaal (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Emissie (EM): D535/30 m 47281), mCherry kanaal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Voer de juiste instellingen in voor het time-lapse-experiment (zie Tabel met materialen voor de software die in dit onderzoek wordt gebruikt): Klik op Apps | Multidimensionale acquisitie. Selecteer het eerste tabblad Hoofd en selecteer timelapse, posities in meerdere werkgebiedenen meerdere golflengten.
- Selecteer het tabblad Opslaan om de locatie in te voeren waar het experiment moet worden opgeslagen.
- Selecteer het tabblad Timelapse om het aantal tijdspunten, duur en tijdsinterval in te voeren.
OPMERKING: De duur van het time-lapse-experiment hangt af van de onderzochte diersoorten, omdat de timing van de oöcytmeiotische rijping per soort verschilt. In dit experiment met muisoocyten werden oöcyten elke 15 minuten gedurende 16 uur geregistreerd. - Selecteer het tabblad Werkgebied. Schakel brightfield in en zoek de positie van de oöcyten door een nieuw venster te openen door Acquire | | overnemen Live weergeven. Zodra de oöcyten zich hebben bevonden, schakelt u terug naar het venster Multidimensionale acquisitie en drukt u op + om de locatie van de oöcyten in te stellen.
- Selecteer het tabblad Golflengtenen stel 3 verschillende golflengten in voor brightfield (belichting 15 ms), YFP (belichting 150 ms voor Ypet/IL7 3' UTR) en mCherry (belichting 75 ms voor Ypet/IL7 3' UTR).
OPMERKING: Pas de belichting voor elke Ypet/3' UTR-verslaggever aan op basis van het niveau van de accumulatie van de verslaggever en het geïnjecteerde volume. Zorg ervoor dat het YFP-signaal aan het begin van het experiment in het midden van het detectiebereik valt om onderschatting of verzadiging in geval van activering van de vertaling te voorkomen. Pas voor mCherry de blootstelling voor elke partij mCherry aan, omdat het signaal afhankelijk is van het aantal adeninenucleotiden dat tijdens de polyadenylatatieprocedure is toegevoegd. Vanwege de variatie in polyadenylation-efficiëntie, gebruik dezelfde batch mCherry in verschillende experimenten voor een betere vergelijking tussen experimenten. - Start het timelapse-experiment door te klikken op Acquire. Zie figuur 2 en het aanvullende bestand voor een voorbeeld van een time-lapse-opname in één oöcyt.
- Analyse van Ypet-3' UTR vertaling
- Voer voor deze analyse (zie Tabel met materialen voor de software die in deze studie wordt gebruikt) twee regiometingen uit voor elke oöcyt: de oöcyt zelf-klik op ellipsgebied en omringt de oöcyt-en een klein gebied dicht bij de oöcyt om te worden gebruikt voor achtergrondaftrekking-klik op rechthoekig gebied.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de oöcyten tijdens de timelapse-opname niet uit het geselecteerde gebied bewegen. Besteed speciale aandacht aan de plaatsing van de regiometing rond polaire lichaamsextrusie, omdat dit beweging in de oöcyt veroorzaakt en de opname kan verstoren. - Exporteer de regiometingsgegevens naar een spreadsheet door eerst op Logboek openen en vervolgens op Logboekgegevens te klikken om de gegevensanalysesoftware te exporteren.
- Trek voor elke afzonderlijke oöcyt en voor alle gemeten tijdpunten de achtergrondgebiedmeting af van de oöcytregiometing. Doe dit voor YFP en mCherry golflengten afzonderlijk.
- Noteer de timing van kiemblaasjesafbraak (GVBD) en polaire lichaamsextrusie (PBE) voor latere referentie.
OPMERKING: Sluit rijpende muisoöcyten uit wanneer GVBD meer dan 2 uur bedraagt. - Plot YFP en mCherry expressie in de loop van de tijd voor elke oöcyt om te controleren op uitschieters.
