Summary
Här beskriver vi beredningen av humana organoid-härledda intestinala epitelmonolager för att studera tarmbarriärfunktion, permeabilitet och transport. Eftersom organoider representerar original epitelvävnadssvar på yttre stimuli kombinerar dessa modeller fördelarna med cellinjernas expanderbarhet och primärvävnadens relevans och komplexitet.
Abstract
Tidigare var tarmepitelmodellsystem begränsade till transformerade cellinjer och primär vävnad. Dessa modellsystem har inneboende begränsningar eftersom de förra inte troget representerar original vävnadsfysiologi, och tillgängligheten av den senare är begränsad. Därför hindrar deras tillämpning grundläggande och läkemedelsutvecklingsforskning. Vuxna stamcellsbaserade organoider (hädanefter kallade organoider) är miniatyrer av normal eller sjuk epitelvävnad från vilken de härleds. De kan etableras mycket effektivt från olika mag-tarmkanalen (GI) regioner, har långsiktig expanderbarhet och simulerar vävnads- och patientspecifika svar på behandlingar in vitro. Här har etableringen av intestinala organoid-härledda epitelmonolager demonstrerats tillsammans med metoder för att mäta epitelbarriärintegritet, permeabilitet och transport, antimikrobiell proteinsekretion samt histologi. Dessutom kan intestinala organoid-härledda monolager berikas med prolifererande stam- och transitförstärklande celler samt med viktiga differentierade epitelceller. Därför representerar de ett modellsystem som kan skräddarsys för att studera effekterna av föreningar på målceller och deras verkningssätt. Även om organoidkulturer är tekniskt mer krävande än cellinjer, när de väl är etablerade, kan de minska misslyckanden i de senare stadierna av läkemedelsutveckling eftersom de verkligen representerar in vivo epitelkomplexitet och interpatient heterogenitet.
Introduction
Tarmepitelet fungerar som en fysisk barriär mellan tarmarnas luminala innehåll och den underliggande vävnaden. Denna barriär består av ett enda epitelskikt av huvudsakligen absorberande enterocyter som är förbundna med snäva korsningar, vilka etablerar starka intercellulära förbindelser mellan intilliggande celler. Dessa celler bildar ett polariserat epitelfoder som separerar de apikala (lumen) och basolaterala sidorna av tarmen, samtidigt som de reglerar paracellulär transport av smälta näringsämnen och metaboliter. Förutom enterocyter bidrar andra viktiga epitelceller som bägare, Paneth och enteroendokrina celler också till intestinal homeostas genom att producera slem, antimikrobiella peptider respektive hormoner. Tarmepitelet fylls ständigt på genom att dela leucinrika upprepningsinnehållande G-proteinkopplade receptor 5-positiva (LGR5+) stamceller i botten av tarmkrypter som producerar transitförstärkande (TA) celler som migrerar uppåt och differentierar sig till andra celltyper1. Störning av intestinal epitelial homeostas av genetiska och miljömässiga faktorer, såsom exponering för matallergener, medicinska föreningar och mikrobiella patogener, leder till störningar i tarmbarriärfunktionen. Dessa tillstånd orsakar flera tarmsjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), celiaki och läkemedelsinducerad GI-toxicitet2.
Studier på tarmepitelet utförs med hjälp av flera in vitro-plattformssystem såsom membraninsatser, organ-on-a-chip-system, Ussing-kamrar och tarmringar. Dessa plattformar är lämpliga för att etablera polariserade epitelmonolager med tillgång till både apikala och basolaterala sidor av membranet, med användning av transformerade cellinjer eller primär vävnad som modeller. Även om transformerade cellinjer, såsom kolorektala (adeno)karcinomcellinjer Caco-2, T84 och HT-29, i viss utsträckning kan differentieras till polariserade intestinala enterocyter eller slemproducerande celler, är de inte representativa för in vivo-epitelet eftersom flera celltyper saknas, och olika receptorer och transportörer uttrycks avvikande3 . Dessutom, eftersom cellinjer härrör från en enda givare, representerar de inte heterogenitet mellan patienter och lider av minskad komplexitet och fysiologisk relevans. Även om primära vävnader som används i Ussing-kamrar och som tarmringar är mer representativa för in vivo-situationen, gör deras begränsade tillgänglighet, kortsiktiga livskraft och brist på expanderbarhet dem olämpliga som ett medium för studier med hög genomströmning (HT).
Organoider är in vitro epitelkulturer etablerade från olika organ som tarm, njure, lever, bukspottkörtel och lunga. De har visat sig ha långsiktig, stabil expanderbarhet samt genetisk och fenotypisk stabilitet och är därför representativa biologiska miniatyrer av det ursprungliga organets epitel med trogna svar på yttre stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoider etableras effektivt från antingen resekterad eller biopsierad normal, sjuk, inflammerad eller cancerös vävnad, vilket representerar heterogena patientspecifika svar 10,11,12,13,14,15,16. Detta dokument visar hur man etablerar intestinala epiteliala monolager härledda från organoidkulturer. Monolager har framgångsrikt etablerats från tunntarm samt kolon- och rektala organoidkulturer. Denna modell skapar en möjlighet att studera epitelcellernas transport och permeabilitet till läkemedel samt deras toxikologiska effekter på epitelet. Dessutom tillåter modellen samodling med immunceller och bakterier för att studera deras interaktioner med tarmepitelet 17,18,19. Dessutom kan denna modell användas för att studera svar på terapier på ett patientspecifikt sätt och initiera screeninginsatser för att leta efter nästa våg av epitelbarriärfokuserade terapier. Ett sådant tillvägagångssätt kan utvidgas till kliniken och bana väg för personliga behandlingar.
Även om epitelmonoskikten i detta protokoll framställs från humana normala tarmorganoider, kan protokollet appliceras och optimeras för andra organoidmodeller. Epitelorganoidmonolager odlas i intestinalt organoidexpansionsmedium innehållande Wnt för att stödja stamcellsproliferation och representera tarmkryptcellulär sammansättning. Tarmorganoider kan berikas för att ha olika intestinala epitelöden, såsom enterocyter, Paneth, bägare och enteroendokrina celler, genom att modulera Wnt, Notch och epidermal tillväxtfaktor (EGF) vägar. Här, efter etableringen av monolager i expansionsmedium, drivs de mot mer differentierade tarmepitelceller, som tidigare beskrivits 20,21,22,23,24,25. För screeningändamål, beroende på verkningssättet för föreningen av intresse, dess målceller och de experimentella förhållandena, kan monolaverna drivas mot den valda cellulära kompositionen för att mäta effekterna av föreningen med relevanta funktionella avläsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser för odling
OBS: Utför alla steg inuti ett biosäkerhetsskåp och följ standardriktlinjerna för att arbeta med cellkulturer. Ultraviolett ljus används i 10 minuter innan biosäkerhetsskåpet startas. Före och efter användning rengörs ytan på biosäkerhetsskåpet med ett silkespapper dränkt i 70% etanol. För att underlätta bildandet av tredimensionella droppar extracellulär matris (ECM), håll ett förvärmt lager av 96-, 24- och 6-brunnsplattor redo i inkubatorn vid 37 ° C.
