Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Temperaturstyret samling og karakterisering af en dråbe interface Bilayer

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Denne protokol beskriver brugen af et feedback temperaturstyret varmesystem til at fremme lipid monolayer samling og dråbe interface bilayer dannelse for lipider med forhøjede smeltetemperaturer, og kapacitance målinger til at karakterisere temperatur-drevet ændringer i membranen.

Abstract

Dråben interface bilayer (DIB) metode til samling af lipid bilayers (dvs. DIBs) mellem lipid-coated vandige dråber i olie giver vigtige fordele versus andre metoder: DIBs er stabile og ofte langvarige, bilayer område kan vendes, folder asymmetri er let kontrolleres via dråbe kompositioner, og væv-lignende netværk af bilayers kan opnås ved at vedlægge mange dråber. Dannelse af DIB'er kræver spontan samling af lipider i lipidmonomer med høj densitet på dråbernes overflader. Mens dette sker let ved stuetemperatur for fælles syntetiske lipider, en tilstrækkelig monolayer eller stabil bilayer undlader at danne på lignende betingelser for lipider med smeltepunkter over stuetemperatur, herunder nogle cellulære lipid ekstrakter. Denne adfærd har sandsynligvis begrænset sammensætningen - og måske den biologiske relevans - af DIB'er i modelmembranundersøgelser. For at løse dette problem præsenteres en eksperimentel protokol for omhyggeligt at opvarme oliereservoiret, der er vært for DIB-dråber og karakterisere virkningerne af temperatur på lipidmembranen. Specifikt viser denne protokol, hvordan man bruger en termisk ledende aluminiumsarmarmatur og resistive varmeelementer, der styres af en feedbacksløjfe til at ordinere forhøjede temperaturer, hvilket forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sæt lipidtyper. Membranens strukturelle egenskaber samt lipidernes termotropiske faseovergange, der omfatter bilayeren, kvantificeres ved at måle ændringerne i DIB's elektriske kapacitance. Sammen kan denne procedure hjælpe med at evaluere biofysiske fænomener i modelmembraner over forskellige temperaturer, herunder bestemmelse af en effektiv smeltetemperatur (TM) for multikomponent lipidblandinger. Denne evne vil således give mulighed for tættere replikation af naturlige faseovergange i modelmembraner og tilskynde til dannelse og brug af modelmembraner fra et bredere skår af membranbestanddele, herunder dem, der bedre fanger heterogeniteten af deres cellulære modstykker.

Introduction

Cellulære membraner er selektivt gennemtrængelige barrierer bestående af tusindvis af lipid typer1, proteiner, kulhydrater og steroler, der indkapsler og underinddeler alle levende celler. At forstå, hvordan deres kompositioner påvirker deres funktioner og afslører, hvordan naturlige og syntetiske molekyler interagerer med, overholder, forstyrrer og translokerer cellulære membraner, er derfor vigtige forskningsområder med vidtrækkende konsekvenser inden for biologi, medicin, kemi, fysik og materialeteknik.

Disse mål for opdagelse direkte drage fordel af gennemprøvede teknikker til at samle, manipulere og studere model membraner, herunder lipid bilayers samlet fra syntetiske eller naturligt forekommende lipider-at efterligne sammensætning, struktur og transport egenskaber af deres cellulære kolleger. I de senere år har dråbe interface bilayer (DIB) metode2,3,4 til opførelse af en planar lipid bilayer mellem lipid-belagt vanddråber i olie fået betydelig opmærksomhed5,6 ,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, og har vist praktiske fordele i forhold til andre tilgange til modelmembrandannelse: DIB-metoden er enkel at udføre, kræver ingen avanceret fabrikation eller forberedelse (f.eks. "maleri") af et substrat til at støtte membranen, giver konsekvent membraner med overlegen levetid, giver mulighed for standard elektrofysiologi målinger, og forenkler dannelsen af modelmembraner med asymmetriske folder sammensætninger3. Fordi bilayer former spontant mellem dråber og hver dråbe kan skræddersys i position og makeup, DIB-teknikken har også tiltrukket sig stor interesse for at udvikle celleinspirerede materialesystemer, der bygger på brugen af stimuli-responsive membraner18,24,25,26,27,28,29, afbalanceret opdeling og transport14,30,31og vævslignende materialer17,23,32,33,34,35,36.

Størstedelen af de offentliggjorte forsøg med modelmembraner, herunder forsøg med DMB'er, er blevet udført ved stuetemperatur (RT, ~20-25 °C) og med en håndfuld syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC osv.). Denne praksis begrænser omfanget af biofysiske spørgsmål, der kan studeres i modelmembraner, og baseret på observation kan den også begrænse de typer lipider, der kan bruges til at samle DIB'er. For eksempel samler en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, ikke tætpakkede monolag eller danner DIB'er ved RT37. DIB-dannelse ved stuetemperatur har også vist sig vanskelig for naturlige ekstrakter, såsom ekstrakter fra pattedyr (f.eks. hjernens samlede lipidekstrakt, BTLE)38 eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)37, som indeholder mange forskellige typer lipider og stammer fra celler, der bor ved forhøjede temperaturer (37 °C). Aktivering af undersøgelse af forskellige sammensætninger giver således mulighed for at forstå membranmedierede processer under biologisk relevante forhold.

At hæve oliens temperatur kan tjene to formål: det øger monolayersamlingens kinetik, og det kan forårsage lipider at gennemgå en smeltende overgang for at nå en flydende uorganiseret fase. Begge konsekvenser støtte i monolayer samling39, en forudsætning for en DIB. Ud over opvarmning til bilayerdannelse kan afkøling af membranen efter dannelsen bruges til at identificere termotropiske overgange i enkelt lipid bilayers38, herunder dem i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE), der kan være vanskelige at opdage ved hjælp af kalorimetri. Ud over at vurdere termotropiske overgange af lipider kan der anvendes præcist varierende DIB-temperatur til at studere temperaturinducerede ændringer i membranstrukturen38 og undersøge, hvordan lipidsammensætning og fluiditet påvirker kinetik hos membranaktive arter (f.eks. poredanne peptider og transmembranproteiner37), herunder pattedyrs- og bakteriemodelmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).

