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Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione

Published: December 10, 2020 doi: 10.3791/62047
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 1, 5, 1, 6, 6, 1
1Department of Anesthesiology, Center of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2University Department for Vascular Surgery and Department of Operative Medicine, Medical University of Innsbruck, 3Department of Medical Biometry and Epidemiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Vascular Medicine, University Heart and Vascular Center Hamburg (UHZ), 5Department of Cardiology, Rostock University Medical Center, 6University Department for Cardiac Surgery, Heart Center Leipzig

Summary

La microcircolazione del midollo spinale svolge un ruolo fondamentale nella lesione del midollo spinale. La maggior parte dei metodi non consente la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale, che è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione. Qui, proponiamo un protocollo che utilizza sonde Laser-Doppler-Flow Needle in un modello animale di ischemia/ riperfusione di grandi dimensioni.

Abstract

La lesione del midollo spinale è una complicanza devastante della riparazione aortica. Nonostante gli sviluppi per la prevenzione e il trattamento delle lesioni del midollo spinale, la sua incidenza è ancora considerevolmente elevata e, pertanto, influenza l'esito del paziente. La microcircolazione svolge un ruolo chiave nella perfusione tissutale e nell'apporto di ossigeno ed è spesso dissociata dalla macroemodinamica. Pertanto, la valutazione diretta della microcircolazione del midollo spinale è essenziale per lo sviluppo di terapie mirate alla microcircolazione e la valutazione degli approcci esistenti per quanto riguarda la microcircolazione del midollo spinale. Tuttavia, la maggior parte dei metodi non fornisce una valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un protocollo standardizzato per la valutazione microcircolatoria del midollo spinale in tempo reale utilizzando sonde ad ago laser-Doppler inserite direttamente nel midollo spinale. Abbiamo usato un modello suino di ischemia/riperfusione per indurre il deterioramento della microcircolazione del midollo spinale. Inoltre, è stata utilizzata una tecnica di iniezione di microsfere fluorescenti. Inizialmente, gli animali sono stati anestetizzati e ventilati meccanicamente. Successivamente, è stato eseguito l'inserimento della sonda ad ago laser-Doppler, seguito dal posizionamento del drenaggio del liquido cerebrospinale. È stata eseguita una sternotomia mediana per l'esposizione dell'aorta discendente per eseguire il cross-clamping aortico. L'ischemia/riperfusione è stata indotta da cross-clamping aortico sopra-celiaco per un totale di 48 min, seguito da riperfusione e stabilizzazione emodinamica. Laser-Doppler Flux è stato eseguito in parallelo con la valutazione macroemodinamica. Inoltre, il drenaggio automatico del liquido cerebrospinale è stato utilizzato per mantenere una pressione cerebrospinale stabile. Dopo il completamento del protocollo, gli animali sono stati sacrificati e il midollo spinale è stato raccolto per l'analisi istopatologica e della microsfera. Il protocollo rivela la fattibilità di misurazioni di microperfusione del midollo spinale utilizzando sonde laser-Doppler e mostra una marcata diminuzione durante l'ischemia e il recupero dopo la riperfusione. I risultati hanno mostrato un comportamento paragonabile alla valutazione della microsfera fluorescente. In conclusione, questo nuovo protocollo potrebbe fornire un utile modello animale di grandi dimensioni per studi futuri che utilizzano in tempo reale la valutazione della microperfusione del midollo spinale in condizioni di ischemia / riperfusione.

Introduction

La lesione del midollo spinale indotta da ischemia/riperfusione (SCI) è una delle complicanze più devastanti della riparazione aortica associata a esito ridotto1,2,3,4. Le attuali opzioni di prevenzione e trattamento per SCI includono l'ottimizzazione dei parametri macroemodinamici e la normalizzazione della pressione del liquido cerebrospinale (CSP) per migliorare la pressione di perfusione del midollo spinale2,5,6,7,8,9. Nonostante l'implementazione di queste manovre, l'incidenza di SCI varia ancora tra il 2% e il 31% a seconda della complessità della riparazione aortica10,11,12.

Recentemente, la microcircolazione ha guadagnato maggiore attenzione13,14. La microcircolazione è l'area di assorbimento di ossigeno cellulare e di scambio metabolico e, pertanto, svolge un ruolo fondamentale nella funzione degli organi e nell'integrità cellulare13. Il flusso sanguigno microcircolatorio alterato è un importante determinante dell'ischemia tissutale associata ad un aumento della mortalità15,16, 17,18,19. La compromissione della microcircolazione del midollo spinale è associata a una ridotta funzione neurologica e all'esito20,21,22,23. Pertanto, l'ottimizzazione della microperfusione per il trattamento della SCI è un approccio molto promettente. La persistenza dei disturbi microcircolatori, nonostante l'ottimizzazione macrocircolatoria, è stata descritta26,27,28,29. Questa perdita di coerenza emodinamica si verifica frequentemente in varie condizioni tra cui ischemia/riperfusione, sottolineando la necessità di una valutazione microcircolatoria diretta e di terapie mirate alla microcircolazione26,27,30.

Finora, solo pochi studi hanno utilizzato sonde laser-Doppler per la valutazione in tempo reale del comportamento microcircolatorio del midollo spinale20,31. Gli studi esistenti hanno spesso utilizzato tecniche di iniezione della microsfera, che sono limitate dall'uso intermittente e dall'analisi post-mortem32,33. Il numero di diverse misurazioni che utilizzano la tecnica di iniezione della microsfera è limitato dalla disponibilità di microsfere con diverse lunghezze d'onda. Inoltre, a differenza delle tecniche Laser-Doppler, la valutazione in tempo reale della microperfusione non è possibile, poiché per questo metodo è necessaria l'elaborazione e l'analisi dei tessuti post-mortem. Qui presentiamo un protocollo sperimentale per la valutazione in tempo reale della microcircolazione del midollo spinale in un modello animale sucino di grandi dimensioni di ischemia/riperfusione.