OPMERKING: Dit moet een vloeiende curve zijn, als dit niet het gevolg is, kan dit erop wijzen dat de oöcyt tijdens de opname is verplaatst. - Bereken voor elke afzonderlijke oöcyt de gemiddelde mCherry-expressie voor de laatste tien tijdpunten van de opname. Deel voor elk tijdspunt de YFP-expressie door de gemiddelde mCherry-expressie om te corrigeren voor geïnjecteerd volume om een YFP/mCherry-verhouding te verkrijgen op elk tijdstip voor elke afzonderlijke oöcyt.
- Bereken de omrekeningssnelheden voor een specifiek tijdsinterval door de helling van de curve aan te passen door lineaire regressie. Beoordeel de verschillen in omrekeningspercentages aan de hand van statistische conclusies.
- Voer voor deze analyse (zie Tabel met materialen voor de software die in deze studie wordt gebruikt) twee regiometingen uit voor elke oöcyt: de oöcyt zelf-klik op ellipsgebied en omringt de oöcyt-en een klein gebied dicht bij de oöcyt om te worden gebruikt voor achtergrondaftrekking-klik op rechthoekig gebied.
- Oocyte collectie
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedenudeerde profase I-arrested oöcyten van 21-daagse C57/BL6 muizen werden geïnjecteerd met een reporter mix met mRNA die codeert voor de Ypet reporter versmolten met de 3' UTR van IL-7 en mRNA codering mCherry. YFP en mCherry expressie werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan 30 gerijpt, en 9 werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Drie rijpende oöcyten werden uitgesloten voor analyse omdat ze ofwel een vertraagde GVBD (N=2) hadden of tijdens de opname in de schaal bewogen (N=1). Figuur 3 toont mCherry en YFP expressie in profase I en rijpende oöcyten. Figuur 4 toont de YFP-expressie van rijpende oöcyten gecorrigeerd voor plateauvormige mCherry-expressie (gemiddelde mCherry-expressie in de laatste 10 tijdpunten) om te corrigeren voor het geïnjecteerde volume. De omrekeningssnelheden van de melder werden gemeten aan de hand van curve-fitting (lineaire regressie) van de YFP/mCherry-waarden in profase I en in rijpende oöcyten gedurende de eerste 0-2 uur of 8-10 uur na het vrijkomen van cilostamide (figuur 5A). De accumulatie van de melder volgt geen lineair patroon, zoals blijkt uit een significant verschil in vertaalsnelheden tussen 0-2 uur en 8-10 uur na afgifte van cilostamide (p<0,0001; Figuur 5B). Daarom wijzen deze resultaten op activering van IL-7-vertaling tijdens oöcytmeiotische rijping.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de experimentele procedure. Oligoadenylated Ypet/3' UTR en polyadenylated mRNA die mCherry coderen, worden micro-geïnjecteerd in gedenudeerde oöcyten van 21-daagse C57/BL6 muizen. Oöcyten worden gedurende 16 uur voorbeïnten in cilostamide bevattend rijpingsmedium om het mCherry-signaal een plateau te laten bereiken. Na de pre-incubatie wordt een time-lapse-opname gestart waarbij oöcyten ofwel in medium met cilostamide worden bewaard om een profase I-arrested controlegroep te creëren of worden vrijgegeven in cilostamidevrij medium om te rijpen. Afkortingen: UTR = onvertaald gebied; YFP = geel fluorescerend eiwit; fw primer = voorwaartse primer; toerenprimer = omgekeerde primer; Ampr = ampicilline weerstand; polyA = polyadenyl; oligoA = oligoadenyl; GV = kiemblaasje. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van een enkele oöcyt time-lapse opname. Brightfield-, YFP- en mCherry-opnamen van een enkele oöcyt geïnjecteerd met mRNAs die coderen voor Ypet/Interleukin-7 3' UTR en polyadenylated mCherry bij profase I, MI (6 uur na afgifte van cilostamide) en MII (15 uur na afgifte van cilostamide). Schaalbalk = 25 μm. Afkortingen: YFP = geel fluorescerend eiwit; GV = kiemblaasje; MI = metafase I; MII = metafase II. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: YFP- en mCherry-signalen geregistreerd door time-lapse microscopie. YFP- en mCherry-signalen van oöcyten geïnjecteerd met oligoadenylated Ypet/IL7 3' UTR en polyadenylated mRNA die coderen voor mCherry. Oöcyten werden ofwel in medium gehouden met cilostamide om een profase I-arrested controlegroep (N=9) te genereren of vrijgegeven in cilostamidevrij medium om rijping mogelijk te maken (N=30). Gegevens zijn individuele oöcytmetingen. Afkortingen: IL-7 = interleukine-7; YFP = geel fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: YFP-signaal gecorrigeerd voor co-geïnjecteerd mCherry-niveau. YFP-signalen van profase I-arrested en rijpende oöcyten werden gecorrigeerd voor geïnjecteerd volume door het YFP-signaal te delen door het gemiddelde mCherry-signaal van de laatste 10 tijdpunten. Individuele YFP/mCherry ratio's voor (A) profase I-arrested oöcyten en (B) rijpende oöcyten en gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde YFP/mCherry ratio's van (C) profase I-arrested en (D) rijpende oöcyten. Afkortingen: YFP = geel fluorescerend eiwit; GVBD = kiemblaasjesafbraak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Berekende omrekeningssnelheden bij 0-2 uur en 8-10 uur rijping. (A) Gele fluorescerende eiwitsignalen (YFP) signalen van enkelvoudige oöcyten gecorrigeerd voor mCherry (YFP/mCherry) bij 0-2 uur of 8-10 uur na afgifte van cilostamide en (B) omrekeningssnelheden (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde) zoals berekend door curve-fitting (lineaire regressie) de YFP/mCherry waarden De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ongepaarde tweezijdige t-test. *p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeld van onderdrukking van vertalingen: Oosp2. Opnieuw geanalyseerde gegevens van een experiment waarbij oöcyten werden geïnjecteerd met Ypet-Oosp2 3′ UTR en polyadenylated mRNA-codering mCherry. YFP-signalen van profase I-arrested (N=63) en rijpende oöcyten (N=72) werden gecorrigeerd voor geïnjecteerd volume door het YFP-signaal te delen door het gemiddelde mCherry-signaal van de laatste 10 tijdpunten. YFP- en mCherry-expressiegegevens werden verkregen met behulp van een Xenon Arc-lamp, in tegenstelling tot het IL-7-experiment waarbij een LED-lichtbron werd gebruikt. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van individuele oöcytmetingen en werden eerder gepubliceerd in Luong et al. 5. Afkortingen: YFP = geel fluorescerend eiwit; Oosp2 = oöcyt uitgescheiden eiwit 2; UTR = onvertaald gebied; IL-7 = interleukine-7; LED= lichtgevende diode; GVBD = kiemblaasjesafbraak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Effect van blootstelling aan micro-injectie en fluorescentie op de timing van GVBD en PBE. Timing van GVBD en PBE van oöcyten die ofwel micro-geïnjecteerd en blootgesteld aan fluorescentie (geïnjecteerd), of niet-geïnjecteerd en niet blootgesteld aan fluorescentie (niet-geïnjecteerd). Gegevens zijn individuele oöcytmetingen. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de ongepaarde tweezijdiget-test. *blz<0.001. Afkortingen: GVBD = germinal vesicle breakdown; PBE= polaire lichaamsextrusie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Basis oocyt verzamelmedium | ||
| bestanddeel | Voor 500 ml | |
| HEPES wijzigde Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 g | |
| Natriumbicarbonaat | 252 mg | |
| Natrium pyruvaat | 1,15 ml | |
| Penicilline/Streptomycine 100x | 5 ml | |
| Ultrapure gedestilleerd water (Invitrogen, 10977-015) | Tot 500 ml | |
| Rijpingsmedium | ||
| bestanddeel | Voor 500 ml | |
| MEM alfa 1x | Tot 500 ml | |
| Natrium pyruvaat | 1,15 ml | |
| Penicilline/Streptomycine 100x | 5 ml | |
Tabel 1: Voorbereiding van de media. Lijst met componenten die moeten worden toegevoegd om basis-oöcytverzamelingsmedium en oöcytrijpingsmedium voor te bereiden.