- Basal mediumberedning
- Förbered basalmedium (BM) i en 500 ml Advanced Dulbeccos modifierade örnmedium med Skinkas näringsblandning F-12 (Ad-DF) mediumflaska genom att tillsätta 5 ml 200 mM glutamin, 5 ml 1 M 4-(2-hydroxiethil)-1piperazinetansulfonsyra (HEPES) och 5 ml penicillin/streptomycin (penna/strep) lösningar (10 000 U/ml eller 10 000 μg/ml). Detta kan förvaras i kylskåp vid 4 ° C i minst 4 veckor.
- Wnt-källor
- Förbered Wnt3a-konditionerat medium (Wnt3aCM) enligt den tidigare beskrivna metoden26.
OBS: Nyligen har nästa generations surrogat Wnt (NGS-Wnt), som också stöder expansion av mänskliga tarmorganoider, genererats27.
- Förbered Wnt3a-konditionerat medium (Wnt3aCM) enligt den tidigare beskrivna metoden26.
- Intestinal organoid bas medium beredning
OBS: Använd alla tillväxtfaktorer och reagenser enligt tillverkarens rekommendationer. Använd små alikvoter och undvik frys-tina cykler; funktionella tillväxtfaktorer är avgörande för framgångsrik organoidkultur.- Förbered koncentrerat 2x intestinalt organoidbasmedium (2x IBM) genom att komplettera BM med 1 μM A83-01, 2,5 mM N-acetylcystein, 2x B27-tillskott, 100 ng / ml human epidermal tillväxtfaktor (hEGF), 10 nM gastrin, 200 ng / ml hNoggin och 100 μg / ml av en antimikrobiell formulering för primära celler (se materialförteckningen).
- Aliquot 2x IBM och frys vid -20 ° C i upp till 4 månader. Tina vid behov en alikvot över natten vid 4 °C eller i flera timmar vid rumstemperatur (RT).
- För att förbereda intestinal organoid expansion medium (IEM), komplettera 2x IBM med antingen 50% Wnt3aCM eller 50% BM och 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml human Rspondin-3 (hRspo3), 10 mM nikotinamid och 10 μM SB202190.
- Intestinal organoid differentiering medium beredning
- Förbered enterocytdifferentieringsmedium (eDM) genom att komplettera 2x IBM med 50% BM, 250 ng / ml hRspo3 och 1,5 μM Wnt-vägshämmare (IWP-2). Förvara eDM vid 4 °C i upp till 10 dagar.
- Förbered kombinationsdifferentieringsmedium (cDM) genom att komplettera 2x IBM med antingen 40% BM och 10% Wnt3aCM eller 50% BM och 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng / ml hRspo3, 10 μM DAPT och 100 nM PD0325901. Förvara cDM vid 4 °C i upp till 10 dagar.
- Manipulering av extracellulär matris (ECM)
OBS: Förbered den extracellulära matrisen (ECM) (se materialförteckningen) enligt tillverkarens rekommendation.- Tina ECM över natten på is; Överför ECM från flaskan till ett koniskt rör på 15 ml med en 5 ml pipett, båda förkylda vid -20 °C. Frys alikvoter endast en gång vid -20 °C. När den har tinats, förvara ECM i kylskåp vid 4 ° C i upp till 7 dagar. Inkubera i minst 30 min på is före användning.
OBS: Blanda ECM ordentligt och se till att det är kallt innan du bäddar in krypter eller organoider.
- Tina ECM över natten på is; Överför ECM från flaskan till ett koniskt rör på 15 ml med en 5 ml pipett, båda förkylda vid -20 °C. Frys alikvoter endast en gång vid -20 °C. När den har tinats, förvara ECM i kylskåp vid 4 ° C i upp till 7 dagar. Inkubera i minst 30 min på is före användning.
2. Organoidkulturer
- Etablera kulturer från frysta organoider
OBS: Låt BM nå RT och håll en 12 ml alikvot, uppvärmd till 37 ° C, redo innan du börjar proceduren för att tina en kryovial som innehåller frysta organoider.- Tina organoidkryovialen snabbt genom att agitera i ett 37 ° C vattenbad tills endast en isbit återstår. Tillsätt omedelbart 500 μL varm BM droppvis till kryovialen och pipettera upp och ner några gånger för att späda frysmediet och blanda innehållet försiktigt.
- Använd en P1000-pipett, överför organoiderna till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt ytterligare 1 ml varm BM droppvis medan du försiktigt blandar botten av röret. Pipett upp och ner några gånger för att späda ut frysmediet och blanda innehållet försiktigt.
- Tillsätt upp till 12 ml varm BM droppvis till det 15 ml koniska röret som innehåller organoiderna och pipettera upp och ner med en 10 ml steril pipett för att försiktigt återanvända organoiderna.
- Centrifugera organoidsuspensionen i 5 min vid 85 × g och 8 °C. Kassera supernatanten försiktigt utan att störa pelletsen och återsuspendera organoiderna i 30 % v/v av IEM kompletterat med 10 μM Y27632 eller annan rho-associerad lindad spolbildande proteinserin/treoninkinashämmare (ROCK-hämmare). Placera röret på is.
- Tillsätt 70 % v/v ECM i det koniska röret på 15 ml som innehåller organoiderna. Blanda organoidsuspensionen som håller det 15 ml koniska röret på is och frö 5 μL av suspensionen för att kontrollera densiteten (Figur 1A). Fortsätt pläteringen om densiteten är lämplig. Om densiteten är för hög lägger du till fler IEM/ECM-lösningar i samma förhållande på 30–70 % v/v.
- I varje brunn av en förvärmd 24-brunnsplatta, frö 50 μL av organoidsuspensionen genom pipettering av 5 separata droppar av 10 μL (Figur 1B). Vänd plattan upp och ner och låt den stå i biosäkerhetsskåpet i 5 min. Överför plattan fortfarande upp och ner till 37 ° C inkubatorn och låt den stå i ytterligare 30 minuter.
- Tillsätt 500 μL IEM med 10 μM ROCK-hämmare till varje brunn och överför plattan till inkubatorn. Avbilda en droppe regelbundet för att övervaka tillväxten och uppdatera Underhåll av Internet Explorer var 2–3:e dag genom att aspirera på det gamla mediet och lägga till 500 μL färskT Internet Explorer.