Heri vil en beskrivelse af, hvordan man samler et modificeret DIB-oliereservoir og driver en feedback-temperaturregulator for at muliggøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer højere end RT, forklares. Adskilt fra en tidligere protokol40er der medtaget eksplicitte detaljer om integration af instrumentering, der er nødvendig for måling og styring af temperatur parallelt med montering og karakterisering af DIB i oliereservoiret. Proceduren vil således gøre det muligt for en bruger at anvende denne metode til at danne og studere DIB'er på tværs af en række temperaturer i forskellige videnskabelige sammenhænge. Desuden giver de repræsentative resultater specifikke eksempler på de typer målbare ændringer i både membranstruktur og iontransport, der kan forekomme, efterhånden som temperaturen varieres. Disse teknikker er vigtige tilføjelser til de mange biofysiske undersøgelser, der kan designes og udføres effektivt i DIB'er, herunder undersøgelse af kinetik af membranaktive arter i forskellige membransammensætninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opvarmet armatur forberedelse

  1. Der samles 2 stykker 1 mm tykt isolerende gummi trimmet til henholdsvis 25 mm x 40 mm i bredde og længde, 2 stykker af et 6 mm tykt gummi, der også er 25 mm x 40 mm, en forberedt aluminiumsbasearmarmatursamling og et akryloliereservoir, der passer ind i visningsvinduet i aluminiumsbasisarmaturet (se figur S1, S2 og S3 for detaljer om fabrikation og et eksploderet syn på samling). Forbered aluminium armatur først ved at fastgøre til bunden af armaturet et glas coverslip visning vindue med UV helbredes klæbemiddel og vedhæftning 1 resistiv varmeelement til toppen af hver 25 mm x 25 mm side flange af armaturet.
  2. Placer de tyndere gummistykker på mikroskopets stadie, således at den lange kant af hvert stykke tanger til sceneåbningen som vist i (Figur 1).
  3. Placer aluminium-base armaturet på toppen af de isolerende puder med visningsvinduet på armaturet centreret over den objektive linse. Korrekt justering er nødvendig for at billed de tilsluttede dråber.
  4. Placer et tykkere stykke gummi oven på hvert resistivt varmeelement, og brug et mikroskopstadieklip til at holde det på plads. Disse stykker beskytter varmeelementerne mod skader forårsaget af sceneklemmerne og isolerer mod utilsigtet elektrisk kortslutning mellem varmeelementerne og både aluminiumsarmaturet og mikroskopstadiet.
  5. Bøj forsigtigt måleenden af et termoelement for at opnå en vinkel på 90° ved ~4 mm fra enden.
  6. Sæt termoelementets bøjede spids ind i nederste venstre hjørne af aluminiumsarmaturet, og fastgør den forsigtigt med låseskruen.
  7. Placer akrylbeholderen i aluminiumsarmaturets brønd. Dette gøres, før der tilsættes hexadecaneolie til brønden (trin 1.8) i aluminiumsarmaturet for at minimere risikoen for at fange luftbobler mellem visningsvinduet og bunden af akrylbeholderen, hvilket kan blokere visningen af dråberne.
    BEMÆRK: Olie, der tilsættes til aluminiumsarmaturets visningsrum, bruges til at matche akryl- og glasindekset for klarere billeddannelse af dråberne i akrylbeholderen. Således er det værd at bemærke, at olie i brønden af aluminium armaturet ikke kontakte indholdet af akryl reservoir og streng rengøring af aluminium armaturet er ikke påkrævet.
  8. Dispenser ~ 1.000 μL hexadecane olie i brønden af aluminium armatur (dvs. mellem væggene i akryl reservoir og aluminium armatur), passe på ikke at overfylde. Olien niveau i brønden af aluminium armaturet bør være så højt som tilladt at maksimere overfladeareal for varmeoverførsel, uden at olien til at spilde over kanterne af armaturet på mikroskop fase eller objektiv linse.
  9. Der dispenseres ~1.000 μL hexadecaneolie i akrylbeholderen, samtidig med at man forbliver opmærksom på ikke at overfylde.
    BEMÆRK: Akrylbeholderen skal altid rengøres grundigt mellem forsøgene. Brugeren skal ansætte et regiment bestående af successive skylninger med ethylalkohol og deioniseret vand efterfulgt af tørring i en desiccator skål i over 12 timer.

Figure 1
Figur 1:Opvarmet scenemontering. Billeder viser samlingen af den termisk ledende armatur og oliereservoir til DIB dannelse; under hvert billede identificerer det tilsvarende trin i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Instrumentering til samtidig feedback temperaturkontrol og elektrisk karakterisering af en DIB

BEMÆRK: Denne protokol integrerer følgende instrumenter til aktivering af feedback temperaturstyring og samtidig elektrisk karakterisering af en DIB: en pc (PC) med to tilgængelige USB-forbindelser (Universal Serial Bus), en patch clamp forstærker parret med et dedikeret dataopsamlingssystem (DAQ-1), en bølgeformgenerator, en anden programmerbar DAQ (DAQ-2) med spændingsudgangs- og temperaturinputmoduler og en strømforsyning / forstærker. Følgende trin beskriver de nødvendige forbindelser af disse instrumenter (som illustreret i figur 2a),der er nødvendige for at isolere måling og kontrol af temperatur fra samtidig elektrofysiologi af en DIB. Der kan foretages erstatninger for tilsvarende instrumenter efter behov.

  1. Opret output- og inputforbindelser til DAQ-2-modulerne.
    1. Vælg to par skrueterminaler på spændingsudgangsmodulet for differentialspændingsforbindelser, og fastgør ledningsledninger til disse steder. Ulige nummerterminaler er almindelige jordforbindelser, og lige antal terminaler er ugrundede udgange, som vist i (Figur 2c). Tilslut hvert af disse to par blyledninger til separate skrueterminal-BNC-adaptere, og tilslut derefter hver adapter til et separat BNC-kabel, der bruges til at dirigere spændingssignaler til andre instrumenter.
      BEMÆRK: I denne opsætning tildeles differentialforbindelser ved terminal 0 og 1 til temperaturstyringsudgangen til effektforstærkeren, mens et andet par tilslutninger ved terminal 6 og 7 er udpeget til spændingseffekt, der skal sendes til dråberne via patchklemmeforstærkeren.
    2. Med henvisning til (Figur 2c) skal du vælge et sæt termoelementterminaler (f.eks. er terminal 2 og 3 udpeget som TC1-par) på termoelementindgangsmodulet og tilslutte termoelementledningerne til det.