Questo studio faceva parte di un grande progetto su animali che combinava uno studio randomizzato che confrontava l'influenza dei cristalloidi rispetto ai colloidi sulla microcircolazione in ischemia / riperfusione e uno studio randomizzato esplorativo sugli effetti dei fluidi rispetto ai vasopressori sulla microperfusione del midollo spinale. La calibrazione a 2 punti della sonda di flusso e la calibrazione del catetere a punta di pressione sono state precedentemente descritte34. Oltre al protocollo riportato, sono state utilizzate microsfere fluorescenti per la misurazione della microperfusione del midollo spinale, come precedentemente descritto, utilizzando 12 campioni di tessuto del midollo spinale per ciascun animale, con campioni 1-6 che rappresentano il midollo spinale superiore e 7-12 che rappresentano il midollo spinale inferiore35,36. L'iniezione di microsfere è stata eseguita per ogni fase di misurazione dopo il completamento delle registrazioni Laser-Doppler e della valutazione macroemodinamica. La valutazione istopatologica è stata eseguita utilizzando il Kleinman-Score come precedentemente descritto37.

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Protocol

Lo studio è stato approvato dalla Commissione governativa per la cura e l'uso degli animali della città di Amburgo (riferimento n. 60/17). Gli animali hanno ricevuto cure in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" (pubblicazione NIH n. 86-23, rivista nel 2011) e le raccomandazioni e gli esperimenti FELASA sono stati condotti secondo le linee guida ARRIVE24,25. Questo studio è stato uno studio acuto e tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia alla fine del protocollo.

NOTA: Lo studio è stato condotto su sei suini maschi e femmine di tre mesi (Landrace tedesca) di peso di circa 40 kg. Gli animali sono stati portati nelle strutture per la cura degli animali almeno 7 giorni prima degli esperimenti e sono stati ospitati in conformità con le raccomandazioni sul benessere degli animali. Agli animali sono stati forniti cibo e acqua ad libitum e il loro stato di salute è stato regolarmente valutato dal veterinario responsabile. Un tempo di digiuno di 12 ore è stato mantenuto prima degli esperimenti. L'intera procedura sperimentale e la manipolazione degli animali è stata supervisionata dal veterinario responsabile.

1. Induzione dell'anestesia e mantenimento dell'anestesia

  1. Per l'induzione dell'anestesia e il mantenimento dell'anestesia, premedicare gli animali e sedarli profondamente usando un'iniezione intramuscolare seguita da iniezioni endovenose, se necessario, per eseguire l'intubazione endotracheale. Successivamente, indurre e mantenere l'anestesia utilizzando una combinazione di un agente di anestesia volatile con un'applicazione continua di oppioidi integrata con un'ulteriore iniezione in bolo di oppioidi.
  2. Eseguire iniezioni intramuscolari di ketamina 20 mg·kg-1, azaperone 4 mg·kg-1e midazolam 0,1 mg·kg-1 per premedicazione e sedazione.
  3. Posizionare un catetere venoso in una vena dell'orecchio, fissare una corretta fissazione e valutare la funzionalità applicando rapidamente 10 ml di soluzione salina.
  4. Metti l'animale in posizione supina su una coperta riscaldante per prevenire la perdita di calore.
  5. Stabilire un monitoraggio di base con elettrocardiografia (ECG) e pulsossimetria per monitorare lo stato cardio-polmonare degli animali e collegarlo all'hardware di monitoraggio di base.
  6. Somministrare 15 L·min-1 di ossigeno tramite una maschera a forma di maiale per la preossigenazione.
  7. Iniettare boli per via endovenosa di 0,1 mg·kg-1 di propofol all'1%, se necessario, ed eseguire l'intubazione endotracheale.
  8. Fissare il corretto posizionamento con capnografia e auscultazione di marea, somministrare 0,1 mg•kg-1 di pancuronio e garantire la corretta fissazione del tubo endotracheale.
  9. Stabilire una ventilazione volumetrica controllata utilizzando volumi di marea di 10 ml·kg-1 peso corporeo-1,una pressione espiratoria finale positiva di 10 cmH2O e una frazione di ossigeno inspirato (FiO2)di 0,3 utilizzando la macchina per anestesia. Regolare la frequenza del ventilatore per mantenere una tensione di anidride carbonica espiratoria terminale (etCO2) di 35-45 mmHg.
  10. Introdurre un tubo gastrico, eseguire l'aspirazione dei fluidi gastrici, fissare correttamente il tubo e collegarlo a una sacca di raccolta. Chiudere con attenzione gli occhi dell'animale per prevenire la secchezza degli occhi durante l'anestesia.
  11. Mantenere l'anestesia mediante infusione continua di fentanil (10 μg·kg-1·h-1) e sevoflurano (concentrazione scaduta del 3,0%, erogata dal vapore). Garantire un adeguato livello di anestesia attraverso un'attenta osservazione dei segni vitali e dei parametri di ventilazione nonché dall'assenza di movimenti durante l'intero protocollo, prestando particolare attenzione alle fasi di stimolo chirurgico. Somministrare ulteriori dosi in bolo di fentanil (50 μg) se vi è qualche indicazione di dolore o angoscia.
    NOTA: Garantire la presenza di ricercatori esperti in anestesia animale durante l'intera procedura e utilizzare la supervisione di un veterinario esperto per garantire un'anestesia adeguata.
  12. Somministrare una velocità di infusione basale di10ml·kg -1 ·h-1 cristalloidi bilanciati per compensare le perdite di liquidi durante l'anestesia, la preparazione chirurgica e l'esecuzione del protocollo sperimentale. Utilizzare uno scalda fluido per prevenire la perdita di calore.
  13. Pulire delicatamente la pelle del maiale con acqua saponata. Utilizzare una soluzione di disinfezione della pelle contenente povidone-iodio per ridurre la contaminazione della pelle. Utilizzare guanti sterili per preparazioni chirurgiche. Applicare 300 mg di clindamicina come profilassi antimicrobica e ripetere il dosaggio dopo 6 ore.