- Passera organoiderna när de har återhämtat sig ordentligt från upptining och har nått rätt storlek för att bearbetas (figur 1C), enligt beskrivningen i avsnitt 2.2.
- Passaging av intestinala organoider
OBS: Kyl ECM på is i minst 30 minuter och håll IEM på RT i minst 1 timme före användning.- Använd mediet från en kulturbrunn för att bryta upp organoidkupolerna med en 1250 μL filterspets med låg retention och överför brunnsinnehållet till ett märkt 15 ml koniskt rör. Tvätta brunnen med 1 ml BM och överför den till samma 15 ml koniska rör.
- Upprepa steg 2.2.1 och 2.2.2 med alla andra brunnar (högst en halv platta eller 600 μL ECM-droppar kan tvättas och tillsättas till ett 15 ml koniskt rör).
- Tillsätt BM för att fylla röret upp till 12 ml och pipettera upp och ner 10x med en 10 ml pipett. Centrifug vid 85 × g i 5 min vid 8 °C.
- Innan du tar bort BM, kontrollera under mikroskopet för att se om alla organoider är pelleterade längst ner på det 15 ml koniska röret (figur 1D). Om det inte finns någon ECM-överlagring av organoidpelleten eller om ECM-skiktet antingen är rent eller bara innehåller skräp, enstaka celler eller mycket få organoider jämfört med de pelleterade organoiderna, aspirera supernatanten och pipettera ut ECM som överlagrar organoidpelleten mycket noggrant med en P200-pipett.
OBS: Organoider kan fastna i ECM och sedimenterar inte som en kompakt pellets på grund av låg centrifugeringskraft. Om ECM innehåller organoider, centrifugera röret igen vid 450 × g i 5 min vid 8 °C och avlägsna försiktigt supernatantet enligt beskrivningen i 2.2.4. Om det finns flera 15 ml koniska rör kan de slås samman efter steg 2.2.4. - Tillsätt 1 ml BM till varje pellets (med en volym på 50-200 μL, beroende på organoidkultur och densitet) och återsuspendera försiktigt. Pipet organoiderna upp och ner minst 5x för att skjuva dem, för att undvika skumbildning. Kontrollera under mikroskopet för att se om organoiderna störs (Figur 2A). Om organoiderna störs, fortsätt till steg 2.2.7; om organoiderna inte störs, pipettera dem ytterligare 5x. Den här gången, rör vid plaströrets vägg med pipettspetsen för att utöva mer mekanisk kraft för att störa organoiderna.
OBS: Mekanisk skjuvning av cystiska (figur 1C) och spirande (figur 1E) organoider är möjlig med antingen en 200 μL eller 10 μL plastpipettspets monterad på en lågretention 1250 μL filterspets (figur 1F), beroende på den volym som krävs för att störa organoiderna. Användning av en smalare glaspipett (figur 1F) rekommenderas när mer än 200 μL ECM innehållande organoiderna bearbetas (en brunn av en 6-brunnsplatta eller 4 brunnar av en 24-brunnsplatta). - Kontrollera under mikroskopet igen för att se om organoiderna störs. Om det störs, fortsätt med nästa steg; om inte, pipettera organoiderna upp till 20x, kontrollera organoiderna under mikroskopet regelbundet. Om organoiderna fortfarande inte störs, tillsätt 25% v / v celldissociationsreagens 1 (se materialförteckningen) till suspensionen, inkubera i vattenbadet vid 37 ° C i 2 minuter och pipettera organoiderna upp till 20x, kontrollera organoiderna under mikroskopet regelbundet för att se till att de inte smälts till enskilda celler.
- Tillsätt upp till 12 ml BM till det 15 ml koniska röret och tvätta organoidpelleten genom pipettering upp och ner. Centrifug vid 85 × g i 5 min vid 8 °C. Kassera supernatanten och justera den slutliga koncentrationen till 70 % v/v ECM genom att tillsätta IEM och ECM till organoidpelleten.
- Börja återanvända organoidpelleten med dubbelt så stor volym IEM/ECM som samlats in för att passera och utsäde 5 μL av suspensionen för att kontrollera densiteten. Fortsätt pläteringen om densiteten är lämplig (figur 2B). lägg till fler IEM/ECM-lösningar om densiteten är för hög. Tillsätt 200 μL av suspensionen till varje brunn på en förvärmd 6-brunnsplatta, vilket gör separata droppar med 10 μL volym.
- Vänd plattan upp och ner och låt den stå i biosäkerhetsskåpet i 5 min. Överför plattan fortfarande upp och ner till 37 ° C inkubatorn och låt den stå i ytterligare 30 minuter. Tillsätt 2 ml IEM med 10 μM ROCK-hämmare till varje brunn och överför plattan till inkubatorn.
- Avbilda en droppe regelbundet för att övervaka tillväxten och uppdatera Underhåll av Internet Explorer var 2–3:e dag genom att aspirera det gamla mediet och lägga till 2 ml färsk IEM.
- Passaging av tarmorganoider för epitelial monolagerberedning
- Passageorganoider 3 dagar före skörd för enskiktsberedning genom att följa samma passeringsprotokoll som beskrivs i avsnitt 2.2, med ett undantag. I steg 2.2.7 återanvänder du organoiderna i 1–1,5x startvolymen för IEM/ECM för att få en högre densitet och expansionspotential när de skördas för beredning i enskikt (figur 3A).
3. Epitelial monolagerberedning
- Kulturepiteliala monolager på både 24-brunns och 96-brunns membraninsatser med en mängd olika tillgängliga platttyper (tabell 1). Använd HTS-membraninsatser (High ThroughPut System) för båda storlekarna eftersom dessa innehåller en integrerad bricka med membraninsatserna och en mottagarplatta. För 24-brunnsformatet är det också möjligt att använda plattor med separata avtagbara membraninsatser.
OBS: Olika membrantyper (polyetentereftalat (PET) eller polykarbonat) och porstorlekar (0,4-8,0 μm) finns tillgängliga och kan användas beroende på experimentella behov. Monolager kan endast avbildas av ljusfält när insatser med PET-membran används. Ljustäta membran blockerar fluorescerande ljusläckage från apikalen till basolateralfacket och kan beaktas när dynamisk transport eller permeabilitet hos fluorescerande märkta substrat studeras. Det nuvarande protokollet använder 24-brunnsmembraninsatser; Anpassningar för membraninsatser med 96 brunnar beskrivs i avsnitt 5. Beroende på densitet, morfologi och storlek på organoiderna (figur 3A) är 6 brunnar av en 6-brunnsplatta (som sådd i avsnitt 2.3) tillräckliga för sådd av en full 24-brunnsplatta med membraninsatser. - Beläggning av membraninsatser med ECM
OBS: Om det finns tvivel om att ha tillräckligt med celler, belägg insatserna efter att ha räknat cellerna. Detta för att förhindra onödig beläggning och förlust av de dyra membraninsatserna.- Placera membraninsatserna i stödplattan i biosäkerhetsskåpet. Späd ECM 40x i iskall Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med Ca2+ och Mg2+ och pipettera 150 μL av den utspädda ECM i det apikala facket för varje insats. Inkubera plattan vid 37 °C i minst 1 timme.
