Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris

Summary

Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.

Abstract

Le signal électrique physiologiquement généré par les cellules du stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire (SAN) est conduit à travers le système de conduction, qui comprend le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), pour permettre l’excitation et la contraction de tout le cœur. Tout dysfonctionnement du SAN ou de l’AVN entraîne des arythmies, indiquant leur rôle fondamental dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse. Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l’arythmie, mais l’étude spécifique du SAN et de l’AVN reste difficile.

Le SAN est situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure et AVN est situé au sommet du triangle de Koch, formé par l’orifice du sinus coronaire, l’anneau tricuspide et le tendon de Todaro. Cependant, en raison de la petite taille, la visualisation par histologie conventionnelle reste difficile et ne permet pas l’étude du SAN et de l’AVN dans leur environnement 3D.

Nous décrivons ici une approche d’immunofluorescence à montage entier qui permet la visualisation locale du SAN et de l’AVN marqués chez la souris. La coloration par immunofluorescence à montage entier est destinée à de plus petites sections de tissu sans nécessiter de section manuelle. À cette fin, le cœur de souris est disséqué, avec le tissu indésirable enlevé, suivi de la fixation, de la perméabilisation et du blocage. Les cellules du système de conduction dans le SAN et l’AVN sont ensuite colorées avec un anticorps anti-HCN4. La microscopie confocale à balayage laser et le traitement d’image permettent de différencier les cellules nodales et les cardiomyocytes fonctionnels, et de localiser clairement le SAN et l’AVN. En outre, des anticorps supplémentaires peuvent également être combinés pour marquer d’autres types de cellules, telles que les fibres nerveuses.

Par rapport à l’immunohistologie conventionnelle, la coloration par immunofluorescence à montage entier préserve l’intégrité anatomique du système de conduction cardiaque, permettant ainsi l’investigation de l’AVN; en particulier dans leur anatomie et leurs interactions avec le myocarde de travail environnant et les cellules non myocytaires.

Introduction

Les arythmies sont des maladies courantes qui touchent des millions de personnes et sont la cause d’une morbidité et d’une mortalité importantes dans le monde entier. Malgré d’énormes progrès dans le traitement et la prévention, tels que le développement de stimulateurs cardiaques, le traitement des arythmies reste difficile, principalement en raison des connaissances très limitées sur les mécanismes sous-jacents de la maladie ^1,2,3. Une meilleure compréhension de l’électrophysiologie normale et de la physiopathologie des arythmies peut aider à développer des stratégies de tr....

Protocol

Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich, et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Les souris C57BL6/J ont été achetées au Jackson Laboratory.

NOTE: La figure 1 montre les instruments nécessaires à l’expérience. La figure 2 montre une illustration de l’anatomie....

Results

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, l’imagerie par microscopie confocale du SAN et de l’AVN peut être réalisée de manière fiable. La coloration spécifique du système de conduction à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant HCN4 et la coloration du myocarde de travail à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant Cx43 permettent l’identification claire du SAN (Figure 5, Vidéo 1) et de l’AVN (Figure 6, Vidéo 2) .......

Discussion

L’anatomie cardiaque a traditionnellement été étudiée à l’aide de coupes histologiques minces¹¹. Cependant, ces méthodes ne préservent pas la structure tridimensionnelle du système de conduction et ne fournissent donc que des informations 2D. Le protocole de coloration par immunofluorescence à montage complet décrit ici permet de surmonter ces limitations et peut être utilisé en routine pour l’imagerie SAN et AVN.

Par rapport aux méthodes standard telles que l’immunohis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Comprend une chambre d’induction, une unité d’évacuation de gaz et des filtres à charbon
Circuit Bain modifié	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Comprend un masque d’anesthésie pour souris
Plateforme chirurgicale	Kent Scientific	SURGI-M
Instrumentation in vivo
Pince fine	Outils de science fine	11295-51
Ciseaux à iris	de science fine	14084-08
Ciseaux à ressort	de science fine	91500-09
Pince à tissus	Outils de science fine	11051-10
Épingles à tissu	Outils de science fine	26007-01	Pourrait utiliser des aiguilles 27G comme substitut
General lab instruments
Agitateur orbital	Sunlab	D-8040
Agitateur magnétique	IKA  ;	de base
, volume 10 & micro ; L, 100 et micro ; L, 1000 et micro ; L	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes Microscope
stéréo-zoom de dissection  ;	VWR	10836-004
Laser Scanning Microscope confocal	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 noir	Zeiss
General Lab Material
0,2 et micro ; Filtre à seringue	Sartorius	17597
100 mm Boîte de Pétri	Falcon	351029
27G aiguille	BD Microlance 3	300635
50 ml Tube conique en polypropylène	Falcon	352070
5ml Seringue	Braun	4606108V
Couvre-slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Composants du TEA
16 % Formaldéhyde Solution	Thermo Scientific  ;	28908	Utilisation en solution à 4 %  ;
Acide acétique	Merck	100063	Composants du thé
Agarose	Biozym	850070
Sérum bovin Albumine	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Sérum de chèvre normal	Sigma	NS02L
Saccharose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Composants du TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Dilué à 1 % dans PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5  ; mg/10  ; mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygène 5 L	Linde	2020175	Comprend un régulateur de pression
Chèvre anti-Lapin IgG Alexa Fluor  ; 488  ;	Cell Signaling Technology	#4412	dilué à 1:200
IgG anti-rat de chèvre Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	dilué à 1:200
Hoechst 33342, trichlorhydrate trihydraté (DAPI)	Invitrogen	H3570	dilué à 1:1000
Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	dilué à 1:200
Anti-HCN4 de rat (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	dilué à 1:200
<>AutreAnneau
	et imprimé en 3D
C57BL/6	Le Laboratoire