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Article de méthode

Explantations tumorales dérivées de patients en tant que plate-forme préclinique « vivante » pour prédire la résistance aux médicaments chez les patients

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DOI :

10.3791/62130

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7 février 2021

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1Leicester Cancer Research Center, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des explants dérivés du patient pour évaluer les réponses aux médicaments tumoraux dans un système de modèle préclinique vivant, pertinent pour le patient.

Résumé

La compréhension de la résistance aux médicaments et le développement de nouvelles stratégies pour sensibiliser les cancers hautement résistants reposent sur la disponibilité de modèles précliniques appropriés capables de prédire avec précision les réponses des patients. L’un des inconvénients des modèles précliniques existants est l’incapacité de préserver contextuellement le microenvironnement tumoral humain (TME) et de représenter avec précision l’hétérogénéité intratumorale, limitant ainsi la traduction clinique des données. En revanche, en représentant la culture de fragments vivants de tumeurs humaines, la plate-forme d’explant dérivé du patient (PDE) permet d’examiner les réponses médicamenteuses dans un contexte tridimensionnel (3D) qui reflète le plus fidèlement possible les caractéristiques pathologiques et architecturales des tumeurs d’origine. Des rapports antérieurs avec des PDE ont documenté la capacité de la plate-forme à distinguer les tumeurs chimiosisttives des tumeurs chimiorésistantes, et il a été démontré que cette ségrégation est prédictive des réponses des patients aux mêmes chimiothérapies. Simultanément, les PDE permettent d’interroger les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques des tumeurs qui prédisent les réponses aux médicaments, identifiant ainsi des biomarqueurs pour la stratification des patients ainsi que de nouvelles approches interventionnelles pour sensibiliser les tumeurs résistantes. Cet article décrit en détail la méthodologie pdE, de la collecte d’échantillons de patients à l’analyse des critères d’évaluation. Il fournit une description détaillée des méthodes de dérivation et de culture des explants, en mettant en évidence les conditions sur mesure pour des tumeurs particulières, le cas échéant. Pour l’analyse des critères d’évaluation, l’accent est mis sur l’immunofluorescence multiplexée et l’imagerie multispectrale pour le profilage spatial de biomarqueurs clés dans les régions tumorales et stromales. En combinant ces méthodes, il est possible de générer des données quantitatives et qualitatives sur la réponse aux médicaments qui peuvent être liées à divers paramètres clinicopathologiques et donc potentiellement utilisées pour l’identification de biomarqueurs.

Introduction

Le développement d’agents anticancéreux efficaces et sûrs nécessite des modèles précliniques appropriés qui peuvent également fournir un aperçu des mécanismes d’action qui peuvent faciliter l’identification de biomarqueurs prédictifs et pharmacodynamiques. L’hétérogénéité inter- et intratumorale1,2 ,3,4,5et le TME6,7 ,8,9,10,11,12 sont connus pour influencer les réponses médicamenteuses anticancéreuses, et de nombreux modèles de cancer précliniques existants tels que les lignées cellulaires, les organoïdes et les modèles murins ne sont pas en mesure de s’adapter pleinement à ces facteurs cruciaux. fonctionnalités. Un modèle « idéal » est celui qui peut récapituler les interactions spatiales complexes des cellules malignes avec les cellules non malignes dans les tumeurs ainsi que refléter les différences régionales au sein des tumeurs. Cet article se concentre sur les PDE en tant que plate-forme émergente pouvant répondre à bon nombre de ces exigences13.

Le premier exemple de l’utilisation de PDE humains, également connus sous le nom d’histocultures, remonte à la fin des années 1980 lorsque Hoffman et al. ont généré des tranches de tumeurs humaines fraîchement réséquées et les ont cultivées dans une matrice de collagène14,15. Cela impliquait la mise en place d’un système de culture 3D qui préservait l’architecture tissulaire, assurant le maintien des composants stromaux et des interactions cellulaires au sein du TME. Sans déconstruire la tumeur d’origine, Hoffman et al.16 ont annoncé une nouvelle approche de la recherche translationnelle, et depuis ce temps, de nombreux groupes ont optimisé différentes méthodes d’explant dans le but de préserver l’intégrité des tissus et de générer des données précises sur la réponse aux médicaments17,18 , 19, 20,21,22,23,24 , bien que certaines différences entre les protocoles soient évidentes. Butler et al. ont cultivé des explants dans des éponges de gélatine pour aider à la diffusion des nutriments et des médicaments à travers le spécimen20,21,25, tandis que Majumder et al. ont créé un écosystème tumoral en cultivant des explants sur une matrice composée de protéines tumorales et stromales en présence de sérum autologue dérivé du même patient22, 23.

Plus récemment, notre groupe a mis en place un protocole par lequel les explants sont générés par fragmentation des tumeurs en morceaux de 2 à 3 mm3qui sont ensuite placés sans composants supplémentaires sur des membranes perméables à l’interface air-liquide d’un système de culture24. Prises ensemble, ces nombreuses études ont démontré que les PDE permettent la culture de fragments intacts et vivants de tumeurs humaines qui conservent l’architecture spatiale et l’hétérogénéité régionale des tumeurs d’origine. Dans les expériences originales, les explants ou les histocultures étaient généralement soumises à une homogénéisation après un traitement médicamenteux, après quoi divers tests de viabilité ont été appliqués aux échantillons homogénéisés tels que le test de réponse au médicament histoculture20,21, le test MTT (bromure de 3-(6)-2,5-diphényltétrazolium), le test de la lactate déshydrogénase ou le test à base de résazurine26,27,28 . Les progrès récents dans les techniques d’analyse des paramètres, en particulier la pathologie numérique, ont maintenant élargi le répertoire des tests et des essais des paramètres qui peuvent être effectués sur les explants29,30. Pour appliquer ces nouvelles technologies, au lieu de l’homogénéisation, les explantes sont fixées dans du formol, incorporées dans de la paraffine (FFPE) puis analysées à l’aide de techniques d’immunocoloration, permettant un profilage spatial. Des exemples de cette approche ont été documentés pour le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), le cancer du sein, le cancer colorectal et les explants de mésothéliome où la coloration immunohistochimique du marqueur de prolifération, Ki67, et du marqueur apoptotique, la poly-ADP ribose polymérase clivée (cPARP), a été utilisée pour surveiller les changements dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire24,31,32,33,34.

L’immunofluorescence multiplexée est particulièrement propice au profilage spatial des réponses médicamenteuses chez les explants au point d’extrémité35. Par exemple, il est possible de mesurer la relocalisation et la distribution spatiale de classes spécifiques de cellules immunitaires, telles que les macrophages ou les lymphocytes T, au sein du TME lorsd’untraitement médicamenteux13,36,37,38, et d’étudier si un agent thérapeutique peut favoriser la transition de la « tumeur froide » à la « tumeur chaude »39 . Au cours des dernières années, ce groupe s’est concentré sur la dérivation des PDE de différents types de tumeurs (CPNPC, cancer du rein, cancer du sein, cancer colorectal, mélanome) et sur le test d’une gamme d’agents anticancéreux, y compris les chimiothérapies, les inhibiteurs de petites molécules et les inhibiteurs du point de contrôle immunitaire (ICO). Les méthodes d’analyse des paramètres ont été optimisées pour inclure l’immunofluorescence multiplexée afin de permettre le profilage spatial des biomarqueurs pour la viabilité ainsi que des biomarqueurs pour différents constituants du TME.

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Protocole

1. Prélèvement de tissus

  1. Après la chirurgie, transférer les échantillons de tumeurs humaines fraîchement réséqués dans un tube contenant 25 mL de milieu de culture frais (milieu Eagle modifié de Dulbecco complété par 4,5 g / L de glucose et de L-glutamine + 1% (v / v) de sérum de veau fœtal + 1% de pénicilline-streptomycine) et stocké sur de la glace. Traiter l’explantation dans les 2 heures suivant la chirurgie dans une hotte stérile de classe II.

2. Explant préparation

  1. Nettoyez tout l’équipement chirurgical (lames de greffe/surface de cire dentaire/pinces à épiler) avec une solution d’alcool méthylé industriel (IMS) à 70 %.
  2. Remplissez un plat de culture de 10 cm (voir la Table des matériaux)avec environ 25 mL de milieu frais et placez-le sur un lit de glace.
  3. À l’aide d’une pince à épiler, transférer l’échantillon sur une surface de cire dentaire (voir la Table des matériaux)et découper le tissu en fragments d’environ 2 à 3 mm3 à l’aide de deux lames de greffe de peau.
    REMARQUE: Pour une meilleure performance, commencez à trancher le tissu pour obtenir une bande individuelle de 2 à 3 mm d’épaisseur, puis coupez la bande le long de la longueur pour obtenir les explants finaux. Répétez le processus jusqu’à ce que l’échantillon entier soit haché.
  4. Transférer rapidement les explants dans le milieu de culture glacé dans le plat de 10 cm. Prendre une proportion des explants (6–9 morceaux), les placer dans un tube de 1 mL contenant 10% de solution de formol non tamponnée et laisser à température ambiante (RT) pendant 24 h.
    REMARQUE: Ces fragments représenteront les explants témoins de la condition « non cultivée ».
  5. Remplissez le nombre souhaité de puits de plaques de 6 puits avec 1,5 mL de milieu frais par puits et placez un disque d’insert de culture organotypique (voir la Table des matériaux)dans chaque puits afin qu’il flotte sur le milieu, en évitant soigneusement les bulles d’air à l’interface média-insert.
  6. Sélectionnez les explants au hasard et placez-les une à la fois sur le disque d’insertion. Pour être cohérent avec la condition « inculte », utilisez 6 à 9 explants par puits. Placer la plaque multipuits dans un incubateur à CO2 à 37 °C et 5 % de CO2, et laisser les explants récupérer pendant 16 h.
    REMARQUE: Pour éviter d’écraser le tissu, une manipulation douce de la pince à épiler est fortement recommandée.

3. Traitement de la toxicomanie

  1. Après 16 h, prendre de nouvelles plaques de 6 puits, ajouter 1,5 mL de milieu frais à chaque puits, ajouter les médicaments pertinents aux concentrations souhaitées et inclure un puits pour le contrôle du véhicule. À l’aide de la pince à épiler, déplacez chaque insert contenant les explants vers les plaques à 6 puits nouvellement préparées contenant les médicaments. Placer les plaques dans l’incubateur à CO2 à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24–48 h.
  2. Transférer les explants non cultivés précédemment fixés dans le formol dans une cassette histologique (voir rubrique 4 ci-dessous) et stocker dans 70% d’IMS jusqu’à la fin de l’expérience.

4. Traitement histologique

  1. Fixation tissulaire
    1. Après le traitement médicamenteux, transférer les disques d’insertion contenant les explants dans de nouvelles plaques à 6 puits contenant 10% de formol et ajouter quelques gouttes de formalin à 10% sur le dessus des explants pour assurer une couverture complète avec le fixateur.
      ATTENTION : Le formol est dangereux. Évitez tout contact avec la peau et manipulez-la à l’intérieur d’un aliment fumant pour éviter toute inhalation.
    2. Laissez les explants rester toute la nuit (20–24 h) dans le formol à 10%.
    3. Le lendemain, trempez le nombre pertinent de petites éponges d’histologie dans 70% d’IMS et placez-les dans des cassettes d’histologie. Transférer doucement toutes les explants d’une condition de traitement médicamenteuse donnée sur une seule éponge (maintenir l’orientation des explants de sorte que les côtés des explants en contact avec les disques d’insertion, et donc les zones traitées par le médicament, soient mis en contact avec l’éponge). Placez une autre éponge pré-trempée sur le dessus des explants et fixez-la dans une cassette d’histologie (une cassette par puits/traitement).
    4. Immergez les cassettes dans 70% IMS, et laissez à RT pendant 24 h.
  2. Enrobage de paraffine et sectionnement des tissus
    1. Le lendemain, transférer les cassettes d’histologie contenant les explants dans le panier d’échantillons du processeur de tissus (voir la Table des matières)et fixer le couvercle. Placez le panier dans l’autoclave et fermez doucement. Sélectionnez le programme souhaité et démarrez le processeur. Égouttez la cornue, ouvrez-la pour retirer le panier et transférez-la dans le bain de cire du centre d’intégration.
    2. Après l’intégration, transférez les couvercles de cassettes métalliques dans le panier et retournez à la cornue du processeur de papier tissu pour le programme de nettoyage. Essuyez le capteur avec un mouchoir sec, retirez tout excès de cire du couvercle de l’autoclave et poursuivez le programme de nettoyage.
    3. Placez un bloc de paraffine dans le microtome rotatif, coupez quelques sections à 4 μm et retournez le bloc dans la glace. Repositionnez le bloc et coupez plus de sections de 4 μm. Transférez les sections avec un petit pinceau et des pinces au bain-marie pour enlever les plis et les bulles.
    4. Placez les sections au centre sur les lames de microscope, égouttez les lames pendant quelques minutes et placez-les dans un porte-lames pour les sécher pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C. Lorsque les sections sont sèches, rangez-les à TA dans un dossier ou une boîte à glissière pour les protéger de la poussière.

5. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E)

  1. Remplissez le colorant (voir la table des matériaux)avec des réactifs et définissez le programme requis pour la coloration H & E: temps d’incubation de l’hématoxyline: 5 min; temps d’incubation de l’éosine: 3 min.
  2. Fixez le porte-glissière au support, placez-le dans le premier récipient contenant du xylène et démarrez le programme. Retirez le support de glissière du rack et emmenez le conteneur avec le porte-diapositives dans la zone de montage.
  3. Montez les lames avec du phtalate de dibutyle xylène (DPX) sous la hotte d’extraction. Placez DPX sur chaque couvercle et abaissez la glissière sur le couvercle avec la section vers le bas, ce qui permet au DPX de s’étaler.
    REMARQUE: DPX est dangereux. Évitez tout contact avec la peau et utilisez-la dans une hotte désignée.

6. Immunocoloration

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées à RT, sauf indication contraire.

  1. Déparaffinisation et réhydratation
    1. Placez les lames dans un porte-diapositives et chauffez à 65 °C pendant 10 min avant de déparaffiner les sections dans du xylène pendant 3 min (2x). Minimisez la quantité de solution de report.
      REMARQUE : Le xylène est inflammable, dangereux et irritant. Manipuler à l’intérieur de la hotte tout en utilisant des gants à double couche. Évitez le contact avec la peau et les yeux. Éliminer les déchets dans un contenant scellé.
    2. Réhydrater les lames dans un gradient d’alcool comme suit : 99% IMS pendant 1 min (2x) et 95% IMS pendant 1 min. Minimisez la quantité de solution de report.
      REMARQUE: IMS est hautement inflammable, volatil et irritant. Manipulez à l’intérieur de la hotte et évitez le contact avec la peau et les yeux.
    3. Immergez complètement le porte-glissière dans de l’eau ultrapure (UP) pendant 5 min.
  2. Récupération d’antigènes
    1. Préparer le tampon de récupération de l’antigène conformément aux directives du fabricant pour l’anticorps particulier utilisé.
      REMARQUE: Le tampon de citrate 0,2 M, pH 6, ou tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)-éthylènediamine acide tétraacétique (EDTA) 0,1 M, pH 9, sont les tampons communs utilisés pour les conditions acides ou alcalines, respectivement. L’acide citrique monohydraté et Tris sont des agents irritants. Préparez toutes les solutions d’origine dans la hotte. Évitez tout contact avec la peau et les yeux.
    2. Immergez le rack contenant les glissières dans un tampon de récupération d’antigène, et au micro-ondes (voir le tableau des matériaux)à pleine puissance (800 W) pendant 20 min.
      REMARQUE: Gardez les diapositives complètement immergées dans la mémoire tampon pendant tout le processus. Pour éviter une réduction excessive du volume tampon, placez un couvercle sur le dessus du récipient utilisé.
  3. Immunofluorescence multiplex (mIF)
    REMARQUE: Ce processus prend 1 à 2 jours.
    1. Remplissez un récipient propre avec 250 mL d’eau UP et immergez complètement le porte-glissière pendant 2 min (2x). Procédez à l’assemblage de chaque diapositive dans une plaque de couverture de diapositive (voir la table des matériaux).
      1. Pour assembler une glissière sur une plaque de couverture, préparez un abreuvoir en verre avec de l’eau. Immergez à la fois la plaque de couverture et glissez-la dans l’eau, en plaçant la section de tissu côté face à la plaque de couverture.
      2. Placez le bord inférieur de la glissière sur le dessus des protubérances au bas de la plaque de couverture, et enfin alignez la glissière sur la plaque de couverture, permettant à l’eau de combler l’espace entre les deux sans air piégé. Tenez la plaque de couverture et glissez-la ensemble, puis placez-les dans un porte-plaques de couverture.
    2. Remplissez la plaque de couverture avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et attendez que le tampon lave les lames, en s’écoulant par gravité (2x). Pipeter 110 μL de tampon bloquant (voir le tableau des matériaux)sur chaque plaque de couverture et incuber pendant 10 min.
    3. Préparer la dilution d’anticorps primaire souhaitée dans le PBS ou le tampon bloquant conformément aux recommandations du fabricant. Incuber les lames avec un anticorps primaire (110 μL par lame) pendant 30 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
    4. Incuber les lames avec 110 μL de polymère de peroxydase de raifort pendant 30 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
    5. Préparer la dilution du fluorophore dans un diluant d’amplification 1:100 (v/v) et incuber les lames avec du fluorophore (110 μL par lame) pendant 10 min. Laver les lames avec 5 mL de PBS (2x), comme décrit au point 6.3.2.
      REMARQUE: Pour l’utilisation du fluorophore 780, suivez les directives du fabricant. L’expérience peut être suspendue ici si les lames sont incubées dans le lavage final du PBS et stockées à 4 °C pendant la nuit.
    6. Déclipsez les lames des plaques de couverture et revenez à l’étape de récupération de l’antigène pour commencer la coloration avec un anticorps différent. Répétez la coloration pour obtenir le nombre souhaité d’anticorps à tester.
    7. Après l’étape 6.3.5 pour le dernier fluorophore utilisé, conserver les lames sur les plaques de couverture, préparer une solution de 6 μM de dilactate de 4'-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec de l’eau UP et contre-conserver les lames pendant 5 min (110 μL par lame). Lavez les lames avec de l’eau UP (2x) et éliminez l’excès d’eau en séchant les bords des lames. Assemblez les couvercles sur les glissières à l’aide d’un support de montage et stockez-les à RT dans l’obscurité.

7. Numérisation

REMARQUE: La numérisation des diapositives a été effectuée à l’aide d’un système d’imagerie automatisé multispectral (voir la table des matériaux).

  1. Assemblez les glissières dans le support et chargez-les dans le scanner dans l’ordre souhaité.
    REMARQUE: Il est recommandé d’inclure une lame témoin dans laquelle aucun fluorophore ou DAPI n’est utilisé pendant la coloration immunohistochimique. Cette lame sera utilisée comme témoin de la floraison intrinsèque (autofluorescence (AF)) du tissu.
  2. Après avoir lancé le logiciel de numérisation de diapositives, sélectionnez Modifier le protocole sur la page d’accueil. Créez un nouveau protocole abordant le nom,le mode d’imagerie,le type de balayage multispectral à effectuer(4 à 7 canaux)et l’étude(répertoire).
    REMARQUE: Pour modifier les paramètres par défaut des bandes analysées, sélectionnez/désélectionnez les filtres souhaités à l’aide de la fonction Sélectionner les bandes de balayage
  3. Passez à l’exposition à l’analyse et au support de charge,puis sélectionnez le support pour la configuration du protocole. Sélectionnez Prendre une vue d’ensemble pour détecter le tissu sur la diapositive. Choisissez une diapositive affichée sur le supportet sélectionnez une zone spécifique du tissu avec le curseur rouge pour le mettre en vue réelle dans la fenêtre de gauche de l’écran.
  4. Sélectionnez le filtre DAPI, puis cliquez sur Autofocus ou ajustez manuellement le curseur Hauteur de scène pour mettre au point le champ d’intérêt. Cliquez sur Autoexpose pour permettre au système de trouver la meilleure exposition pour ce filtre/bande.
    REMARQUE: Le temps d’exposition pour chaque filtre est réglé à 12 ms. Après avoir exposé automatiquement le système, affinez le temps d’exposition pour une meilleure estimation. Il est également possible de remplacer la valeur d’exposition automatique en tapant une valeur manuellement dans la cellule en surbrillance.
  5. Répétez les étapes ci-dessus pour tous les filtres du protocole. Si nécessaire, modifiez les emplacements et/ou les diapositives pour trouver les meilleurs signaux pour régler les expositions.
    REMARQUE: Si le tissu est surligné en rouge en vue réelle, le signal fluorescent du filtre analysé est saturé et l’auto-exposition doit être répétée.
  6. Une fois les paramètres d’exposition établis, cliquez sur le bouton Précédent et enregistrez le protocole. Sur la page d’accueil du logiciel (voir la table des matériaux),sélectionnez Numériser les diapositives.
  7. Empilez tous les supports à numériser dans le Slide Carrier Hotelet prenez note de l’ordre des diapositives pour attribuer leur identifiant dans le système.
    REMARQUE: Sur l’écran du logiciel, chaque support sera lié à un emplacement contenant 4 diapositives.
  8. Pour configurer plusieurs diapositives avec les mêmes paramètres, cliquez sur Configurer les tâches, et sélectionnez un ou plusieurs emplacements avec l’option Uchanterles mêmes règles pour les mêmes diapositives. Une fois que les diapositives d’édition s’ouvrent, configurez : Tâches, Étudeet Protocole,puis cliquez sur OK.
  9. Étiquetez chaque diapositive en cliquant sur l’icône Emplacement et tapez un nom dans la cellule ID de diapositive. Cliquez sur Scan pour lancer la numérisation.
    REMARQUE: Une fois que l’icône de la fente devient bleue et que les diapositives sont marquées d’une flèche bleue, le transporteur a toutes les règles et est prêt à être scanné. Il est possible d’enregistrer les ID de diapositive, les études, les protocoles et les tâches en cliquant sur le bouton Enregistrer la configuration.

8. Analyse

REMARQUE: Le protocole ci-dessous illustre la méthode d’analyse du phénotype.

  1. Préparation de l’image
    1. Pour préparer les images en vue de leur analyse, ouvrez le logiciel de visualisation (voir la table des matériaux),puis sélectionnez Charger les diapositives. Sélectionnez les scans souhaités pour le projet de formation sur le côté droit de l’écran.
    2. Pour chaque numérisation, cliquez sur Tampon, puis choisissez Projet dans la zone Sélectionner pour : Définir un tampon de taille 1 x 1 dans le champ d’image à utiliser ultérieurement comme modèle pour l’analyse de la formation. Observez que ce timbre sera marqué comme un carré rouge.
      Remarque : Le nombre d’annotations de tampon pour le projet est arbitraire. Il est recommandé d’en générer un pour le balayage de fluorescence intrinsèque et quelques autres qui sont généralement représentatifs de la distribution du signal dans le tissu.
    3. Enfin, ouvrez tous les scans de l’expérience. Pour chacun d’eux, cliquez sur Tampon, et cette fois, choisissez l’option Lot dans la case Sélectionner pour: Placer un tampon circonscrivant chaque explant.
      REMARQUE: Cette fois, les timbres seront marqués comme des carrés verts et seront requis une fois l’analyse par lots lancée. Choisissez la taille appropriée pour les timbres (1 x 1, 2 x 2, 3 x 3) et évitez le chevauchement des timbres, ce qui générerait des données dupliquées dans le fichier exporté.
  2. Analyse de la formation
  3. Lancez le logiciel pour l’analyse (voir la table des matériaux)et créez un nouveau projet : Sélectionnez Fichier | Nouvelle | Projet.
  4. Tapez un nom dans la zone Nom du projet et configurez le type de projet.
    REMARQUE: Les expériences ont été réalisées en utilisant les spécifications suivantes: segmentation tissulaire entraînable; segmentation cellulaire adaptative; phénotypage.
  5. Charger les scans contenant les tampons pour la formation : Fichier | Ouvrir | Image. Dans la vue monomode,parcourez les images et sélectionnez les scans avec fluorescence intrinsèque.
  6. Cliquez sur le bouton Autofluorescence (AF) et, à l’aide du sélecteur d’autofluorescence,dessinez sur une partie non colorée du tissu. Cliquez sur Préparer les images pour permettre au logiciel de soustraire l’intensité de la fluorescence intrinsèque de toutes les images téléchargées pour l’entraînement.
  7. Cliquez sur le bouton Modifier les marqueurs et les couleurs, puis entrez les noms des marqueurs dans la case associée à leur fluorophore. Cliquez sur l’étape Segment Tissue en haut de l’écran pour ouvrir la fenêtre Tissue Segmentation Training.
  8. Dans la fenêtre Catégories de tissus, tapez le nom des catégories de tissus dans lesquelles segmenter les images (par exemple, Tumeur, Stroma, Arrière-plan, Nécrose).
  9. Dans la fenêtre Formation à la segmentation tissulaire, cliquez sur le bouton Dessiner et dessinez des régions autour de groupes de cellules pour définir une catégorie de tissus d’intérêt. Par exemple, pour définir une zone tumorale, dessinez une région autour d’un groupe de cellules tumorales. Passez à la catégorie suivante et répétez le processus de dessin.
    REMARQUE: Il est recommandé de dessiner des régions dans la plupart des images téléchargées pour la formation. Il est également possible d’affiner la formation en éditant l’échelle de motif et la résolution de segmentation dont les détails sont mieux décrits dans le manuel d’utilisation.
  10. Après avoir défini les régions d’entraînement, procédez à Train the Tissue Segmenter.
    REMARQUE: Pendant le processus de formation, le logiciel affiche le pourcentage de précision de la segmentation tissulaire. Pour des résultats optimaux, il est recommandé que la segmentation des tissus soit précise à au moins 90%. Une fois le segmenteur stabilisé, cliquez sur le bouton Terminé.
  11. Pour voir le masque Catégorie de tissu sur toutes les images, cliquez sur le bouton Segmenter tout.
  12. Après avoir vérifié la qualité de la segmentation des tissus, redessinez les régions d’entraînement autour des zones qui ont été mal classées et réentraînez la segmenteuse tissulaire jusqu’à ce que le processus réussisse.
  13. Cliquez sur l’étape Segmentation des cellules dans la barre d’étapes en haut de la fenêtre pour poursuivre l’analyse.
  14. Choisissez les compartiments cellulaires à segmenter : Noyaux, Cytoplasmeet/ou Membrane.
    REMARQUE: Comme la segmentation cellulaire adaptative ne peut détecter que les cellules avec un signal nucléaire, ne désélectionnez pas les noyaux. Bien qu’il soit également possible de segmenter le cytoplasme et/ou la membrane, il est recommandé de choisir d’abord le composant nucléaire le plus fort et le plus abondant (par exemple, le DAPI).
  15. Configurez le composant nucléaire à l’aide du curseur Intensité typique pour ajuster le seuil utilisé pour détecter les pixels nucléaires. Prenez note de la fenêtre d’aperçu qui s’ouvre et fournit des commentaires en direct lorsque le seuil est ajusté.
    REMARQUE: Ce seuil est adaptatif et est mesuré par rapport à l’arrière-plan environnant. Augmentez cette valeur si trop d’arrière-plan est détecté comme nucléaire. Réduisez cette valeur si des noyaux faibles sont manqués. Utilisez le bouton Afficher/Masquer les régions pour activer et désactiver les masques de segmentation et vérifier si les pixels corrects sont détectés comme nucléaires.
  16. Pour fractionner des grappes de pixels nucléaires, utilisez le panneau Fractionnement des composants nucléaires. Choisissez le bouton qui décrit le mieux la qualité de coloration des noyaux. Ensuite, utilisez la barre de défilement pour ajuster la sensibilité de fractionnement, en gardant à l’esprit que des valeurs plus faibles entraîneront plus de fractionnement.
  17. Cliquez sur le bouton Segmenter tout pour segmenter toutes les images. Si le résultat n’est pas précis, modifiez les paramètres et rééquencez le logiciel jusqu’à ce qu’une segmentation satisfaisante soit obtenue.
  18. Passez à la dernière étape de l’analyse : Phénotypage. Dans le panneau Phénotypes, ajoutez la liste des phénotypes à détecter et tapez le nom dans la zone de texte correspondante. Cliquez sur le bouton Modifier les phénotypes, sélectionnez une cellule particulière pour afficher un menu déroulant et choisissez le phénotype correspondant.
    REMARQUE: Au moins cinq cellules pour chaque phénotype sont nécessaires pour entraîner le classificateur. Désactiver la visualisation des noyaux permet une meilleure visualisation du phénotype cellulaire à attribuer.
  19. Une fois la sélection pour la formation terminée, cliquez sur le bouton Classificateur de train.
    REMARQUE: Le logiciel classera chaque cellule de l’image, et chaque fois que des erreurs de classification se produisent, il est possible de modifier le phénotype des cellules et de répéter l’entraînement du classificateur. Enregistrez le projet avant de procéder à l’analyse par lots et cliquez sur Exporter dans la barre d’outils en haut de l’écran.
  20. Sélectionnez l’onglet Analyse de Bath dans le menu de gauche, puis chargez le projet dans la zone Algorithme de traitement par lots ou Projet.
  21. Cliquez sur Options d’exportation pour créer des répertoires distincts pour chaque image, et avec le bouton Parcourir, naviguez pour trouver l’emplacement pour exporter les données. Cliquez sur toutes les options des Images et Tableaux à exporter.
  22. Sur le côté droit de l’écran, cliquez sur Ajouter des diapositives et chargez toutes les images contenant des tampons pour les lots préalablement préparés (étape 7.3). Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer l’analyse par lots et traiter un tampon à la fois, en exportant les données correspondantes.

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Résultats

L’imagerie multispectrale des coupes histologiques colorées par mIF permet l’identification et le phénotypage des populations cellulaires individuelles et l’identification des composants tumoraux et stromaux dans l’explant TME (Figure 2). L’imagerie multispectrale est particulièrement utile pour l’analyse des tissus à forte autofluorescence intrinsèque, tels que les tissus à forte teneur en collagène, car elle permet de déconfléchir le signal d’autofluorescence des autres signaux et de l’exc...

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Discussion

Cet article décrit les méthodes de génération, de traitement médicamenteux et d’analyse des PDE et met en évidence les avantages de la plate-forme en tant que système de modèle préclinique. La culture ex vivo d’une tumeur fraîchement réséquée, qui n’implique pas sa déconstruction, permet la rétention de l’architecture tumorale13,24 et donc, les interactions spatiales des composants cellulaires dans le TME ainsi que l’hétérogénéité intratumorale. Cette méthode mon...

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Déclarations de divulgation

Rien à divulguer

Remerciements

Nous remercions les chirurgiens et les pathologistes des hôpitaux universitaires de Leicester NHS Trust pour avoir fourni du tissu tumoral réséqué chirurgicalement. Nous remercions également l’installation d’histologie de Core Biotechnology Services pour son aide au traitement des tissus et à la section des blocs de tissus FFPE et Kees Straatman pour son soutien à l’utilisation du Vectra Polaris. Cette recherche a été soutenue et financée par le consortium Explant composé de quatre partenaires : l’Université de Leicester, l’unité de toxicologie du MRC, Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories et LifeArc. Un soutien supplémentaire a été fourni par le CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Le financement des OGM, des CD et des NA a été fourni par le programme Catalyst de Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066), qui est soutenu par un financement de Pfizer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueSigma320099Réactif de coloration
Diluant / Bloc d’anticorps, 1xPerkin Elmer ARD1001EADiluant/tampon de blocage d’anticorps
Barnstead NANOpure DiamondBarnsteadUltra Pure (UP) H2O machine
Acide citrique monohydratéSigma-AldrichC7129Réactif pour tampon de citrate
Costar Multiple Well Cell Culture PlatesCorning Incorporated35166 plaques multipuits
DAPI DilactateLife TechnologiesD3571
100 x 17 mm Plat, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific150350Plat de 100 mm de diamètre pour la culture tissulaire
DMEM (1x) Dubelcco’s Modified Eagle Medium + 4,5 g/L de D-Glucose + 110 mg/mL de pyruvate de sodiumGibco (Life Technologies)10569-010Milieu de culture tissulaire (500 mL)
Montant DPXVWR360294HMilieu de montage
DPX montantMerck6522Milieu de montage
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-Aldrich3609Réactif pour tampon TE
ÉosineCellPathRBC-0100-00ARéactif de coloration
Sérum de veau fœtalGibco10500-064la culture tissulaire moyen
37 % FormaldéhydeFisher (Acros)11969001010 % Formalin
iGenix, four à micro-ondes IG2095iGenixIG2095Micro-ondes utilisé pour le titrage antigénique
alcool méthylé industriel (IMS)Genta Medical19905099 % d’alcool industriel dénaturé (IDA)
InForm Logiciel avancé d’analyse d’imagesAkoya BiosciencesInForm
Leica ASP3000 Tissue ProcessorLeica BiosystemsAutomated Tissue Processor
Leica Arcadia H et CLeica BiosystemsBain de cire d’enrobage
Leica RM2125RTLeica BiosystemsMicrotome rotatif
Leica ST4040 Colorateur linéaireLeica BiosystemsH& E colorant
Mayer’s HaematoxylinSigmaGHS132-1LRéactif de coloration
Inserts de culture cellulaire millicellule, 30 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; mMerck MiliporePICMORG50Disque d’insertion de culture organotypique
Novolink Polymer Detection SystemLeica BiosystemsRE7150-KDAB staining kit
OPAL 480Akoya BiosciencesFP1500001KTFluorophore avec diluant de diluant de sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
<>OPAL 520Akoya BiosciencesFP1487001KTFluorophore avec diluant < sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
>OPAL 570Akoya BiosciencesFP1488001KTFluorophore avec diluant < sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
>OPAL 620Akoya Biosciences FP1495001KT Fluorophoreavec diluant < sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
>OPAL 650 Akoya BiosciencesFP1496001KTFluorophore avec diluant au sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
< fort>OPAL 690Akoya BiosciencesFP1497001KTFluorophore avec diluant au diluant de diméthylsulfoxyde de diméthyle (DMSO)
OPAL 780 / Réactif OPAL TSA-DIG Akoya BiosciencesFP1501001KTFluorophore avec diluant au diluant au diluant de diméthylsulfoxyde de diméthyle (DMSO) et réactif TSA-DIG
Polymère Opal HRP Ms Plus Rb, 1xPerkin ElmerARH1001EApolymère HRP
solution de pénicilline/streptomycineFisher Scientific11548876Pour une utilisation dans le milieu de culture tissulaire
PhenoChart Entire Slide Contextual ViewerAkoya BiosciencesPhenoChart Viewer logiciel pour images numérisées
Comprimés salins tamponnés au phosphateThermo Scientific OxoidBR0014GPBS
strong>1x Plus Amplification DiluantPerkin ElmerFP1498Diluant fluorophore
Prolong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36961Montage medium
Slide CarrierPerkin ElmerPour charger les diapositives dans le Slide Carrier Hotel pour les numériser avec Vectra Polaris
Sodium ChlorideFisher ScientificS/3160/6310 % Formalin
Sodium Hydroxide pelletsFisher ScientificS/4920/53Réactif pour tampon de citrate
Tenatex Toughened Wax - Rose (500 g)KEMDENT1-601Cire dentaire surface
Thermo Scientific  ; Shandon Sequenza Rack de lames pour centre d’immunocolorationFisher10098889Support pour lames et clips de diapositives
Thermo Scientific Shandon Plastic CoverplatesFisher Scientific11927774 Clips dediapositives
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma-Aldrich252859Réactif pour tampon TE
VectaShieldVecta LaboratoriesH-1000-10Montage medium
Vectra Polaris Slide ScannerPerkin ElmerVectra PolarisScanner de diapositives
XyleneGenta MedicalXYL050Agent déparaffinant
Pour < Scientific

Références

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