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Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62058
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

ERRATUM NOTICE

Summary

Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Abstract

La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.

La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.

Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.

En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.

Introduction

Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento novedosas, innovadoras y causales en el futuro. Además, para estudiar exhaustivamente la arritmogénesis, es importante localizar y visualizar el sistema de conducción cardíaca específico en modelos animales como el ratón, ya que los ratones son ampliamente utilizados en la investigación electrofisiológica.

Las partes principales del sistema de conducción cardíaca son el nódulo sinoauricular (SAN), donde el impulso eléctrico se genera en células marcapasos especializadas, y el nódulo auriculoventricular (AVN), que es la única conexión eléctrica entre las aurículas y los ventrículos4. Siempre que se alteran las propiedades electrofisiológicas de la RAS y la AVN, pueden ocurrir arritmias como el síndrome del seno enfermo o el bloqueo auriculoventricular que pueden conducir a deterioro hemodinámico, síncope e incluso la muerte, y así subrayar el papel esencial de la RAS y la NVA en electrofisiología y arritmogénesis5.

Los estudios exhaustivos sobre SAN o AVN requieren una localización y visualización precisas de ambas estructuras, idealmente dentro de su entorno fisiológico. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación dentro del miocardio de trabajo, sin establecer una estructura macroscópicamente visible clara, estudiar la anatomía y electrofisiología de SAN y AVN es un desafío. Los puntos de referencia anatómicos se pueden usar para identificar aproximadamente la región que contiene SAN y AVN 6,7,8. En resumen, la RAS se encuentra en la región intercava de la aurícula derecha adyacente a la crista terminal muscular (TC), la AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch establecido por la válvula tricúspide, el ostium del seno coronario y el tendón de Todaro. Hasta ahora, estos puntos de referencia anatómicos se utilizaron principalmente para localizar, eliminar y luego estudiar SAN y AVN como estructuras individuales (por ejemplo, por histología convencional). Sin embargo, para comprender mejor la compleja electrofisiología de SAN y AVN (por ejemplo, los efectos reguladores de las células adyacentes del miocardio de trabajo), es necesario estudiar los sistemas de conducción dentro del entorno fisiológico 3D.

La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo es un método que se utiliza para estudiar las estructuras anatómicas in situ , preservando la integridad del tejido circundante9. Aprovechando el software de microscopía confocal y análisis de imágenes, SAN y AVN se pueden visualizar con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a canales iónicos expresados específicamente en estas regiones.

El siguiente protocolo explica los pasos necesarios para realizar un método de tinción de montaje completo bien establecido para la localización y visualización de microscopios SAN y AVN. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) localizar SAN y AVN por puntos de referencia anatómicos para preparar estas muestras para tinción y análisis de microscopía (2) realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de los marcadores de referencia HCN4 y Cx43 (3) para preparar muestras SAN y AVN para microscopía confocal (4) para realizar imágenes confocales de SAN y AVN. También describimos cómo se puede modificar este protocolo para incluir tinción adicional de miocardio circundante o células no miocitos que funcionan, como fibras nerviosas autónomas, lo que permite una investigación exhaustiva del sistema de conducción cardíaca dentro del corazón.

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Protocol

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich, y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Los ratones C57BL6/J fueron comprados en el Laboratorio Jackson.

NOTA: La figura 1 muestra los instrumentos necesarios para el experimento. La figura 2 muestra una ilustración de la anatomía cardíaca macroscópica. La Figura 3 muestra la ubicación de SAN y AVN en un corazón de ratón adulto. La figura 4 muestra la muestra preparada cargada en la microscopía confocal.

