Summary
Die Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels KryoEM ist für bestimmte Klassen von Proteinen und Komplexen zur Routine geworden. Hier wird diese Pipeline zusammengefasst (Probenvorbereitung, Screening, Datenerfassung und -verarbeitung) und die Leser werden auf weitere detaillierte Ressourcen und Variablen geleitet, die bei anspruchsvolleren Proben geändert werden können.
Abstract
Die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsfähige Technik zur Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mittels Einzelpartikelanalyse (SPA). Der Gesamtprozess beinhaltet i) die Vitrifizierung der Probe in einem dünnen Film, der auf einem KryoEM-Gitter liegt; ii) Screening der Probe zur Beurteilung der Partikelverteilung und der Eisqualität; iii) wenn das Gitter geeignet ist, das Sammeln eines einzelnen Partikeldatensatzes für die Analyse; und iv) Bildverarbeitung, um eine EM-Dichtekarte zu erhalten. In diesem Protokoll wird eine Übersicht für jeden dieser Schritte bereitgestellt, wobei der Schwerpunkt auf den Variablen liegt, die ein Benutzer während des Workflows ändern kann, und der Fehlerbehebung bei häufigen Problemen. Da der Fernbetrieb des Mikroskops in vielen Einrichtungen zum Standard wird, werden Variationen der Bildgebungsprotokolle beschrieben, um Benutzer bei einer effizienten Bedienung und Bildgebung zu unterstützen, wenn der physische Zugang zum Mikroskop eingeschränkt ist.
Introduction
Einzelpartikel-KryoEM
Um das Leben auf molekularer Ebene zu untersuchen, müssen wir die Struktur verstehen. Viele Techniken zur Untersuchung der Proteinstruktur stehen zur Verfügung, wie NMR, Röntgenkristallographie, Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie (EM). Bisher wurde der Großteil der in der Protein Databank (PDB) deponierten Strukturen mittels Röntgenkristallographie gelöst. Ab ~ 2012 wurde die Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) jedoch zu einer Mainstream-Technik zur Bestimmung der Proteinstruktur und ihre Verwendung nahm dramatisch zu. Die Gesamtzahl der in der Electron Microscopy Databank (EMDB) hinterlegten EM-Karten (Stand Dezember 2020) betrug 13.421 gegenüber 1.566 im Jahr 2012 (Abbildung 1, www.ebi.co.uk). Im Jahr 2012 betrug die Anzahl der atomaren Koordinaten, die in KryoEM-Dichtekarten modelliert wurden, die bei der PDB hinterlegt wurden, nur 67, aber bis Dezember 2020 wurden bisher 2.309 Strukturen abgelagert, ein 35-facher Anstieg. Dieses zugrunde liegende Wachstum der Qualität und Quantität der erzeugten KryoEM-Dichtekarten, manchmal auch als "Auflösungsrevolution"1 bezeichnet, wurde durch eine Verschmelzung von Fortschritten in mehreren Bereichen verursacht: die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektoren bekannt sind; neue Software; und stabilere Mikroskope2,3,4.
Abbildung 1: Kumulative Einreichungen bei der EMDB von 2012 bis Dezember 2020. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Zahl anzuzeigen.
Die Einzelpartikelanalyse (SPA) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Gewinnung biologischer Erkenntnisse in einer Vielzahl von Probentypen durch Aufklärung hochauflösender Strukturen isolierter Komplexe5,6 einschließlich Viren7,8, Membranproteine9,10, helikaler Baugruppen11 und anderer dynamischer und heterogener makromolekularer Komplexe12,13, deren Größe um Größenordnungen variiert (ab 39 kDa 14,15 bis dutzende Megadaltons). Hier wird ein Protokoll für eine Standard-Pipeline für cryoEM SPA von der Probe zur Struktur beschrieben.
Vor Beginn dieser Pipeline sollte eine gereinigte Probe einer biochemischen Analyse unterzogen werden, um ihre Erfolgschancen nachgelagert zu bewerten. Die Präparation einer geeigneten Probe ist wohl das größte Hindernis für SPA, insbesondere für transiente und heterogene (sowohl kompositorische als auch konformative) Komplexe. Das makromolekulare Komplexpräparat sollte so wenig Kontaminanten wie möglich enthalten, in ausreichender Konzentration, um viele Partikel in jeder KryoEM-Mikroaufnahme zu erhalten, und in einer Pufferzusammensetzung, die für die KryoEM-Analyse gut geeignet ist. Bestimmte Pufferbestandteile, einschließlich Saccharose, Glycerin und hohe (~ > 350 mM Konzentrationen von Salzen, abhängig von der Probengröße, den Eigenschaften und anderen Pufferbestandteilen), können den Prozess der Vitrifikation stören oder das Signal-Rausch-Verhältnis in Bildern verringern, was die Strukturbestimmung behindert16.
Typischerweise sollten zur Beurteilung der Probenreinheit mindestens die Größenausschlusschromatographie (SEC) und die SDS-PAGE-Gelanalyse verwendet werden17,18, aber zirkulärer Dichroismus, funktionelle Assays, SEC in Verbindung mit Mehrwinkel-Lichtstreuung und thermische Stabilitätsassays sind nützliche Werkzeuge für die qualitative Analyse makromolekularer komplexer Präparate vor der KryoEM-Analyse. Die Ergebnisse dieser biochemischen Analysen können jedoch wenig Aufschluss über die strukturelle Heterogenität der Probe und ihr Verhalten auf einem KryoEM-Gitter geben. Aus diesem Grund wird negative Färbungs-EM routinemäßig als schnelles, kostengünstiges und leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der Zusammensetzungs- und Konformationsheterogenität verwendet und daher eine gute Möglichkeit, festzustellen, welche Elutionsfraktion aus einer Reinigung am vielversprechendsten ist, oder um verschiedene Pufferzusammensetzungen zu screenen19,20. Sobald eine vielversprechende Probe identifiziert wurde, können wir zur SPA-KryoEM-Pipeline übergehen. Negative Färbung stimmt nicht immer mit den nachfolgenden Ergebnissen überein, die in CryoEM beobachtet wurden; Manchmal sieht eine Probe durch negative Färbung schlecht aus, verbessert sich aber, wenn sie in Glaseis in KryoEM gesehen wird. Im Gegensatz dazu sehen Proben manchmal während negativer Färbeschritte hervorragend aus, erfordern jedoch eine erhebliche weitere Optimierung, wenn sie zu CryoEM übergehen. In den meisten Fällen bietet die negative Färbung jedoch einen nützlichen Qualitätskontrollschritt.
Verglasung
Die raue Umgebung innerhalb des Vakuumsystems des Elektronenmikroskops verursacht sowohl Austrocknung als auch Strahlenschäden an nicht fixierten biologischen Proben21. Um die Probe in einem nativen Zustand abzubilden, muss die biologische Probe daher vor der Bildgebung konserviert werden. Für gereinigte Zubereitungen makromolekularer Komplexe ist die Vitrifikation die Methode der Wahl, um ihre Visualisierung durch KryoEM zu ermöglichen und gleichzeitig die atomaren Details des Komplexes zu erhalten. Die Entdeckung der Vitrifikation als Methode der Probenvorbereitung war ein grundlegender Fortschritt in der Elektronenmikroskopie biologischer Proben, für den Dubochet 2017 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde. Bei der Probenverglasung wird eine dünne Lösungsschicht erzeugt, die die interessierende Probe enthält, typischerweise dutzende nm dick, die auf einem KryoEM-Gitterträger aufgehängt ist. Der dünne Film wird dann extrem schnell in einem Kryogen wie flüssigem Ethan bei ~-175 °C eingefroren. Die Gefriergeschwindigkeit beträgt ~106 °C/s, schnell genug, dass sich amorphes oder glasartiges Eis bildet, das die Probe in einem dünnen, festen Film suspendiert22.
Die erste zu berücksichtigende Variable ist die gewählte KryoEM-Grid-Unterstützung23. Ein EM-Gitter besteht typischerweise aus einem amorphen Kohlenstofffilm mit Perforationen (entweder regelmäßig oder unregelmäßig) über einer Stützstruktur. Die Tragstruktur ist typischerweise ein kreisförmiges Metallgitter mit einem Durchmesser von 3,05 mm, das normalerweise aus Kupfer besteht, aber auch andere Metalle wie Gold oder Molybdän (das bevorzugte Wärmeausdehnungseigenschaften hat24) können verwendet werden. Manchmal wird eine zusätzliche dünne, kontinuierliche Unterstützung über das Gitter aufgetragen, wie Graphen, Graphenoxid oder eine dünne (~ 1-2 nm) amorphe Kohlenstoffschicht. Während Standard-KryoEM-Gitter (am häufigsten 400-200 Mesh-Kupfer mit einer perforierten (1,2 μm runden Löcher getrennt durch 1,3 μm (r1,2/1,3) oder 2 μm getrennt durch 2 μm Kohlenstoff (r2/2)) Kohlenstoffunterstützung - obwohl viele verschiedene Muster verfügbar sind) in der überwiegenden Mehrheit der bisher berichteten Strukturen verwendet wurden, wurden neuartige Gittertechnologien mit verbesserter Leitfähigkeit und reduzierter Probenbewegung berichtet25 . Ausgewählte Gitter werden einer Glühentladungs-/Plasmareinigungsbehandlung unterzogen, um sie hydrophil und probentauglich zu machen26.