Figure 2
Figur 2: Tilslutninger til systemledninger. Der vises et skema over de enheder og ledninger, der kræves til systemet, i (a), mens der findes et detaljeret kig på DAQ-2-forbindelserne i (b). Illustrationen i (c) viser vandige dråber på hydrogelbelagte elektroder nedsænket i olie til DIB-dannelse. De to elektroder er forbundet med henholdsvis jordforbundne og ugrundede (V+) forbindelser på hovedstykket på plasterklemmeforstærkeren. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Når der er oprettet elektriske forbindelser til DAQ-2-modulerne, skal du tilslutte DAQ-2-kabinettet til en pc via en USB-forbindelse og oprette forbindelse til en elektrisk strømkilde. Bekræft derefter vellykket driver- og softwareinstallation før brug med en kommerciel software.
  2. Konfigurer og tilslut en effektforstærker mellem DAQ-2 og modstandsvarmeelementer.
    1. Konfigurer forstærkeren til at fungere i forstærkningstilstand med fast forstærkning med en gevinst på 10X.
    2. Ved hjælp af en bananstik-BNC-adapter tilsluttes BNC-kablet fra terminal 0 og 1 på spændingsudgangsmodulet (Figur 2b) til indgangsforbindelserne på effektforstærkeren.
    3. Ved hjælp af ekstra BNC-adaptere og kabler tilsluttes effektforstærkerens udgangsterminaler til begge sæt varmeelementer, som er forbundet parallelt med hinanden og forstærkeren for at sikre, at begge elementer opretholder det samme spændingsfald under brug.
  3. Etablere nødvendige forbindelser til elektrofysiologiudstyret.
    1. Tilslut et BNC-kabel fra terminal 6 og 7 på spændingsudgangsmodulet (Figur 2b) til de bageste switchede eksterne kommando BNC-stik på bagsiden af plasterklemmeforstærkeren.
    2. Tilslut et andet BNC-kabel mellem waveform-generatorens udgang og Front Switch External Command-forbindelsen på bagsiden af patchklemmeforstærkeren.
      BEMÆRK: Disse to forbindelser giver alternative metoder til at generere spændingsbølgeformer, der påføres dråbeelektroderne via plasterklemmeforstærkeren. Bølgeformgeneratoren er især nyttig til generering af trekantede bølgeformspændinger, der bruges til at måle membrankatacitance. Brugeren kan beslutte, hvilken, hvis en af dem, der er nødvendige for deres egen ansøgning.
    3. Med et tredje BNC-kabel tilsluttes udgangen af den målte strøm, der er placeret på frontpanelet på plasterklemmeforstærkeren, til et tilgængeligt analogt BNC-stik på forsiden af DAQ-1.
    4. Med et fjerde BNC-kabel tilsluttes udgangen af målt membranspænding (på bagsiden af plasterklemmens forstærker) til et separat analogt indgangsstik på DAQ-1. Dette muliggør digitalisering af spændingen på tværs af elektroderne.
    5. Med de to dråbeelektroder tilberedt og understøttet på mikromanipulatorer som beskrevet i trin 7-9 i ref.40, tilslut elektroden fører til plasteret klemme headstage, som er fastgjort via kabel til plasteret klemme forstærker.
      BEMÆRK: Hovedbilledets rolle er at styre spændingen mellem elektroderne og måle den resulterende strøm, som omdannes til en proportional spænding, der får udgang af plasterklemmeforstærkeren til DAQ-1.
    6. Tilslut DAQ-1 til en pc via en USB-forbindelse, og tilslut de tilsvarende strømforsyningskabler til både patchklemmeforstærkeren og DAQ-1.
  4. Tænd alt måleudstyr.
    BEMÆRK: Måske er den vigtigste detalje i denne opsætning at sikre, at effektforstærkerudgangen (mA-A) er elektrisk isoleret fra hovedspærringsenheden på plasterklemmeforstærkeren, som bruger et følsomt kredsløb til at måle pA-nA-niveaustrømme i en DIB.

3. Feedback temperaturkontrol af dråbe interface bilayers

BEMÆRK: Følgende trin til betjening af feedbacktemperaturstyringssystemet er baseret på en brugerdefineret grafisk brugergrænseflade ( GUI), der er oprettet til implementering af proportional-integral (PI) feedback temperaturkontrol40,41 (se Supplerende kodningsfiler). Andre software- og kontrolalgoritmer kan bruges i stedet. En kopi af dette program leveres til læseren med de supplerende oplysninger til papiret, men brugeren er ansvarlig for at konfigurere det til deres eget udstyr og behov.

  1. Start DAQ-2-softwaren på pc'en, og åbn temperaturstyringsprogramfilen. Når den grafiske brugergrænseflade er åbnet, skal du åbne programmet igen ved at klikke på mappeikonet i nederste venstre hjørne af den grafiske brugergrænseflade og vælge temperaturkontrolprogrammet (Figur 3).
  2. Angiv de relevante numeriske værdier for den proportionale kontrolforøgelse (KP) og integreret kontrolgevinst (KI).
    BEMÆRK: KP og KI værdier på 0,598 og 0,00445, henholdsvis blev anset for at fungere godt i opsætningen. Disse værdier blev bestemt iterativt gennem simulering ved hjælp af en systemmodel, der inkorporerer parametre opnået fra målte åbne kredsløbsvarmeresponser (se figur 4). Under åben opvarmninger den foreskrevne varmeeffekt uafhængig af den målte temperatur. I modsætning hertil består opvarmning i lukket kredsløb af løbende at justere den påførte effekt til varmeapparaterne på en måde, der hjælper med at drive den målte temperatur tættere på den ønskede temperatur. Dette opnås heri ved hjælp af en PI-kontrolordning.
  3. Hvis du vil teste temperaturreguleringsskemaet, skal du angive en ønsket indstillet punkttemperatur (over rumtemperaturen) og derefter aktivere feedbacktemperaturstyring i den grafiske brugergrænseflade. Overhold det målte temperatursignal under feedback (lukket kredsløb), som vises i gui'en i de næste par minutter. Hvis den målte temperatur på olien i høj grad overskrider den ønskede temperatur, reagerer for langsomt på ændringer eller ikke konvergerer til det ønskede sætpunkt, skal brugeren justere kontrolgevinsterne for at opnå den ønskede lukkede kredsløbsydelse.
    BEMÆRK: Programmet definerer en mætningsgrænse for den effekt (og dermed spænding), der leveres til de resistive varmeelementer. For eksempel bruger to elementer, der rapporteres heri, op til 5 W strøm hver. Ledninger dem parallelt betyder, at det samlede strømforbrug ikke bør overstige 10 W. Brugeren rådes til at overveje den maksimale mængde strøm, der skal leveres til enhederne, og vide, at denne grænse kan påvirke den hastighed, hvormed systemet med lukket kredsløb reagerer på de ønskede temperaturændringer. Højere effektvarmeelementer muliggør hurtigere opvarmning og højere sætpunktstemperaturer, men kræver højere medfølgende strømme til opvarmning.
  4. Når systemet er indstillet til acceptabel ydeevne i lukkede kredsløb, skal du indtaste den ønskede olietemperatur for DIB-dannelse som sættepunkt i GUI.
    BEMÆRK: En indstillet punkttemperatur på 60 °C gav f.eks. Brugeren henvises andetsteds2,40 for protokoller, der forklarer DIB-samling mellem dråber hængende på wire-type elektroder og konfiguration af elektrofysiologiudstyr ved hjælp af patch clamp forstærkeren, DAQ-1 og elektrofysiologimålesoftware. Specifikt kan protokollen fra Najem, et al.40, følges nøje indtil trin 13. Ud over dette trin, en lidt anden tilgang er ansat til en vellykket monolayer og bilayer dannelse, når du bruger lipider, der kræver opvarmning for at fremme monolayer eller bilayer dannelse.
  5. Sænk spidsen af sølv/sølvchlorid (Ag/AgCl) elektroderne ned i olien, indtil de næsten rører bunden af akrylbeholderen. Denne placering af elektrodespidserne er afgørende for at holde dråben på elektroden i opvarmet olie, hvor konvektive strømme i olien er observeret for at løsne dråber fra de hydrogelbelagte elektroder (Figur 2c).
  6. Pipetter en 250 nL dråbe vandig lipidopløsning indeholdende 2 mg/mL BTLE, 100 mM kaliumchlorid (KCl) og 10 mM 3-(N-morpholino) propansulfonsyre (MOPS) på hver elektrodespids og lad dem inkubere i den opvarmede olie i mindst 10 minutter for at fremme monolayerdannelse.
  7. Dæk hovedbilledet og opvarmet scenearmatur med et jordet Faraday bur.
  8. Bring dråberne i blid kontakt ved langsomt at
    manipulere de vandrette positioner af elektroderne, indtil brugeren ser dråberne deformere fra kontakt eller begynde at fortrænge hinanden og vente et par minutter, indtil bilayer dannelse begynder. Hvis der efter flere minutter ikke er dannet en bilayer, kan dråberne tvinges mere sammen for at lette bilayerdannelse. Dannelsen af en fortyndet interfacial bilayer kan bekræftes ved visuel inspektion (figur 5a) eller ved at måle stigningen i amplituden af en firkantet bølgeformet kapacitive strøm fremkaldt af en bølgeformet generator, der udsender en 10 mV, 10 Hz trekantet spænding22. Lad bilayeren ekvilibrere i mindst 10 minutter for at nå et stabilt interfacialt område, ved den første dannelse og før efterfølgende karakterisering ved det første sætpunkt.
    BEMÆRK: Olietypen kan have en betydelig indvirkning på bilayerfortynding, membrantykkelse og kontaktvinkel mellem dråber. Generelt, jo mindre oliemolekylet er, jo lettere kan det forblive i bilayerens hydrofobe kerne besat af lipid acylkæder. Olieophobning øger både monolags- og bilayerspændinger og tykkelse og reducerer området og kontaktvinklen mellem dråber. Disse målinger betyder en svagere tilstand af vedhæftning. Større, bulkier molekyler udøver den modsatte effekt. For eksempel er squalen et bulkier molekyle end alkaner som hexadecane, som gør det muligt at være let udelukket fra mellem monolayers under bilayer udtynding. Som sådan er DIBs dannet i squalene tyndere, de viser højere kontaktområder og vinkler, og de udviser højere frie energier afformation 22,42 (et mål for dråbedråbe vedhæftning).