1. Preparativos

  1. Prepare una solución de formaldehído al 4% (PFA al 4%) diluyendo 10 ml de solución de formaldehído al 16% en 30 ml de PBS.
  2. Prepare una solución de sacarosa al 15% y una solución de sacarosa al 30% disolviendo 15 g y 30 g de sacarosa en polvo en 100 ml de PBS, respectivamente. Una vez disuelto completamente el polvo de sacarosa, filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm antes de conservarla a 4 °C.
  3. Prepare un gel de agarosa al 3% -4%, agregue 3 g o 4 g de polvo de agarosa y 100 ml de 1x TAE (diluido de una solución madre de 50x TAE) en un vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y hiérvalo hasta que la agarosa se disuelva por completo.
  4. Prepare el plato de disección vertiendo suavemente 30 ml de gel de agarosa (3% -4%) en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Deje la placa de Petri en el banco a temperatura ambiente para que se enfríe y se endurezca.
  5. Prepare la solución de bloqueo y la solución de lavado de acuerdo con las recetas proporcionadas en la Tabla 1. Prepare todas las soluciones preparadas el día de su uso. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo.
  6. Preparar las soluciones de anticuerpos diluyéndolas en frío (4 °C) 1x PBS, proteger la dilución de la luz (por ejemplo, envolviendo papel de aluminio alrededor) y mantener las diluciones en hielo hasta que se utilicen. Diluir los anticuerpos poco antes de la incubación. Evite dejar los anticuerpos diluidos a temperatura ambiente.
    NOTA: La dilución de anticuerpos apropiada debe probarse con muestras de tejido comparables mediante la realización de una tinción inmunofluorescente convencional. Aquí, probamos los anticuerpos teñiendo secciones congeladas cortadas a un espesor de 10 μm.

2. Sustracción de órganos y preparación de tejidos

  1. Anestesia al ratón colocándolo en una cámara de incubación conectada a un vaporizador de isoflurano. Ajuste el vaporizador para que entregue 4-5% de isoflurano (96-95% de oxígeno, respectivamente).
    NOTA: La anestesia completa se confirma por la pérdida de la reacción postural y el reflejo de enderezamiento al hacer rodar suavemente la cámara hasta que el ratón se coloca sobre su espalda.
  2. Coloque el ratón en posición supina sobre la mesa quirúrgica. Coloque la nariz del ratón en una máscara de anestesia conectada a un circuito Bain modificado con su tubo interior conectado al vaporizador de isoflurano. Para mantener la anestesia, use isoflurano al 1-2% en oxígeno a una velocidad de flujo de 1 L / min. Elimine el exceso de vapor anestésico del ratón a través del tubo exterior de la máscara y extraiga a través de un recipiente de carbón activado, que absorbe el exceso de gas anestésico.
  3. Cuando se logre la anestesia completa, inyecte fentanilo para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal i.p.).
  4. Cuando el reflejo de pellizco del dedo del pie es indetectable, haga un corte claro desde la yugula hasta la sínfisis usando tijeras de iris para eliminar el pelaje y la piel. Haga otro corte de izquierda a derecha debajo de las costillas usando tijeras de iris para abrir cuidadosamente el abdomen.
  5. Vive un poco el xifoide usando pinzas curvas para permitir cortar el diafragma de izquierda a derecha sin lesionar ningún órgano. Corte la caja torácica en una línea axilar medial en ambos lados usando tijeras de iris para voltearla cranealmente y permitir el acceso al corazón.
  6. Cortar la vena cava inferior y la aorta torácica descendente a nivel del diafragma con tijeras de iris. Perfore el corazón con una aguja de 27 G en el área del ápice y luego empuje cuidadosamente la aguja hacia el ventrículo izquierdo (VI). Inyecte suavemente 5-10 ml de PBS helado en el VI para perfundir el corazón.
    NOTA: El color del corazón debe cambiar de rojo a gris, lo que indica una perfusión exitosa con PBS.
  7. Levante con cuidado el ápice del corazón con una pinza que permita cortar los vasos grandes y extraer el corazón.
  8. Extirpe el corazón cortando las arterias y venas grandes lo más lejos posible del corazón para evitar cualquier daño a la vena cava superior (SVC). Conserve el SVC, ya que servirá como hito importante durante el procesamiento posterior.
  9. Después de la extracción del corazón, apague el vaporizador de isoflurano.
  10. Coloque el corazón en un plato de disección lleno de PBS helado bajo el microscopio de disección. Después de determinar la izquierda / derecha y la parte frontal / posterior del corazón, gire el corazón con la parte frontal del corazón en la parte inferior del plato (para exponer los vasos grandes que se encuentran en la parte posterior).
  11. Inmovilizar el corazón colocando pequeños alfileres a través del ápice y el apéndice auricular izquierdo (LAA) en la agarosa en la parte inferior de la placa de disección (Figura 2A). Usando pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido no cardíaco alrededor de la VCS y la vena cava inferior (VCI) (p. ej., pulmones, grasa, pericardio) para exponer la región intercava (Figura 3A).
  12. Retire la mayoría de los ventrículos cortando paralelo el surco entre los ventrículos y las aurículas con la microtijera. Preservar una pequeña parte del tejido ventricular para la carga posterior en el anillo de plexiglás.
  13. Para la fijación y deshidratación, poner la muestra (que contiene las aurículas, SVC y IVC) en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
  14. Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 15% durante 24 horas a 4 °C.
  15. Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 30% durante 24 horas a 4 °C.
    NOTA: Para la fijación y deshidratación en los pasos 2.13, 2.14 y 2.15, las muestras se dejan a 4°C sin agitación ni balanceo.

3. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo

  1. Lavar el corazón en Triton X-100 al 1% diluido en PBS y bloquear y permeabilizar en solución de bloqueo (Tabla 1) durante la noche a 4 °C.
  2. Colocar el corazón en un tubo de 1,5 ml e incubar con conexina-43 de conejo anti-ratón (dilución de 1:200) y anticuerpos anti-ratón HCN4 de rata (dilución de 1:200) diluidos con solución bloqueante durante 7 días a 4 °C.
    NOTA: La concentración óptima de anticuerpos primarios debe probarse antes de utilizar las hojas de datos como orientación. Otros antígenos de interés también podrían teñirse en este paso, siempre y cuando la especie huésped del antígeno primario sea diferente de las demás. Una mayor concentración de Triton X-100 puede ayudar a obtener una tinción de anticuerpos más eficiente como se demostró antes de10, pero la concentración puede determinarse individualmente.
  3. Después de 7 días, retire la solución que contiene anticuerpos primarios con una pipeta y lave el corazón con una solución Triton X-100 al 1% 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).
  4. Después del lavado, incubar el corazón = con Alexa Fluor 488 cabra anti-rata IgG (dilución de 1:200) y Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (dilución de 1:200) durante 7 días a 4 °C.
  5. Después de 7 días, retire toda la solución que contiene los anticuerpos secundarios con una pipeta. Luego lave el corazón con solución de lavado (Tabla 1) 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).
  6. Para teñir los núcleos, incubar el corazón en solución DAPI (10 μg/ml) durante la noche a 4 °C.
  7. Al día siguiente, lave el corazón con solución de lavado 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).
    NOTA: Para el bloqueo, permeabilización, incubación de anticuerpos y tinción DAPI en los pasos 3.1, 3.2, 3.4 y 3.6, dejar las muestras en estado estacionario a 4 °C, no es necesario agitar. El tejido teñido podría conservarse completamente cubierto con solución de lavado a 4 °C y protegido de la luz durante unos días hasta obtener imágenes en el microscopio confocal.