2. Posizionamento della sonda

  1. Posiziona l'animale nella giusta posizione laterale e fletti la schiena dell'animale per allargare lo spazio tra le vertebre.
  2. Esporre chirurgicamente l'area paravertebrale per la preparazione di processi spinosi e archi vertebrali (Figura 1A).
  3. Posizionare un paramediatore vascolare 14 G del catetere venoso periferico nel midollo spinale a livello della vertebra toracica (Th) 13/14 o della vertebra lombare (L) 1/2 tra due archi vertebrali (Figura 1B).
  4. Rimuovere l'ago, inserire la sonda dell'ago laser/Doppler sul catetere venoso (Figura 1C) e testare la qualità del segnale collegandosi all'hard-up e al software designato. Assicurarsi che vi sia un segnale stabile con pulsatilità moderata.
  5. Fissare con attenzione la sonda con punti di sutura (Figura 1D) e utilizzare l'imbottitura per evitare lussazioni o attorcigliamenti della sonda.
  6. Per il posizionamento percutaneo del drenaggio del liquido cerebrospinale per misurare e controllare la pressione cerebrospinale, identificare il livello di L 4/5 o L 5/6, perforare la pelle e lo spazio sottocutaneo con l'ago introduttore e rimuovere l'ago intarsio.
  7. Posizionare una siringa riempita di soluzione salina sull'ago e introdurre con attenzione l'ago con una pressione costante sulla siringa riempita di liquido.
  8. Una volta che una perdita di resistenza è sentita come prova della posizione epidurale, reintrodurre l'ago dell'intarsio e introdurre l'ago 2-3 mm ulteriormente per perforare la dura madre e rimuovere l'ago dell'intarsio.
  9. Verificare la posizione intratecale gocciolando rapidamente di liquido trasparente. Introdurre il drenaggio fino a 20 cm di profondità, collegare l'adattatore Luer-lock e verificare la posizione mediante un'attenta aspirazione del liquore.
  10. Fissare con cura il drenaggio con punti di sutura e collegarlo al sistema di drenaggio del liquido cerebrospinale.
  11. Esporre il cranio dietro l'orecchio sinistro ed eseguire con attenzione una trapanazione del foro di perforazione della pelle utilizzando un attacco da trapano da 6 mm.
  12. Introdurre una seconda sonda doppler laser direttamente nel cervello. Fissare con attenzione la sonda con punti di sutura e testare la qualità del segnale collegandosi a hardware e software designati. Ancora una volta, assicurarsi che vi sia un segnale stabile con pulsatilità moderata.
  13. Scollegare tutte le sonde, posizionare con cura l'animale in posizione supina, assicurando la posizione della sonda non influenzata. Assicurarsi che almeno 4-5 ricercatori eseguano questa manovra.
  14. Ricollegare le sonde e ricontrollare la qualità del segnale.
  15. Collegare i canali di uscita dell'hardware laser-Doppler all'amplificatore e all'hardware e al software di acquisizione sincronica per registrare ulteriormente il flusso laser/Doppler contemporaneamente ai segnali macroemodinamici.
  16. Calibrare il flusso come da unità (PU) con calibrazione a 2 punti.
    1. Premere Invio per aprire il menu e selezionare l'impostazione di uscita analogica.
    2. Utilizzare il fattore di conversione visualizzato (5,0 V = 1000 PU) per calibrare Flux con calibrazione a 2 punti da utilizzare con il software di acquisizione sincronica.
    3. Selezionare Ritorna per tornare al menu precedente e selezionare Misurazione per continuare con la misurazione.
    4. Aprire il software di acquisizione sincronica. Selezionare zero tutti gli ingressi dal menu Setup. Collegare tutti gli ingressi con i dispositivi e le sonde utilizzati.
    5. Eseguire la calibrazione a 2 punti per Flux facendo clic sul menu a discesa del canale Flux. Selezionare la calibrazione a 2 punti. Impostare la conversione delle unità su on e selezionare BPU come unità. Per il punto 1, impostare 0 V su 0 BPU. Per il punto 2, impostare 5.0 V su 1000 BPU. Selezionare Imposta unità per tutti e nuovi dati. Premere OK per chiudere il menu.
  17. Avviare il drenaggio continuo del liquido cerebrospinale con una pressione target di 10 mmHg e un volume di drenaggio di 20 mL·h-1.

3. Posizionamento del catetere

  1. Esporre entrambe le arterie femorali.
  2. Ligatare la parte distale dell'arteria femorale destra, occludere temporaneamente il lume prossimale dell'arteria usando un anello vascolare, eseguire un taglio di 2 mm del vaso usando una forbice di Potts e introdurre il filo guida.
  3. Introdurre ulteriormente il filo guida, garantendo un inserimento privo di resistenza ed evitando qualsiasi attorcigliamento del filo; introdurre il catetere sul filo.
  4. Fissare il catetere con punti di sutura.
  5. Garantire la corretta posizione mediante aspirazione del sangue arterioso verificato con analisi dei gas ematici e misurazione del segnale arterioso dopo una corretta connessione alla pressione sanguigna e monitoraggio trans-cardiopolmonare hard- e software.
  6. Posizionare una sonda di flusso da 5 mm sull'arteria femorale sinistra e testare la qualità del segnale collegandosi al flussometro.
  7. Chiudere entrambi gli inguini con punti di sutura.
  8. Esporre l'arteria carotide destra e la vena giugulare interna destra per il posizionamento di 8 guaine introduttrici Fr.
  9. Per il posizionamento del catetere, procedere nello stesso modo descritto ai punti 3.2-3.4.
  10. Collegare il lume laterale della guaina introduttrice dell'arteria carotidea al monitoraggio della pressione di base e all'hardware di termodiluizione polmonare per la misurazione della pressione arteriosa.
  11. Introdurre un catetere a punta di pressione nell'aorta ascendente e verificare la posizione collegandosi all'amplificatore e all'acquisizione sincronica hard e software.
  12. Posizionare un catetere dell'arteria polmonare Swan-Ganz attraverso la guaina venosa nell'arteria polmonare gonfiando il palloncino con aria a 20 cm di profondità e inserendolo delicatamente fino a quando non si vede una pressione del cuneo nella curva emodinamica. Sgonfiare il palloncino e tirare indietro il catetere di 2 cm. Garantire una qualità del segnale soddisfacente della pressione dell'arteria polmonare. Collegare i termistori al monitoraggio della pressione di base e all'hardware di termodiluizione polmonare.
  13. Utilizzare la guida ecografica per il posizionamento percutaneo di un catetere venoso centrale da 12 Fr. 5 Lumen per la somministrazione del farmaco e la misurazione della pressione venosa centrale nella vena giugulare destra esterna. Utilizzare l'approccio a 6 fasi per il posizionamento ecografico38
  14. Collegare il lume distale del catetere alla pressione sanguigna e al software di monitoraggio trans-cardiopolmonare. Passare tutti i farmaci e le infusioni al catetere venoso centrale. Utilizzare un lume diverso per analgesici, fluidi e catecolamine e risparmiare il grande lume per la somministrazione di colloidi durante le fasi di carico del volume.