4. Karakterisering af temperaturafhængig adfærd i DIB'er

BEMÆRK: Mange fysiske processer kan studeres i DIB-baserede modelmembraner, herunder hvordan temperaturændringer påvirker membranens struktur og transportegenskaber. Følgende trin skal udføres efter vellykket bilayerdannelse ved en ønsket temperatur.

  1. Den nominelle kapacitance af membranen måles, samtidig med at temperaturen i oliebadet sænkes fra et bestemt punkt, der gør det muligt for bilayerdannelse at identificere termotropiske faseovergange af lipiderne i membranen38.
    1. Højreklik på temperaturgrafen på den grafiske brugergrænseflade, og ryd de viste data. Dette sikrer, at der er tilstrækkelig plads i bufferen til efterfølgende optagelser.
    2. Ved hjælp af bølgeformgeneratoren, der er tilsluttet plasterklemmeforstærkeren, skal du anvende en trekantet spændingsbølgeform (f.eks. 10 mV, 10 Hz) på tværs af DIB-elektroderne og registrere den inducerede strømrespons gennem bilayeren.
    3. Bilayeren afkøles ved at reducere den indstillede punkttemperatur i trin på 5 °C og vente mindst 5 minutter ved den nye konstante temperatur mellem temperaturændringerne, indtil den ønskede temperatur er opnået. Alternativt kan du prøve passivt at køle bilayeren ved at slukke for feedbackstyringssystemet. Vær dog opmærksom på, at forsøg med passiv køling fra 50-60 °C resulterede i højere satser for sammensmeltning.
    4. Når oliebadet og bilayeren er afkølet til den ønskede minimumstemperatur, skal du højreklikke på temperaturgrafen i GUI igen og eksportere temperaturdata kontra tid til en regnearkssoftware. Stop den aktuelle optagelse.
    5. Ud fra den målte strøm beregnes den nominelle kapacitance af kvadratbølgestrømmens respons i forhold til tiden i afkølingsperioden.
    6. Plot nominel kapacitance (C) versus temperatur (T) for at observere, hvordan membran kapacitance ændret. Find ikkemonomoniske ændringer i C versus T for at identificere TM.
      BEMÆRK: Nominel kapacitance kan beregnes ud fra amplituden af kvadratbølgestrømmen43 (| (1984|) ved hjælp af relationen | - Jeg | = C dv/dt, hvor dv/dt er lig med fire gange produktet af spændingsforstærkning (| V|) og frekvens (f) af den påførte trekantede spænding. Fra disse ligninger, C = | I|/(4| V|f).
  2. På samme måde skal man vurdere bilayerens kvasistatiske specifikke kapacitance (Cm) ved faste temperaturer ved successivt at øge temperaturen i oliebadet og bilayerområdet.
    1. Skift den indstillede punkttemperatur i trin på 10 °C ved hjælp af GUI'en, og lad systemet udjævne til den nye temperatur.
      1. Udfør trin 4.1.2 for at starte målingen af kapacitive strøm og optagelse.
      2. Skift bilayerområdet ved omhyggeligt at justere elektrodernes positioner ved hjælp af mikromanipulationerne (dvs. adskillelse af elektroderne reducerer bilayerområdet). Tillad, at kvadratbølgestrømmen når en stabil tilstands amplitude og indsamler billeder af DIB for at muliggøre beregning af membranområdet versus tiden ved hjælp af et kamera monteret på mikroskopet for at afbilde bilayeren set fra mikroskopstadiets blænde. Samtidig skal du tilføje et digitalt mærke i den aktuelle optagelsessoftware for at markere det tilsvarende tidspunkt for billedsamling.
        BEMÆRK: Mikromanipulationer giver mulighed for præcis kontrol af elektroderne og dermed blid kontakt mellem dråber. Grov manipulation af dråberne kan føre til et mislykket eksperiment ved sammensmeltning af dråberne eller ved at forårsage, at en dråbe falder af elektroden. Som diskuteret andetsteds22, bilayer område beregnes ud fra kontaktlængden mellem dråber, der vises som overlappende cirkler i et nederste billede. Dråbernes positioner og dimensioner og længden af kontaktlinjen kan beregnes ved hjælp af en billedbehandlingssoftware eller med andre videnskabelige programmeringsværktøjer.
      3. Gentag trin 4.2.1.2 mindst 4 gange for at få i alt 5 DIB-billeder og stabil tilstand regioner bilayer strøm.
    2. Gentag trin 4.2.1 ved hver ønsket temperatur.
    3. På de mærkede tidspunkter, der svarer til steady-state bilayer områder for erhvervede billeder, analysere de nuværende optagelser og DIB billeder til at udtrække C og A data for hver temperatur.
    4. Plot C versus A data for hver temperatur og beregne hældningen af en første ordens regression, som repræsenterer Cm af bilayer ved hver temperatur22.
    5. Afbildningsværdier på Cm fra trin 4.2.4 mod T.
    6. Undersøg Cm versus T-data for ikke-monotoniske variationer for at identificere smeltetemperaturer, TM.
  3. Vurder dynamikken i spændingsafhængig ionkanaldannelse ved at generere en dc spændingstrinindgang over bilayeren.
    1. Indstil Indledende spænding til den ønskede trinværdi i mV (f.eks. 100 mV).
    2. Indstil Endelig spænding og trinstørrelse til en højere værdi end det ønskede trin (f.eks. 110 mV slutspænding og 110 mV trinstørrelse).
    3. Angiv den ønskede varighedstid for trinindgangen i sekunder (f.eks. 90 s).
    4. Vælg den ønskede polaritet til trinindgangen (f.eks. positiv).
    5. Skift plasterklemmeforstærkeren for at sende kommandospændingen fra GUI/spændingsudgangsmodulet til hovedbilledet.
    6. Start aktuelle optagelser.
    7. Tænd for spændingen, og registrer den inducerede strømrespons, som skal udvise en S-formet reaktion på en kritisk spænding (f.eks. ~70 mV for 1 μg/mL Mz i 2 mg/mL BTLE).
  4. Separat kan dynamiske strømspændingsforhold for en membran opnås ved de ønskede temperaturer for at afsløre spændingsafhængige relationer, såsom ionkanaladfærd.
    1. Skift plasterklemmeforstærkeren for at sende kommandospændingen fra bølgeformgeneratoren til hovedbilledet, og start aktuelle optagelser.
    2. På bølgeformgeneratoren skal du udsende en kontinuerlig sinusformet bølgeform med en ønsket amplitude, offset og frekvens.
    3. Registrer den inducerede aktuelle respons på tværs af en eller flere cyklusser.
    4. Gentag som ønsket for forskellige sinus bølge amplituder og frekvenser og temperaturer.