Nach der Glimmentladung ist die nächste Stufe die Dünnschichtbildung. Dieser dünne Film wird am häufigsten mit Filterpapier gebildet, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Gitter zu entfernen. Während dies manuell durchgeführt werden kann, sind eine Reihe von Tauchgefriergeräten im Handel erhältlich, darunter der Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) und CP3 (Gatan). Mit diesen Geräten werden ~ 3-5 μL Probe in Lösung auf das EM-Gitter aufgetragen, gefolgt von der Ablöschung überschüssiger Lösung mit Filterpapier. Das Gitter, über dem ein dünner Film schwebt, wird dann in flüssiges Ethan getaucht, das durch flüssigen Stickstoff (LN2) auf ~ -175 ° C gekühlt wird. Nach dem Einfrieren wird das Gitter vor und während der Bildgebung auf einer Temperatur unterhalb des Entleerungspunktes (-137 °C) gehalten.
Probenscreening und Datenerhebung
Nach der Vitrifizierung eines KryoEM-Gitters besteht der nächste Schritt darin, das Gitter zu screenen, um seine Qualität zu bewerten und festzustellen, ob das Gitter für die hochauflösende Datenerfassung geeignet ist. Ein ideales KryoEM-Gitter hat Glaseis (im Gegensatz zu kristallinem Eis), wobei die Eisdicke gerade ausreicht, um die längste Dimension der Probe aufzunehmen, um sicherzustellen, dass das umgebende Eis so wenig Rauschen wie möglich zum resultierenden Bild beiträgt. Die Partikel im Eis sollten eine Größe und (falls bekannt) Form haben, die mit der Biochemie übereinstimmt, und idealerweise monodispers mit einer zufälligen Verteilung der Partikelorientierungen sein. Schließlich sollte das Raster genügend Bereiche von ausreichender Qualität aufweisen, um die gewünschte Datenerfassungslänge zu erfüllen. Abhängig von der Probe kann dies viele Iterationen der Vitrifikation und des Screenings erfordern, bis optimale Gitter erzeugt werden. Sowohl glücklich als auch unglücklicherweise gibt es eine Vielzahl von Variablen, die empirisch getestet werden können, um die Partikelverteilung auf KryoEM-Gittern zu verändern (überprüft in16,27). In diesem Manuskript werden repräsentative Ergebnisse für ein Membranproteinprojekt10 gezeigt.
Sobald ein geeignetes Raster identifiziert wurde, kann die Datenerfassung fortgesetzt werden. Mehrere Modelle von Kryo-Transmissionselektronenmikroskopen für biologische Proben sind optimiert, um hochauflösende Daten automatisiert zu sammeln. Typischerweise werden Daten auf 300-kV- oder 200-kV-Systemen gesammelt. Die automatisierte Datenerfassung kann mit Software wie EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 und SerialEM31,32 erreicht werden. Eine automatisierte Datenerfassung mit modernen Detektoren führt typischerweise zu Terabyte (TB) an Rohdaten in einem Zeitraum von 24 Stunden (durchschnittliche Datensätze sind ~ 4 TB groß).
Aufgrund der COVID-19-Beschränkungen, die in weiten Teilen der Welt gelten (Zeitpunkt des Schreibens im Dezember 2020), sind viele Mikroskopieeinrichtungen dazu übergegangen, Fernzugriff anzubieten. Sobald die Gitter in den Autoloader eines Mikroskops geladen wurden, kann die Datenerfassung aus der Ferne durchgeführt werden.
Bildverarbeitung und Modellbildung
Wenn eine Datenerfassungssitzung in der Regel 0,5-4 Tage dauern kann, kann die nachfolgende Bildverarbeitung je nach Verfügbarkeit der Rechenressourcen viele Wochen und Monate dauern. Es ist Standard für anfängliche Bildverarbeitungsschritte, nämlich Bewegungskorrektur und Kontrastübertragungsfunktion (CTF) Schätzung, um "on the fly" 33,34 zu erfolgen. Für die nachgelagerte Verarbeitung stehen eine Vielzahl von Software-Suiten zur Verfügung. Partikel werden "gepflückt" und aus Mikroaufnahmen extrahiert35,36. Sobald Partikel extrahiert sind, wäre ein Standardprotokoll, die Partikel durch mehrere Runden der Klassifizierung zu verarbeiten (sowohl in zwei Dimensionen (2D) als auch in drei Dimensionen (3D) und / oder fokussiert auf bestimmte Regionen von Interesse), um eine homogene Teilmenge von Partikeln zu erreichen. Diese homogene Teilmenge der Partikel wird dann zu einer 3D-Rekonstruktion gemittelt. An dieser Stelle werden die Daten oft weiter korrigiert, um eine möglichst hochwertige Karte zu erhalten, zum Beispiel durch CTF-Verfeinerung, Verzerrungskorrekturen37 und Bayes'sches Polieren38 . Das Ergebnis dieser Bildverarbeitung ist eine 3D-KryoEM-Karte der biologischen Probe von Interesse. Der Auflösungsbereich, der in einem "standardmäßigen" automatisierten Einzelpartikelexperiment aus einem Raster von ausreichender Qualität erreicht wird, wobei die auf einem 300-kV-Mikroskopsystem gesammelten Daten typischerweise zwischen 10 Å und 2 Å liegen, abhängig von der Größe und Flexibilität des Proteinkomplexes. Mit einer idealen Probe wurden nun Auflösungen von ~1,2 Å mit SPA-Workflows erreicht5. Während dieses Protokoll Die Schritte zur Erlangung einer EM-Dichtekarte detailliert beschreibt, kann sie, sobald diese in der Hand ist, durch Anpassen und Verfeinern eines Proteinmodells (wenn die Auflösung < 3,5 Å beträgt) oder durch Erstellen von de novo39 weiter interpretiert werden. Daten im Zusammenhang mit Strukturbestimmungsexperimenten können in öffentlichen Online-Repositorien hinterlegt werden, darunter EM-Dichtekarten (Electron Microscopy Data Bank)40, resultierende Atomkoordinaten (Protein Data Bank)41 und Rohdatensätze (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
In diesem Protokoll wird der äußere Membranproteinkomplex RagAB (~340 kDa) aus Porphyromonas gingivalis als Beispiel makromolekularer Komplex10 (EMPIAR-10543) verwendet. Für diejenigen, die neu in der KryoEM sind, ist die Unterstützung für Proben durch diese Pipeline von der Probe bis zur Struktur verfügbar, vorbehaltlich einer Peer-Review durch finanzierte Zugangsprogramme wie iNEXT Discovery und Instruct.
Protocol
1. Gitterverglasung
HINWEIS: Stellen Sie für alle Schritte in den Schritten 1 und 2 sicher, dass alle Werkzeuge sauber, trocken und bei Raumtemperatur sind, bevor Sie sie auf LN2-Temperatur abkühlen, indem Sie frisch dekantiertes LN2 verwenden, um die Eiskontamination zu reduzieren. Wenn möglich, arbeiten Sie in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit < 20% relativer Luftfeuchtigkeit. Stellen Sie sicher, dass eine geeignete persönliche Schutzausrüstung und H & S-Dokumentation vorhanden ist, bevor Sie mit der Arbeit beginnen.
- Stellen Sie sicher, dass die gewünschte Probe für die Probenvorbereitung bereit ist.
- Wählen Sie geeignete KryoEM-Gitter und stellen Sie sicher, dass diese durch Glühentladung oder Plasmabehandlung hydrophil gemacht wurden. Eine Vielzahl von Systemen und Variationen des Protokolls sind verfügbar, aber alle beinhalten das Platzieren der Gitter in einem Glimmentladungs- / Plasmareinigungssystem und das Ausführen eines Programms, das die Kammer auf ein gewünschtes Vakuumniveau pumpt, bevor ein bestimmtes Gasgemisch / chemischer Dampf oder Luft in das System eingeführt wird. Ein elektrischer Strom wird durch das System geleitet, ionisiert die Gaspartikel und bewirkt, dass die Oberfläche der Gitter hydrophiler wird.
- Starten Sie das Tauchgefriergerät für die Gitterverglasung, indem Sie das System mit dem Netzschalter auf der Rückseite einschalten, und warten Sie, bis der Touchscreen geladen ist.
- Stellen Sie mit dem mitgelieferten Stift oder den Fingern in der Konsole die gewünschte Arbeitstemperatur der Kammer ein (der verfügbare Bereich beträgt 4-60 °C, empfohlen für die meisten Makromoleküle 4-6 °C).
- Füllen Sie den Luftbefeuchter mit 50 ml Laborwasser Typ II mit einer Spritze über den Gummischlauch am Boden des Luftbefeuchters. Achten Sie darauf, die eingeschlossene Luft in der Spritze vor dem Füllen zu entfernen. Achten Sie darauf, den Luftbefeuchter nicht zu überfüllen, da sonst Wasser in die Kammer austritt. Sobald der Luftbefeuchter gefüllt ist, ziehen Sie den Spritzenkolben um 5-10 ml zurück, um eine Vakuumdichtung zu erzeugen.