4. Preparazione chirurgica

  1. Eseguire una mini-laparotomia, mobilitare la vescica, inserire un catetere foley per il drenaggio delle urine, gonfiare il palloncino con soluzione salina e fissare il catetere con suture a sacca.
  2. Collegare il catetere a una sacca per la raccolta delle urine che mostra la quantità di urina in ml.
  3. Aumentare il FiO2 a 1,0 e ri-somministrare 0,1 mg·kg-1 pancuronio per via endovenosa.
  4. Eseguire una sternotomia mediana utilizzando l'elettrocauterizzazione per la preparazione fino allo sterno. Sezionare delicatamente lo sterno dal tessuto circostante. Eseguire il posizionamento retrosternale di un impacco per prevenire lesioni.
  5. Interrompere la ventilazione e dividere l'osso con una sega oscillante. Continuare la ventilazione e ridurre FiO2 a 0,3. Utilizzare l'elettrocauterizzazione per ridurre il sanguinamento e sigillare lo sterno con cera ossea.
  6. Mobilitare con attenzione l'apice del polmone sinistro e dividere la parte laterale sinistra del diaframma per facilitare l'esposizione chirurgica.
  7. Esporre l'aorta discendente prossimale al tronco celiaco mediante delicata retrazione del polmone sinistro, garantendo una ventilazione indisturbata ed evitando traumi al polmone sinistro (Figura 2A) e dividere il tessuto circostante (Figura 2B). Somministrare 7 mL·kg-1 colloide idrossietilico-amido se è necessaria la stabilizzazione emodinamica.
  8. Posizionare una presa intorno all'aorta discendente per garantire una corretta esposizione (Figura 2C).
  9. Collegare una sonda di flusso attorno all'aorta toracica discendente (Figura 2D). Garantire la corretta qualità del segnale collegandosi al modulo di flusso e all'acquisizione sincronica hard e software. Utilizzare il gel di contatto per migliorare la qualità del segnale, se necessario.
  10. Attaccare un anello del vaso attorno all'aorta discendente, distale alla sonda di flusso per contrassegnare l'area di serraggio della croce aortica.

5. Valutazione e acquisizione dati

  1. Azzerare tutti i cateteri e i cateteri di livello utilizzando linee piene di liquido poste al giusto livello atriale.
  2. Posizionare gli elettrodi ECG ad ago e collegarli all'acquisizione sincronica rigida e al software.
  3. La valutazione della termodiluizione trans-cardiopolmonare e le misurazioni del flusso aortico e della pressione sono state precedentemente descritte 34.
  4. Per la misurazione della gittata cardiaca utilizzando la termodiluizione dell'arteria polmonare, eseguire 3 iniezioni con 10 ml di soluzione salina fredda e notare il valore medio visualizzato dall'hardware di monitoraggio di base.
  5. Avviare il software laser-Doppler semplicemente premendo Starte impostare un segno per ogni fase di misurazione etichettando attentamente i passaggi da M0 a M5.

6. Protocollo sperimentale

  1. Eseguire misurazioni di base (M0).
  2. Eseguire l'ottimizzazione emodinamica utilizzando fasi di carico volumetrico di 7 mL·kg-1 colloide idrossietilico-amido. Eseguire ogni fase di caricamento del volume nell'arco di 5 minuti utilizzando infusioni pressurizzate. Dopo aver completato ogni fase di caricamento del volume, consentire 5 minuti per l'equilibrio. Iniziare il carico di volume fino a quando l'aumento della gittata cardiaca è <15%.
  3. Ripetere le misurazioni (M1) dopo il completamento dell'ottimizzazione emodinamica.
  4. Indurre ischemia/riperfusione per un totale di 48 min di cross-clamping aortico sopra-celiaco posizionando un morsetto aortico sulla zona segnata.
  5. Applicare il serraggio aortico in ordine crescente di intervalli di 1, 2, 5, 10 e 30 minuti per migliorare la sopravvivenza degli animali durante il protocollo di studio.
  6. Continuare il cross-clamping aortico dopo ogni intervallo dopo un massimo di 5 minuti o dopo la normalizzazione del flusso dell'arteria femorale.
  7. Eseguire l'occlusione manuale dell'afflusso della vena cava inferiore per prevenire aumenti della pressione sanguigna di > 100 mmHg di pressione arteriosa media.
  8. Somministrare iniezioni in bolo di noradrenalina o epinefrina durante la fase di serraggio, se necessario, per prevenire diminuzioni della pressione arteriosa media inferiore a 40 mmHg.
  9. Ripetere le misurazioni alla fine dell'intervallo di serraggio di 30 minuti prima della riperfusione (M2).
  10. Aprire gradualmente il morsetto per garantire la stabilità emodinamica. Chiudere il morsetto se la pressione sanguigna scende troppo rapidamente e consentire la stabilizzazione.
  11. Somministrare 7 mL·kg-1 di colloidi idrossietil-amido e ulteriori iniezioni in bolo di 10-20 μg di noradrenalina e/o epinefrina per la stabilizzazione. Somministrare 2 ml kg-1 di bicarbonato di sodio all'8,4% se il pH scende al di sotto di 7,1. Garantire una corretta regolazione della frequenza respiratoria per garantire normocapnia.
  12. Ripetere le misurazioni 1 ora dopo la riperfusione (M3).
  13. Ripetere l'ottimizzazione emodinamica come descritto al punto 6.2 e ripetere le misurazioni (M4).
  14. Eseguire le misurazioni finali 4,5 ore dopo l'induzione di ischemia/riperfusione (M5).

7. Eutanasia

  1. Somministrare 40 mmol di cloruro di potassio per via endovenosa per l'eutanasia per indurre fibrillazione ventricolare e asistolia.
  2. Terminare la ventilazione e rimuovere tutti i cateteri.

8. Prelievo di organi

  1. Posizionare l'animale in posizione prona e rimuovere le sonde ad ago e il drenaggio.
  2. Esporre la colonna vertebrale mediante incisione cutanea e rimozione del tessuto muscolare utilizzando un bisturi e una pinza.
  3. Utilizzare una sega oscillante per dividere il paramediano dell'arco vertebrale su entrambi i lati e rimuovere la parte dorsale dell'osso vertebrale spostando attentamente il processo spinoso lateralmente per allentare le connessioni rimanenti.
  4. Utilizzare una pinza per sollevare con cura il midollo spinale dalle estremità caudali a quelle craniche e utilizzare un bisturi per tagliare i nervi spinali per rimuovere il midollo spinale.
  5. Conservare il midollo spinale in formalina al 4% fino a un ulteriore utilizzo per la valutazione istopatologica o la quantificazione della microsfera.