- Framställning av celler för sådd
- Förvärmningsalcitat av celldissociationsreagenset 2 i vattenbadet (37 °C). Förbered 2 ml av reagenset för varje brunn på en 6-brunnsplatta.
- Överför odlingsplattan som innehåller organoiderna (beredda i avsnitt 2.3) från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet. Bearbeta organoiderna enligt beskrivningen i steg 2.2.1–2.2.4. Samla inte flera rör i ett rör.
- Fyll röret, som innehåller organoider från högst 3 brunnar på en 6-brunnsplatta, upp till 12 ml med DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) och pipettera upp och ner 10x med en 10 ml pipett. Centrifug vid 85 × g i 5 min vid 8 °C och aspirera supernatanten utan att störa organoidpelleten.
- Tillsätt 2 ml av det förvärmde celldissociationsreagenset 2 per brunn av en 6-brunnsplatta som används som utgångsmaterial och återsuspend. Inkubera rören diagonalt eller horisontellt i 5 minuter i vattenbadet vid 37 °C för att förhindra att organoiderna sjunker till botten av röret.
- Pipettera upp och ner 10x med en 5 ml steril plastpipett eller en P1000-pipett, beroende på den totala volymen av celldissociationsreagenset. Kontrollera organoidsuspensionen under mikroskopet för att se om en blandning av enskilda celler och några cellklumpar bestående av 2-4 celler har bildats (Figur 3B). Fortsätt vid behov matsmältningen genom att upprepa steg 3.3.4–3.3.5 (öka inte volymen av celldissociationsreagens) tills blandningen liknar figur 3B.
OBS: Undvik att smälta organoiderna helt till enskilda celler. Det är nödvändigt att ha några små grupper av celler (dvs grupper av 2-4 celler). - Stoppa celldissociation genom att tillsätta upp till 12 ml BM inklusive 10 μM ROCK-hämmare till cellsuspensionen. Centrifug vid 450 × g i 5 min vid 8 °C och aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Vid hantering av samma organoidkultur i flera 15 ml koniska rör, slå samman cellpelletsna och återsuspendera dem i 12 ml BM.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 40 μm sil förgift med BM och skörda genomströmningen i ett 50 ml koniskt rör. Tvätta silen med 10 ml BM och skörda genomströmningen i samma 50 ml koniska rör.
- Överför den ansträngda cellsuspensionen till två nya 15 ml koniska rör. Centrifug vid 450 × g i 5 min vid 8 °C och aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Återsuspendera cellerna i 4 ml IEM kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare per full odlingsplatta som används som utgångsmaterial.
- Blanda en liten mängd cellsuspension i ett förhållande 1: 1 med trypanblå för räkning. Räkna de levande, inte blåa, cellerna (figur 3C) och beräkna det totala antalet levande celler. I små klumpar räknar du varje enskild cell.
- Förbered en cellsuspension innehållande 3 × 106 levande celler per ml IEM kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare.
- Sädceller på polyestermembraninsatser
- Aspirera försiktigt DPBS från de ECM-belagda skären (steg 3.2.1), samtidigt som plattan hålls horisontellt. Pipett 800 μL IEM kompletterat med ROCK-hämmare i varje basolateralt fack. Pipett 150 μL av cellsuspensionen framställd i steg 3.3.10 på det ECM-belagda membranet i det apikala facket droppvis. Per platta, var noga med att ha minst en "tom" brunn med endast BM.
- När cellerna har sedimenterat på membranet, mäta transepitelial elektrisk resistans (TEER), som beskrivs i avsnitt 4.1, och avbilda membranets insatser med hjälp av ett mikroskop. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2. Mät TEER varje dag och skaffa bilder regelbundet för att övervaka monolagerbildning (figur 4A-D).
- Uppfriskande monolager
OBS: Uppdatera mediet var 2-3: e dag, följ följande ordning för att upprätthålla ett positivt hydrostatiskt tryck ovanför cellerna och förhindra att celler skjuts av membranet. När du uppdaterar mediet, se till att monolagret, som är synligt vid aspiration av mediet, inte skadas av pipettspetsen.- Ta bort mediet från de basolaterala facken på plattan som innehåller membraninsatserna. Aspirera sedan försiktigt mediet från de apikala facken i membraninsatserna.
- Tillsätt 150 μL färsk IEM droppvis i varje apikalt fack och tillsätt sedan 800 μL färskT Internet explorer till varje basolateralt fack.
- Anrikning av monoskiktet för önskade intestinala epitelcellstyper
- Låt monolagret bli sammanflytande i Underhåll av Internet Explorer, vilket motsvarar ett TEER-värde på cirka 100 Ω·cm² (beräknat i steg 4.1.1.4). Kontrollera under mikroskopet för att avgöra om monolaverna har bildats helt (figur 4D) och för frånvaro av hål (som ses i figur 4B,C).
- Ta försiktigt bort Underhåll av Internet Explorer från de basolaterala och apikala facken i membraninsatserna och ersätt med antingen eDM eller cDM enligt vad som förberetts i avsnitt 1.4. Odla monolagret i ytterligare 3-4 dagar i det specifika differentieringsmediet för att få organoidcellerna berikade med önskad specifik celltyp. Uppdatera mediet varannan till var tredje dag, enligt beskrivningen i avsnitt 3.4.
- Mät TEER dagligen och skaffa bilder regelbundet om så önskas (Figur 5A-C).
OBS: TEER-värdet som indikerar ett helt organiserat berikat monolager varierar per organoidkultur; VANLIGTVIS ökar TEER-värdena till 600 och kan öka upp till 1000 Ω·cm2 (beräknat i steg 4.1.1.4) efter 3 dagar i differentieringsmedier och är stabila i 3-5 dagar.