Figure 3
Figur 3: Den gui for temperaturkontrol. Dette tal fremhæver og mærker de kritiske trin, der kræves for at bruge programmets GUI til at styre temperaturen i oliebadet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser, hvordan aluminiumsarmaturet og akryloliebeholderen fremstilles på mikroskopstadiet til DIB-dannelse. Montering trin 1.2-1.4 tjener til termisk at isolere armaturet fra scenen for mere effektiv opvarmning. Trin 1.5-1.7 viser, hvordan termoelementet fastgøres korrekt til armaturet, og placerer oliereservoiret, og trin 1.8 -1.9 viser anbefalede steder til udlevering af olie i disse stykker.

Figur 2 skitserer de komponenter, der anvendes til at etablere feedback temperaturkontrol og udføre elektriske målinger på en DIB: en pc, en fast forstærkningseffektforstærker, en patch klemme forstærker og et DAQ-system (eller tilsvarende instrument til anvendelse af spænding og måling af pA-nA-niveaustrømme), en anden DAQ med passende analoge indgange og udgange, en bølgeformgenerator og den samlede aluminiumsarmarmatur med tilhørende modstandsvarmere. DAQ-2 gør brug af to moduler (Figur 2b). Et 4-kanals, ±10 V, 16-bit analogt spændingsudgangsmodul bruges til at starte de uafhængige spændinger, der leveres til indgangen til effektforstærkeren (blå forbindelse i figur 2a) og en ekstern kommandoindgang på plasterklemmeforstærkeren (grøn forbindelse). Spændingsudgangsmodulet er begrænset af en maksimal udgangsstrøm på 46 mA og en maksimal udgangsspænding på 10 V, mens hvert varmeelement, der anvendes heri, bruger så meget som 5 W strøm (~ 180 mA max) ved en maksimal spænding på 28 V. Af denne grund blev strømforsyningen / forstærkeren inkluderet for at forforstærke udgangsspændingen og supplere den medfølgende strøm, der er nødvendig for at drive varmeelementerne (kablet parallelt) fastgjort til aluminiumsarmaturet. En 4-kanals, 24-bit termoelementinputenhed bruges til at digitalisere temperaturmålinger fra oliereservoiret nær DIB (gul forbindelse). Da termoelementets indgangsenhedsmodul tillader op til 4 termoelementer, kan brugeren overveje at overvåge temperaturer andre steder i armaturet. Hvis det gøres, skal de også overveje, hvilket signal eller hvilken kombination af signaler der bruges til sammenligning med den ønskede indstillede punkttemperatur i feedbacksløjfen.

Disse udgange og målte signaler styres via to software: 1) den brugerdefinerede GUI for temperaturstyring; og 2) software til måling af elektrofysiologi. Figur 3 viser et skærmbillede af den grafiske brugergrænseflade og indeholder anmærkninger til tilsvarende trin i protokollen. GUI'en bruges til at definere nøgleparametre (Set Point-temperatur, PI-kontrolgevinster, spændingsgrænser), sammenligne den målte temperatur med den indstillede punkttemperatur og beregne det kontrolsignal, der leveres til forstærkeren og derefter varmeelementerne, og registrere data om temperaturen og den anvendte spænding kontra tid. Dette program omfatter også evnen til at lede spændingen anvendes på DIB elektroder (Figur 2c) via plasteret klemme forstærker. Separat bruges målesoftware til at konfigurere målinger af både spændingen, der påføres DIB-elektroderne, og den inducerede strøm gennem lipid bilayeren. En spænding, der er proportional med DIB-strømmen, udsendes af plasterklemmeforstærkeren og sendes via BNC-kablet til DAQ-1 (forbindelsen vises ikke).