9. Analisi statistica

  1. Utilizzare software statistico.
  2. Garantire la distribuzione normale mediante l'ispezione di istogrammi e variabili di trasformazione del log, se necessario.
  3. Sottoporre le variabili dipendenti - flusso del midollo spinale, gittata cardiaca, frequenza cardiaca, volume dell'ictus, pressione arteriosa sistolica, pressione arteriosa media, pressione arteriosa diastolica, pressione venosa centrale, resistenza vascolare sistemica - nonché microperfusione del midollo spinale superiore e inferiore valutata con microsfere fluorescenti se lo si desidera - ad analisi di modelli misti lineari generali, utilizzando la routine GENLINMIXED per dati continui con una funzione di collegamento di identità.
  4. Utilizzare le regolazioni di base.
  5. Specificate modelli con effetti fissi per la linea di base e il punto di misurazione variabili. Considerare il punto di misurazione come misure ripetute all'interno degli animali.
  6. Riportare i valori p degli effetti fissi per il punto di misurazione per ciascun parametro.
  7. Per l'analisi della microsfera fluorescente del midollo spinale, utilizzare la regione (midollo spinale inferiore, midollo spinale superiore) in aggiunta come effetto fisso e interazione tra regione e punto di misurazione per valutare le interazioni tra regioni e punto di misurazione e riportare i valori p di effetti fissi anche per l'interazione.
  8. Calcola le medie marginali aggiustate al basale con intervallo di confidenza (CI) del 95% per tutte le variabili dipendenti nei punti di misurazione M1-M5, seguite da confronti a coppie tramite test di differenza meno significativi.
  9. Esprimere le variabili come media (IC 95%). Esprimere il peso dell'animale come deviazione media ± standard.
  10. Presentare valori p non rettificati.

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Representative Results

Tutti e sei gli animali sono sopravvissuti fino al completamento del protocollo. Il peso degli animali era di 48,2 ± 2,9 kg; cinque animali erano maschi e un animale era femmina. L'inserimento della sonda dell'ago del midollo spinale e la misurazione del flusso del midollo spinale erano fattibili in tutti gli animali.

Esempi di registrazioni microcircolatorie del midollo spinale in tempo reale in combinazione con registrazioni microcircolatorie e macroemodinamiche cerebrali durante il cross-clamping aortico per l'induzione dell'ischemia e durante lo sblocco e la riperfusione sono mostrati in Figura 3A, Figura 3B. L'interruzione del flusso aortico discendente è stata seguita da una marcata diminuzione del flusso del midollo spinale, mentre la pressione nell'aorta ascendente è aumentata (Figura 3A). La riperfusione ha portato a effetti opposti (Figura 3B).

L'analisi statistica dei parametri macro e microcircolatori è riportata nella Tabella 1. Le medie marginali stimate su modelli misti e i loro intervalli di confidenza indicano una marcata riduzione del flusso del midollo spinale durante l'ischemia. Al contrario, il flusso cerebrale è aumentato notevolmente durante l'ischemia, come indicato dai mezzi marginali stimati e dai loro intervalli di confidenza. Ciò è stato accompagnato da un aumento della pressione arteriosa, della frequenza cardiaca e della resistenza vascolare sistemica, mentre la gittata cardiaca e il volume dell'ictus sono diminuiti. L'analisi della microsfera fluorescente ha rivelato una marcata diminuzione del flusso sanguigno microcircolatorio del midollo spinale nel midollo spinale inferiore, mentre non vi è stato alcun cambiamento significativo nel midollo spinale superiore, come indicato dai mezzi marginali stimati e dai loro intervalli di confidenza. La riperfusione ha portato a effetti opposti. Sebbene ci sia stata un'ulteriore diminuzione della gittata cardiaca, del volume dell'ictus e della pressione arteriosa alla fine del protocollo, il flusso sanguigno del midollo spinale e il flusso sanguigno microcircolatorio del midollo spinale erano stabili.

I risultati di questo studio mostrano la capacità delle sonde ad ago Laser/Doppler di rilevare cambiamenti in tempo reale nella microperfusione del midollo spinale. Come previsto, la diminuzione della microcircolazione del midollo spinale durante l'ischemia è stata drastica con un flusso microcircolatorio minimo. Il recupero del flusso del midollo spinale si è verificato dopo la riperfusione. La perfusione inferiore del midollo spinale, valutata con microsfere fluorescenti, ha mostrato un comportamento comparabile, supportando così il metodo. Come previsto, la perfusione del midollo spinale superiore e il flusso cerebrale hanno mostrato comportamenti diversi. Sebbene la microcircolazione del midollo spinale fosse stabile, la macrocircolazione è diminuita alla fine del protocollo, mostrando una perdita di coerenza emodinamica. Mentre il flusso nell'aorta discendente era pari a zero durante l'ischemia, la riperfusione ha portato a un recupero del flusso aortico. L'analisi istopatologica ha rivelato una lieve necrosi del midollo spinale con punteggi di Kleinman per il midollo spinale inferiore tra 0 e 2 e per il midollo spinale superiore tra 0 e 1.