- Stellen Sie in der Konsole die gewünschte relative Luftfeuchtigkeit für die Kammer ein (verfügbarer Bereich ist 0-100%, Luftfeuchtigkeit von 95-100% wird typischerweise verwendet). Lassen Sie die Luftfeuchtigkeit bis unmittelbar vor der Gitterherstellung auf "Aus" eingestellt, damit die Kammer nicht zu nass wird.
- Besorgen Sie sich die Pinzette des Tauchgefriergeräts und das Filterpapier, das auf die richtige Größe zugeschnitten ist, um auf die Pads zu passen, entweder gekauft oder mit einem Stempel, um eine Öffnung der entsprechenden Größe zu schneiden.
- Bereiten Sie das Kryogen für das Einfrieren vor.
- Legen Sie den Metall-Kryogitter-Boxhalter, den Kryogenbecher und die Beine der Metallspinne in den Kühlmittelbehälter.
- Kühlen Sie den Behälter ab, indem Sie die äußere Kammer mit LN2 füllen. Halten Sie die äußere Kammer aufgefüllt, um die Oberseite des Kryogitter-Boxhalters abzudecken. Fügen Sie ~ 1 cm zusätzliches LN2 zum Kryogenbecher hinzu, um das Gleichgewicht des Systems auf LN2-Temperatur zu unterstützen.
HINWEIS: Der Antikontaminationsring kann verwendet werden, um die feuchte Luft zu begrenzen, die um den Kryobecher kondensiert und zu einer Kryokühlmittel- / Ethankontamination führt. Dies ist in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung im Allgemeinen nicht erforderlich. Wenn Sie den Antikontaminationsring verwenden, achten Sie darauf, den Behälter nicht mit LN2 zu überfüllen, da er sonst verschüttet werden kann, wenn der Ring später in den Behälter gedrückt wird. - Warten Sie 3-5 Minuten, um das Kochen der Spinnenbeine zu beobachten, und warten Sie dann weitere 3 Minuten, um sicherzustellen, dass der Kryogenbecher ausreichend kalt ist, um das Vitrifikationsmedium zu kondensieren.
- Verflüssigen Sie das Kryogen (flüssiges Ethan) in den Kryobecher.
- Nehmen Sie das Ethanflaschenrohr mit dünnen Schläuchen und einer Düse, um das Gas abzugeben. Ideal ist hier eine P200-Pipettenspitze mit geöffneter Öffnung durch Abschneiden der Spitze mit einer Rasierklinge. Eine größere Öffnung ist erforderlich, um zu verhindern, dass ethan an der Spitze erstarrt und den Gasfluss blockiert.
- Stellen Sie sicher, dass der Kryogenbecher kein verbleibendes LN2 enthält, nehmen Sie die Ethangasdüse und legen Sie sie in den Kryobecher. Starten Sie mit dem Gasflaschenregler einen niedrigen Durchfluss und geben Sie Kryogengas in den Kryobecher ab, um das Gas zu kondensieren. Halten Sie die Spitze, aus der das Gas fließt, direkt gegen die Wand des Kryobechers gedrückt, bewegen Sie sie jedoch vorsichtig in einer Klopfbewegung gegen die Oberfläche. Regulieren Sie den Gasfluss, damit ein niedriger, stetiger Durchfluss kontrolliert in der Kryoschale kondensieren / verflüssigen kann.
- Füllen Sie den Becher bis knapp unter den silbernen Spinnenrand und stoppen Sie den Gasfluss, dann entfernen Sie die Gasleitung vorsichtig, um eine Kontamination des umgebenden LN2 mit Ethan zu vermeiden.
- Füllen Sie den Kühlmittelbehälter mit LN2 auf und achten Sie sehr darauf, keines in das flüssige Ethan zu verschütten.
- Lassen Sie die Beine der Spinnen für ~ 3-5 min in Position, um sicherzustellen, dass das flüssige Ethan auf eine ausreichend kalte Temperatur ausgeglichen ist. Das Kryogen beginnt trüb / leicht undurchsichtig auszusehen. Dies deutet darauf hin, dass es sich nahe an seinem Gefrierpunkt befindet. Verwenden Sie in diesem Stadium eine Pinzette, um die Spinne zu entfernen. Solange das LN2 in dem Behälter aufbewahrt wird, der den Kryogenbecher umgibt, bleibt das Ethan nun verflüssigt und für die Vitrifikation für 1-2 h geeignet. Versuchen Sie jedoch, das Verfahren so schnell wie möglich abzuschließen, insbesondere in nicht feuchtigkeitskontrollierten Räumen, um die Eiskontamination zu reduzieren.
HINWEIS: Wenn die Spinne "aufgeklebt" zu sein scheint, verwenden Sie einen Metallgegenstand wie eine Nuss und halten Sie sich an die Beine der Spinne, um sie leicht aufzuwärmen, und entfernen Sie dann die Beine.
- Bereiten Sie das Tauchgefriergerät und das Zubehör für die Probenverglasung vor.
- Fügen Sie dem Metall-Kryo-Gitter-Box-Halter Gitterspeicherboxen hinzu und stellen Sie während des gesamten Verfahrens sicher, dass der LN2 bis knapp über dem Niveau der Gitterboxen (normalerweise alle ~ 5 Minuten) aufgeladen wird.
- Geben Sie auf dem Bildschirm des Tauchgefriergeräts im Feld Prozessparameter die ausgewählten Parameter ein, darunter: Blot-Zeit (die Zeit, zu der die Pads des Tauch-Gefriergeräts zusammenkommen), Kraft (der Abstand der Blotting-Pads vom Gitter, der den Gradienten der Eisbildung verändert) und Insgesamt (Anzahl der Male, in denen sich die Blotting-Pads treffen). Wählen Sie diese Parameter basierend auf der individuellen Tauchgefriervorrichtung und dem Verhalten des Makromoleküls. Typische Werte sind eine Blot-Kraft zwischen 0 und 5, eine Blot-Zeit von 1-6 s und eine Blot-Summe von 1. Die typische Wartezeit (Zeit zwischen dem Initiieren des Blots und dem Beginn des Blots) und die Abflusszeit (Zeit nach dem Blotting vor dem Eintauchen) beträgt 0-2 s.
HINWEIS: Abhängig von den Benutzereinstellungen können zusätzliche Optionen im Abschnitt Optionen, Verschiedenes ausgewählt werden, einschließlich Fußpedal verwenden , um bei jeder Presse zum nächsten Schritt zu wechseln, Grid-Übertragung überspringen (überspringt den letzten Schritt, bei dem der Pinzettenarm leicht angehoben wird), Luftfeuchtigkeit während des Prozesses ausschalten (während die Probe aufgetragen wird, stoppt die aktive Befeuchtung der Kammer, wodurch es schwieriger wird, das Gitter zu sehen) und Autoraise Ethanelift (kombiniert den Schritt der Pinzette, die in die Kammer angehoben wird, und das Anheben des Kühlmittelbehälters - Mulden Ethanbehälter Schritt heben ). Hier sind alle diese Optionen aktiviert. - Stellen Sie den Kühlmittelbehälter sicher auf den beweglichen Plattformarm unter der Kammer
- Legen Sie frisches Löschpapier auf jeden Löscharm und stellen Sie sicher, dass die Ringclips aus Kunststoff befestigt sind. Jedes Filterpapier lässt 16 Blots zu (Arme drehen Löschpapier). Drücken Sie im Abschnitt Steuerelemente die Taste Blot-Papier zurücksetzen.
- Führen Sie 1 vollständigen Zyklus des Vitrifizierungsprozesses der Tauchgefriervorrichtung durch, um sicherzustellen, dass sich jedes bewegliche Teil wie erwartet verhält.
- Drücken (oder verwenden Sie das Fußpedal), um neues Raster zu platzieren, dann Prozess starten, dann Prozess und dann Weiter. Achten Sie in diesem Stadium darauf, dass sich die Löscharme wie erwartet berühren.
- Schalten Sie den Luftbefeuchter ein. Es entsteht Wasserdampf (solange die eingestellte Luftfeuchtigkeit höher ist als derzeit in der Kammer).
- Das gewünschte Exemplar kann nun verglast werden. Verwenden Sie das Fußpedal oder platzieren Sie ein neues Gitter und die Tauchstange steigt aus der Kammer ab, so dass die Pinzette in der Halterung befestigt werden kann.
- Nehmen Sie mit der Pinzette des Tauchgefriergeräts das gewünschte glühende / plasmagereinigte KryoEM-Gitter auf und achten Sie darauf, welche Seite die richtige Seite für die Probenanwendung ist, so der Gitterhersteller. Nehmen Sie das Gitter an der Felge auf und achten Sie darauf, einen übermäßigen / unnötigen Kontakt mit der Pinzette zu vermeiden, da dies die Unterstützung beschädigt. Befestigen Sie das Gitter in der Pinzette, indem Sie den schwarzen Clip bis zum geriffelten Teil der Pinzette bewegen. Das Gitter muss sicher gehalten werden, aber der Clip sollte nicht zu weit unten sein, da er die Löschpads berührt, was zu einem nicht reproduzierbaren Blotting führt und später die Pinzette beim Loslassen des Clips unter diesen Punkt gehalten werden muss.