| volgorde | |||||
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTG GCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAAGGCGA AGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTG AAGCTGCTGTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTG GGCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGGTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCA AGAGCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGCGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAA CTACAAGACCCGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGGATCGAGCTGA AGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAACTACAAC AGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGAT CCGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTG TTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTCCTGACCGCCGCC GGCATCACCGAGGGCATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAA CCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAACAGGAC ATGTAGTAACAACCTCCAAGAATCTACTGGTTCATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAG AAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATG AGATGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATACATATATAAAGATATATCAA CTATACAGATTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTAAAACCGTTCCAAATGTTTC TAACACTACAAAGTCTACAAAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTCTTAGC AAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTGTTTTAG ACTGGAGATACTGGAGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTCTTGAAAACAAGAGTCTATCTTAAAGC AGCAGCAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAACAAATGTAGTTAAATATGAATGTATAACA CATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAATAAAAGTATTTTTAAAGATAGAAATGCACTTAT TCCAAAGATACTGAACCTTAGTATTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAA TTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAAGAATAATATATGCTAGACTTTTAATTAATGTATATGTTTAATTT TGGCATTCTGTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT ATTTTCATATACTACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTTTATTAACAC TGTCAGGTTCCCTTACTCTCGAGAGTGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTATTGAACAC ATATCCTTTAACACACTCACGTCCAGATTTAGCAGGAGAGAGGACCCTATAACTTTGTTAAGAGAGAA AACACTAATTTCTTGTTTTATAGTAGGGTCTTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGCAGACATGAGC CAATATGCTTAATTAGAAACATTCTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATCCTAT GTATATGCCTGTTTAAATCCTTTTTTGTAAGGTCTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTA TGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTTTGCTTGTACTGAATTCTCATTCTCCTTGCTTT TTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCTGGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCAC ATTGCATGTGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTTCTCCTTTTCCCCAACCCCTATAATGCTCTACTCAGTGG TACAGATAGCTGGGATTATCACAATTTTGAGAGAAACACCAATTGTTTAAAGTTTGTTTCATAATCACCATTT GCCCAGAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTGTTAATGGACTT TCGATAACTTCCTTAGATATCCCACATCTCCTACGTGTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTA AGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTCTGGAT GGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATTTTGGCAAAATAAAGGATAATATTTT |
||||
| Voorwaartse primer | GAGAACCCACTGCTTAC | ||||
| Omgekeerde primer | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCCTTTATTTTG CCAAAATC |
||||
Tabel 2: Voorbeeld van reporter- en primersequenties Opeenvolging van YFP/IL7 3'UTR-reporter en sequenties van voorwaartse en omgekeerde primers die werden gebruikt om een lineaire PCR-sjabloon voor in vitro transcriptie te produceren.
Supplemental File: Yellow fluorescent protein(YFP) en mCherry time-lapse recording. YFP en mCherry time-lapse opnames van een enkele oöcyt geïnjecteerd met mRNAs die coderen voor Ypet/Interleukin-7 3' UTR en polyadenylated mCherry. YFP-kanaal (Bijv. S500/20 × 49057; Em: D535/30 m 47281), mCherry kanaal (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m). De oöcyten werden elke 15 minuten gedurende 16 uur (7 frames/seconde) geregistreerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode beschrijft een strategie om activering en onderdrukking van de vertaling van doelmiER bij verschillende overgangen tijdens in vitro oöcytmeiotische rijping te bestuderen. IL-7, een cytokine vrijgegeven door de oöcyt die betrokken kan zijn bij oöcyt-cumulus cel communicatie8,13, werd gekozen voor het beschrijven van deze methode. HET is bekend dat IL-7 steeds vaker wordt vertaald tijdens oöcytrijping8 en maakt een goede visualisatie van translationele activering mogelijk met behulp van deze methode. Als de vertaling echter gedurende het hele experiment met een constante snelheid plaatsvindt, zal de accumulatie van een verslaggever een lineair patroon volgen en zullen de vertaalsnelheden aan het begin en het einde van het experiment vergelijkbaar zijn. Deze conclusie kan worden geverifieerd door de geschiktheid van de pasvorm (R) van een lineaire regressie gedurende het gehele opname-interval. Een repressie in de vertaling van verslaggevers zal zich voordoen als de plateauing van het YFP-signaal.