4. Epiteliala monolageranalysavläsningar
- Mätning av transepitelialt elektriskt motstånd (TEER)
OBS: TEER-mätningar är allmänt accepterade som en metod för att analysera snäv korsningsdynamik och barriärfunktionsintegritet i biologiska modeller av fysiologiska barriärer, såsom epitelmonolager28,29. Ökning av TEER efter differentiering på grund av ökad cellulär interaktion vid snäva korsningar kan mätas med hjälp av en manuell TEER-mätare eller en automatiserad TEER-mätrobot.- Mätning av TEER med hjälp av en manuell TEER-mätare
- Rengör elektroden med 70% etanol och låt den lufttorka inuti biosäkerhetsskåpet. Placera elektroden i ett rör som innehåller BM. Anslut elektroden till den manuella TEER-mätaren. Vrid på funktionsomkopplaren för att mäta i ohm (Ω). Slå på strömbrytaren .
- Placera den korta elektroden i skärets apikala fack, medan den långa elektroden är placerad i basolaterala facket (figur 6A). Undvik att röra vid monolagret.
- Mät motståndet i den tomma brunnen (R-blank) och mät sedan de återstående proverna (R-provet) på samma sätt. Tvätta elektroden med BM mellan prover med olika förhållanden. Rengör elektroden först med demivatten och sedan med 70% etanol och låt den lufttorka.
- Beräkna TEER (Ω·cm2): [R-prov (Ω) -R-blank (Ω)] × membranarea (cm2) (tabell 1 och figur 6B).
- Mätning av TEER med hjälp av en automatiserad TEER-mätrobot (Table of Materials)
- Utför automatiserade TEER-mätningar när du använder HTS-system för HTS-plattor med 96 och 24 brunnar som innehåller membraninsatser. Använd olika elektroder för TEER-mätning för båda typerna (24- och 96- HTS-membraninsatser). Följ tillverkarens instruktioner för att mäta TEER med hjälp av en automatiserad TEER-mätrobot.
- Mätning av TEER med hjälp av en manuell TEER-mätare
- Mätning av epitelbarriärintegritet och permeabilitet
OBS: Detta protokoll introducerar Lucifer Yellow permeabilitet från det apikala till basolaterala facket som en indikation på monolagerintegritet. I detta avsnitt beskrivs fluorescensmätning i basolaterala facket efter ett 1 timmars inkubationssteg för att utvärdera monolagerpermeabilitet och därmed barriärintegritet. Denna mätning är en slutpunktsanalys och är särskilt användbar vid testning av föreningar för deras effekt på barriärintegriteten.- Tina Lucifer Yellow på is och låt BM balansera till RT. För en 24-brunnsplatta med membraninsatser, förbered 5 ml arbetslösning av 60 μM Lucifer Yellow i BM.
OBS: Lucifer Yellow är ljuskänslig. Förbered utspädningar i mörka 1,5 ml sterila rör och utför alla steg med biosäkerhetsskåpets lampa avstängd. - Avlägsna försiktigt mediet från de basolaterala och apikala facken i membraninsatserna, enligt beskrivningen i steg 3.5.1. Om så önskas, repa ett obehandlat monolager med en pipettspets som en positiv kontroll för Lucifer Yellow läckage genom en skadad barriär.
- Tillsätt 150 μL BM med 60 μM Lucifer Yellow till varje apikalt fack och tillsätt 800 μL BM utan Lucifer Yellow till varje basolateralt fack. Placera plattan på en shaker vid 37 °C, 50 rpm i 60 min.
- Under tiden förbereder du en standardkurva för Lucifer Yellow i BM med början med arbetslösningen som framställts i steg 4.2.1. Späd 1:3 i varje steg tills en koncentration på 3 nM uppnås. Inkludera en negativ kontroll (endast BM).
- Överför 100 μL av varje standard i tre exemplar till en 96-brunns transparent platta. Efter 60 minuters inkubation, ta bort membraninsatserna och överför 100 μL från varje basolateral brunn (steg 4.2.3) i tre exemplar till den 96-brunns transparenta plattan. Mät fluorescensen hos plattan med hjälp av en plattläsare vid en excitationsvåglängd på 430 nm och en emissionsvåglängd på 530 nm.
- Efter korrigering för det negativa kontrollvärdet (endast BM), använd standardkurvvärdena för att beräkna Lucifer Yellow-koncentrationen i basolateralfacket (slutlig mottagarkoncentration (μM)).
- Beräkna den skenbara permeabilitetskoefficienten (P-app) enligt följande formel (Figur 6C):
- För en 24-brunnsplatta som innehåller membraninsatser, använd följande formel:
- Tina Lucifer Yellow på is och låt BM balansera till RT. För en 24-brunnsplatta med membraninsatser, förbered 5 ml arbetslösning av 60 μM Lucifer Yellow i BM.
- Fixering av monolager och beredning av paraffinblock för histologi
OBS: Epiteliala monolager kan användas för histologisk färgning för utvärdering av deras cellulära sammansättning, polaritet och uttryck av olika proteiner av intresse, såsom korsningsproteiner, proliferation eller differentieringsmarkörer. I det här avsnittet beskrivs paraffinblockberedning för histologisk färgning.- Avlägsna försiktigt mediet från de basolaterala och apikala facken i membraninsatserna, enligt beskrivningen i steg 3.5.1.
- Tvätta monolamenten genom att tillsätta 150 μL DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) till varje apikalt fack och 800 μL till varje basolateralt fack. Aspirera försiktigt DPBS igen, först från basolaterala facket och sedan från det apikala facket.
OBS: Basolateralfacket kommer att förbli tomt från och med detta steg. - Tillsätt 150 μL 4% paraformaldehyd i en dragskåpa och inkubera i 30 minuter vid RT.
OBS: Från detta steg och framåt, utför alla åtgärder i detta avsnitt inuti en draghuva, eftersom paraformaldehyd är giftigt. - Aspirera försiktigt fixeringsmedlet från de apikala facken i membraninsatserna och kassera det som flytande halogenavfall.
OBS: Från och med detta steg, kassera allt flytande avfall som flytande halogenavfall. - Tvätta monolamenten genom att tillsätta 200 μL DPBS (utan Ca2+ och Mg2+) till varje apikalt fack och aspirera försiktigt DPBS igen. Upprepa detta steg en gång till.
- Tillsätt 200 μL 25% etylalkohol (EtOH) till varje apikalt fack och inkubera i 15 min vid RT. Efter 15 minuter aspirerar du försiktigt 25% EtOH från de apikala facken i membraninsatserna. Upprepa med 50% EtOH-lösning och därefter med 70% EtOH-lösning.
- Tillsätt 200 μL 70% EtOH till varje apikalt fack och linda in plattan med parafilm. Förvara den vid 4 °C tills vidare användning.
- Aspirera försiktigt 70% EtOH och använd en skalpell för att noggrant skära monolagermembranen från insatserna. Skär från basolateralsidan, runt kanten på insatsen.
- Förbered paraffinblock enligt standardproceduren.