4. Microscopía confocal

  1. Prepare los anillos de plexiglás y llénelos con plastilina (Figura 1). En el centro de la plastilina se forma un pequeño surco en el centro para cargar el corazón. Haga una ranura poco profunda, ya que sería más fácil adquirir un plano de imagen plana, y ajustar el espacio y evitar burbujas de aire entre la muestra y los cubreobjetos en el paso 4.4.
  2. Utilice la misma muestra de corazón para obtener imágenes de SAN y AVN secuencialmente. Para las imágenes SAN, cargue directamente el corazón, mientras que para las imágenes AVN, realice la microdisección antes.
    1. Imágenes del SAN
      1. Identificar la RAS por puntos de referencia anatómicos: se encuentra en el lado dorsal del corazón dentro de la región intercava (la región entre la vena cava superior e inferior). La crista terminalis (CT) es la raya muscular entre la RAS y la RAA.
      2. Coloque el corazón en la ranura de plastilina con la parte posterior del corazón hacia arriba. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).
      3. Bajo el microscopio de disección, presione suavemente el RAA, la LAA y las partes restantes del ventrículo izquierdo en la plastilina para fijar el corazón. Asegúrese de que toda la región intercaval y la crista terminalis puedan verse claramente (no cubiertas por plastilina). El área que se visualizará se muestra en la Figura 3A.
    2. Imágenes AVN
      1. Después de terminar la obtención de imágenes de SAN, recoja la misma muestra y posteriormente utilícela para la imagen AVN. Para la microdisección AVN, coloque el corazón = en una placa de disección bajo el microscopio de disección.
      2. Orientar el corazón con el lado derecho hacia arriba (incluidas las partes restantes del ventrículo derecho). Coloque clavos a través de la parte restante de la pared libre del VI (que ahora está en la parte inferior) para inmovilizar el tejido (Figura 2B).
      3. Corte la pared libre de RV restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide y la vena cava superior. Luego voltee el RV y la AR para exponer el tabique interventricular e interauricular. (Figura 3B)
        NOTA: Preste atención a no dañar el seno coronario (CS), ya que es un hito anatómico importante para encontrar el triángulo de Koch que luego permite localizar el AVN. El SC corre transversalmente en el surco auriculoventricular izquierdo en el lado posterior del corazón, y la abertura del orificio CS se encuentra entre la VCI y la válvula tricúspide en la parte inferior del tabique interauricular (Figura 3A y B).
      4. Identificar el triángulo de Koch que se puede encontrar en la superficie endocárdica de la aurícula derecha, bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide (TV), y posteriormente por el tendón de Todaro. La base está formada por el orificio del seno coronario (Figura 3B). Dado que esta es la región objetivo para las imágenes AVN, debe ser claramente visible.
      5. Transfiera el corazón a la ranura de plastilina dentro del anillo de plexiglás con el triángulo de Koch claramente expuesto (es decir, no cubierto por plastilina). Presione suavemente el tejido alrededor del triángulo de Koch en la plastilina para fijar la muestra. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).
  3. Aplique silicona en los bordes de los anillos de plexiglás para permitir cubrir los corazones cargados dentro de los anillos de plexiglás llenos de plastilina con cubreobjetos.
  4. Presione suavemente la parte posterior de la plastilina para exprimir partes del PBS y para unir el corazón al cubreobjetos, evitando cualquier burbuja de aire dentro del área de imágenes.
    NOTA: Asegúrese de que las regiones de interés no estén dobladas y cubiertas durante el prensado de la parte posterior de la plastilina. Un plano plano de imagen sin sobrecompresión de la muestra es necesario para conservar la anatomía y para obtener imágenes confocales adecuadas de las muestras. Para la RAS, es importante asegurarse de que la región intercava esté claramente expuesta. Para AVN, el triángulo de Koch debe estar completamente expuesto.
  5. Coloque las muestras de tinción de montaje completo boca abajo en la plataforma del microscopio confocal. El SAN/AVN expuesto unido al cubreobjetos está ahora en la parte inferior de la plataforma del microscopio (Figura 4).
    NOTA: Para tomar imágenes, utilizamos el Carl Zeiss LSM800 con Airyscan Unit y el software ZEN 2.3 SP1 negro.
  6. Elija la placa "BP420-480 + LP605" para la excitación de Alexa Fluor 647 conjugado anti-HCN4. Varíe la ganancia maestra de 650-750.
  7. Tome una imagen general de toda la región SAN y AVN mediante la función Tile Scan . A continuación, seleccione la región positiva para HCN4 haciendo clic y agregando un cuadrado en la imagen general alrededor del área de interés que se escaneará.
  8. Compruebe los parámetros, incluidas las placas y la ganancia maestra para los canales restantes (Alexa Fluor 488 y DAPI) del microscopio confocal y configúrelos como se describe en el paso 4.6.
  9. Ajuste lentamente el enfoque de arriba a abajo de la muestra para obtener una vista previa de toda la muestra y establecer el primero y el último para el rango de pila Z. Establezca un intervalo óptimo para la pila Z en función del grosor de la muestra óptica. Usamos un objetivo de 20x y 0.8-1 μm como intervalo para la pila Z.
  10. Después de que todos los parámetros estén configurados correctamente, analice toda el área de la SAN y AVN.
  11. Realice la reconstrucción 3D de las imágenes utilizando software (por ejemplo, Imaris versión 8.4.2).
    1. Seleccionar procesamiento de imágenes | Resta basal para eliminar las manchas de fondo.
    2. Seleccione la creación de superficie en la configuración para el canal seleccionado y la región de interés para el procesamiento.

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Representative Results

Mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, se pueden realizar imágenes de microscopía confocal de SAN y AVN de manera confiable. La tinción específica del sistema de conducción utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a HCN4 y la tinción del miocardio de trabajo utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a Cx43 permite la identificación clara de SAN (Figura 5, Video 1) y AVN (Figura 6, Video 2) dentro de la anatomía intacta.