Een voorbeeld van repressie van 3' UTR vertaling, is te vinden in de studie van Luong et al. 5, waar de auteurs melding maken van onderdrukking van Oocyte Secreted Protein 2 (Oosp2) tijdens oöcyt meiotische rijping. Deze gegevens zijn opnieuw geanalyseerd en worden weergegeven in figuur 6. De rijpende oöcyten vertonen plateauing van het YFP-signaal, wat duidt op onderdrukking van de vertaling, terwijl de profase I-arrested controlegroep een lineair patroon van reporteraccumulatie volgt, wat wijst op vergelijkbare vertaalsnelheden aan het begin en einde van het experiment. Bij het bestuderen van de onderdrukking van vertalingen is het vooral belangrijk om een profase I-arrested controlegroep op te nemen om ervoor te zorgen dat de plateauing van het YPF-signaal niet wordt verklaard door een afname van de oöcytkwaliteit als gevolg van slechte kweekomstandigheden, waardoor de levensvatbaarheid van de oöcyten wordt bevestigd. Accumulatie van de reporter kan worden gevalideerd door kwantitatieve reverse-transcription PCR met behulp van primers voor YFP of door western blotting door gebruik te maken van de V5-epitooptag die in de reporter in dit protocol is opgenomen.
Plateauing van het YFP-signaal is mogelijk niet alleen te wijten aan actief gereguleerde onderdrukking van vertalingen, maar kan ook worden verklaard door de degradatie van de verslaggever tijdens oöcytmeiotische progressie. Dit kan een weerspiegeling zijn van destabilisatie van het endogene mRNA , wat essentieel is voor de overgang naar embryonale genoomexpressie14,15,16. Deze mogelijkheid kan worden geverifieerd door doelgentranscriptspiegels in de profase I-fase versus metafase II-fase te meten om de stabiliteit van de mRNAs te bevestigen. Bij het bereiden van oöcyt cDNA verdient het de voorkeur om willekeurige hexameerpriming te gebruiken boven oligo-dT-priming. De laatste methode vertoont schijnbare verschillen in gentranscriptieniveaus die verschillen in poly(A)-lengte van deze transcripties kunnen weerspiegelen in plaats van werkelijke verschillen in transcriptieniveaus7.
Er zijn verschillende methoden om genoombrede endogene mRNA-vertaling in muisoocyten te bestuderen. Deze methoden omvatten polysomenprofilering7,17,18 en RiboTag/RNA-Seq5,19,20. Ribosoomprofilering is een andere methode om genoombrede vertaling te bestuderen die is gebruikt in gist, een ander modelorganisme dat wordt gebruikt om meiose21,22te bestuderen . Deze genoombrede analyses om mRNA-vertaling bij de muis te bestuderen, vereisen echter het gebruik van 150-200 oöcyten per monster, terwijl het aantal voor analyse beschikbare oöcyten meestal beperkt is. De hierin beschreven single-oöcyttest ter beoordeling van de vertaling van 3' UTR van doel-MRNAs vormt een aanvulling op genoombrede analyses van vertalingen , aangezien hiermee elementen van de 3'UTR kunnen worden gekarakteriseren die het vertaalprogramma reguleren tijdens oöcytmeiotische rijping4,5,6. In het verleden werden luciferase-gebaseerde assays gebruikt om de vertaling van de 3' UTR van doel mRNAs10,20,23 te beoordelen, omdat het een zeer gevoelige methode is die slechts een paar oöcyten per monster vereist; de oöcyten moeten echter worden gelyseerd om de hoeveelheid luciferase in een monster te detecteren.
Anderen hebben een 3' UTR/green fluorescent protein (GFP) reporter gebruikt om GFP accumulatie in levende muisoocyten te beoordelen4. In deze experimenten werden echter slechts twee tijdpunten gebruikt: het begin van incubatie (profase I) en het einde van de incubatie (metafase II). Dit vermindert het vermogen van de metingen aanzienlijk en vergroot de kans op fouten. Kinetische gegevens bieden nauwkeurige metingen op basis van snelheden (meerdere punten) en bepalen nauwkeurig het tijdstip waarop translationele activering of onderdrukking plaatsvindt. Bovendien kan de repressie van de vertaling niet op deze ene tijdstippen worden beoordeeld, wat tot een onjuiste conclusie kan leiden. Daarom werd deze methode aangepast door time-lapse microscopie toe te passen om de accumulatie van UTR-verslaggevers van Ypet/3 te beoordelen tijdens de in vitro rijping van muisoöcyten5,6,9. Door deze strategie te gebruiken, is het mogelijk om vertalingen te bestuderen bij verschillende overgangen tijdens de rijping van de oöcyt.