- När paraffinet fortfarande är varmt, ta monolagret från paraffinet med pincett och placera det på en förkyld yta.
- Var försiktig så att du inte skadar monolagret. Skär monolagret på mitten med ett enda kantblad.
- När paraffinet i kassettens botten börjar stelna, använd uppvärmd pincett för att placera de två monolagerdelarna i paraffinet, bredvid varandra med rak sida nedåt och i vertikal riktning för att säkerställa att monolagret blir vertikalt i kupén.
- När paraffinblocken är klara, skär blocken med en mikrotom och gör bilder med 4 μm tjocka sektioner enligt standardproceduren. Se till att monolaverna hamnar vertikalt i kupén.
- Utför histologiska fläckar som beskrivits tidigare 7,9. Använd hematoxylin och eosin (H & E), Ki67, mucin-2 (MUC2) och Alcian Blue för att visa allmän morfologi, proliferativa celler, slemproduktion respektive bägareceller (Figur 6E).
OBS: Ytterligare differentieringsmarkörer, såsom lysozym för Paneth-celler, kan också användas. Denna markör presenteras inte i figur 6E eftersom Paneth-celler är närvarande i tunntarmsepitelet snarare än kolonepitel.
- Utsöndrad proteinmätning i medium supernatant
- Mät lysozymnivåerna i den apikala supernatanten hos ileala monolager (se figur 6D) med hjälp av satsen som anges i materialförteckningen. Om så önskas, mäta nivåer av olika cytokiner och andra proteiner av intresse.
- Analys av genuttryck
- Kvantifiera effekterna av differentieringsmediet på uttrycket av epitelcellmarkörgener med kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR).
- Lysa monolaverna i 350 μL RNA-lysbuffert följt av RNA-isolering enligt tillverkarens instruktioner. Utför cDNA-syntes och qPCR, som beskrivits tidigare 7,9, med hjälp av cDNA-syntessatserna, mastermixen och oligonukleotiderna som anges i materialförteckningen.
- Kvantifiera effekterna av differentieringsmediet på uttrycket av epitelcellmarkörgener med kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR).
5. Uppskalning till 96-brunnsplattor som innehåller membraninsatser
OBS: Förbered epiteliala monolager för läkemedelsscreening med högre genomströmning eller flera medelstora tillstånd med HTS 96-brunnsplattor som innehåller membraninsatser.
- Anpassningar vid beredning av monolager i 96-brunnsformat
- Följ alla steg som beskrivs i detta protokoll för 24-brunnsplattor som innehåller membraninsatser, ändra volymer och cellnummer till de som beskrivs i tabell 1. För beredning av monolager på 96-brunnsplattor med membraninsatser, fortsätt enligt beskrivningen i avsnitt 3 med följande skillnader.
- Cirka 9 brunnar av en 6-brunns odlingsplatta med organoiddensitet representerad i figur 3A behövs för att fröa en full 96-brunnsplatta med membraninsatser. I steg 3.2.1 förbelägger du membranen med 67 μL 40x utspädd ECM i DPBS (med Ca2+ och Mg2+).
- I avsnitt 3.5 överför först den integrerade plattan av membraninsatser till en annan 96-brunnsplatta för att möjliggöra medium förfriskning av både apikala och basolaterala fack.
- Följ alla steg som beskrivs i detta protokoll för 24-brunnsplattor som innehåller membraninsatser, ändra volymer och cellnummer till de som beskrivs i tabell 1. För beredning av monolager på 96-brunnsplattor med membraninsatser, fortsätt enligt beskrivningen i avsnitt 3 med följande skillnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar en representativ ljusfältsbild av tarmorganoider efter upptining av dem från en kryovial. Det är viktigt att tina organoider med hög densitet för att säkerställa optimal återhämtning. Organoider är pläterade i 24- eller 6-brunnsplattor i ECM-kupoler på cirka 10 μL (figur 1B). De flesta normala tarmorganoider har en cystisk morfologi. Efter att ha återhämtat sig från upptiningsprocessen växer organoiderna till en större storlek och är redo att passera efter 3-7 dagar beroende på organoidkulturen (Figur 1C). Efter att ha skördat organoiderna och tvättat bort ECM (figur 1D) kan organoider störas till en liten storlek genom mekanisk skjuvning. Beroende på organoidernas morfologi (cystisk figur 1C, spirande figur 1E) kan organoider störas med hjälp av plast- eller glaspipetter (figur 1F). Organoider störs i en suspension (figur 2A), som regelbundet bör övervakas under mikroskopet. Det är viktigt att undvika att göra dem för små, eftersom grupper av celler måste hålla ihop för att säkerställa organoidtillväxt. Figur 2B visar organoiderna i ECM sjunker strax efter passering. I allmänhet pläteras cystiska organoider med en relativt hög densitet medan spirande organoider pläteras i låg densitet; Detta kan dock skilja sig mellan olika organoidkulturer.
När du passerar organoider för beredning av monolager, var noga med att platta dem med hög densitet och låt dem växa i tre dagar så att de är i optimala expansionsförhållanden. Organoider kan skördas för monolagerberedning när de är jämförbara med figur 3A i storlek och densitet, där 6 brunnar av en 6-brunnsplatta, vardera innehållande 200 μL organoidkupoler, vanligtvis räcker för sådd av en full 24-brunnsplatta med membraninsatser. Efter beredning av en encellig suspension med celldissociationsreagenset ska enstaka celler och små klumpar av celler vara synliga (figur 3B) och levande celler kan räknas (figur 3C). Pilarna indikerar döda celler färgade med trypanblå, vilket bör uteslutas från räkning. De enskilda cellerna och de små klumparna sås sedan i membraninsatserna som ses i figur 4A. Monolagerbildning är synlig efter 1-3 dagar (figur 4B,C), och monolastren kommer i allmänhet att vara sammanflytande efter 3-6 dagar beroende på organoidkulturen (figur 4D). Monolager stannar i expansionsmedium tills de är sammanflytande, varefter de kan berikas med bland annat enterocyter eller bägareceller med hjälp av olika anrikningsmedier. Figur 5A visar ett monolager som odlades i 8 dagar i expansionsmedium (IEM). När de berikas med enterocyter (eDM) ses en struktur, som i figur 5B, medan monolager utsatta för kombinationsmedium (cDM) visar en mjukare struktur (figur 5C).