Figure 1
Figura 1: Instrumentos para disección y soporte de anillo de plexiglás. A. Anillo de plexiglás lleno de plastilina (la flecha roja muestra la ranura formada en el centro para cargar el corazón). B. Placa de Petri de disección con gel de agarosa. C. Tijeras de resorte. D. Tijeras de iris. E. Pinzas curvas. F. Pinzas finas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración de la anatomía cardíaca macroscópica. A. Ilustración esquemática de la microdisección SAN. Los clavos se aplican a través del ápice y el apéndice auricular izquierdo (LAA). SAN se indica mediante un círculo discontinuo rojo. B. Ilustración esquemática de la microdisección AVN. Los pasadores se colocan a través de la parte restante de la pared libre de LV (que ahora está en la parte inferior). AVN se indica mediante un círculo discontinuo rojo. SVC: vena cava superior; VCI: vena cava inferior; CS: seno coronario; LAA: apéndice auricular izquierdo; RAA: apéndice auricular derecho; PA: arteria pulmonar; PV: vena pulmonar; VI: ventrículo izquierdo; IVS: tabique interventricular; IAS: tabique interauricular; OF: fosa ovalada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ubicación de SAN y AVN en un corazón de ratón adulto. R. Ubicación del nódulo sinoauricular (SAN) en el corazón de un ratón adulto. Vista desde la parte posterior del corazón. La ubicación de la RAS está indicada por una línea discontinua roja dentro de la región intercaval (líneas discontinuas negras). SVC: vena cava superior; VCI: vena cava inferior; CS: seno coronario; LAA: apéndice auricular izquierdo; RAA: apéndice auricular derecho; PV: vena pulmonar; TC: Crista terminalis; VI: ventrículo izquierdo; VD: ventrículo derecho. B. Ubicación del nódulo auriculoventricular (AVN) en el corazón de un ratón adulto. Vista desde la derecha. El AVN (círculo discontinuo rojo) se encuentra en el vértice del triángulo de Koch (triángulo discontinuo blanco) cerca de la parte inferior del tabique membranoso. El triángulo de Koch está formado por el tendón de Todaro (TT, línea discontinua verde), la válvula tricúspide (TV, línea discontinua azul) y el orificio del seno coronario (CS, línea discontinua amarilla). SVC: vena cava superior; VCI: vena cava inferior; IVS: tabique interventricular; OF: fosa ovalada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Muestra preparada cargada en la microscopía confocal. A. La muestra preparada (flecha roja) para microscopía confocal montada en el anillo de plexiglás con plastilina (flecha negra). Vista desde abajo. B. Anillo de plexiglás con muestra montada cargada boca abajo en la plataforma del microscopio confocal (microscopio inverso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Reconstrucción de imágenes de microscopía confocal de SAN en un ratón C57BL6/J teñido con anticuerpos anti-HCN4 (rojo) y Cx43 (blanco). Un. El área discontinua delinea el SAN, que está orientado a lo largo de la región intercava entre la vena cava superior e inferior. B. Ampliación de la incrustación del panel A. C. Reconstrucción 3D del panel B. RAA: apéndice auricular derecho; AR: aurícula derecha; SAN: nódulo sinoauricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Reconstrucción de imágenes de microscopía confocal de AVN en un ratón C57BL6/J teñido con anticuerpos anti-HCN4 (rojo) y Cx43 (blanco). Un. El área discontinua indica el AVN. B. Ampliación de la incrustación del panel A. C. Reconstrucción 3D del panel B. IVS: tabique interventricular; IAS: tabique interauricular; AVN: nódulo auriculoventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Imagen de control negativo. Un. control negativo de tinción de montaje completo para SAN. El círculo discontinuo mostraba la región RAS confirmada por los hitos de anatomía. B. tinción de control negativo para SAN solamente con segundos anticuerpos. C. Tinción DAPI para SAN. D . tinción de montaje completo con control negativo para AVN. El círculo discontinuo mostraba la región AVN confirmada por los puntos de referencia de anatomía. E . tinción de control negativo para AVN solo con segundos anticuerpos. F. Tinción DAPI para AVN. RAA: apéndice auricular derecho; AR: aurícula derecha; SVC: vena cava superior; IVS: tabique interventricular; IAS: tabique interauricular; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Reconstrucción 3D de la RAS Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Reconstrucción 3D del AVN Haga clic aquí para descargar este video.

Compuesto Concentración final g o mL/100 ml requeridos
Solución de fijación
Formaldehído (16%) 4% 25 ml
PBS (1x) 75 ml
Solución Triton al 1%
Tritón X100 1% 1 ml
PBS 99 ml
Solución de bloqueo
Tritón X-100 1% 1 ml
BSA 0.50% 0,5 g
Suero de cabra normal 20% 20 ml
PBS (1x) 89 ml
Solución de lavado
Preadolescente 20 0.10% 0.1 mL
BSA 0.50% 0,5 g
PBS (1x) 99.9 ml
TAE (50x)
Tris-base 24.20% 24,2 g
100% ácido acético 5.71% 5,71 ml
EDTA de 0,5 m 0,05 m 10 ml
dH2O Añadir hasta 100 ml

Tabla 1.

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Discussion

La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.

En comparación con los métodos estándar, como la inmunohistoquímica convencional, que requieren incrustación de parafina, seccionamiento y recuperación de antígenos, la metodología de montaje completo es ventajosa para abordar la localización y morfología 3D exactas de SAN y AVN, y para examinar la relación con el tejido circundante ya que la morfología del tejido se conserva considerablemente con solo una deshidratación tisular y ruptura física mínimas. Además, la inmunorreactividad (es decir, la unión de anticuerpos a antígenos tisulares) también se mantiene en gran medida.

Establecimos un método práctico de procesión de muestras para microscopía confocal mediante el uso de un soporte de plástico montado en anillo lleno de plastilina12,13. La plastilina es ideal ya que se puede ajustar individualmente al tamaño del tejido, es lo suficientemente dura como para sostener el tejido de manera confiable sin una presión excesiva del tejido. Lo más importante es que no es fluorescente, evitando el fondo autofluorescente y, por lo tanto, no interfiriendo con la señal fluorescente de los anticuerpos utilizados.

Utilizamos el microscopio de barrido láser confocal (LSM-Zeiss) con el detector Airyscan, que puede ofrecer una clara ventaja en la obtención de imágenes con alta calidad. El uso de un microscopio de imagen de campo amplio solo puede ofrecer información a nivel de tejido, pero carece de resolución celular. Además, el microscopio de campo amplio conlleva un riesgo de fondo alto14. Mediante el uso de un detector Airyscan para LSM confocal, se puede adquirir una resolución mejorada y una relación señal-ruido (SNR), en comparación con el sistema tradicional de imágenes confocales de un agujero de alfiler y detector15.

Las formas y la posición de SAN y AVN se presentan como reconstrucción 3D y los planos de sección virtuales adicionales derivados de la reconstrucción 3D pueden mejorar la interpretación de las secciones histológicas, mientras que la histología convencional permite solo una evaluación 2D de la anatomía con el riesgo inherente de no detección de estructuras pequeñas pero relevantes. Además, la reconstrucción 3D brinda la oportunidad de examinar estructuras anatómicas de interés transmuralmente y dentro del microambiente intacto, por ejemplo, el plexo nervioso autónomo intrínseco que inerva el corazón16. La tinción in situ de montaje completo y la reconstrucción 3D permiten la investigación del entorno celular, así como los tipos específicos de células y su orientación. Además, la expresión de proteínas específicas regionales y de tipo celular puede visualizarse y puede apoyar aún más los análisis de Western blot y proteómica17.

SAN y AVN son estructuras especializadas dentro del corazón con un patrón de expresión diferente de canales iónicos y conexinas que pueden ser utilizados para una identificación confiable10,18. Los canales catiónicos activados por nucleótidos cíclicos (HCN) activados por hiperpolarización establecen la despolarización diastólica en las células marcapasos y, por lo tanto, se expresan específicamente dentro del sistema de conducción, siendo HCN4 la isoforma predominante en el ratón19. Los estudios han demostrado que HCN4 es una de las isoformas de HCN detectables y expresadas de manera estable en toda la RAS y AVN11,20. Las conexinas conectan directamente las células vecinas y permiten el paso de iones de célula a célula; Por lo tanto, son esenciales para la conducción del impulso eléctrico a través del corazón21. Los patrones de expresión de conexina varían entre las diferentes regiones del corazón, siendo Cx43 la isoforma más abundante que se ha encontrado en casi todas las partes del corazón, excepto en la SAN y AVN22. La combinación de microdisección para permitir la exposición de regiones específicas de interés con anticuerpos anti-HCN4 y anti-CX43, así como enfoques in silico para la reconstrucción tridimensional de imágenes confocales, permite una identificación confiable de SAN y AVN y una investigación exhaustiva de la morfología de SAN/AVN, así como su interacción con el tejido circundante.