Er zijn verschillende belangrijke aspecten aan deze methode om rekening mee te houden. Ten eerste omvatten de gebruikte verslaggevers een oligo(A)-staart waarvan de omissie de accumulatie van verslaggevers aanzienlijk vermindert. Dit kan te wijten zijn aan zowel verminderde vertaling als reporter mRNA destabilisatie24,25. Tijdens de pre-incubatie in profase I past de vertaling van een oligoadenyleerde sonde zich aan om de omrekeningssnelheid van het endogene mRNA5weer te geven . Ten tweede is het belangrijk om te beseffen dat een toename van het aantal opnamen of de duur van fluorescentieblootstelling mogelijk fototoxiciteit kan veroorzaken en daardoor de oöcytkwaliteit kan aantasten. Hoewel het huidige experiment intervallen van 15 minuten heeft aangenomen, kan de bemonsteringsfrequentie worden verlaagd wanneer een hoge fluorescentieblootstelling moet worden gebruikt in het geval van een lage melderexpressie.
Om de hoeveelheid fototoxiciteit te beperken, werd een koude LED-lichtbron gebruikt, die een kortere excitatie vereist26. Om mogelijke fototoxiciteitseffecten in de oöcyten te beoordelen, werd de timing van GVBD en PBE vergeleken in oöcyten die ofwel micro-geïnjecteerd waren en blootgesteld aan fluorescentie of niet geïnjecteerd en niet blootgesteld aan fluorescentie. De combinatie van blootstelling aan micro-injectie en fluorescentie bleek GVBD enigszins te vertragen (p<0,001), terwijl de timing van PBE vergelijkbaar was (figuur 7).
Deze methode is gebruikt om translationele regulerende elementen van de 3' UTR te bestuderen tijdens in vitro oöcyt meiotische rijping. Evenzo kan het ook worden gebruikt voor de studie van functionele 5' UTR-elementen die essentieel zijn voor de regulering van vertalingen of voor het bestuderen van vertaling tijdens in vitro oöcytfertilisatie. Hoewel deze methode is toegepast op menselijke en muisoöcyten, is deze ook van toepassing op andere diersoorten. Omdat deze reportertest wordt uitgevoerd in enkelvoudige oöcyten, is het vooral geschikt voor gebruik bij mono-ovulatoire soorten waarbij het aantal voor analyse beschikbare oöcyten beperkt is. In tegenstelling tot het gebruik van gedenudeerde oöcyten, is een andere toepassing van deze techniek de injectie van de verslaggever in met cumulus omsloten oöcyten, omdat de cumuluscellen een belangrijke rol spelen bij de regulering van het translationele programma8,10,27. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat met cumulus omsloten oöcyten tijdens het experiment vaker van het registratievlak afwijken in vergelijking met gedenudeerde oöcyten vanwege de beweging van de cumuluscellen tijdens COC-expansie. Dit kan resulteren in een groter deel van de oöcyten die van analyse moeten worden uitgesloten. In de toekomst kan celtraceringssoftware worden gebruikt die x-, y- en z-posities van de oöcyten in de druppel kan volgen, wat dit probleem kan oplossen.
Concluderend, de beschreven single oocyte reporter assay vertegenwoordigt een strategie om het translationele programma uitgevoerd bij de oöcyt-naar-zygote overgang te onderzoeken. Meer kennis van dit translationele programma kan belangrijke aanwijzingen geven over de moleculaire regulatie van oöcyt ontwikkelingscompetentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM097165, GM116926 en Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 aan Marco Conti. Enrico M. Daldello werd ondersteund door een fellowship van de Lalor Foundation en Natasja G. J. Costermans werd ondersteund door een Rubicon fellowship van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
References
- Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
- Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
- Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. , Springer, Cham. 129-156 (2015).
- Dai, X. -X., et al. A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
- Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
- Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
- Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
- Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
- Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
- Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
- Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
- Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
- Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
- Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
- Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
- Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
- Morgan, M., et al. mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
- Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).