Monolagerbildning kan kvantitativt följas genom mätning av TEER (figur 6A). Ett helt sammanflytande monolager har ett TEER-värde på ~ 100 Ω · cm2, vilket ökar till ~ 1000 Ω · cm2 när det utsätts för något av differentieringsmediet (figur 6B). Monolager under alla medelstora förhållanden visar en låg uppenbar permeabilitet (P-app) till Lucifer Yellow (0,45 kDa). Lysozymsekretionen av ileala monolager odlade i IEM var högre än för monolager odlade i IEM tills de var sammanflytande och i ytterligare 4 dagar i eDM eller cDM (betecknad som + efterföljande eDM eller cDM) (figur 6D). Monolager odlade i IEM, IEM + efterföljande eDM eller IEM + efterföljande cDM visar olika morfologi, vilket kan observeras med H&E-färgning (figur 6E). Medan kolonorganoid-härledda epitelmonolager i IEM- och cDM-medier har en slät apikal yta, uppvisar enterocytdifferentierade monolager en invaginerad apikal morfologi i frånvaro av Wnt. Ki67-positiva proliferativa celler kan detekteras endast under expansionsförhållanden. Alcian Blue och MUC2 fläckar slem som produceras av bägare celler, som visualiseras i monolamenten differentierade i eDM och mer framträdande i cDM när Wnt, Notch och EGF signalering hämmas, respektive (Figur 6E). Vid differentiering minskar proliferativa celler medan bägarecell och enterocytmarkörgenuttryck ökar jämfört med det som observerats under IEM-förhållanden, vilket visas av LGR5, MUC2 respektive ALPI genuttryckskvantifiering med qRT-PCR (Figur 6F).
Figur 1: Upprättande av en intestinal organoidkultur från frysta organoider. (A) Representativ ljusfältsbild av en intestinal organoidkultur efter upptining. (B) ECM-kupoler (50 μL) sådda i varje brunn på en odlingsplatta med 24 brunnar. (C) Representativ bild av en normal intestinal organoidkultur redo för genomströmning. (D) Representativ bild av hur man kontrollerar förekomsten av ECM i ett 15 ml rör som innehåller organoider under ett ljusmikroskop. (E) Representativ bild av en spirande tarmorganoidkultur redo för genomgående. F) En 10 μL plastpipettspets monterad på en filterspets med låg retention på 1 250 μL (vänster) och en smalare glaspipett (höger) för mekanisk skjuvning av organoider. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: ECM = extracellulär matris. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bearbetning av tarmorganoider för underhåll eller beredning av monolager. (A) Representativ bild av tarmorganoider efter mekanisk störning. (B) Representativ bild av en intestinal organoidkultur sådd efter genomströmning. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beredning av enstaka celler från tarmorganoider för monolagerberedning. (A) Tarmorganoider redo att skördas för monolagerberedning. (B) Enstaka celler och små klumpar av celler efter beredning av enstaka celler. (C) Synliga enskilda celler och små klumpar under räkning i en rutnätskammare. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Monolagerbildning efter sådd av enskilda celler på membran. (A) Enstaka celler strax efter sådd på membran. I genomsnitt är (B) monolagret cirka 50% sammanflytande 1-3 dagar efter sådd, (C) ~ 90% sammanflytande vid dag 3-5 och (D) det kompletta monolagret har bildats runt dag 4-7. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Berikning av specifika celltyper i monoskiktet. (A) Monolager efter 8 dagar i Underhåll av internet explorer. (B) Monolager berikat med enterocyter efter 4 dagar i Underhåll av Internet explorer och ytterligare 4 dagar i eDM. (C) Monolager berikat med bägareceller och andra celltyper efter 4 dagar i IEM och ytterligare 4 dagar i cDM. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: IEM = intestinalt organoid expansionsmedium; eDM = enterocytdifferentieringsmedium; cDM = kombinationsdifferentieringsmedium. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: En mängd möjliga avläsningar med epitelorganoidmonolager. (A) Elektrod i membraninsatsen för att mäta TEER. (B) TEER-värdena ökar i tid med ett värde på ~ 100 Ω · cm2 när monoskiktet når sammanflöde. Efter att ha berikat monolager med enterocyter eller en kombination av olika epitelceller ökar TEER till 1000 Ω ·cm2 eller högre. (C) Monolager under alla medelstora förhållanden (IEM + 4 dagar IEM/eDM/cDM) är ogenomträngliga för Lucifer Yellow. (D) Uttrycket av lysozym är högre i ileummonolager när det odlas i expansionsmedium än i någon typ av differentieringsmedium (IEM + 4 dagar IEM/eDM/cDM). (E) Kolonmonolager visar olika morfologier när de utsätts för olika medelbetingelser (IEM + 4 dagar IEM/eDM/cDM) som visualiseras av H&E-, Ki67-, Alcian Blue- och MUC2-fläckar. Som förväntat är monolager odlade i expansionsmedium mycket proliferativa, vilket framgår av Ki67-färgning. Monolager differentierade med eDM visar ett kolumnärt epitel utan proliferativa celler. Monolager som utsätts för cDM är inte heller proliferativa och utvecklar fler bägareceller. Skala bar = 100 μm. (F) Stamceller (LGR5), bägare cell (MUC2) och enterocyt (ALPI) markör genuttryck i kolon monolager av qRT-PCR. Förkortningar: TEER = transepitelialt elektriskt motstånd; IEM = intestinalt organoid expansionsmedium; eDM = enterocytdifferentieringsmedium; cDM = kombinationsdifferentieringsmedium; Papp = skenbar permeabilitetskoefficient; LGR5 = leucinrik upprepningsinnehållande G-proteinkopplad receptor 5; H&E = hematoxylin och eosin; AB = Alcian Blå; MUC2 = mucin-2; ALPI = intestinalt alkaliskt fosfatas; qRT-PCR = kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Membraninsatser | ||
| 24-brunnsplattor | 96-brunnsplattor | |
| Membranyta (cm2) | 0.33 | 0.143 |
| Apikal volym (μL) | 150 | 100 |
| Basolateral volym (μL) | 800 | 300 |
| # Celler till frö per brunn | 450,000 | 200,000 |
| HTS-plattor med membraninsatser | SÄLLSKAPSDJUR | SÄLLSKAPSDJUR |
| Plattor med separata insatser | SÄLLSKAPSDJUR | NA |
| Ljustäta plattor med membraninsatser | ||
| Elektroder är olika för de två formaten | Se materialförteckningen | |
Tabell 1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver den allmänna manipulationen och underhållet av tarmorganoider samt beredning och möjliga tillämpningar av epitelmonolager härledda från dessa organoider. Hittills har monolager framgångsrikt framställts från tolvfingertarmen, ileum och olika regioner av kolonorganoider härledda från normal såväl som tidigare och aktivt inflammerad tarmvävnad (opublicerade data). Tillämpningen av patient-härledda organoidmonolager underlättar studien av barriärfunktionen på ett sjukdoms- och patientspecifikt sätt samt studien av patientspecifika svar på en mängd olika läkemedelsbehandlingar. Även om cellinjer kan bilda differentierade och polariserade monolager innehållande intestinala enterocyter och bägareliknande celler, uttrycks många olika enzymer och transportörer avvikande i dessa cellinjer, vilket resulterar i minskad komplexitet och fysiologisk relevans 3,30. Organoidkultur är tekniskt mer krävande och mödosam än cellodling; Organoider är emellertid mer representativa för in vivo-situationen, medan cellinjer upprepade gånger har misslyckats med att representera vävnadssvar i komplexa inställningar.