Figur 4 viser temperaturændringen og den absolutte elektriske effekt, der sendes til varmeapparaterne i forhold til tiden under både åbne og lukkede varmescenarier. For førstnævnte blev der anvendt en vilkårlig indgangsspænding svarende til ~5,2 W effekt på varmeapparaterne, hvilket resulterede i en eksponentiel temperaturstigning med en tidskonstant på ~ 125 s og en stabil tilstand ΔT ≈ 4,5 °C / W efter en indledende forsinkelse på ~ 20 s. Disse karakteristika ved open loop-systemet blev brugt til at konstruere en model af systemet med lukkede kredsløb i en simuleringssoftware (se figur S4 for detaljer), der kan bruges til at bestemme værdier for de proportionale og integrerede kontrolgevinster. De lukkede og simulerede modelresponser i figur 4 repræsenterer således de målte og simulerede reaktioner fra den indstillede PI-controller med KP- og KI-værdier på henholdsvis 0,598 og 0,00445 til en indstillet punkttemperatur på 20 °C højere end RT. Sammenlignet med open loop-sagen bekræfter både simuleringen og målingerne den øgede responshastighed i det lukkede kredsløbssystem (tidskonstant ~ 63 s). Reduktionen i opvarmningstid kommer på bekostning af højere indledende anvendt effekt. Alligevel forblev den ønskede indstillede punkttemperatur og den målte olietemperatur inden for 0,6 °C i stabil tilstand, hvilket blev anset for egnet til brug. Den samlede leverede effekt er begrænset i programmet under lukket kredsløbskontrol for ikke at overskygge den samlede effektgrænse på 10 W for de to varmeapparater.

Temperaturstyringssystemet blev brugt til at fremvise opløsningsmiddelets temperaturafhængighed i en DIB dannet af BTLE-lipider og dets indvirkning på membranens kapacitance (figur 5). BTLE lipider blev valgt til denne måling, fordi opvarmning er nødvendig for DIB-dannelse på grund af en lipidfaseovergang, der opstår mellem 35-42 °C38. Den heri beskrevne protokol blev udført for at indlede bilayerdannelse ved 60 °C. Efter membrandannelse og ækvilibrering kan temperaturen sænkes eller hæves efter behov for at karakterisere membranens reaktion. Figur 5a viser f.eks. Bemærk, at amplituden af den kapacitive strømbølgeform reduceres med mere end halvdelen, når temperaturen stiger, hvilket skyldes optagelsen af olie i membranens hydrofobe kerne. Denne ændring tykkere grænsefladen og ændrer sideværts spænding af bilayer22,37,38.

Dataene i figur 5b-dokumentet ændres i C (normaliseret ved kapacitancen ved 27 °C) i forhold til T på tværs af en komplet kølevarmecyklus efter den første bilayerdannelse ved 60 °C. Ligesom i figur 5a, som temperaturen stiger, falder kapacitancen. Hvad denne præsentation viser mere tydeligt er de ikkemonotiske ændringer, der opstår ved temperaturer mellem ~ 30-42 ° C, som repræsenterer den kollektive smeltetemperatur, TM, hvor lipidblandingen skifter mellem en væskebestilt og en væskeforseglet termotropisk fase. Den temperatur , hvor den ikkemonotiske ændring i kapacitance sker , svarer til en ændring i bilayertykkelsen fra udelukkelse af olie fra membranen38. Bemærk også, at hysteresen, der vises mellem varmecyklussen og kølecyklussen, skyldes irreversible ændringer i bilayerområdet, der opstår mellem efterfølgende cyklusser, som typisk blev udført 10 minutter fra hinanden.

På samme måde viser figur 6a, b , hvordan kvasistatiske målinger af C m ved forskellige temperaturer kan bruges til at identificere TM. Her varieres membranens område successivt ved manuelt at øge afstanden mellem dråbeelektroderne. Under dette forsøg skubbes dråberne først sammen for at fremme maksimalt membranområde forud for efterfølgende reduktioner i kontaktområdet med trinvise adskillelser mellem elektroderne. På hvert kontaktniveau vurderes bilayerens nominelle kapacitance ud fra den inducerede strøm, og dens område bestemmes ved billedanalyse. Plotte C versus A giver mulighed for en lineær regression, hvor hældningen repræsenterer værdien af Cm som vist i figur 6a. En gentagelse af denne procedure på tværs af flere temperaturer (figur 6b) viser, at Cm falder med næsten 50% ved temperaturer over TM, hvilket bekræfter en stigning i membranens hydrofobe tykkelse på grund af opvarmningsinduceret hexadecaneoptagelse (se figur S5 for fuldstændig C versus A-data). Ved højere temperaturer reducerer det ekstra opløsningsmiddel i membranen også det maksimale kontaktområde mellem dråberne og dermed maksimal nominel kapacitance. Reduktion af temperaturen vender disse effekter. DIB-billedet i figur 6c viser, at når temperaturen (25 °C) er et godt stykke under TM, kan membranen stabilt vedtage en meget klæbende tilstand - selv under spændingen af strakte dråber forårsaget af godt adskilte elektroder. Dette er resultatet af fuldstændig udelukkelse af hexadecane fra bilayeren, hvilket øger dråbernes vedhæftningsenergi. I denne tilstand kan bilayerområdet ikke ændres pålideligt gennem manipulation af elektroderne og hindrer evnen til nøjagtigt at måle specifik kapacitance (se figur S5 for flere detaljer).

Endelig viser de repræsentative data i figur 7, hvordan temperaturændringer kan påvirke adfærden hos poredannende arter, der skaber ionledende kanaler gennem en DIB. Monazomycin (Mz), et positivt ladet antibiotikum, der danner kation selektive kanaler gennem bilayer på tilstrækkelig transmembrane potentialer37,44, blev valgt for at demonstrere dette forhold. Disse målinger blev udført på en BTLE-baseret (2 mg/mL endelig koncentration i begge dråber) DIB oversået med Mz (1 μg/mL endelig koncentration i begge dråber). De strøm- kontra spændingsspor, der er vist i figur 7a, blev opnået ved at anvende sinusformede membranspændinger og måle den inducerede strøm ved to forskellige temperaturer; pilene og de efterfølgende tal i figur 7a hjælper med at visualisere de efterfølgende kvartaler af sinusoidspændingen med hensyn til tid. Denne type måling udføres ofte for at undersøge strømafhængigheden af strøm gennem ionkanaler. Dataene her viser, at en forøgelse af DIB's temperatur fra 27 °C til 45 °C får tærsklen for kanaldannelse til at stige fra ~ |100 mV| til ~|110 mV|. Denne ændring, der sandsynligvis er drevet af den højere membrantykkelse på grund af absorberet olie, viser, at energibarrieren for indsættelse er steget. Hysteresen i disse kurver, som betyder hukommelsesmodstand, kan være forårsaget af spændingsinducerede ændringer i enten bilayerområdet eller kinetik af Mz-kanaldannelse og inaktivering44.

For at hjælpe med at adskille disse faktorer i DIB'er kan forbigående ændringer i ionstrømmen måles som reaktion på en DC-trinspænding. Figur 7b viser den målte strømtæthed for den samme Mz-dopede BTLE-membran ved samme spændingsniveau (+90 mV) og to forskellige temperaturer (27 °C og 45 °C). Dataene viser tydeligt, at de kinetik af kanalen svar er helt forskellige. Især ved 27 °C udviser membranen en hurtigere og større stigning i strømmen, som derefter efterfølges af et forbigående henfald (sidstnævnte er et resultat af, at Mz-kanalerne translokerer over bilayeren til en inaktiv tilstand44). Reaktionen er meget mere dæmpet ved 45 °C, hvor den S-formede stigning i strømmen ikke fortsættes med et efterfølgende fald. Forskelle som disse er nyttige til at vurdere kinetik af kanalresponser og forstå, hvordan disse kan bidrage til membranens samlede dynamiske modstand.