La SAN y AVN pueden ser fáciles de distinguir después de la tinción con un anticuerpo específico. Sin embargo, para localizar la RAS y la AVN por sus puntos de referencia anatómicos, se necesita algo de práctica antes de que se pueda realizar la microdisección correcta.

Usando el protocolo anterior, también se pueden aplicar otros antígenos. El protocolo también funciona bien tanto en tejido fijado por perfusión como en tejido fijado por inmersión. Sin embargo, el tiempo de incubación puede ajustarse para una fijación óptima, ya que ciertos anticuerpos muestran una inmunorreactividad reducida cuando el antígeno está sobrefijado. Como el enfoque de tinción de montaje completo necesita 7 días para la incubación de anticuerpos primarios y secundarios, es importante sumergir completamente las muestras en volúmenes adecuados de soluciones que contengan anticuerpos. La relación de dilución de cada anticuerpo debe probarse antes del experimento. Para una tinción óptima, se debe eliminar cualquier tejido irrelevante. Para el protocolo, solo preservamos pequeñas partes de los ventrículos para una mejor orientación y eliminamos todo el tejido graso circundante y las venas pulmonares, ya que el tejido circundante (irrelevante) también podría unirse a los anticuerpos, especialmente cuando los antígenos objetivo se expresan globalmente.

La tinción in situ de montaje completo, las imágenes confocales y la reconstrucción 3D son una técnica invaluable y poderosa para investigadores de diversos campos. Sin embargo, el método también tiene algunas limitaciones. (i) Requiere equipo especializado, como un microscopio confocal, que no está comúnmente disponible en todas las instituciones. (ii) Como se mencionó anteriormente, la microdisección de estructuras anatómicas especializadas como la RAS o AVN, pero también las imágenes confocales y el procesamiento posterior a la imagen, requieren una práctica intensiva y personal experimentado. (iii) El éxito del método depende en gran medida de la calidad de los anticuerpos utilizados y, por lo tanto, puede ser muy difícil en algunos casos. También (iv) la reconstrucción 3D puede ser difícil de lograr y puede requerir una solución de problemas intensiva para optimizar el procedimiento. Por ejemplo, los intervalos óptimos deben establecerse durante la adquisición de imágenes, ya que las secciones demasiado separadas dejarán huecos y podrían no permitir una reconstrucción 3D adecuada de la anatomía. Las secciones que están demasiado cerca pueden causar sobremuestreo y blanqueo debido a la iluminación excesiva y tardarán mucho tiempo en completar una imagen. Finalmente, (v) la principal limitación de la microscopía confocal es la profundidad de imagen, lo que significa que si el grosor de la muestra está más allá de la profundidad máxima de operación del microscopio confocal, no se puede detectar el fluoróforo adicional.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system  Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent Scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Magnetic stirrer IKA  RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL Eppendorf Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope  VWR 10836-004
Laser Scanning Confocal microscope Zeiss LSM 800
Software
Imaris 8.4.2 Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter Sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube Falcon 352070
5ml Syringe Braun 4606108V
Cover slips Thermo Scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158 Components of TEA
16% Formaldehyde Solution Thermo Scientific  28908 use as a 4% solution 
Acetic acid Merck 100063 Components of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Normal goat serum Sigma NS02L
Sucrose Sigma S1888-1kg
Tris-base Roche TRIS-RO Components of TEA
Triton X-100 Sigma T8787-250ml Diluted to 1% in PBS
Tween 20 Sigma P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL Cp-pharma 31303
Oxygen 5 L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling Technology #4412 diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen #A-21247 diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43 Sigma C6219 diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) Invitrogen MA3-903 diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring Self-designed and 3D printed
Plasticine Cernit 49655005
Silikonpasten, Baysilone VWR 291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6 The Jackson Laboratory

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References

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Tags

Medicina Número 166 Ganglio sinoauricular Ganglio auriculoventricular Cardiología electrofisiología sistema de conducción cardíaca Microdisección Inmunofluorescencia Microscopía confocal

Erratum

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón
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Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J.,… More

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J., Kääb, S., Ishikawa-Ankerhold, H., van den Heuvel, D. A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. J. Vis. Exp. (166), e62058, doi:10.3791/62058 (2020).

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