- Legen Sie die Pinzette des Tauchgefriergeräts, die das KryoEM-Gitter hält, auf den pneumatischen Arm, wobei die richtige Seite Ihrer dominanten Hand zugewandt ist. Das Design der Pinzette und der Kammer der Tauchgefriervorrichtung ist so, dass die Probe je nach Händigkeit des Benutzers entweder durch die rechte oder linke Seite der Kammer aufgetragen werden kann.
HINWEIS: Die Anwendung der Probe auf verschiedenen Seiten mit den gleichen Löschparametern führt selten zu vergleichbaren Ergebnissen, so dass linkshändige Forscher ihre Löschparameter möglicherweise unabhängig von ihren rechtshändigen Kollegen abstimmen müssen. - Drücken Sie Startprozess und das in der Pinzette gehaltene Gitter wird in die Kammer gebracht und der Kühlmittelbehälter wird angehoben.
- Drücken Sie Prozess und die Pinzette bewegt das Gitter an die Position, an der eine Pipette verwendet werden kann, um die Probe auf das Gitter aufzutragen. Öffnen Sie den Seitenport mit Blick auf die richtige Seite des Gitters und tragen Sie die Probe durch Pipettieren auf, wobei Sie sicherstellen, dass die Pipettenspitze das Gitter nicht berührt, da dies zu einer Beschädigung der Gitterunterstützung / Biegung des Gitters führen kann, aber geben Sie die Flüssigkeit nahe genug ab, so dass der Tröpfchen auf das Gitter abgegeben wird. Typischerweise werden 3-5 μL angewendet.
- Drücken Sie Weiter und die vom Benutzer vordefinierten Parameter löschen das Gitter und tauchen dann die Pinzette mit montiertem Gitter in den Kühlmittelbecher zur Probenverglasung. Die Pinzette sinkt in Verbindung mit dem Arm, der den Kühlmittelbehälter und das Kühlmittel hält, ab und hält das Gitter im Kryogen unter Wasser.
- Übertragen Sie das Gitter vom Kryogenbecher auf die in LN2 eingetauchte Netzspeicherbox.
- Lösen Sie die Pinzette vom Pinzettenarm und achten Sie sehr darauf, das verglaste Gitter nicht mit den Seiten des Kryobechers zu berühren. Stellen Sie den Griff so ein, dass die Pinzette bequem gehalten wird. Bewegen Sie das Gitter so schnell und vorsichtig wie möglich vom Kryogen zum LN2. Halten Sie mit einer Hand die Pinzette mit den Fingern geschlossen und schieben Sie mit der anderen Hand den schwarzen Clip nach oben aus dem Weg und halten Sie die Pinzette geschlossen. Justieren Sie den Griff neu und manipulieren Sie das Gitter in die Netzspeicherbox.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.19, bis alle Raster erstellt sind (eine typische Sitzung umfasst die Erstellung von 4-12 Rastern). Lagern Sie alle Netzspeicherboxen, die Gitter enthalten, bis zu den nächsten Stufen in LN2 dewar.
2. Clipping-Gitter zum Laden in ein Autoloader-Mikroskop
- Schneiden Sie Raster gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll in die Autogrid-Assembly ein 28.
3. Sichere Fernanmeldung bei Mikroskopen
HINWEIS: Mit COVID-19-Kontrollen zum Zeitpunkt des Schreibens, aber auch mit Umweltbedenken im Zusammenhang mit internationalen Reisen, bieten mehr Mikroskopieeinrichtungen Dienstleistungen an, bei denen der Benutzer aus der Ferne arbeitet. Die Implementierungsmethode hierfür hängt von der lokalen IT-Konfiguration jeder Einrichtung und den Bedürfnissen der internen und externen Benutzergemeinschaft ab. Hier wird der Prozess für den Fernzugriff auf KryoEMs bei eBIC und die Steuerung des Mikroskops über EPU-Software beschrieben.
- Melden Sie sich aus der Ferne bei kryoEM's an. Die Fernanmeldung wird über die NoMachine-Software vermittelt, um auf den Mikroskop-Support-PC zuzugreifen, und ist so konfiguriert, dass der Zugriff nur Benutzern gestattet wird, die bei einem Besuch über die FedID-Anmeldeinformationen des Benutzers registriert sind. Der Zugriff bleibt nur für die Dauer der Sitzung aktiv.
- Öffnen Sie NoMachine und starten Sie eine neue NX-Verbindung zu nx-cloud.diamond.ac.uk mit Kennwortauthentifizierung.
- Öffnen Sie die Verbindung und melden Sie sich mit dem Benutzernamen fedid@fed.cclrc.ac.uk und FedID-Passwort an. Doppelklicken Sie aus den verfügbaren Optionen auf das Symbol für das entsprechende Mikroskop, um eine Verbindung zum entsprechenden Support-PC herzustellen.
- Geben Sie den Benutzernamen clrc\FedID und das Kennwort auf dem Windows-Anmeldebildschirm ein.
- Öffnen Sie die TeamViewer-Software über das Desktop-Symbol und verbinden Sie sich mit dem angegebenen Passwort mit der PartnerID: TEM. Dadurch wird die Verbindung vom Support-PC zum TEM-PC hergestellt. Über die Schaltfläche Nächster Monitor im TeamViewer-Menüband können Sie zwischen der Benutzeroberfläche des Mikroskops und dem EPU-Fenster wechseln.
- Mikroskopfunktionen können dann vom Benutzer direkt über die EPU-Schnittstelle gesteuert werden.
4. Laden von Proben in ein Autoloader-Mikroskop und Screening auf Eis und Probenqualität
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Mikroskop mit Autoloader und EPU-Software für das Probenscreening verwendet, dies kann jedoch mit anderer Software und einem Seiteneingangssystem und KryoEMs anderer Hersteller erreicht werden.
- Laden Sie abgeschnittene Gitter wie zuvor beschrieben in den Mikroskop-Autoloader28.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Autoloader der Benutzeroberfläche des Mikroskops mit dem Pfeil auf das Dialogfeld Optionen , und drücken Sie die Taste Inventar . Dadurch wird jede Position in der Kassette nacheinander überprüft, um festzustellen, ob eine Patrone vorhanden ist. Belegte Slots werden blau gekennzeichnet. Wenn alle belegten Slots zugeordnet wurden, drücke erneut die Inventartaste , um nach der aktuellen Position anzuhalten, andernfalls lass sie laufen, bis alle belegten Slots zugeordnet wurden. Beschriften Sie alle belegten Steckplätze mit den Probendetails in den mitgelieferten Feldern.
- Markieren Sie das Raster, das in die Mikroskopspalte übertragen werden soll, und klicken Sie auf Laden. Das Slot-Label wird von blau nach gelb, sobald das Gitter erfolgreich auf die Bühne geladen wurde. Fahren Sie mit dem Bildschirm der Raster fort.
- Öffnen Sie die EPU-Software. Wählen Sie auf der Seite Vorbereitung die Option Erfassungsoptik und -einstellungen aus, und wählen Sie dann die Atlas-Voreinstellung aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie geeignete Strahleinstellungsvoreinstellungen (z. B. 64-fach nominal mag, Spotgröße 5, Mikrosonde, mit einem beleuchteten Bereich im parallelen Bereich für Falcon-Detektor - weitere Informationen zur Auswahl von Strahleinstellungsvoreinstellungen siehe28). Drücken Sie Set (Set ), um die Parameter auf das Mikroskop zu drücken.
- Drücken Sie Säulenventile öffnen und setzen Sie den FluScreen ein. Überprüfen Sie, ob ein Strahl sichtbar und ausreichend verteilt und zentriert ist, um den Detektor abzudecken. Navigieren Sie bei Bedarf mit dem Joystick oder dem Bühnenmenü zu einem dünneren Bereich des Rasters, um die Bühnenbewegungen in X und Y zu steuern.
- Heben Sie den FluScreen an und nehmen Sie ein Bild mit der Vorschau-Taste in EPU auf. Basierend auf dem aufgenommenen Bild kann die Dosis erhöht werden, indem auf eine niedrigere Zahlenfleckgröße verschoben wird und umgekehrt.
- Gehen Sie in EPU zur Atlas-Seite und drücken Sie Neue Sitzung. Wählen Sie MRC-Bildformat aus, geben Sie einen geeigneten Ordnernamen und Speicherort für die Screening-Sitzung ein, und klicken Sie dann auf Übernehmen.
- Wählen Sie Screening aus dem Menü auf der linken Seite. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben jedem Raster, um eine Atlasmontage zu erhalten. Starten Sie die Screening-Sitzung in EPU. Für jedes geprüfte Gitter wird ein Atlas erworben, in dem nach Fertigstellung eine Anzahl verfügbarer Gitterquadrate aufgelistet wird. Jeder Atlas kann angezeigt werden, indem er auf der Screening-Seite hervorgehoben wird, komplett mit einem Mark-up, das Gitterquadrate mit einer ähnlichen vorhergesagten Eisdicke nach Farbe gruppiert zeigt.
- Überprüfen Sie nach Abschluss die gesammelten Atlanten und identifizieren Sie die Gitter, die für die Beurteilung der Probenqualität bei höheren Vergrößerungen geeignet sind (d. h. solche mit einer angemessenen Anzahl von Gitterquadraten, die weder trocken noch durch dickes Eis verdeckt sind). Markieren Sie das ausgewählte Raster im EPU-Screening-Menü, und klicken Sie auf Beispiel laden.
- Verwenden Sie die Balkeneinstellungsvoreinstellungen (Siehe 28 für die Erläuterung der für jede Stufe gewünschten Strahleinstellungsvoreinstellungen) und die Vorschaufunktion, um die gewünschten Gitterquadrate genauer zu untersuchen.
- Wählen Sie im Atlas-Vorführmenü das derzeit geladene Raster aus und verschieben Sie die Bühne in ein Rasterquadrat, das gefüllte Löcher enthält, indem Sie mit der rechten Maustaste über die gewünschte Position im Rasterbild klicken und Zum Rasterquadrat verschieben auswählen.
- Kehren Sie zur Seite EPU, Vorbereitung zurück, und wählen Sie die Voreinstellung GridSquare aus.
- Öffnen Sie die Seite EPU, Auto Functions und führen Sie Auto-eucentric by stage tilt mit der Voreinstellung GridSquare aus, um das Sample auf euzentrische Höhe zu verschieben.
HINWEIS: Auto-euzentrisch nach Balkenneigung ist ebenfalls verfügbar, was schneller, aber in der Regel weniger genau ist als auto-euzentrisch durch Stufenneigung. - Nehmen Sie in EPU, Vorbereitung, ein neues GridSquare Preview-Bild auf. Beachten Sie die unterschiedlichen Grauwerte in den verschiedenen Löchern, die auf unterschiedliche Eisdicken hinweisen. Bewegen Sie die Bühne mit einem Rechtsklick über ein Loch > verschieben Sie die Bühne hier. Wählen Sie die Voreinstellung "Loch/Euzentrische Höhe" und "Vorschau".
HINWEIS: Abhängig vom Molekulargewicht und der Form des interessierenden Partikels kann es möglich sein, es bei der Vergrößerung von Loch/euzentrischer Höhe zu identifizieren. - Wählen Sie die Voreinstellung "Datenerfassung" und legen Sie eine Vergrößerung fest, die eine einfache Identifizierung der Partikel ermöglicht (entsprechend einer Objektabtastung von im Allgemeinen <2 Å/Pixel). Stellen Sie den Defokussierungsversatz auf ~-3 bis -5 μm mit einer Belichtungselektronendosis von ~40-80 e-/ Å2 ein.
- Durchlaufen Sie die Schritte in 4.4, um eine Reihe von Eisdicken für die Partikelverteilung, -orientierung und -kontamination im gesamten Gitter zu bewerten. Die Partikelverteilung kann in der Nähe der Kanten gegenüber der Mitte des Lochs variieren, daher ist es wichtig, verschiedene Stellen mit dem Bohrloch zu untersuchen.
- Screenen Sie alle Gitter, die von Atlanten vielversprechend sind, da sie genügend Gitterquadrate haben. Bewahren Sie diese entweder im Mikroskop auf und fahren Sie mit der Datenerfassung mit EPU fort, oder entladen Sie die Proben aus dem Mikroskop und lagern Sie sie unter LN2 , bis die Datenerfassung geplant ist.
5. Einzelpartikel-KryoEM-Datenerfassung (mit Schwerpunkt Fernbetrieb)
HINWEIS: Ein detailliertes Protokoll für die Datenerfassung mit EPU ist im Herstellerhandbuch und an anderer Stelle beschrieben28. Hier werden Modifikationen dieses Protokolls für die Fernsteuerung (nämlich die Reduzierung der Verwendung der Handpanels zur Durchführung von Aufgaben und die Verwendung softwarebasierter Alternativen) hervorgehoben.
- Wenn nicht bereits während der Sitzung eine gesammelt wurde, sammeln Sie einen Atlas für das Raster.
- Definieren Sie jede der Voreinstellungen für die Strahleinstellung entsprechend den experimentellen Anforderungen des Projekts.
- Führen Sie Bildverschiebungskalibrierungen durch28.
- Richten Sie die EPU-Sitzung ein.
- Wählen Sie in EPU die Option EPU-Seite, dann Sitzungseinrichtung, wählen Sie Neue Sitzung und dann Neu aus den Einstellungen.
- Wählen Sie Neue Sitzung ein Popup-Fenster wird angezeigt, das eine Option zur Verwendung früherer Einstellungen bietet. Yes lädt automatisch die Einstellungen aus der vorherigen EPU (d. h. Probenträger, Defokusbereich, Autofokuseinstellungen, Rastertyp) in die aktuelle EPU-Sitzung. Wenn Sie Neu aus den Einstellungen auswählen, kann der Benutzer eine Datei mit gespeicherten Einstellungen auswählen (z. B. Defokusbereich, Autofokuseinstellungen, Rastertyp), und diese Informationen werden in die EPU vorinstalliert.
- Füllen Sie den Sitzungsnamen mit etwas Informativem aus. Die lokale Einrichtung kann eine Namenskonvention vorschlagen.
- Wählen Sie unter Typ die Option Manuell aus.
- Wählen Sie für den Erfassungsmodus die genaue Bohrungszentrierung oder die schnellere Erfassung aus.
- Wählen Sie unter Bildformat das gewünschte Format aus.
- Wählen Sie einen geeigneten Speicherordner aus , und die EPU erstellt ein Verzeichnis mit dem Sitzungsnamen.
- Wählen Sie den entsprechenden Probenträger aus, je nachdem, welcher Gittertyp und Lochabstand verwendet wird (z. B. Quantifoil 1.2/1.3), und klicken Sie auf Anwenden. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess zum Generieren einer Vorlage für ein reguläres Array von Bohrungen
- Wählen Sie ein anfängliches Rasterquadrat aus und legen Sie eine Erfassungsvorlage fest.
- Gehen Sie zur Quadratauswahl, wenn alle Quadrate grün sind, klicken Sie oben links auf Auswahl aufheben.
- Öffnen Sie Kacheln (klicken Sie mit der rechten Maustaste > öffnen Sie die Kachel). Wählen Sie ein Quadrat aus (klicken Sie mit der rechten Maustaste > Hinzufügen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf > Bühne in Rasterquadrat verschieben).
- Gehen Sie zu Lochauswahl und drücken Sie Auto Eucentric. Warten Sie, bis dies abgeschlossen ist und ein Rasterquadratbild aufgenommen wurde. Wenn die Autofunktion fehlschlägt, kann dies daran liegen, dass die Höhe erheblich abweicht. Wenn ja, kann es manuell mit dem FluScreen bei Grid Square Vergrößerung eingestellt werden.
- Messen Sie die Lochgröße. Bewegen und justieren Sie die gelben Kreise so, dass sie sich mit der richtigen Größe und dem richtigen Abstand über den Löchern befinden.
- Klicken Sie auf Löcher suchen. Überprüfen Sie, ob die Löcher korrekt gefunden wurden. Wenn nicht, ändern Sie die Lochgröße und finden Sie Löcher wieder. Wiederholen Sie dies, bis das Loch korrekt gefunden wird. Wenn es konsequent fehlschlägt, sollten Sie in Betracht ziehen, bei Gitterquadratvergrößerung zu einer niedrigeren (helleren) Spotgröße zu wechseln.
- Verwenden Sie das Filter-Eisqualitätshistogramm auf der rechten Seite, um die Lochauswahl anzupassen. Dies kann nützlich sein, um Bereiche mit dickem Eis und dünnem Eis auszuschließen. Dies wird für zukünftige Gitterquadrate, die während dieser Sitzung ausgewählt werden, in Erinnerung bleiben.
- Optimieren Sie die Bohrungsauswahl mit den Werkzeugen im Menü "Auswählen " oben. Klicken Sie beispielsweise auf Bohrungen in der Nähe der Rasterleiste entfernen.
- Gehen Sie zu Vorlagendefinition und drücken Sie Erwerben.
- Klicken Sie auf Bohrloch suchen und zentrieren. Es wird nun ein Bild von einem Loch mit einem gelben Kreis um das Loch geben.
HINWEIS: Wenn es Schwierig ist, das Loch zu finden, setzen Sie die Objektivblende ein. Wenn das Loch immer noch nicht gefunden werden kann, versuchen Sie, die Belichtungszeit für die Voreinstellung "Loch/euzentrische Höhe" zu erhöhen oder die Defokussierung für diese Voreinstellung zu erhöhen oder das Bild zu binden. Eine große Defokussierungsänderung kann die Ausrichtung der Bildverschiebung verändern. - Ändern Sie die Verzögerung nach der Stufenverschiebung und die Verzögerung nach der Bildverschiebung auf 1-5 s.
- Aktivieren Sie den wert maximale Bildverschiebung (falls option verfügbar) ist wie gewünscht. Wenn die aberrationsfreie Bildverschiebungssammlung verwendet wird, wird dieser Wert in der EPU-Konfigurationsdatei definiert, andernfalls ist 5 μm ein Standardwert.
- Klicken Sie auf Erfassungsbereich hinzufügen und dann auf eine beliebige Stelle im Bild. Verschieben Sie den Erfassungsbereich an die gewünschte Position (d. h. am Rand einer Bohrung), damit Die Erfassungsbereiche nicht doppelt mit dem Strahl belichtet werden (das Quadrat im grünen Kreis stellt den Detektorbereich dar, der grüne Kreis ist der Strahldurchmesser).
- Fügen Sie oben rechts den Defokusbereich hinzu. Fügen Sie dann weitere Akquisitionsbereiche hinzu. Eine typische Defokussierungsliste für ein Membranproteinprojekt beträgt -0,8 bis -3 μm Defokussierung.
- Klicken Sie auf Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf eine beliebige Stelle auf dem Bild. Bewegen Sie den Autofokusbereich auf das Carbon, das ein Loch umgibt. Standardpraxis ist der Autofokus nach der Zentrierung bei Verwendung von AFIS oder alle 5-15 μm, abhängig von der Z-Höhenvariation über das Quadrat.
- Klicken Sie auf Driftmessbereich hinzufügen, Driftmessung wird einmal pro Gitterquadrat durchgeführt, wobei ein festgelegter Schwellenwert von 0,05 nm/s eine Standardeinstellung ist. Der Drift-Messbereich kann sich (und es ist eine gute Idee) direkt mit dem Autofokusbereich überlappen. Stellen Sie sicher, dass sich weder Drift- noch Autofokusbereich mit einem Erfassungsbereich überlappen.
HINWEIS: Die Vorlage kann mit der Vorlagenausführungsfunktion überprüft werden. Dies ist eine gute Idee, um zu sehen, ob Erfassungsbereiche bewegt werden müssen (z. B. zu viel / nicht genug Kohlenstoff in Bildern), ist aber nicht notwendig. - Gehen Sie zurück zur Quadratauswahl, und wählen Sie im Raster die Quadrate für die Erfassung aus. Verwenden Sie die Anzahl der Erfassungsbereiche und die erwartete Datenerfassungsrate (von der Einrichtung basierend auf Detektoren und Versuchsaufbau), um vorherzusagen, wie viele Erfassungsbereiche erforderlich sind.
- Wenn alle gewünschten Quadrate ausgewählt sind, klicken Sie auf Alle Quadrate vorbereiten.
- Sobald jedes Quadrat gesammelt ist, navigieren Sie zwischen den Rasterquadraten und stimmen Sie die Löcher mit dem Auswahlpinsel ab.
- Bewegen Sie sich zu einer Bühnenposition über der Probe und verwenden Sie automatische Funktionen, um die euzentrische Höhe einzustellen. Führen Sie Mikroskopausrichtungen wie zuvor beschrieben durch28, aber anstatt eine komafreie Ausrichtung durchzuführen und objektiven Astigmatismus manuell zu korrigieren, verwenden Sie Ausrichtungswerkzeuge innerhalb der Software. Stellen Sie kurz die Bedingungen für den Erfassungsstrahl ein, stellen Sie sicher, dass die Objektivöffnung (OA) entfernt wird und die Stufe über einem strahlstabilen Bereich der Probe in euzentrischer Höhe positioniert ist. Führen Sie eine komafreie Ausrichtung innerhalb der Autofunktionen durch, bevor Sie die OA wieder einsetzen und zentrieren und den Objektivastigmatismus mit EPU korrigieren. Stellen Sie sicher, dass beide Ausrichtungen auf geeignete Werte konvergieren (<150 nm Koma und Astigmatismus nahe Null.
- Bevor Sie mit dem automatischen Erfassungslauf beginnen, stellen Sie sicher, dass die Autoloader-Turbopumpe ausgeschaltet und die Objektivöffnung eingesetzt ist.
- Drücken Sie unter Automatisierte Erfassung auf Startlauf , um die automatisierte Datenerfassung zu starten.
6. Bildverarbeitung zur Erzielung einer EM-Dichtekarte
HINWEIS: Die meisten KryoEM-Einrichtungen bieten die Vorverarbeitung von Mikrogrammfilmen "on the fly" an. Hierfür stehen eine Vielzahl von Softwarepaketen und Ansätzen zur Verfügung, darunter die RELION-Pipelines 28,33, cryoSPARC43, Scipion34 und WarpEM44. Hier wird eine RELION-basierte Pipeline beschrieben und es wird davon ausgegangen, dass der Anwender die Mikrogrammfilme an einen geeigneten Speicherort mit Zugriff auf Rechenressourcen verschoben hat. Ein Überblick über den Prozess und repräsentative Ergebnisse für ein Membranprotein-Projekt werden gegeben, eine detaillierte Beschreibung und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung finden Sie auf der RELION Homepage: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- Führen Sie eine spontane Analyse der Bewegungskorrektur der Mikroaufnahme und der CTF-Schätzung durch. Starten Sie RELION im Projektverzeichnis. Planen Sie Import-, Bewegungskorrektur- und CTF-Schätzaufträge so in einer Schleife, dass sie gleichzeitig mit der Datenerfassung und -übertragung erfolgen. Ein Mikrographenanalyseskript28 liefert visuelles Echtzeit-Feedback zu Astigmatismus und geschätzten Defokussierungswerten (siehe repräsentative Ergebnisse).
- Wählen Sie Partikel aus vorbearbeiteten Mikroaufnahmen. Es gibt eine Reihe von automatisierten Partikelkommissioniersoftwarepaketen zur Auswahl. Referenzfreie und vorlagenbasierte Kommissioniermöglichkeiten stehen im Reiter Auto-Picking von RELION37 zur Verfügung. Andere Programme können für verschiedene Schritte verwendet werden, zum Beispiel die Verwendung von crYOLO für die Partikelentnahme35.
- Extrahieren Sie Partikel aus den CTF-korrigierten Mikroaufnahmen.
HINWEIS: Um die Rechenzeit zu reduzieren, die für frühe, "aufräumende" Verarbeitungsschritte erforderlich ist, skalieren Sie die Partikel bei der Extraktion herunter / binden Sie sie ab. Details zur Ausführung des Extraktionsauftrags finden Sie im RELION 3.1 Tutorial. Für dieses Projekt wurden die Partikel zunächst um den Faktor 2 gebunden. - Führen Sie eine 2D-Klassenmittelung durch. Die Klassifizierung über 100-200 Klassen funktioniert gut für die meisten Datensätze, die ≥100.000 Partikel enthalten. Es wird nicht empfohlen, viel mehr als 200 Klassen oder weniger als 50 Klassen zu verwenden, selbst wenn Datasets klein sind, es sei denn, die Stichprobe weist eine hohe Symmetrie auf (d. H. Ikosaedervirus), in welchem Fall weniger als 50 Klassen immer noch ein gutes Ergebnis liefern können. Stellen Sie den Maskendurchmesser groß genug ein, um die längste Dimension des Partikels aufzunehmen, aber eng genug, um benachbarte Partikel auszuschließen (dies kann einige Versuche und Irrtümer erfordern).
- Wählen Sie gute Klassen (d. h. solche mit strukturellen Details) mithilfe des Teilmengenauswahlauftrags aus. Beispiele für gute und schlechte 2D-Klassendurchschnitte finden Sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse.
- Generieren Sie aus den Daten de novo ein Initialmodell mit dem 3D-Initialmodelljob in RELION.
HINWEIS: Weniger saubere Partikelstapel können von einer Multireferenz-Ab-initio SGD-Verfeinerung (stochastic gradient descent) profitieren, da dies eine zusätzliche Möglichkeit bietet, Junk/suboptimale Partikel herauszufiltern. Wählen Sie einen Maskendurchmesser aus, der das interessierende Partikel aufnehmen kann, und belassen Sie die Standardwerte für Felder auf der Registerkarte "SGD", da diese routinemäßig gut funktionieren. Stellen Sie sicher, dass das ursprüngliche Modell in Chimera (oder einem anderen geeigneten Visualisierungsprogramm) vernünftig aussieht (siehe repräsentative Ergebnisse). - Führen Sie eine 3D-Klassifizierung durch, um die Heterogenität in den Daten zu beheben, indem Sie die Ausgabe aus Schritt 6.6 als Referenzmodell verwenden. Bewerten Sie die resultierenden Karten in Chimera. Verarbeiten Sie Partikelstapel, die eindeutigen Konformationszuständen entsprechen, unabhängig voneinander. Verwenden Sie den Teilmengenauswahlauftrag, um eine oder mehrere Klassen von Interesse auszuwählen und particles.star-Dateien für die zugeordneten Partikelstapel zu generieren.
- Führen Sie die automatische 3D-Verfeinerung aus. Verwenden Sie die im vorherigen Schritt erhaltenen 3D-Klassendurchschnitte als Referenzen für die Verfeinerung der entsprechenden Partikelstapel. Wenn sich die Auflösung der Verfeinerung der Nyquist-Grenze der Daten nähert, extrahieren Sie die Partikel ohne Herabskalierung erneut. Wiederholen Sie nach der erneuten Extraktion den 3D-Auto-Refine-Job mit dem nicht gebundenen Partikelstapel. In diesem Fall müssen die 3D-Referenzmodelle so neu skaliert werden, dass die Pixel- und Boxgrößen mit denen der erneut extrahierten Partikelbilder übereinstimmen. Verwenden Sie das relion_image_handler-Befehlszeilentool, um diesen Vorgang auszuführen.
- Verwenden Sie gegebenenfalls Symmetrie bei der Verfeinerung. Wenn eine rekonstruierte Karte Symmetrie besitzt, richten Sie die Karte mit dem Befehlszeilenwerkzeug relion_align_symmetry auf der entsprechenden Symmetrieachse aus. Verwenden Sie die resultierende ausgerichtete Karte als Referenz in einem neuen 3D-Autofeinerauftrag mit dem entsprechenden Symmetrieoperator, der auf der Registerkarte Referenz angegeben ist.
- Schärfen Sie Karten aus der automatischen 3D-Verfeinerung. Dies geschieht über den Nachbearbeitungsjob in RELION, aber zuerst muss aus der verfeinerten Karte eine geeignete Maske erstellt werden. Die Schritte der Maskenerstellung und Nachbearbeitung sind im RELION Tutorial detailliert beschrieben (siehe auch repräsentative Ergebnisse).
HINWEIS: Die Auflösung vieler Rekonstruktionen kann mit den Bayes'schen Polier- und CTF-Verfeinerungsfunktionen in RELION weiter verbessert werden. Verwenden Sie den CTF-Verfeinerungsauftragstyp, um Aberrationen höherer Ordnung (Strahlneigung, Kleeblattaberrationen und Aberrationen 4. Ordnung) und als separate Jobs anisotrope Vergrößerung und Partikeldefokussierung zu schätzen und zu korrigieren. Verwenden Sie anschließend den Bayes'schen Polierauftrag (trainiert oder mit Standardwerten), um strahlinduzierte Bewegungen pro Partikel zu adressieren. Wie im RELION 3.1-Tutorial beschrieben, werden diese Jobs wahrscheinlich von einem iterativen Ansatz (CTF-Verfeinerung → Bayes'schem Polieren → 3D-Autoverfeinerung → Nachbearbeitung → profitieren... Schleife), da beide von Modellen mit höherer Auflösung profitieren. - Korrigieren Sie bei Bedarf die Händigkeit von EM-Dichtekarten. Untersuchen Sie die Karten, um festzustellen, ob die Händigkeit korrekt ist, indem Sie entweder versuchen, ein vorhandenes atomares Modell anzupassen, oder indem Sie die Händigkeit der alphahelixischen Regionen bewerten. Bei Bedarf blättern Sie die Karte mit dem Befehl 'vop zflip' entlang der z-Achse in UCSF Chimera45.
Representative Results
Beim Screening können Gitter in der Atlasstufe verworfen werden, wo Merkmale, die bei geringer Vergrößerung aufgelöst werden, das Gitter als nicht für die Datenerfassung geeignet markieren. Zum Beispiel, wenn ein Gitter einer erheblichen mechanischen Beschädigung ausgesetzt war, wobei die Mehrheit der Gitterquadrate gebrochen ist (Abbildung 2A), oder wenn das Gitter "trocken" zu sein scheint, ohne Glaseis (Abbildung 2B). Solche Gitter sind typischerweise identifizierbar, da die Kanten der Gitterquadrate scharf und deutlich erscheinen. In der Mehrzahl der Gitter, die mit der Tauchgefriervorrichtung hergestellt wurden, wird ein Eisgradient beobachtet (Abbildung 2C,D). Die Partikelverteilung kann je nach interessierender Probe mit der Eisdicke dramatisch variieren, so dass das Screening einer Reihe von Gitterquadraten zur Beurteilung der Partikelverteilung empfohlen wird. Während des Atlas-Screening-Schritts wurden Werkzeuge in der EPU-Software implementiert, um dem Benutzer zu helfen, Gitterquadrate mit ähnlicher oder unterschiedlicher Eisdicke zu identifizieren, was besonders für Benutzer nützlich sein kann, die neu in der Untersuchung von KryoEM-Gittern sind (Abbildung 2E, F).
Abbildung 2: Beispiel für "Atlas"-Montagen mit geringer Vergrößerung aus Screening-Sitzungen. A) Ein Gitter, das erheblichen Schaden erlitten hat, indem die Mehrheit der Gitterquadrate gebrochen ist - ungeeignet für die Sammlung. B) Ein trockenes Gitter ohne Glaseis - ungeeignet für die Sammlung. C) Ein Gitter, das einen Eisgradienten mit ~ 50% des Gitters zeigt. D) Ein Eisgradient mit ~ 33% des Gitters nutzbar. Sowohl C als auch D eignen sich für die Datenerfassung, wenn die verwendbaren Gitterquadrate eine für die Sammlung geeignete Eisdicke aufweisen und genügend Erfassungsbereiche vorhanden sind, um die Mindestdauer einer Sammlung zu erfüllen (z. B. 24 h) E) Ein Beispielatlas mit einem Bereich von Eisdicken. F) Derselbe Atlas, der in E dargestellt wird, aber mit Gitterquadraten, die von der EPU-Software nach Eisdicke kategorisiert und gefärbt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Stellen Sie beim Screening der Partikelverteilung sicher, dass bildgebende Parameter wie Vergrößerung und Gesamtelektronendosis denen ähneln, die während der Datenerfassung erwartet werden, um ein genaues Bild der erwarteten Ergebnisse zu erhalten. Während des Screenings ist eine ideale Partikelverteilung monodispers mit einer Reihe von sichtbaren Partikelorientierungen (abhängig von der Probe und den vorhandenen Kenntnissen der Morphologie des Partikels kann dies schwierig zu bestimmen sein) (Abbildung 3A). Das Eis sollte so dünn wie möglich sein und gleichzeitig die größte Dimension der Partikel aufnehmen, wenn Eis zu dünn ist, kann es schmelzen, wenn es mit dem Elektronenstrahl beleuchtet wird. Dies führt zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme, und Bereiche, die diese Eigenschaft aufweisen, sollten vermieden werden (Abbildung 3B). Aus kollektiver Erfahrung wird dieser Effekt am häufigsten beobachtet, wenn sich Reinigungsmittel im Puffer befindet. Dies kann zu sehr dünnem Eis in der Mitte des Lochs führen und so können Partikel physikalisch ausgeschlossen und zum Rand gezwungen werden. Dieser Effekt ist in Abbildung 3C zu beobachten, aber in diesem Fall ist es kein extremes Beispiel und diese Bilder würden immer noch nützlich zu einem Datensatz beitragen. Schließlich muss das Eis glasig sein; Schließen Sie alle Bereiche des Gitters (oder der Gitter) aus, in denen die Mehrheit oder alle aufgenommenen Bilder kristallines Eis (Abbildung 3D) aus der Datenerfassung zeigen. Oft wird glasfreies Eis am Rand von Gitterquadraten beobachtet. Für weitere Informationen werden die Leser auf detaillierte Übersichten über die Variablen verwiesen, die während der Gitterverglasung verändert werden können16 und Beschreibungen des Partikelverhaltens in der Dünnschichtumgebung46,47.
Abbildung 3: Repräsentative Mikroaufnahmen mit unterschiedlichen Partikelverteilungen. A) Eine "ideale" Verteilung von monodispersen Partikeln, die eine Reihe von Orientierungen annehmen. B) Zu dünnes Eis in der Mitte des Lochs, das sich bei Einwirkung des Elektronenstrahls verformt, was zu einer übermäßigen Bewegung in der Mikroaufnahme führt. Dieser Effekt wird am häufigsten beobachtet, wenn Reinigungsmittel im Puffer vorhanden ist C) Wenn Eis in der Mitte des Lochs dünner ist, schließt dies Partikel physikalisch aus dem Zentrum aus, was zu einer Verdichtung der Partikel in Richtung Lochrand führt. In diesem Fall ist es nicht extrem genug, um zu verhindern, dass diese Bilder nützlich sind, aber es deutet darauf hin, dass es sich lohnt, etwas dickere Bereiche zu screenen. D) Eis ist nicht glasig, Daten sollten nicht über Bereiche gesammelt werden, die wie diese Beispielmikroskopaufnahme aussehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
On-the-fly-Bildverarbeitung kann helfen, Fehler und Probleme bei der Datenerfassung zu erkennen und ist daher immer zu empfehlen, wo es möglich ist. Zum Beispiel kann eine übermäßige Bewegung in Mikroaufnahmen darauf hindeuten, dass die Autoloader-Turbopumpe aktiv ist, oder daten werden auf einem rissigen Gitterquadrat gesammelt, wo sich Eis im Elektronenstrahl signifikant bewegt, was darauf hindeutet, dass das Gitterquadrat übersprungen werden sollte. Im laufenden Betrieb kann die CTF-Schätzung Umstände aufdecken, unter denen ein positiver Fokuspunkt (und nicht eine Defokussierung) angewendet wird (wo CTF-Schätzprogramme und Parameter zum Auffinden dieser Punkte verwendet werden), und die Phasenverschiebung bestimmen, bei der eine Volta-Phasenplatte48 verwendet wird. On-the-fly-Bildverarbeitungspipelines enthalten häufig eine grafische Zusammenfassung der Daten (Abbildung 4A), um es den Benutzern zu erleichtern, die Mikroaufnahmequalität schnell zu beurteilen und zu entscheiden, ob Änderungen an der Datenerfassung erforderlich sind.
Die Auswahl von Partikeln aus Mikroaufnahmen bei gleichzeitiger Vermeidung von "Fehlalarmen" wie Verunreinigungen oder der Rasterträgerfolie kann eine Optimierung erfordern. Partikelpicker wie crYOLO funktionieren jedoch oft ausreichend gut, indem sie Standardparameter für einen "ersten Durchlauf" der Daten verwenden (Abbildung 4B), was den Übergang zur 2D-Klassenmittelung ermöglicht, bei der es einfacher sein kann, die Qualität der Daten und die Wahrscheinlichkeit eines nachgelagerten Erfolgs zu beurteilen. Für die meisten Projekte sollte die 2D-Klassifizierung von ~ > 10k-Partikeln beginnen, Klassen aufzudecken, die sekundäre Strukturdetails aufweisen. Um mit 3D fortzufahren, sollte die 2D-Klassifizierungsphase in der Regel Klassen anzeigen, die eine Reihe von Partikelorientierungen darstellen. Wenn eine bevorzugte Orientierung offenbart wird, können weitere Iterationen der Probenvorbereitung16 oder eine weitere Datenerfassung mit geneigter Probe erforderlich sein49. Alle Klassen, die sekundäre Strukturdetails zeigen, sollten so gewählt werden, dass sie zur 3D-Analyse weitergeleitet werden, während "Junk"-Partikel verworfen werden (Abbildung 4C).
Abbildung 4: Erste Bildverarbeitungsschritte. A) Ausgabe von einem "on the fly" Bildverarbeitungsskript. B) Beispiel-Mikroaufnahme (links) mit entsprechend automatisch ausgewählten Partikeln, die mit dem crYOLO-Allgemeinenmodell identifiziert wurden (rechts, mit Partikeln, die durch rote Quadrate begrenzt sind) Skalenbalken (weiß) sind 50 nm. C) Ergebnisse aus der 2D-Klassifikation, die Klassen zeigen, die im roten Quadrat verworfen wurden, und Klassen, aus denen Partikel für die weitere Verarbeitung in Grün ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Eine kleine Teilmenge von Partikeln kann verwendet werden, um ein erstes Modell zu erstellen (Abbildung 5A). Dieses Ausgangsmodell kann dann als Ausgangsmodell in der 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung verwendet werden. Im Fall von RagAB enthielt der Datensatz drei verschiedene Konformoren, die während der 3D-Klassifizierung getrennt werden können (Abbildung 5B). Partikel, die zu jeder dieser Klassen beitragen, können dann unabhängig voneinander behandelt und verwendet werden, um eine EM-Dichtekarte zu verfeinern, die dann einer weiteren Interpretation und Modellbildung unterzogen werden kann.
Abbildung 5: Generieren einer 3D-EM-Dichtekarte. A) Typisches Ausgangsmodell, das mit RELION generiert wurde. B) 3D-Klassifikation über 5 Klassen, die die Trennung von Partikeln in drei verschiedene Konformationszustände zeigen: offen-offen (grün), offen-geschlossen (blau), geschlossen-geschlossen (violett). C) Prozess der Maskenerstellung. Die Karte aus der 3D-Verfeinerung (links) sollte in Chimären visualisiert werden. Der Volumen-Viewer kann dann verwendet werden, um den niedrigsten Schwellenwert zu identifizieren, bei dem die Karte frei von unzusammenhängender, verrauschter Dichte (Mitte) ist. Dieser Schwellenwert wird als anfänglicher Binarisierungsschwellenwert in den RELION Mask Erstellungsjob eingegeben. Eine Beispiel-Maskenausgabe ist grau dargestellt (rechts). D) Hochauflösende EM-Dichtekarte des offen-geschlossenen Zustands von RagAB (EMD-10245), gefiltert und eingefärbt nach lokaler Auflösung (Å). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine grundlegende Rohrleitung beschrieben, die auf Proben anwendbar ist, die für Routine-SPA geeignet sind. Während diese Filterpapier-Blotting-Methode der Dünnschichtbildung und -verglasung aufgrund ihrer Verwendung in der überwiegenden Mehrheit der bisherigen SPA-Projekte zweifellos erfolgreich ist, bringt sie eine Reihe von Nachteilen mit sich. Dazu gehören Probenverschwendung, die langsamen Zeitskalen (Sekunden), die erforderlich sind, um den dünnen Film zu bilden und die Probe einzufrieren, berichtete Irreproduzierbarkeit27 und berichtete über negative Auswirkungen der Verwendung von Filterpapier zum Abwischen überschüssiger Flüssigkeit50. In jüngster Zeit wurden neue Technologien entwickelt, um die Reproduzierbarkeit der Dünnschichtproduktion zu verbessern51,52. Es wurden andere Technologien entwickelt, die die Zeit zwischen Probenapplikation und Vitrifikation verkürzen53,54,55. Während filterpapierbasierte Methoden zur Dünnschichtbildung zum Zeitpunkt des Schreibens die allgegenwärtigste Methode der SPA-KryoEM-Probenvorbereitung bleiben, können diese neuen Technologien eine Reihe von Vorteilen in Bezug auf die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Gitterverglasung mit sich bringen und neue Möglichkeiten schaffen, zusätzliche experimentelle Dimensionen wie Zeitauflösung und schnelles Mischen vor der Vitrifikation einzubringen.
Der Prozess des Rasterscreenings ist für die meisten Benutzer derzeit ein qualitativer Prozess, der die Erfassung von Atlanten mit niedriger Vergrößerung beinhaltet, gefolgt von der Aufnahme von Bildern mit hoher Vergrößerung über das Gitter, um die Partikelverteilung zu beurteilen. Während dies für einige Probentypen ein ausreichend robuster Ansatz ist, kann es schwierig sein, mit dem Auge zu beurteilen, ob die Probe tatsächlich das ist, was der Forscher abbilden möchte, oder eine bevorzugte Orientierung hat, zum Beispiel bei kleinen (<200 kDa) Proben oder wo die niedrig aufgelöste Morphologie es schwierig macht, mit dem Auge zu identifizieren, ob eine Reihe von Partikelverteilungen vorhanden sind. Bei einigen Projekten ist es unmöglich festzustellen, ob die Probe wie gewünscht ist, z. B. wo ein Ligand gebunden ist oder wo die Probe gescreent wird, um zu beurteilen, ob eine kleine (z. B. 10 kDa) Untereinheit in Verbindung mit einem Komplex noch vorhanden ist. Für diese Projekte würden vollautomatische Pipelines für die Datenanalyse in Kombination mit einer "kurzen" 0,5 - 1-h-Sammlung, die über Bildverarbeitungsschritte zur 2D-Klassifizierung oder sogar zur 3D-Klassifizierung und -Verfeinerung führen können, helfen, effizient festzustellen, ob eine längere Sammlung gerechtfertigt ist. Diese Pipelines befinden sich noch in der Entwicklung und sind derzeit noch nicht weit verbreitet, aber sie haben das Potenzial, die Effizienz des KryoEM-Rastersiebens zu verbessern, insbesondere bei anspruchsvollen Proben.
Verbesserungen bei direkten Elektronendetektoren sowie Modifikationen in der Mikroskopie in Kombination mit Fortschritten in der Bildverarbeitung wie der Erfassung von Bildverschiebungsdaten haben den Durchsatz und die Qualität der während der Datenerfassung erzeugten Bilder erhöht. Dieser Anstieg der Rate der gesammelten Daten unterstreicht die Notwendigkeit eines gründlichen Screenings von KryoEM-Grids, bevor viele TB an Daten erfasst werden.
CryoEM SPA hat sich zu einer echten Mainstream-Strukturbiologie-Technik entwickelt und in vielen Fällen der "Go to" -Ansatz für einige Klassen von Proben, wie heterogene und labile makromolekulare Komplexe. Während das Protokoll hier einen grundlegenden Überblick über die SPA-Pipeline beschreibt, ist jeder hier behandelte Abschnitt (Gitterverglasung und -screening, KryoEM und Bildverarbeitung) ein Thema für sich und es lohnt sich, während der Entwicklung eines SPA-Projekts untersucht zu werden. Während die Probenvorbereitungs- und Mikroskopietechnologien voranschreiten und neue Bildverarbeitungsalgorithmen und -ansätze online gehen, wird sich SPA als Pipeline weiterentwickeln und Forschern helfen, Einblicke in komplexe biologische Systeme zu gewinnen.
Disclosures
Es werden keine Interessenkonflikte gemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das iNEXT-Discovery (Grant 871037) unterstützt, das durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission finanziert wird. J B. R. White wird vom Wellcome Trust (215064/Z/18/Z) finanziert. Die FEI Titan Krios Mikroskope wurden von der University of Leeds (UoL ABSL Award) und wellcome Trust (108466/Z/15/Z) finanziert. Wir danken M Iadanza für die Verwendung seines Mikrographenanalyseskripts. Wir danken Diamond Light Source für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im nationalen britischen Electron Bio-imaging Centre (eBIC), das vom Wellcome Trust, MRC und BBRSC finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W.
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R.
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al.
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L.
- Dubochet, J., et al.
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al.
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