Figure 1
Figura 1: Posizionamento della sonda laser/Doppler nel midollo spinale. (A) Esposizione chirurgica delle strutture vertebrali. (B) Puntura del midollo spinale utilizzando un catetere venoso. (C) Inserimento della sonda ad ago dopo la rimozione dell'ago da intarsio. (D) Fissazione della sonda ad ago. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Esposizione dell'aorta discendente e posizionamento della sonda di flusso e dell'anello del vaso. (A) Esposizione dell'aorta discendente dopo aver mobilitato l'apice del polmone sinistro e diviso la parte laterale sinistra del diaframma. (B) Divisione del tessuto circostante per l'esposizione chirurgica. (C) Posizionamento di una presa attorno all'aorta discendente per garantire un'adeguata esposizione circolare. (D) Posizionamento della sonda di flusso e dell'anello del recipiente attorno all'aorta discendente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Registrazioni campione di segnali microcircolatori e macroemodinamici durante l'ischemia e la riperfusione. Registrazioni di campioni di ECG, pressione nell'aorta ascendente misurata utilizzando un catetere microtip, flusso nell'aorta discendente misurata utilizzando una sonda di flusso ad ultrasuoni, midollo spinale e flusso microcircolatorio cerebrale misurato utilizzando sonde ad ago laser / Doppler. (A) Campione di 50 s durante l'induzione dell'ischemia mediante cross-clamping aortico sopra-celiaco. (B) Campione di 20 s durante l'induzione della riperfusione mediante delicata riapertura del morsetto trasversale aortico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

M1 · M2 · M3 · M4 · M5 ·
Flusso del midollo spinale 61.35 (41.96-89.70) 6.78 (4.63-9.91) 58.97 (40.33-86.22) 66.05 (45.17-96.57) 59.09 (40.41-86.40)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,878 p = 0,777 p = 0,886
Flusso cerebrale 41.12 (28.17-60.04) 71.73 (49.13-104.73) 60.34 (41.33-88.10) 59.91 (36.93-78.71) 49.82 (34.12-72.74)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p = 0,023 Confronto a coppie M1 p = 0,001 p = 0,045 p = 0,173 p = 0,341
Microperfusione del midollo spinale (ml/min/g) Midollo spinale superiore 0.071 (0.058-0.087) 0.063 (0.052-0.078) 0.088 (0.072-0.11) 0.082 (0.067-0.100) 0.083 (0.068-0.102)
Confronto a coppie M1 p = 0,420 p = 0,146 p = 0,344 p = 0,281
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001
Midollo spinale inferiore 0.079 (0.065-0.097) 0.031 (0.026-0.039) 0.111 (0.090-0.136) 0.089 (0.073-0.110) 0.105 (0.086-0.129)
Punto di misurazione dell'interazione · Regione del midollo spinale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,021 p = 0,400 p = 0,051
Gittata cardiaca (l/min) 4.15 (3.69-4.61) 3.13 (2.67-3.60) 3.30 (2.84-3.76) 3.67 (3.20-4.13) 2.67 (2.00-2.93)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,007 p = 0,125 p < 0,001
Frequenza cardiaca (bpm) 74.42 (53.70-95.15) 131.09 (110.36-151.82) 88.92 (68.19-109.65) 80.62 (59.89-101.35) 99.38 (78.65-120.11)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p = 0,002 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,314 p = 0,666 p = 0,092
Volume corsa (ml) 55.50 (49.20-61.81) 25.33 (19.03-31.64) 37.00 (30.69-43.31) 45.33 (39.03-51.64) 27.17 (20.86-33.47)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,004 p < 0,001
Aorta ascendente a pressione arteriosa sistolica (mmHg) 94.36 (85.20-103.52) 122.05 (112.89-131.20) 76.72 (67.56-85.88) 88.36 (79.20-97.52) 73.36 (64.20-82.52)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,006 p = 0,321 p = 0,002
Aorta ascendente a pressione arteriosa media (mmHg) 78.18 (68.68-87.67) 107.29 (97.80-116.78) 59.08 (49.58-68.57) 70.38 (60.89-79.87) 58.35 (48.85-67.84)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,005 p = 0,217 p = 0,004
Aorta ascendente a pressione arteriosa diastolica (mmHg) 59.20 (49.41-69.00) 93.76 (83.97-103.56) 45.18 (35.38-54.98) 52.48 (42.69-62.28) 45.33 (35.54-55.13)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,038 p = 0,302 p = 0,040
Resistenza vascolare sistemica (dyn x sec x cm-5) 1421.13 (1236.94-1632.74) 208089.94 (181128.10-239085.87) 1335.36 (1162.29-1534.21) 1412.62 (1229.54-1622.97) 1807.46 (1573.21-2076.60)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p < 0,001 Confronto a coppie M1 p < 0,001 p = 0,407 p = 0,938 p = 0,005
Portata (l/min) Aorta discendente 3.27 (0.96-5.58) 0 3.27 (0.96-5.58) 3.54 (1.23-5.85) 4.54 (2.32-6.85)
Punto di misurazione dell'effetto principale: p = 0,003 Confronto a coppie M1 p = 0,998 p = 0,844 p = 0,381

Tabella 1: Cambiamenti nei parametri emodinamici durante il protocollo. I valori sono indicati come medie marginali stimate aggiustate per lo scenario basale con intervalli di confidenza del 95%. Per ciascun parametro vengono forniti valori p non rettificati dei test F dei principali effetti del punto di misurazione e degli effetti di interazione tra regione e punto di misurazione per la microperfusione del midollo spinale superiore e inferiore. Vengono inoltre presentati valori p non rettificati di confronti a coppie di singoli punti di misura con M1. I punti di misura sono: M1 = Ottimizzazione emodinamica prima ischemia/riperfusione, M2 = Durante l'ischemia, M3 = 1 ora dopo riperfusione M4 = Ottimizzazione emodinamica dopo ischemia/riperfusione, M5 = 4,5 h dopo l'induzione dell'ischemia/riperfusione.

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Discussion

La SCI indotta dall'ischemia del midollo spinale è una delle principali complicanze della riparazione aortica con un enorme impatto sull'esito del paziente1,2,3,4,10,11,12. Le terapie mirate alla microcircolazione per prevenire e curare la SCI sono le più promettenti. Il protocollo fornisce un metodo riproducibile per la valutazione microcircolatoria del midollo spinale in tempo reale e offre la possibilità di valutare gli effetti di nuovi approcci terapeutici sulla microcircolazione del midollo spinale in condizioni di ischemia/riperfusione.

Ci sono alcuni passaggi metodologici critici in questo modello sperimentale. Per prevenire la perdita di animali, i ricercatori devono essere esperti nelle tecniche anestesiologiche (inserimento del drenaggio del liquido cerebrospinale, accesso vascolare ecografico e terapia emodinamica durante l'esposizione aortica, cross-clamping aortico e riperfusione) e nelle tecniche chirurgiche (sternotomia, esposizione dei vasi, esposizione chirurgica dell'aorta discendente). L'inserimento della sonda ad ago del midollo spinale richiede esperienza, profonda conoscenza dell'anatomia e solide competenze tecniche. Tuttavia, nella nostra esperienza, la curva di apprendimento è considerevolmente ripida e i ricercatori più esperti raggiungeranno il successo in breve tempo, anche se devono essere evitati più tentativi per prevenire lesioni del midollo spinale che potrebbero influenzare la metodologia.

Un altro passo critico è il passaggio dalla posizione laterale destra a quella supina per prevenire la lussazione o danni alla sonda dell'ago del midollo spinale. Per questa manovra si raccomandano 4-5 persone, è essenziale una corretta imbottitura del sito di inserimento e si deve prestare particolare attenzione a non dislocare la sonda. L'esposizione dell'aorta discendente richiede anche alcuni passaggi critici. L'apice del polmone sinistro deve essere mobilitato per consentire una delicata retrazione del polmone sinistro per esporre il campo chirurgico. Inoltre, la parte laterale sinistra del diaframma deve essere sezionata per facilitare l'esposizione. Durante la preparazione aortica, è necessaria una comunicazione ottimale tra i ricercatori che eseguono interventi chirurgici e quelli che forniscono anestesia e gestione emodinamica per garantire un'adeguata stabilità cardiopolmonare. Durante il cross-clamping aortico, si raccomanda la compressione manuale della vena cava inferiore per ridurre il ritorno venoso. Senza questa manovra, possono verificarsi gravi aumenti di carico che potrebbero portare a lesioni miocardiche deleterie39,40.

La riperfusione deve essere eseguita con cautela con fluidi, vasopressori e inotropi pronti all'uso. Durante la riperfusione, si verificano cambiamenti drammatici che possono portare a grave ipotensione, aritmie cardiache e insufficienza circolatoria41. Tuttavia, l'osservazione cauta del comportamento emodinamico, l'avvio tempestivo degli interventi e l'uso di una prestazione strutturata e delicata durante questa fase critica possono prevenire la perdita di animali. Inoltre, l'uso di intervalli ascendenti di cross-clamping aortico, seguiti da periodi di tempo per migliorare la rigenerazione, come utilizzato nel protocollo, induce effetti di precondizionamento ischemico che migliorano la stabilità emodinamica durante la riperfusione42,43.

Il modello fornisce la possibilità di monitorare la microcircolazione del midollo spinale oltre alla valutazione macrocircolatoria. A causa della perdita di coerenza emodinamica frequentemente osservata in chirurgia ad alto rischio e pazienti critici, è necessaria una valutazione diretta della microcircolazione del midollo spinale13,30. La microcircolazione sublinguale viene spesso utilizzata per sostituire la valutazione microcircolatoria diretta nell'organo di interesse44. Tuttavia, è stata dimostrata la dissociazione tra microcircolazione sublinguale e organi vitali, sottolineando il valore della valutazione microcircolatoria diretta nel midollo spinale, come utilizzato nel modello sperimentale45. Infine, il modello ha il vantaggio del monitoraggio in tempo reale del flusso sanguigno del midollo spinale rispetto alla valutazione della microsfera fluorescente, che è limitata dall'uso intermittente e dall'analisi post-mortem46. L'impatto della valutazione in tempo reale può essere visto meglio quando si guardano le registrazioni di esempio durante l'ischemia e l'induzione della riperfusione, mostrando rapidi cambiamenti nella microperfusione del midollo spinale. Tuttavia, va considerato che l'inserimento della sonda laser-Doppler nel midollo spinale potrebbe portare a piccole, ma considerevoli, lesioni del midollo spinale.

Poiché l'integrità del midollo spinale potrebbe influenzare i parametri emodinamici, questo potrebbe essere uno svantaggio del metodo. Tuttavia, l'uso di tecniche laser-Doppler per valutare la microperfusione del midollo spinale sono stati precedentemente utilizzati47,48,49,50. Inoltre, sebbene non abbiamo osservato cambiamenti emodinamici a seguito dell'inserimento della sonda, non abbiamo potuto escludere effetti emodinamici indotti da questo metodo. Va notato che le alterazioni emodinamiche possono anche essere indotte dall'uso di iniezioni di microsfere, che sarebbero, tuttavia, di minore importanza negli animali di grandi dimensioni51. Inoltre, la funzione sensoriale o motoria può essere influenzata dall'inserimento della sonda e, pertanto, l'uso della valutazione del potenziale evocato sensoriale o motorio deve essere eseguito con cautela in combinazione con la valutazione laser-Doppler.

A questo proposito, la tecnica di iniezione della microsfera potrebbe essere vantaggiosa. Inoltre, le tecniche non dovrebbero essere utilizzate per studi cronici; tuttavia, questo è vero anche per le iniezioni di microsfere, che sono limitate agli studi acuti perché dipendono dall'analisi tissutale post-mortem. La maggior parte degli studi che utilizzano tecniche laser-Doppler sono stati eseguiti in piccoli animali47,48,49,50 Qui, descriviamo una tecnica per l'uso nei suini, come un modello animale di grandi dimensioni, che potrebbe facilitare la traduzione in studi clinici. La tecnica di introduzione paramediana supera il problema dei grandi processi spinosi nei suini, il che complica il corretto posizionamento delle sonde del midollo spinale. Inoltre, la tecnica ha il vantaggio che la laminectomia o la rimozione del tessuto dura non è necessaria, prevenendo una costante perdita di liquore. Poiché la pressione del liquido cerebrospinale ha un enorme impatto sulla perfusione del midollo spinale32,il modello ha il vantaggio di misurare e ottimizzare la pressione del liquido cerebrospinale oltre alla microperfusione del midollo spinale e affronterà l'effetto della pressione del liquido cerebrospinale sulla microperfusione del midollo spinale nei progetti futuri.

Il protocollo ha alcune limitazioni che dovrebbero essere menzionate. I valori assoluti del flusso del midollo spinale differiscono considerevolmente tra gli animali a causa delle differenze nella posizione esatta della sonda e della vicinanza dei vasi del midollo spinale più grandi. Pertanto, le regolazioni di base devono essere eseguite quando si confrontano i valori. Tuttavia, le differenze intra-individuali tra i punti di misurazione sono altamente coerenti purché venga esercitata una meticolosa cautela per evitare movimenti della sonda dell'ago durante il protocollo. Inoltre, questo studio non è stato progettato come uno studio di confronto tra i metodi Laser-Doppler e la microsfera fluorescente. Dato il numero di animali, non abbiamo eseguito un'analisi di correlazione tra questi due metodi.