Även om primära vävnadsbaserade modeller kan vara representativa för in vivo s ituation, kräver de användning av försöksdjureller tillgång till mänskligt material, vilket är förknippat med begränsad tillgänglighet och etiska begränsningar. Dessutom har primär vävnad ingen eller begränsad expanderbarhet och är inte stabil i förlängda experimentella tidsramar. Organoidteknik kräver begränsad mängd primär vävnad för att etablera genetiskt och fysiologiskt stabila långsiktigt expanderande kulturer samtidigt som den representerar epitelvävnadskomplexitet och patientheterogenitet. Olika cellinjer, såsom Caco-2, används ofta för att förbereda epitelmonolager. Caco-2-celler tar 21 dagar att etablera ett polariserat epitelialt monolager som kan användas för alla experiment30. Organoid-härledda epitelmonolager framställs från organoida enskilda celler som beskrivs i det aktuella protokollet och bildar efter 3-6 dagar ett polariserat epitel som kan differentieras ytterligare för att berika dem med enterocyter eller bägareceller.
Monolager är en statisk modell som saknar ett mikrofluidiskt flöde eller mekanisk sträckning som ses i organ-on-a-chip. De erbjuder dock möjlighet till samodling med (autologa) immunceller, liksom bakterier eller parasiter 17,18,19,31. Organoider är lämpliga för monolagerberedning när de befinner sig i sin expansionsfas; för tarmorganoider är detta vanligtvis 3 dagar efter passering. Dissociation av organoider till enskilda celler bör utföras snabbt för att undvika långvarig exponering för matsmältningsenzymer. För att öka överlevnaden av stamceller efter beredning av en encellssuspension tillsätts den Rho-associerade proteinkinashämmaren (ROCK-hämmaren), Y27632, till cellerna för att förhindra anoikisinducerad celldöd32. Dessutom är det viktigt att odla monolaverna på ett membran förbelagt med ECM för att säkerställa att de behåller sina organoidegenskaper och polarisering. För funktionella screeninganalyser som kvantifierar EPITELcellssvar i mag-tarmkanalen på yttre stimuli är det viktigt att organoidkulturer representerar den erforderliga cellulära komplexiteten beroende på vilken typ av analys som ska utvecklas och eventuella avläsningar.
Tarmorganoider representerar olika epitelcelltyper som finns in vivo, såsom stam-, TA-, enterocyt-, paneth-, bägare- och enteroendokrina celler 4,5, och framställs och upprätthålls med användning av ett definierat organoidmedium framställt enligt beskrivningen i detta protokoll. Enterocytdifferentiering kan främjas genom odling av organoider i ytterligare fyra dagar med användning av odlingsbetingelser som dualt hämmar Wnt-vägen, genom avlägsnande av Wnt-molekyler / aktivatorer och tillsats av Porcupine-hämmaren, IWP-2 (enterocytkolondifferentieringsmedium, eDM). Eftersom slemproducerande bägareceller också är väsentliga för barriärfunktionshomeostas, syftar ett andra odlingstillstånd till att producera en mer heterogen cellpopulation som innehåller stam-, enterocyt- och bägareceller, där Notch- och EGF-vägar hämmas medan Wnt-signalering hålls delvis aktiv genom att minska Wnt3aCM till 10% (eller 0,1 nM för NGS-Wnt) istället för 50% (0,5 nM NGS-Wnt) som används i IEM. I motsats till eDM, som berikar för enterocytdifferentiering, stöder detta andra tillstånd närvaron av flera celltyper och kallas därför kombinationsdifferentieringsmedium (cDM).
Tillämpningar av organoid-härledda monolager inkluderar övervakning av epitelbarriärintegritet samt undersökning av tät korsning och transportöruttryck. Barriärintegritet, permeabilitet och transport kan analyseras med hjälp av de avläsningar som introduceras i detta protokoll. Medan TEER mäter jonledning genom snäva korsningar, mäter permeabilitetsanalysen vattenflödet och därmed paracellulär permeabilitet genom de snäva korsningarna 28,29. Epitelbarriärens integritet, permeabilitet och transportfunktionalitet hos monolaret kan utvärderas genom att mäta trafiken av olika fluorescerande eller radioaktiva substrat över apikala och basolaterala fack i membraninsatserna. TEER-mätningar möjliggör kvantifiering av barriärintegritet, vilket visar en ökning av värdena vid differentiering mot polariserade enterocyter och bägareceller och en minskning efter att ha inducerat skada på monolarkerna.
Lucifer Yellow permeabilitetsanalysen kan användas för initial bedömning av barriärintegritet samt bekräftelse av minskad integritet efter att ha framkallat skada på monolakorna. Detta protokoll introducerar Lucifer Yellow permeabilitet från det apikala till basolaterala facket som en indikation på monolagerintegritet. På samma sätt kan andra fluorescerande märkta reagenser, såsom 4 eller 40 kDa dextran, användas för att utvärdera ökad paracellulär permeabilitet som ett resultat av barriärskadeinducerande medel. Fluorescerande märkta substrat, såsom Rhodamine 123, kan användas för att mäta aktiviteten hos olika transportörer, såsom P-glykoprotein-1. Fluorescensanalysen som beskrivs i detta protokoll möjliggör mätning av nivåerna av proteiner, såsom lysozym, som utsöndras i det apikala facket. Svar på skadeinduktion av proinflammatoriska cytokiner kan mätas med dessa avläsningar, liksom de potentiella effekterna av barriäråterställande föreningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) offentlig-privata partnerskap (PPP) ersättning för den nederländska LSH-sektorn med projektnummer LSHM16021 Organoider som nytt verktyg för toxikologisk modellering till Hubrecht Organoid Technology (HUB) och HUB intern finansiering till avdelningen för sjukdomsmodellering och toxikologi. Vi tackar laboratorierna sabine Middendorp (avdelningen för pediatrisk gastroenterologi, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) och Hugo R. de Jonge och Marcel J.C. Bijvelds (Institutionen för gastroenterologi och hepatologi, Erasmus MC, Rotterdam) för att de gav initialt tekniskt stöd för att sätta upp monolager på membraninsatser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363 (2020).
- Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C.
- Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
- Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
- Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
- Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
- Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