Figure 4
Figur 4:Åben kredsløb kontra opvarmning med lukket kredsløb. Panel (a) sammenligner tidsresponserne for det målte og simulerede (Se SI) lukkede kredsløbssystem med et +20 °C temperaturtrin med opvarmningsresponset i åben sløjfe under fast anvendt effekt. Panel (b) viser den strøm, der spredes af hvert system. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Måling af kapacitance og varierende temperatur. Den typiske firkantede bølgeform strøm respons på en 10 mV, 10 Hz trekantet bølgeform input på en BTLE lipid membran gennemgår en fase overgang er vist i (a). Faseovergangen af lipider kan også ses i de områdemålingsdata, der vises over panelet (a). Kapacitance normaliseret ved indledende kapacitance ved 27 °C er vist i panelb) afbildet som funktion af temperaturen for en opvarmnings- og afkølingscyklus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Specifik kapacitancemålingspanel (a) viser nominel kapacitance versus bilayerområde opnået ved successive kontaktområder for to forskellige temperaturer. Lineære regressioner til hvert sæt bruges til at bestemme deres respektive værdier af CM. Panel (b) plotS CM versus T, mens panelet (c) viser den stabile kapacitive strøm bølgeform (venstre) og kontaktområde (højre) under forsøg på dråbe adskillelse ved 25 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Spændingsafhængig membranmodstand og Mz ionkanalkinetik kontra temperatur. Panel (a)   viser, hvordan forholdet mellem strømspænding og temperatur ændres for BTLE DIB'er dannet mellem dråber, der indeholder 1 μg/ml Mz. Pilene og tallene repræsenterer de efterfølgende dele af den anvendte sinusbølge. Forskellene i disse spor illustrerer, hvordan temperaturen ændrer spændingstærsklen for Mz indsættelse, hvilket identificeres som størrelsen af spændingen, hvor induceret strøm stiger kraftigt. På samme måde viser panel (b) virkningen af den forbigående strømrespons fremkaldt af en DC-trinspænding på 90 mV. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur S1: Aluminium armatur. Denne tegning viser de nødvendige dimensioner og funktioner til fremstilling af aluminiumsarmaturet, der er bunden af den opvarmede scene. De 25,2 mm X 26 mm flade pletter ved siden af oliebrønden er designet til at give mulighed for en maksimal mængde overfladekontakt mellem armaturet og varmeelementerne til varmeledning. Ligeledes blev aluminium valgt til grundarmaturet på grund af dets høje termiske ledningsevne. M3 X 0,5 mm skruehullet, der kaldes i udskriften, bruges til at sikre og placere termoelementet i oliebrønden. Klik her for at hente denne fil.

Figur S2: Akrylsubstrat. Akryl substratet er relativt simpelt stykke at fremstille, uden kritiske fremragende funktioner, bortset fra profilen. Den udvendige profil blev designet med Poka-åg i tankerne, så akryl substrat kun kan orienteres i armaturet på en sådan måde, at der er rigelig plads til termoelementet til at passe ind i oliebrønden. Klik her for at hente denne fil.

Figur S3: Opvarmet scenemontering. Der er givet et eksploderet udsyn til den samlede opvarmede fase for at hjælpe eksperimentatoren under den indledende opsætning. Vær også opmærksom på det område, der er fremhævet af den stiplede cirkel, da dette er den ideelle position til at fylde aluminiumsarmaturet med olie under protokoltrin 1.8. Klik her for at hente denne fil.

Figur S4: Åbn loop-data og Simulink-modelleringspanel. a) viser de åbne temperaturresponser på forskellige jævnstrømsniveauer, der blev anvendt til at vurdere systemets forsinkelsestid, td, tidskonstanten, τog opvarmningsforøgelsen i åbne kredsløb, α. Forsinkelsestiden repræsenterer tidsforskydningen, før temperaturen begynder at stige (~20 s). Hver værdi af τ (præget af *, ~125 s) defineres som den tid, der kræves for 63,2% af den samlede temperaturstigning. Panel (b) viser den konstante temperaturændring (∆T)i forhold til den anvendte effekt. Hældningen af de data, der er afbildet i (b), blev brugt til at beregne α, hvilket repræsenterer forholdet mellem temperaturændring pr. leveret effekt. Disse parametre blev brugt i den model, der vises i panel (c), og leveres som en supplerende fil til at justere PI-controlleren for at opnå en ønsket temperaturreguleringsrespons i lukket kredsløb. Klik her for at hente denne fil.

Figur S5: Yderligere specifikke kapacitancedata. De observationsområder, der er vist i figur 6a,er indsamlet på dette C M-datasæt. Dette område viser også den manglende evne til nøjagtigt at måle kapacitance ved temperaturer på 25 °C og derunder, derfor blev denne måling udelukket fra datasættet. De områdeændringer, der er nødvendige for en nøjagtig Cm-måling, kræver, at der påføres for stor kraft på dråberne fra mikromanipulatorerne, hvilket forårsager afskære forvrængning af dråbernes form og kontaktområde. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende kodningsfiler. Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet heri, indeholder instruktioner til montering og drift af et eksperimentelt system til styring af temperaturen på den olie og de dråber, der bruges til at danne DIB'er. Det er især gavnligt at muliggøre DIB-dannelse ved hjælp af lipider, der har smeltetemperaturer over RT. Desuden kan bilayertemperaturen manipuleres ved præcist at variere temperaturen i oliereservoiret for at studere virkningerne af forhøjede temperaturer på forskellige membranegenskaber og egenskaber, herunder kapacitance, område, tykkelse, inducerede termotropiske faseændringer, kinetik af membranaktive arter og energien ved vedhæftning af bilayergrænsefladen37,38.