Sebbene entrambi i metodi abbiano mostrato un comportamento comparabile con riduzioni significative durante l'ischemia e il recupero dopo la riperfusione per entrambi, un confronto dei metodi dovrebbe essere affrontato utilizzando studi adeguatamente progettati in futuro. Tuttavia, l'uso di microsfere ha inoltre consentito la valutazione di diversi comportamenti per la microperfusione del midollo spinale superiore e inferiore. Inoltre, l'analisi istopatologica ha rivelato solo una necrosi moderata del midollo spinale rispetto ad altri modelli di ischemia del midollo spinale37. Prolungare la durata dell'ischemia e omettere misure di pre-condizionamento può portare a cambiamenti più gravi che possono essere desiderati da alcuni ricercatori. Sebbene abbiamo valutato solo lievi cambiamenti istopatologici, questo può essere diverso con una maggiore durata dell'ischemia. A questo proposito, un periodo più lungo dopo ischemia/riperfusione prima della cessazione del protocollo può anche aver portato a cambiamenti istopatologici più gravi. Tuttavia, il protocollo ha permesso la stabilità emodinamica un'ora dopo la riperfusione senza la necessità di ulteriori o addirittura continue applicazioni di inotropi o vasopressori.

Per la valutazione di diversi interventi emodinamici, questo modello fornisce condizioni ottimali. Sebbene abbiamo usato l'ottimizzazione dei fluidi come esempio di intervento emodinamico, altri approcci possono essere valutati con questo metodo. Mentre questo protocollo fornisce una valutazione microcircolatoria in un modello di ischemia/riperfusione, la durata dell'ischemia limita la valutazione degli approcci terapeutici durante l'ischemia prima della riperfusione. Inoltre, durante l'ischemia, si è verificata una variazione nei cambiamenti emodinamici (ad esempio, ipertensione, ipotensione, tachicardia, bradicardia e aritmie cardiache). L'occlusione manuale dell'afflusso influisce ulteriormente sulle variabili emodinamiche durante questa fase. Pertanto, il protocollo non è raccomandato per la valutazione degli approcci terapeutici durante l'ischemia prima della riperfusione. Tuttavia, altre impostazioni sperimentali, come l'uso di tecniche di embolizzazione o legatura, possono essere combinate con la valutazione della sonda laser del midollo spinale / doppler ad ago, come descritto in questo protocollo.

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Disclosures

Constantin J.C. Trepte ha ricevuto un premio onorario per le conferenze di Maquet. Tutti gli altri autori non dichiarano conflitti di interesse. Questo studio è stato supportato dalla European Society of Anaesthesiology Young Investigator Start-Up Grant 2018.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Lena Brix, V.M.D, Institute of Animal Research, Hannover Medical School, così come la signora Jutta Dammann, Facility of Research Animal Care, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Germania, per aver fornito cure pre e perioperatorie agli animali e la loro assistenza tecnica sulla manipolazione degli animali. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Dr. Daniel Manzoni, Dipartimento di Chirurgia Vascolare, Hôpital Kirchberg, Lussemburgo, per la sua assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CardioMed Flowmeter Medistim AS, Oslo, Norway CM4000 Flowmeter for Flow-Probe Femoral Artery
CardioMed Flow-Probe, 5mm Medistim AS, Oslo, Norway PS100051 Flow-Probe Femoral Artery
COnfidence probe,  Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA MA16PAU Flow-Probe Aorta
16 mm liners
DIVA Sevoflurane Vapor Dräger Medical, Lübeck, Germany Vapor
Hotline Level 1 Fluid Warmer Smiths Medical Germany GmbH, Grasbrunn, Germany HL-90-DE-230 Fluid Warmer
Infinity Delta Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Monitoring Hardware
Infinity Hemo Dräger Medical, Lübeck, Germany Basic Pressure Monitoring and Pulmonary Thermodilution Hardware
LabChart Pro ADInstruments Ltd., Oxford, UK v8.1.16 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Software
LiquoGuard 7 Möller Medical GmbH, Fulda, Germany Cerebrospinal Fluid Drainage System
Millar Micro-Tip Pressure Catheter (5F, Single, Curved, 120cm, PU/WD) ADInstruments Ltd., Oxford, UK SPR-350 Pressure-Tip Catheter Aorta
moor VMS LDF moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Hardware
moor VMS Research Software moor Instruments, Devon, UK Designated Laser-Doppler Software
Perivascular Flow Module Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA TS 420 Flow-Module for Flow-Probe Aorta
PiCCO 2, Science Version Getinge AB, Göteborg, Sweden v. 6.0 Blood Pressure and Transcardiopulmonary Monitoring Hard- and Software
PiCCO 5 Fr. 20cm Getinge AB, Göteborg, Sweden Thermistor-tipped Arterial Line 
PowerLab ADInstruments Ltd., Oxford, UK PL 3516 Synchronic Laser-Doppler, Blood Pressure, ECG and Blood-Flow Aquisition Hardware
QuadBridgeAmp ADInstruments Ltd., Oxford, UK FE 224 Four Channel Bridge Amplifier for Laser-Doppler and Invasive Blood Pressure Aquisition
Silverline Spiegelberg, Hamburg, Germany ELD33.010.02 Cerebrospinal Fluid Drainage
SPSS statistical software package  IBM SPSS Statistics Inc., Armonk, New York, USA v. 27 Statistical Software
Twinwarm Warming System Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 12TW921DE Warming System
Universal II Warming Blanket Moeck & Moeck GmbH, Hamburg, Germany 906 Warming Blanket
VP 3 Probe, 8mm length (individually manufactured) moor Instruments, Devon, UK Laser-Doppler Probe
Zeus Dräger Medical, Lübeck, Germany Anesthesia Machine

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Medicina Numero 166 Lesioni del midollo spinale Ischemia del midollo spinale perfusione del midollo spinale terapia emodinamica microcircolazione pressione del liquido cerebrospinale Laser-Doppler
Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione
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Behem, C. R., Friedheim, T., Wipper, S. H., Pinnschmidt, H. O., Graessler, M. F., Gaeth, C., Holthusen, H., Rapp, A., Suntrop, T., Haunschild, J., Etz, C. D., Trepte, C. J. C. Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion. J. Vis. Exp. (166), e62047, doi:10.3791/62047 (2020).

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