Protokollen består af tre dele, inden den anvendes i en DIB-undersøgelse: 1) forberedelse og samling af den opvarmede scenearmatur; 2) tilslutning af de forskellige instrumenter; og 3) bekræfter passende temperaturkontrol med de valgte proportionale og integrerede kontrolgevinster. Vigtigst i del 2, skal brugeren sørge for at undgå fælles ledningsveje mellem produktionen af effektforstærker (>mA strømme) og plasteret klemme headstage (pA-nA strømme). En utilsigtet kort kan forårsage permanent skade på hovedbilledet. Derudover er det at sikre, at pc'en og alle instrumenter er forbundet til en fælles vekselstrømsplads, og brugen af et jordet Faraday-bur nær hovedbilledet og dråbeelektroderne hjælper med at minimere støj i bilayerstrømmålinger. Når opsætningen i del 2 er afsluttet, skal brugeren først vurdere oliebeholderens åbne varmerespons ved at anvende en fast spænding på varmeelementerne og registrere den efterfølgende temperaturstigning (som vist i figur 4a). Denne type eksponentiel respons kan bruges til at definere og simulere en simpel model af systemet med lukkede kredsløb for forskellige værdier af kontrolgevinster (se figur S4 for at få flere oplysninger). De kontrolgevinster, der rapporteres heri, gør det muligt for systemet hurtigt at opvarme til et ønsket temperaturniveau (~ 2 minutter) og med lidt overskridelse og opretholde sætpunktsværdien nøjagtigt. Men de specifikke gevinster, der kræves, afhænger af varmeelementernes effektniveau samt geometrien af armaturet, der understøtter oliereservoiret. Når passende værdier af kontrol gevinster er bestemt, og feedback kontrolsystem fungerer som ønsket, kan brugeren derefter begynde at samle og karakterisere en DIB.

Protokollen ændrer ikke processen med DIB-dannelse eller karakterisering, men der er begrænsninger og overvejelser. At hæve oliens temperatur kan påvirke, hvordan dråber hænger på elektroderne, på grund af reduktioner i monolayerspænding og olietæthed, der øger dråbesagging og konvektive strømme i olien, der kan flytte dråberne. Derfor foreslår protokollen at sænke elektrodernes spidser til nær bunden af substratet, således at dråber understøttes og holdes stille af akrylreservoiret. Brugeren bør vurdere, hvor meget substratet kan forvrænge dråberne (hvis det sænkes for langt), og overveje denne forvrængning ved beregning af bilayerområdet fra billeder af DIB'er som beskrevet andetsteds22.

Mens det beskrevne system er begrænset til opvarmning af oliebadet, kan en Peltier-køleanordning bruges i stedet for de resistive varmeelementer, hvis test ved temperaturer under RT er nødvendig. I dette tilfælde skal brugeren dog overveje frysepunktet i oliefasen. Mange alkaner fryser ved temperaturer, der er højere end 0 °C; hexadecane, der er beskrevet heri, fryser ved 18 °C. Hvis olien fryser, vil dråber ikke længere kunne flyttes, og en bilayer mellem dråber kan blive ustabil eller briste.

For en hidtil uprøvet lipidsammensætning er nøgle ukendt inkubationstiden og temperaturen, der kræves for at muliggøre tilstrækkelig monolagssamling på dråbernes overflader. Den generelle regel er at opvarme olien til en temperatur over TM, hvor lipidmobiliteten forbedres, hvilket giver mulighed for hurtigere lateral diffusion og strammere pakning ved olie-vand-grænsefladen45, og vente længe nok, så monolayer pakning ved olie-vand-grænsefladen er høj. Brugeren kan gennemgå offentliggjort litteratur eller overveje deres egne supplerende målinger for at bestemme passende tids- og temperaturværdier: Interfaciale spændingsmålinger på et vedhæng drop goniometer kan bruges til at vurdere den tid, der kræves til monolayermontering46, og differentialscanningskalorimetri bruges ofte til at identificere termotropiske overgange af lipider38. Eller en iterativ tilgang kan forfølges for at identificere passende tid og temperatur, hvor bilayerdannelsen er konsistent, membranen er stabil i mere end et par minutter, og bilayerens modstand er >1 GΩ. I nylige undersøgelser med E. coli total lipidekstrakt (ETLE)37 og BTLE38,47 fører en starttemperatur >50 °C konsekvent til stabil bilayerdannelse. På samme måde kan den minimale stabile temperatur efter DIB for en given lipidtype også variere mellem lipidvalg. F.eks . kan ETLE DIB'er afkøles til 25 °C37, mens DPPC-DPI'er med en enkelt komponent altid er samlet under TM~40 °C38. Observationen har vist, at BTLE DIBS viser, at 27 °C er en sikker minimumstemperatur for opretholdelse af en stabil bilayer.

Vores repræsentative resultater viser, at temperaturændringer i høj grad kan påvirke egenskaberne af den resulterende DIB. Dataene i figur 5 viser, at membranens nominelle kapacitance falder, efterhånden som temperaturen stiger. Fordi kapacitance, C, er direkte proportional med bilayer område, A, og omvendt proportional med tykkelse, d, som givet af

Equation 1, (1)

et fald i C kan manifesteres ved et fald i A, en stigning i d, eller begge dele (under forudsætning af en fast dielektrisk tilladelse, ε). Disse relationer motiverer brugen af kapacitancemålinger og DIB-billeder til at vurdere ændringer i C, Aog Cm versus temperatur for at afgøre, hvilke effekter der er signifikante. De data, der er medtaget i figur 5 og figur 6 for BTLE-DIB'er, viser, at både C og Cm (som repræsenterer forholdet ε/d) falder med næsten 50 %, efterhånden som temperaturen stiger fra 30 C til 60 C. Tilsammen tyder disse på, at højere temperatur fortykker bilayeren på grund af en øget opløselighed i lipidernes acylkæder i hexadecane48. Den ekstra olie i membranen kan også påvirke bilayerens interfaciale spænding og kontaktvinklen mellemdråberne 22,38. Disse effekter kan kvantificeres ved at analysere billeder af en DIB med brugerdefinerede tidsintervaller for at overvåge bilayerområdet og kontaktvinklen under opvarmning og afkøling.

Temperaturen favorability af olie i membranen kan også bruges til at vurdere termotropiske smeltetemperaturer af lipider og påvirke ionkanal kinetik. Smeltetemperaturen for en lipidblanding kan defineres ved at lokalisere nonmonotoniske ændringer i C versus T-relationer som i figur 6. De aktuelle målinger i figur 7 viser endvidere, at temperaturinducerede ændringer i fase (dvs. fluiditet) og tykkelse kan påvirke tærskelspændingen for indsættelse af ionophores som Mz. Disse fysiske foreninger er vigtige for at forstå ionkanaladfærd i modelmembraner, især i scenarier, der har til formål at replikere kropstemperaturmiljøer. De kan dog også være nyttige til at indstille bilayerens ledningsevne i applikationer som neuromorfe computerenheder47 For eksempel er øget kanalkinetik en ønskelig funktion, når man fremstiller enheder, der udviser hukommelsesmodstand, der har brug for at efterligne hjernens hastighed, funktionalitet og kortsigtede plasticitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Den finansielle støtte blev ydet af National Science Foundation Grant CBET-1752197 og Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Bioengineering Problem 170 teknik bioengineering lipid bilayer dråbe interface bilayer feedback temperaturkontrol kapacitance målinger ion kanal biovidenskab
Temperaturstyret samling og karakterisering af en dråbe interface Bilayer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter