Summary
Strukturbestemmelse av makromolekylære komplekser ved hjelp av kryoEM har blitt rutine for visse klasser av proteiner og komplekser. Her oppsummeres denne rørledningen (prøvepreparering, screening, datainnsamling og prosessering), og leserne er rettet mot ytterligere detaljerte ressurser og variabler som kan endres ved mer utfordrende prøver.
Abstract
Kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftig teknikk for strukturbestemmelse av makromolekylære komplekser, via enkeltpartikkelanalyse (SPA). Den generelle prosessen innebærer i) vitrifisere prøven i en tynn film støttet på et cryoEM rutenett; ii) screening av prøven for å vurdere partikkelfordeling og iskvalitet; iii) hvis rutenettet er egnet, samle et enkelt partikkeldatasett for analyse; og iv) bildebehandling for å gi et EM tetthetskart. I denne protokollen gis en oversikt over hvert av disse trinnene, med fokus på variablene som en bruker kan endre under arbeidsflyten og feilsøking av vanlige problemer. Når ekstern mikroskopdrift blir standard i mange anlegg, vil variasjoner på bildeprotokoller for å hjelpe brukere med effektiv drift og avbildning når fysisk tilgang til mikroskopet er begrenset, bli beskrevet.
Introduction
Enkel partikkel CryoEM
For å undersøke livet på et molekylært nivå må vi forstå struktur. Mange teknikker for å sondere proteinstruktur er tilgjengelige, for eksempel NMR, røntgenkrystallografi, massespektrometri og elektronmikroskopi (EM). Til dags dato har de fleste strukturer deponert til Protein Databank (PDB) blitt løst ved hjelp av røntgenkrystallografi. Men fra ~ 2012 og fremover ble kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) en mainstream-teknikk for proteinstrukturbestemmelse og bruken økte dramatisk. Totalt antall EM-kart deponert til Electron Microscopy Databank (EMDB) (per desember 2020) var 13 421 sammenlignet med 1 566 i 2012 (figur 1, www.ebi.co.uk). I 2012 var antall atomkoordinater modellert i kryoEM tetthetskart, avsatt til PDB bare 67, men per desember 2020 har 2309 strukturer blitt deponert så langt, en 35 ganger økning. Denne underliggende veksten i kvaliteten og mengden av kryoEM tetthetskart produsert, noen ganger referert til som "oppløsningsrevolusjonen"1, var forårsaket av en koalescens av fremskritt på flere områder: utvikling av nye kameraer for avbildning kjent som direkte elektrondetektorer; ny programvare; og mer stabile mikroskoper2,3,4.
Figur 1: Kumulative innleveringer til EMDB fra 2012 til desember 2020. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Single particle analysis (SPA) er et kraftig verktøy for å generere biologisk innsikt i et bredt utvalg av prøvetyper ved å belyse høyoppløselige strukturer av isolerte komplekser5,6 inkludert virus7,8, membranproteiner9,10, spiralformede forsamlinger11 og andre dynamiske og heterogene makromolekylære komplekser12,13, hvis størrelser varierer etter størrelsesorden (fra 39 kDa 14,15 til titalls megadaltonn). Her beskrives en protokoll for en standard rørledning for cryoEM SPA fra prøve til struktur.
Før du tar fatt på denne rørledningen, bør en renset prøve bli utsatt for biokjemisk analyse for å vurdere sjansene for nedstrøms suksess. Forberedelse av en passende prøve er uten tvil den største barrieren mot SPA, spesielt for forbigående og heterogene (både komposisjons- og konformasjonskomplekser). Det makromolekylære komplekse preparatet bør inneholde så få forurensninger som mulig, med tilstrekkelig konsentrasjon til å gi mange partikler i hver kryoEM-mikrograf, og i en buffersammensetning som er godt egnet til kryoEM-analyse. Visse bufferbestanddeler, inkludert sukrose, glyserol og høy (~> 350 mM konsentrasjoner av salter, avhengig av prøvestørrelse, egenskaper og andre bufferbestanddeler) kan forstyrre prosessen med vitrifisering eller redusere signal-til-støy-forholdet i bilder, noe som hindrer strukturbestemmelse16.
Vanligvis bør størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og SDS- PAGE gelanalyse brukes til å vurdere prøverenhet17,18, men sirkulær dikromatisme, funksjonelle analyser, SEC kombinert med multi-vinkel lysspredning, og termiske stabilitetsanalyser er alle nyttige verktøy for kvalitativ analyse av makromolekylære komplekse preparater før kryoemanalyse. Resultatene fra disse biokjemiske analysene kan imidlertid gi liten innsikt i utvalgets strukturelle heterogenitet og dens oppførsel på et kryoEM-nett. Av denne grunn brukes negativ flekk EM rutinemessig som et raskt, billig og kraftig verktøy for å vurdere komposisjons- og konformasjons heterogenitet, og derfor en god måte å fastslå hvilken elutionfraksjon fra en rensing som er mest lovende, eller screening av forskjellige buffersammensetninger19,20. Når en lovende prøve er identifisert, kan vi fortsette til SPA cryoEM-rørledningen. Negativ flekk stemmer ikke alltid overens med de etterfølgende resultatene sett i cryoEM; Noen ganger ser en prøve dårlig ut av negativ flekk, men forbedres når den ses i glassaktig is i cryoEM. Noen ganger ser prøver utmerket ut under negative flekktrinn, men krever betydelig ytterligere optimalisering når du går videre til cryoEM. Men i de fleste tilfeller gir negativ flekk et nyttig kvalitetskontrolltrinn.
Vitrifisering
Det harde miljøet i vakuumsystemet til elektronmikroskopet forårsaker både dehydrering og strålingsskader på uløste biologiske prøver21. Derfor, for å avbilde prøven i en innfødt-lignende tilstand, må den biologiske prøven bevares før avbildning. For rensede preparater av makromolekylære komplekser er vitrifisering den valgte metoden for å muliggjøre visualisering ved kryoEM samtidig som atomdetaljene til komplekset bevares. Oppdagelsen av vitrifisering som en metode for prøvepreparering var et grunnleggende fremskritt innen elektronmikroskopi av biologiske prøver, som Dubochet ble anerkjent for i Nobelprisen i kjemi i 2017. Prøvevistrifisering innebærer å skape et tynt lag med løsning som inneholder prøven av interesse, vanligvis titalls nm tykk, suspendert på en cryoEM rutenettstøtte. Den tynne filmen fryses deretter ekstremt raskt i et kryoogen som flytende etan ved ~ -175 ° C. Frysehastigheten er ~ 106 ° C / s, rask nok til at amorf, eller glassaktig is dannes, suspenderer prøven i en tynn, solid film22.
Den første variabelen du må vurdere er cryoEM-rutenettstøtten som er valgt23. Et EM-rutenett består vanligvis av en amorf karbonfilm med perforeringer (enten vanlig eller uregelmessig), over en støttestruktur. Støttestrukturen er vanligvis et sirkulært metallgitter 3,05 mm i diameter, vanligvis laget av kobber, men andre metaller som gull eller molybden (som har foretrukne termiske ekspansjonsegenskaper24) kan brukes. Noen ganger påføres en ekstra tynn, kontinuerlig støtte over rutenettet, for eksempel grafen, grafenoksid eller et tynt (~ 1-2 nm) amorf karbonlag. Mens standard cryoEM-rutenett (vanligvis 400-200 mesh kobber med perforert (1,2 μm runde hull separert med 1,3 μm (r1.2/1.3), eller 2 μm separert med 2 μm karbon (r2/2)) karbonstøtte - selv om mange forskjellige mønstre er tilgjengelige) har blitt brukt i de aller fleste strukturer rapportert til de aller fleste strukturer rapportert å være tilgjengelige) nye nettteknologier med forbedret konduktivitet og redusert prøvebevegelse er rapportert25 . Utvalgte gitter blir utsatt for en glødeutladning / plasmarengjøringsbehandling for å gjøre dem hydrofile og mottagelige for prøveapplikasjon26.
Etter glødutladning er neste trinn tynn filmdannelse. Denne tynne filmen dannes oftest ved hjelp av filterpapir for å fjerne overflødig væske fra rutenettet. Selv om dette kan utføres manuelt, er en rekke dypfrysingsenheter kommersielt tilgjengelige, inkludert Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) og CP3 (Gatan). Med disse enhetene påføres ~ 3-5 μL prøve i oppløsning på EM-rutenettet, etterfulgt av oppblåsthet bort overflødig løsning ved hjelp av filterpapir. Gitteret, med en tynn film suspendert over det, blir deretter kastet i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen (LN2) til ~ -175 °C. Når det er frosset, opprettholdes rutenettet ved en temperatur under devitrifiseringspunktet (-137 °C) før og under avbildning.
Prøvescreening og datainnsamling
Etter vitrifisering av et cryoEM-rutenett, er neste trinn å screene rutenettet for å vurdere kvaliteten og avgjøre om rutenettet er egnet til å gå videre til datainnsamling med høy oppløsning. Et ideelt kryoEM-rutenett har glassaktig is (i motsetning til krystallinsk is) med istykkelsen akkurat tilstrekkelig til å imøtekomme den lengste dimensjonen av prøven, noe som sikrer at den omkringliggende isen bidrar med så lite støy til det resulterende bildet som mulig. Partiklene i isen skal ha en størrelse og (hvis kjent) form i samsvar med biokjemi, og ideelt sett være monodisperse med en tilfeldig fordeling av partikkelretninger. Til slutt bør rutenettet ha nok områder av tilstrekkelig kvalitet til å tilfredsstille ønsket datainnsamlingslengde. Avhengig av prøven kan dette ta mange gjentakelser av vitrifisering og screening til optimale rutenett produseres. Både heldigvis og dessverre er det et stort utvalg av variabler som empirisk kan testes for å endre partikkelfordeling på cryoEM-rutenett (gjennomgått i 16,27). I dette manuskriptet vises representative resultater for et membranproteinprosjekt10.
Når et passende rutenett er identifisert, kan datainnsamlingen fortsette. Flere modeller av kryooverføringselektronmikroskoper for biologiske prøver er optimalisert for å samle inn høyoppløselige data på en automatisert måte. Vanligvis samles data på 300 kV- eller 200 kV-systemer. Automatisert datainnsamling kan oppnås ved hjelp av programvare som EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30 og SerialEM31,32. En automatisert datainnsamling med moderne detektorer resulterer vanligvis i terabyte (TB) av rådata i en 24 timers periode (gjennomsnittlige datasett er ~ 4 TB i størrelse).
På grunn av COVID-19-restriksjonene som er på plass på store deler av verden (skrivetidspunkt desember 2020), har mange mikroskopifasiliteter gått over til å tilby ekstern tilgang. Når rutenettene er lastet inn i autoloaderen til et mikroskop, kan datainnsamling utføres eksternt.
Bildebehandling og modellbygging
Der en datainnsamlingsøkt vanligvis kan være 0,5-4 dager, kan påfølgende bildebehandling ta mange uker og måneder, avhengig av tilgjengeligheten av databehandlingsressurser. Det er standard for innledende bildebehandlingstrinn, nemlig bevegelseskorrigering og kontrastoverføringsfunksjon (CTF) estimering for å finne sted 'på farten' 33,34. For nedstrøms behandling er det en mengde programvarepakker tilgjengelig. Partikler "plukkes" og ekstraheres fra mikrografer35,36. Når partikler er ekstrahert, vil en standardprotokoll være å behandle partiklene gjennom flere runder med klassifisering (i både to dimensjoner (2D) og tre dimensjoner (3D) og / eller fokusert på bestemte interesseområder) for å nå en homogen undergruppe av partikler. Denne homogene undergruppen av partikler blir deretter gjennomsnittet sammen for å produsere en 3D-rekonstruksjon. På dette tidspunktet korrigeres data ofte ytterligere for å produsere et kart av høyeste kvalitet som er mulig, for eksempel gjennom CTF-presisering, forvrengningskorrigeringer37 og bayesiansk polering38 . Utfallet av denne bildebehandlingen er et 3D cryoEM-kart over det biologiske eksemplaret av interesse. Oppløsningsområdet nådd i et "standard" automatisert enkeltpartikkeleksperiment fra et rutenett av tilstrekkelig kvalitet, med data samlet inn på et 300 kV mikroskopsystem er vanligvis mellom 10 Å og 2 Å avhengig av størrelsen og fleksibiliteten til proteinkomplekset. Med et ideelt eksemplar er oppløsninger på ~1.2 Å nå nådd ved hjelp av SPA-arbeidsflyter5. Mens denne protokollen detaljer skritt mot å skaffe en EM tetthet kart, når dette er i hånden det kan tolkes videre gjennom montering og raffinering av en protein modell (hvis oppløsning er < 3.5 Å) eller bygge de novo39. Data knyttet til strukturbestemmelseseksperimenter kan deponeres i offentlige depoter på nettet, inkludert EM-tetthetskart (Electron Microscopy Data Bank)40, resulterende atomkoordinater (Protein Data Bank)41 og rådatasett (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
I denne protokollen brukes det ytre membranproteinkomplekset RagAB (~ 340 kDa) fra Porphyromonas gingivalis som et eksempel makromolekylært kompleks10 (EMPIAR-10543). For de som er nye i cryoEM, er støtte for prøver gjennom dette datasamlebåndet fra utvalg til struktur tilgjengelig, underlagt fagfellevurdering, gjennom finansierte tilgangsordninger som iNEXT Discovery og Instruct.
Protocol
1. Rutenett vitrifisering
MERK: For alle trinn i trinn 1 og 2 må du sørge for at alle verktøy er rene, tørre og ved romtemperatur før du kjøler dem ned til LN2-temperatur , ved hjelp av nydekantet LN2 for å redusere isforurensningen. Der det er mulig, arbeid i et fuktighetskontrollert miljø med < 20% relativ fuktighet. Sørg for at passende personlig verneutstyr og H&S-dokumentasjon er på plass før arbeidet påbegynnes.
- Sørg for at prøven av interesse er klar for prøveforberedelse.
- Velg passende kryoEM-gitter og sørg for at disse er gjengitt hydrofil ved hjelp av glødutladning eller plasmabehandling. Et bredt utvalg av systemer og variasjoner i protokollen er tilgjengelige, men alle innebærer å plassere gitteret i et glødutladnings-/plasmarengjøringssystem og kjøre et program som vil pumpe kammeret til ønsket vakuumnivå, før du introduserer en bestemt gassblanding / kjemisk damp eller luft i systemet. En elektrisk strøm føres gjennom systemet, ioniserer gasspartiklene og induserer overflaten av gitteret som skal gjøres mer hydrofil.
- Start den dype fryseenheten for rutenettvistrifisering ved å slå på systemet ved hjelp av strømbryteren på baksiden, og vent til berøringsskjermen lastes inn.
- Bruk den medfølgende pekepennen eller fingrene, i konsollen, still inn ønsket arbeidstemperatur på kammeret (tilgjengelig område er 4-60 °C, anbefalt for de fleste makromolekyler 4-6 °C).
- Fyll luftfukteren med 50 ml labvann av type II ved hjelp av en sprøyte, via gummislangen nederst på luftfukteren. Sørg for å fjerne eventuell fanget luft i sprøyten før fylling. Vær forsiktig så du ikke overfyller luftfukteren eller vannet vil utstråle inn i kammeret. Når luftfukteren er fylt, trekker du sprøytestempelet tilbake med 5-10 ml for å lage en vakuumforsegling.
- I Konsoll stiller du inn ønsket relativ fuktighet for kammeret (tilgjengelig rekkevidde er 0-100%, fuktighet på 95-100% brukes vanligvis). La luftfuktigheten være satt til "av" til umiddelbart før gitteret kommer, slik at kammeret ikke blir for vått.
- Få tak i pinsett og filterpapir som er kuttet i riktig størrelse for å passe på putene, enten kjøpt eller ved hjelp av et stempel for å kutte en blenderåpning av riktig størrelse.
- Forbered kryogen for dykkfrysing.
- Plasser metall cryo-grid boksholderen, kryoogenkoppen og metall edderkoppens ben i kjølevæskebeholderen.
- Avkjøl beholderen ved å fylle opp det ytre kammeret med LN2. Hold det ytre kammeret fylt opp for å dekke toppen av kryo-rutenettet. Tilsett ~ 1 cm ekstra LN2 i kryogenkoppen for å hjelpe likevekt av systemet til LN2 temperatur.
MERK: Antikontamineringsringen kan brukes til å begrense fuktig luftkondensering rundt kryoogenkoppen og føre til kryokjølende/etanforurensning. Dette er vanligvis ikke nødvendig i et fuktighetskontrollert miljø. Hvis du bruker antikontamineringsringen, må du passe på at du ikke overfyller beholderen med LN2 , ellers kan den søle når ringen trykkes inn i beholderen senere i prosessen. - Vent 3-5 min for å observere kokingen av edderkoppbenene, og vent deretter ytterligere 3 minutter for å sikre at kryoogenkoppen er tilstrekkelig kald til å kondensere vitrifiseringsmediet.
- Liquefy kryogen (flytende etan) inn i kryoogen koppen.
- Ta etanflaskerøret med tynne slanger og en dyse for å dispensere gassen. En P200 pipettespiss med blenderåpningen åpnet ved å kutte av selve spissen ved hjelp av et barberblad er ideelt her. En bredere blenderåpning er nødvendig for å forhindre etan størkning på spissen og blokkere strømmen av gass.
- Pass på at kryoogenkoppen ikke inneholder gjenværende LN2, ta etangassdysen og legg den i kryogenkoppen. Bruk gassflaskeregulatoren til å starte en lav strømning og dispenser kryogengass i kryoogenkoppen for å kondensere gassen. Hold spissen som gassen strømmer direkte presset mot veggen av kryoogenkoppen, men beveg den forsiktig frem og tilbake i en tappebevegelse mot overflaten. Reguler gassstrømmen slik at en lav, jevn strømning kan begynne å kondensere/flytende på en kontrollert måte i kryogenkoppen.
- Fyll koppen til like under den sølvfargede edderkoppkanten og stopp gassstrømmen, og fjern deretter gassledningen forsiktig for å unngå å forurense den omkringliggende LN2 med etan.
- Fyll på kjølevæskebeholderen med LN2, og vær veldig forsiktig så du ikke søler noen inn i det flytende etanet.
- La edderkoppbenene være på plass i ~ 3-5 min for å sikre at væske etanet er likevektet til en tilstrekkelig kald temperatur. Kryogenet vil begynne å se overskyet / litt ugjennomsiktig ut. Dette indikerer at den er nær frysepunktet. På dette stadiet, bruk pinsett for å fjerne edderkoppen. Så lenge LN2 holdes inne i beholderen rundt kryogenkoppen, vil etanet nå forbli flytende og egnet for vitrifisering i 1-2 timer. Ta imidlertid sikte på å fullføre prosedyren så raskt som mulig, spesielt i ikke-fuktighetskontrollerte rom, for å redusere isforurensning.
MERK: Hvis edderkoppen ser ut til å være "fast på", bruk et metallobjekt som en mutter og hold mot edderkoppens ben for å varme dem litt opp, og fjern deretter bena.
- Forbered den dype fryseenheten og tilbehøret for prøvefestning.
- Legg til oppbevaringsbokser for rutenett i metall cryo-grid-boksholderen, og gjennom hele prosedyren sikrer du at LN2 holdes fylt opp til like over rutenettkassene (vanligvis hver ~ 5 min).
- På skjermen for dypfrysingsenhet legger du inn de valgte parametrene i Prosessparametere-boksen , inkludert: blolottid (tiden de stuper frysende enhetsputene kommer sammen), kraft (avstanden til blotting pads fra rutenettet, som endrer gradienten av isdannelse) og totalt (antall ganger blotting pads vil komme inn for å møte). Velg disse parametrene basert på den enkelte stupefryseenhet og oppførsel av makromolekylet. Typiske verdier er en flekkkraft mellom 0 og 5, flekktid fra 1-6 s og en blott totalt 1. Typisk ventetid (tid mellom å starte blottet og blolot begynnelsen) og dreneringstid (tid etter oppblåsthet før stuping) er 0-2 s.
MERK: Avhengig av brukerpreferanser kan flere alternativer i delen Alternativer, Diverse velges, inkludert Bruk fotpedal for å gå til neste trinn på hvert trykk, Hopp over rutenettoverføring (hopper over det siste trinnet der pinsettarmen heves litt), slå av fuktighet under prosessen (mens prøven brukes, stopper aktiv fukting av kammeret som kan gjøre det vanskeligere å se rutenettet) og Autoraise Ethanelift (kombinerer trinnet med pinsett som heves inn i kammeret og hever kjølevæskebeholderen - hopper Øk etanbeholdertrinnet ). Her er alle disse alternativene slått på. - Plasser kjølevæskebeholderen sikkert på den bevegelige plattformarmen under kammeret
- Sett inn ferskt blottingspapir på hver blotterarm, og pass på at plastringklemmene er festet. Hvert filterpapir tillater 16 flekker (armene roterer blotting papir). Trykk knappen Tilbakestill flekkpapir i Kontroller-delen .
- Kjør 1 full syklus av den dypfrysende enhetens vitrifiseringsprosess for å sikre at hver bevegelige del oppfører seg som forventet.
- Trykk (eller bruk fotpedal) for å plassere nytt rutenett, deretter Start prosess, og deretter Behandle og fortsett. På dette stadiet, se for å sikre at blotting armene kontakter hverandre som forventet.
- Slå på luftfukteren. Vanndamp vil bli produsert (så lenge den innstilte fuktigheten er høyere enn for tiden i kammeret).
- Prøven av interesse kan nå vitrifiseres. Bruk fotpedalen eller Plasser nytt rutenett, og den stupestangen kommer ned fra kammeret slik at pinsettene kan festes i braketten.
- Bruk pinsett med dykkfrysing, plukk opp ønsket glødutladet / plasmarengjort kryoEM-rutenett, pass på å merke seg hvilken side som er riktig side som skal brukes til prøveapplikasjon i henhold til rutenettprodusenten. Plukk opp gitteret ved kanten, pass på å unngå overdreven / unødvendig kontakt med pinsettene, da dette vil skade støtten. Fest rutenettet i pinsettene ved å flytte den svarte klipsen ned til den ristede delen av pinsettene. Gitteret må holdes sikkert, men klipsen bør ikke være for langt nede, da den vil kontakte blotting pads, noe som fører til uopprettelig blotting, og senere må pinsettene holdes under dette punktet når du slipper klippet.
- Plasser stupefryseapparatets pinsett som holder cryoEM-rutenettet på den pneumatiske armen med riktig side vendt mot den dominerende hånden. Utformingen av stupefryseapparatet pinsett og kammer er slik at prøven kan påføres gjennom enten høyre eller venstre side av kammeret, i henhold til brukerens hånd.
MERK: Bruk av prøven på forskjellige sider med de samme blottingsparametrene resulterer sjelden i sammenlignbare resultater, så venstrehendte forskere må kanskje justere blottingsparametrene uavhengig av sine høyrehendte kolleger. - Trykk startprosess og gitteret som holdes i pinsettene vil bli tatt inn i kammeret og kjølevæskebeholderen vil bli hevet.
- Trykkprosess og pinsett vil flytte rutenettet til posisjonen der en pipette kan brukes til å påføre prøven på rutenettet. Åpne sideporten som vender mot riktig side av rutenettet og påfør prøve ved pipettering, og pass på at pipettespissen ikke berører gitteret, da det kan føre til skade på rutenettstøtten / bøying av rutenettet, men dispenser væsken nær nok slik at dråpen dispenserer på rutenettet. Vanligvis påføres 3-5 μL.
- Trykk på Fortsett og brukerdefinerte parametere vil flekke rutenettet og deretter stupe pinsettene med rutenettet montert i kjølevæskekoppen for prøvevistrifisering. Pinsett vil synke sammen med armen som holder kjølevæskebeholderen og kjølevæsken, og holder rutenettet nedsenket i kryoogenet.
- Overfør rutenettet fra kryoogenkoppen til oppbevaringsboksen nedsenket i LN2.
- Løsne pinsettene fra pinsettarmen, og pass på at du ikke kontakter det vitrifiserte rutenettet med sidene av kryogenkoppen. Juster grepet slik at pinsettene holdes komfortabelt. Så raskt og forsiktig som mulig, flytt rutenettet fra kryoogenet til LN2. Med den ene hånden holder du pinsettene lukket med fingrene, og med den andre hånden skyver du den svarte klipsen oppover og holder pinsettene lukket. Juster grepet og manipuler rutenettet til oppbevaringsboksen for rutenettet.
- Gjenta trinn 1.10-1.19 til alle rutenett er laget (en vanlig økt vil innebære å lage 4-12 rutenett). Oppbevar alle oppbevaringsbokser for rutenett som inneholder rutenett i LN2-dewar til de neste stadiene.
2. Klippegitter for lasting i et autoloadermikroskop
- Klipp rutenett inn i autogridsamling i henhold til protokollen som tidligere er beskrevet 28.
3. Sikker ekstern pålogging til mikroskoper
MERK: Med COVID-19-kontroller i skrivende stund, men også med miljøhensyn knyttet til internasjonale reiser, har flere mikroskopianlegg tilbudt tjenester der brukeren opererer eksternt. Implementeringsmetoden for dette vil variere avhengig av den lokale IT-konfigurasjonen for hvert anlegg, og behovene til det interne og eksterne brukerfelleskapet. Her er prosessen for ekstern tilgang til kryoEMer ved eBIC og kontroll av mikroskopet gjennom EPU-programvare beskrevet.
- Logg inn på cryoEM-er eksternt. Ekstern pålogging formidles via NoMachine-programvare for å få tilgang til mikroskopstøtte-PCen og er konfigurert til bare å gi tilgang til brukere som er registrert på et besøk via fedid-påloggingslegitimasjonen for brukerne. Access forblir bare aktiv så lenge økten varer.
- Åpne NoMachine og start en ny NX-tilkobling for å nx-cloud.diamond.ac.uk med passordgodkjenning.
- Åpne tilkoblingen og logg inn med brukernavnet fedid@fed.cclrc.ac.uk og FedID passord. Dobbeltklikk ikonet som tilsvarer relevant mikroskop, fra de tilgjengelige alternativene for å åpne en tilkobling til den relevante støtte-PCen.
- Skriv inn brukernavn clrc\FedID og passord på påloggingsskjermbildet for Windows.
- Åpne TeamViewer-programvare fra skrivebordsikonet og koble til PartnerID: TEM med det medfølgende passordet. Dette oppretter tilkoblingen fra støtte-PCen til TEM-PCen. Neste skjerm-knappen på TeamViewer-båndet kan brukes til å veksle mellom mikroskopbrukergrensesnittet og EPU-vinduet.
- Mikroskopfunksjoner kan deretter styres av brukere direkte gjennom EPU-grensesnittet.
4. Laste prøver inn i et autoloadermikroskop og screening for is- og prøvekvalitet
MERK: I denne delen brukes et mikroskop med autoloader og EPU-programvare til prøvescreening, men dette kan oppnås ved hjelp av annen programvare og et sideinngangssystem og kryoEMer fra andre produsenter.
- Last klipte gitter inn i mikroskopets autoloader som tidligere beskrevet28.
- I kategorien autoloader i mikroskopets brukergrensesnitt, tabulerer du ut dialogboksen Alternativer ved hjelp av pilen og trykker på Inventar-knappen . Dette vil sekvensielt kontrollere hver posisjon i kassetten for å finne ut om det finnes en patron. Okkuperte spilleautomater vil bli merket i blått. Hvis alle okkuperte spor er tilordnet, trykker du på Inventory-knappen igjen for å stoppe etter gjeldende posisjon, ellers lar du kjøre til alle okkuperte spor er tilordnet. Merk alle okkuperte spor med prøvedetaljene i de medfølgende boksene.
- Merk rutenettet som skal overføres til mikroskopkolonnen, og klikk Last inn. Sporetiketten blir fra blå til gul når rutenettet er lastet inn på scenen. Fortsett til å skjerme rutenettene.
- Åpne EPU-programvare. Velg Anskaffelsesoptikk og innstillinger på Forberedelse-siden, og velg deretter Atlas-forhåndsinnstillingen fra rullegardinmenyen. Velg passende forhåndsinnstillinger for stråleinnstilling (f.eks. 64x nominell mag, spotstørrelse 5, Mikrobeskyttelse, med et opplyst område i parallellområdet for Falcon-detektor - for ytterligere informasjon valg av stråleinnstilling forhåndsinnstillinger se28). Trykk på Set for å skyve parametrene til mikroskopet.
- Trykk åpne søyleventiler og sett inn FluScreen. Kontroller at en bjelke er synlig og tilstrekkelig spredt og sentrert for å dekke detektoren. Hvis det er nødvendig, navigerer du til et tynnere område av rutenettet ved hjelp av styrespaken eller scenemenyen for å kontrollere trinnbevegelser i X og Y.
- Løft FluScreen og ta et bilde ved hjelp av Forhåndsvisning-knappen i EPU. Basert på det oppkjøpte bildet kan dosen økes ved å flytte til et lavere tall spotstørrelse, og omvendt.
- Gå til Atlas-siden i EPU, og trykk ny økt. Velg MRC-bildeformat og skriv inn et passende mappenavn og -plassering for lagring av screeningøkten, og klikk deretter på Bruk.
- Velg Screening fra menyen til venstre. Merk av i avmerkingsboksene ved siden av hvert rutenett for å få anskaffet en atlasmontasje. Start screeningøkten i EPU. Det vil bli anskaffet et atlas for hvert kontrollerte rutenett, med en rekke tilgjengelige rutenettstorg oppført etter ferdigstillelse. Hvert atlas kan sees ved å fremheve det på screeningsiden, komplett med en markering som viser rutenett firkanter med en lignende predikert istykkelse gruppert etter farge.
- Når du er ferdig, gjennomgår du de innsamlede atlasene og identifiserer rutenettene som er egnet for å vurdere prøvekvaliteten ved høyere forstørrelser (dvs. de med et passende antall rutenettstorg som verken er tørre eller skjult av tykk is). Merk det valgte rutenettet på EPU-screeningmenyen, og klikk på Last inn eksempel.
- Bruk forhåndsinnstillingene for stråleinnstilling (se 28 for forklaring av forhåndsinnstillinger for stråleinnstilling ønsket for hvert trinn) og forhåndsvisningsfunksjonen for å undersøke de ønskede rutenettplassene mer detaljert.
- Fra Atlas-screeningmenyen velger du rutenettet som er lastet inn for øyeblikket, og flytter scenen til en rutenett firkant som inneholder fylte hull ved å høyreklikke over ønsket sted på rutenettbildet og velge flytt til rutenett firkant.
- Gå tilbake til EPU, Forberedelse-siden , og velg GridSquare-forhåndsinnstillingen .
- Åpne siden EPU, Automatiske funksjoner og kjør Automatisk eusentrisk etter trinn-tilt med GridSquare-forhåndsinnstillingen for å flytte eksemplet til eusentrisk høyde.
MERK: Automatisk eusentrisk etter strålevinkel er også tilgjengelig, noe som er raskere, men vanligvis mindre nøyaktig enn automatisk eusentrisk etter trinnvinkel. - I EPU, Forberedelse, ta et nytt GridSquare Preview-bilde . Legg merke til de forskjellige grå verdiene på tvers av forskjellige hull som indikerer forskjellige istykkelser. Flytt scenen over et hull ved å høyreklikke > flytte scenen her. Velg forhåndsinnstillingen for hull/eusentrisk høyde og forhåndsvisning.
MERK: Avhengig av molekylvekten og formen på interessepartikkelen, kan det være mulig å identifisere den ved hull/eusentrisk høydeforstørrelse. - Velg Forhåndsinnstilling for datainnsamling og angi en forstørrelse som gjør det enkelt å identifisere partiklene (tilsvarende et objektprøvetaking av vanligvis <2 Å/piksel). Sett defokusforskyvningen til ~-3 til -5 μm med en eksponeringselektrondose på ~40-80 e-/ Å2.
- Gå gjennom trinn i 4.4 for å vurdere en rekke istykkelser for partikkelfordeling, orientering og forurensning over hele rutenettet. Partikkelfordelingen kan variere nær kantene i forhold til midten av hullet, og derfor er det viktig å kartlegge forskjellige steder med hullet.
- Screen alle rutenett som viser løfte fra atlas som har tilstrekkelige rutenett firkanter. Enten oppbevar disse i mikroskopet og fortsett til datainnsamling ved hjelp av EPU, eller fjern prøvene fra mikroskopet og lagre under LN2 til datainnsamlingen er planlagt.
5. Innsamling av enkeltpartikkel cryoEM-data (med fokus på fjerndrift)
MERK: En detaljert protokoll for datainnsamling med EPU er beskrevet i produsentens håndbok og andre steder28. Her er endringer i denne protokollen for fjerndrift (nemlig å redusere bruken av håndpanelene for å utføre oppgaver og bruke programvarebaserte alternativer) uthevet.
- Med mindre en allerede er samlet inn i løpet av økten, kan du samle inn et Atlas for nettet.
- Definer hver av forhåndsinnstillingene for stråleinnstilling i henhold til prosjektets eksperimentelle behov.
- Utfør bildeskiftkalibreringer28.
- Sett opp EPU-økten.
- I EPU velger du EPU-siden og deretter Øktoppsett, velger Ny økt og Deretter Ny fra innstillinger.
- Velg Ny økt Et popup-vindu vises med et alternativ for å bruke tidligere innstillinger. Ja vil automatisk laste inn innstillingene fra forrige EPU (dvs. prøvebærer, defokusområde, autofokusinnstillinger, rutenetttype) i gjeldende EPU-økt. Hvis du velger Ny fra innstillinger, kan brukeren velge en fil med lagrede innstillinger (dvs. defokusområde, autofokusinnstillinger, rutenetttype), og denne informasjonen blir forhåndslastet til EPU.
- Fyll ut øktnavnet med noe informativt. Det lokale anlegget kan foreslå en navnekonvensjon.
- Velg Manuell under Type.
- For anskaffelsesmodus velger du nøyaktig hullsentrering eller raskere anskaffelse.
- Velg ønsket format i bildeformat .
- Velg en passende lagringsmappe, og EPU oppretter en mappe med øktnavnet.
- Velg riktig specimen carrier i henhold til hvilken rutenetttype og hullavstand som brukes (f.eks. Quantifoil 1.2/1.3), og trykk på Apply. Denne protokollen beskriver prosessen for å generere en mal for en vanlig matrise med hull
- Velg en innledende rutenettstorg, og angi en anskaffelsesmal.
- Gå til Firkantet markering, hvis alle rutene er grønne, klikker du på fjern merking øverst til venstre.
- Åpne fliser (høyreklikk > åpne flisen). Merk en firkant (høyreklikk > legg til, høyreklikk > Flytt trinn til rutenetts firkant).
- Gå til Hullvalg , og trykk Automatisk eusentrisk. Vent til dette er fullført og et Grid Square-bilde er tatt. Hvis autofunksjonen mislykkes, kan dette skyldes at høyden er betydelig av; I så fall kan den justeres manuelt ved hjelp av FluScreen ved Grid Square-forstørrelsen.
- Mål hullstørrelse. Flytt og juster de gule sirklene slik at de er over hullene med riktig størrelse og avstand.
- Trykk på Finn hull. Kontroller at hullene er funnet riktig. Hvis ikke endre hullstørrelsen og finn hull igjen. Gjenta dette til det finner hullet riktig. Hvis den mislykkes konsekvent, bør du vurdere å gå til en lavere tall (lysere) spotstørrelse ved kvadratisk forstørrelse i rutenettet.
- Bruk histogrammet filteriskvalitet til høyre for å justere hullvalget. Dette kan være nyttig for å utelukke områder med tykk is og tynn is. Dette vil bli husket for fremtidige rutenett firkanter valgt i løpet av denne økten.
- Optimaliser hullvalg med verktøyene i Velg-menyen øverst. Klikk for eksempel Fjern hull nær rutenettlinjen.
- Gå til Maldefinisjon , og trykk Hent.
- Klikk på Finn og midt i hullet. Det vil nå være et bilde av et hull med en gul sirkel rundt hullet.
MERK: Hvis den sliter med å finne hullet, setter du inn objektivåpningen. Hvis det fremdeles ikke finner hullet, kan du prøve å øke eksponeringstiden for forhåndsinnstillingen for hull/eusentrisk høyde eller øke defokuset for denne forhåndsinnstillingen eller skyve bildet. En stor defokusendring kan endre bildeforskyvningsjusteringen. - Endre forsinkelsen etter faseskift og forsinkelsen etter bildeskifttidene til 1-5 s.
- Merk av for Maksimal bildeskiftverdi (hvis alternativet er tilgjengelig) er som ønsket. Hvis aberrasjonsfri bildeskiftsamling brukes, defineres denne verdien i EPU-konfigurasjonsfilen, ellers er 5 μm en standardverdi.
- Klikk på Legg til anskaffelsesområde, og klikk deretter hvor som helst på bildet. Flytt oppkjøpsområdet til ønsket sted (dvs. på kanten av et hull) slik at oppkjøpsområder ikke blir dobbelt eksponert med bjelken (firkanten i den grønne sirkelen representerer detektorområdet, den grønne sirkelen er bjelkediameteren).
- Legg til defokusområdet øverst til høyre. Legg deretter til andre anskaffelsesområder. En typisk defokusliste for et membranproteinprosjekt er -0,8 til -3 μm defokus.
- Klikk Legg til autofokusområde , og klikk hvor som helst i bildet. Flytt autofokusområdet til karbonet som omgir et hull. Standard praksis er å autofokusere etter sentrering når du bruker AFIS, eller hver 5-15 μm, avhengig av z-høydevariasjonen over firkanten.
- Klikk legg til driftmålingsområde, driftmåling utført én gang per rutenettstorg, med en angitt terskel på 0,05 nm/s er en standardinnstilling. Driftmålingsområdet kan (og det er lurt å) overlappe direkte med autofokusområdet. Pass på at verken drift- eller autofokusområdet overlapper med et oppkjøpsområde.
MERK: Malen kan kontrolleres ved hjelp av funksjonen for malutførelse. Dette er en god idé å se om oppkjøpsområdene må bevege seg (f.eks. for mye/ikke nok karbon i bilder), men det er ikke nødvendig. - Gå tilbake til Firkantet valg, og velg rutene for anskaffelse på rutenettet. Bruk antall innsamlingsområder og forventet datainnsamlingsrate (fra innretning basert på detektorer og eksperimentelt oppsett) for å forutsi hvor mange anskaffelsesområder som kreves.
- Når alle ønskede firkanter er valgt, trykker du på Forbered alle firkanter.
- Når hver firkant er samlet, navigerer du mellom rutenettplassene og finjusterer hullene ved hjelp av markeringspenselen.
- Flytt til et stadiumsted over prøven og bruk automatiske funksjoner for å angi eusentrisk høyde. Utfør mikroskopjusteringer som tidligere beskrevet28, men i stedet for å utføre komafri justering og korrigering for objektiv astigmatisme manuelt, bruk justeringsverktøy i programvaren. Kort sagt, sett anskaffelsesbjelkeforhold, sørg for at objektiv blenderåpning (OA) fjernes og scenen er plassert over et bjelkestabilt prøveområde i eusentrisk høyde. Utfør komafri justering i autofunksjonene før du setter inn og sentrerer OA på nytt og korrigerer objektivet astigmatisme med EPU. Sørg for at begge justeringene konvergerer på egnede verdier (<150 nm koma og nær null astigmatisme.
- Før du starter den automatiserte anskaffelseskjøringen, må du kontrollere at turbopumpen for autoloader er slått av, og at objektiv blenderåpning er satt inn.
- I Automatisert anskaffelse trykker du på Start run for å starte automatisert datainnsamling.
6. Bildebehandling for å gi EM tetthetskart
MERK: De fleste cryoEM-fasiliteter tilbyr forhåndsbehandling av mikrograffilmer 'på farten'. Det finnes et bredt utvalg av programvarepakker og tilnærminger tilgjengelig for dette, inkludert RELION-rørledninger28,33, cryoSPARC43, Scipion34 og WarpEM44. En RELION-basert rørledning er beskrevet her, og det antas at brukeren har flyttet mikrograffilmene til et passende lagringssted med tilgang til databehandlingsressurser. En oversikt over prosessen og representative resultater for et membranproteinprosjekt er gitt, en detaljert beskrivelse og trinnvis opplæring finner du på RELION-hjemmesiden: https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion.
- Utfør "on the fly"-analyse av mikrografbevegelseskorreksjon og CTF-estimering. Start RELION i prosjektkatalogen. Planlegg import-, bevegelseskorrigerings- og CTF-estimeringsjobber slik at de er samtidige med datainnsamling og overføring. Et mikrografanalyseskript28 gir visuell tilbakemelding i sanntid om astigmatisme og estimerte defokusverdier (se representative resultater).
- Velg partikler fra forhåndsbehandlede mikrografer. Det finnes en rekke automatiserte partikkelplukkingsprogramvarepakker å velge mellom. Referansefrie og malbaserte plukkalternativer er tilgjengelige i kategorien Automatisk plukking i RELION37. Andre programmer kan brukes til ulike trinn, for eksempel ved bruk av crYOLO for partikkelplukking35.
- Trekk ut partikler fra de CTF-korrigerte mikrografene.
MERK: For å redusere beregningstiden som kreves for tidlig opprydding, "opprydding", behandlingstrinn, nedskalering/beholder partiklene ved ekstraksjon. Detaljer om hvordan du kjører ekstraktjobben finner du i RELION 3.1-opplæringen. For dette prosjektet ble partikler i utgangspunktet binned av en faktor på 2. - Utfør gjennomsnitt av 2D-klasse. Klassifisering på tvers av 100-200 klasser fungerer bra for de fleste datasett som inneholder ≥ 100 000 partikler. Det anbefales ikke å bruke mange flere enn 200 klasser eller færre enn 50 klasser, selv om datasettene er små med mindre prøven har høy symmetri (dvs. icosahedralvirus) i så fall kan færre enn 50 klasser fortsatt gi et godt resultat. Sett maskediameteren stor nok til å imøtekomme partikkelens lengste dimensjon, men stram nok til å utelukke eventuelle nabopartikler (dette kan kreve litt prøving og feiling).
- Velg gode klasser (dvs. klasser med strukturelle detaljer) ved hjelp av kategorivalgjobben. Eksempler på gode og dårlige 2D-klassegjennomsnitt finner du i den representative resultatseksjonen.
- Generer en innledende modell de novo fra dataene ved hjelp av den opprinnelige 3D-modelljobben i RELION.
MERK: Mindre rene partikkelstakker kan dra nytte av multi-referanse ab initio SGD (stokastisk gradient nedstigning) raffinement siden dette gir en ekstra mulighet til å sile ut søppel / sub-optimale partikler. Velg en maskediameter som kan romme interessepartikkelen, og la standardverdiene for felt stå i kategorien SGD siden disse rutinemessig fungerer bra. Forsikre deg om at den første modellen ser rimelig ut i Chimera (eller et annet passende visualiseringsprogram) (se representative resultater). - Utfør 3D-klassifisering for å adressere heterogenitet i dataene ved hjelp av utdataene fra trinn 6.6 som referansemodell. Vurder de resulterende kartene i Chimera. Behandle partikkelstakker som tilsvarer unike konformasjonstilstander uavhengig av hverandre. Bruk delsettvalgjobben til å velge en klasse/klasser av interesse og generere particles.star-filer for de tilknyttede partikkelstakkene.
- Kjør automatisk 3D-presisering. Bruk gjennomsnittet for 3D-klassen oppnådd i forrige trinn som referanser for presisering av de tilsvarende partikkelstabelene. Hvis oppløsningen av raffinementet nærmer seg Nyquist-grensen for dataene, trekker du ut partiklene på nytt uten nedskalering. Etter re-ekstraksjon, gjenta 3D auto-raffinering jobb med unbinned partikkelstakk. I dette tilfellet må 3D-referansemodellene skaleres på nytt slik at piksel- og boksstørrelsene er i samsvar med størrelsene på de reutpakkede partikkelbildene. Bruk kommandolinjeverktøyet relion_image_handler til å utføre denne operasjonen.
- Bruk symmetri i raffinement hvis det er hensiktsmessig. Hvis et rekonstruert kart har symmetri, justerer du kartet på riktig symmetriakse ved hjelp av kommandolinjeverktøyet relion_align_symmetry. Bruk den resulterende justerte tilordningen som referanse i en ny 3D-automatisk presiseringsjobb med riktig symmetrioperator angitt i referansekategorien.
- Gjør kart skarpere fra automatisk 3D-presisering. Dette gjøres ved hjelp av etterbehandlingsjobben i RELION, men først må en passende maske opprettes fra det raffinerte kartet. Trinnene for maskeoppretting og etterbehandling er beskrevet i RELION-opplæringen (se også representative resultater).
MERK: Oppløsningen av mange rekonstruksjoner kan forbedres ytterligere ved hjelp av bayesiansk polering og CTF-raffineringsfunksjoner i RELION. Bruk CTF-raffineringsjobbtypen til å estimere og korrigere for avvik i høyere rekkefølge (bjelkevinkel, trefoil-avvik og fjerde ordens avvik) og, som separate jobber, anisotropisk forstørrelse og per partikkeldefokus. Etter dette, bruk bayesiansk poleringsjobb (opplært eller med standardverdier) for å adressere stråleindusert bevegelse per partikkelbasis. Som omtalt i RELION 3.1 opplæringen, vil disse jobbene sannsynligvis dra nytte av en iterativ tilnærming (CTF-raffinement → bayesiansk polering → 3D auto-raffinement → etterbehandling → ... sløyfe) siden begge drar nytte av modeller med høyere oppløsning. - Korrigere handedness av EM tetthet kart om nødvendig. Undersøk kartene for å finne ut om handedness er riktig enten ved å forsøke å passe til en eksisterende atommodell, eller vurdere handedness av alfa spiralformede regioner. Om nødvendig kan du vende kartet langs z-aksen i UCSF Chimera45 ved hjelp av kommandoen vop zflip.
Representative Results
Ved screening kan rutenett kastes på atlasstadiet, der funksjoner som løses ved lav forstørrelse markerer rutenettet som ikke egnet for datainnsamling. Hvis for eksempel et rutenett har vært utsatt for betydelig mekanisk skade med de fleste rutenettsnøser brutt (figur 2A), eller der rutenettet ser ut til å være "tørt", uten glassaktig is (figur 2B). Slike rutenett kan vanligvis identifiseres fordi kantene på rutenettplassene ser skarpe og distinkte ut. Over de fleste gitter laget ved hjelp av den dype fryseanordningen observeres en isgradient (figur 2C,D). Partikkelfordeling, avhengig av prøven av interesse, kan variere dramatisk med istykkelsen, og derfor anbefales det å screene en rekke rutenett firkanter for å vurdere partikkelfordeling. Verktøy har blitt implementert i EPU-programvare under atlasscreeningstrinnet for å hjelpe brukeren med å identifisere rutenetttorg med lignende eller annen istykkelse, noe som kan være spesielt nyttig for brukere som er nye i å undersøke cryoEM-rutenett (figur 2E, F).
Figur 2: Eksempel på lav forstørrelsesmontasje fra screeningøkter. A) Et rutenett som har fått betydelige skader med de fleste grid firkanter ødelagt - uegnet for innsamling. B) Et tørt gitter uten glassaktig is - uegnet til oppsamling. C) Et rutenett som demonstrerer en isgradient med ~ 50% av rutenettet som kan brukes. D) En isgradient med ~ 33% av rutenettet som kan brukes. Både C og D, er egnet for datainnsamling hvis de brukbare rutenettplassene har en istykkelse som passer for innsamling, og det er nok oppkjøpsområder til å tilfredsstille minimumsvarigheten til en samling (f.eks. 24 timer) E) Et eksempelatlas med utvalg av istykkelser. F) Det samme atlaset presentert i E, men med, rutenett firkanter kategorisert og farget av EPU programvare i henhold til istykkelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved screening av partikkelfordeling må du sørge for at bildeparametere, for eksempel forstørrelse og total elektrondose, ligner de som forventes å bli brukt under datainnsamling for å gi et nøyaktig bilde av forventede resultater. Under screening er en ideell partikkelfordeling monodisperse med en rekke partikkelretninger synlige (avhengig av prøven og eksisterende kunnskap om partikkelens morfologi, kan dette være utfordrende å fastslå) (figur 3A). Isen skal være så tynn som mulig mens den imøtekommer partiklenes største dimensjon, hvis isen er for tynn, kan den smelte når den belyses med elektronstrålen. Dette fører til overdreven bevegelse i mikrografen, og områder som viser denne egenskapen bør unngås (figur 3B). Fra kollektiv erfaring observeres denne effekten oftest når det er vaskemiddel i bufferen. Dette kan resultere i veldig tynn is i midten av hullet, og slik at partikler kan utelukkes fysisk og tvinges mot kanten. Denne effekten observeres i figur 3C, men i dette tilfellet er det ikke et ekstremt eksempel, og disse bildene vil fortsatt nyttig bidra til et datasett. Til slutt må isen være glassaktig; utelukke områder av rutenettet (eller rutenettene) der flertallet eller alle bildene som er tatt, viser krystallinsk is (figur 3D) fra datainnsamlingen. Ofte observeres ikke-glassaktig is på kanten av rutenettet. Leserne henvises til detaljerte gjennomganger av variablene som kan endres under rutenett vitrification16 og beskrivelser av partikkeladferd i tynnfilmmiljøet46,47 for ytterligere informasjon.
Figur 3: Representative mikrografer som viser ulike partikkelfordelinger. A) En "ideell" fordeling av monodisperse partikler som vedtar en rekke orienteringer. B) Altfor tynn is midt i hullet som den deformerer ved eksponering for elektronstrålen forårsaker overdreven bevegelse i mikrografen. Denne effekten observeres oftest når vaskemiddel er til stede i bufferen C) Der isen er tynnere i midten av hullet, utelukker dette fysisk partikler fra midten, noe som forårsaker trengsel av partikler mot hullkanten. I dette tilfellet er det ikke ekstremt nok til å forhindre at disse bildene er nyttige, men det antyder at det er verdt å screene litt tykkere områder. D) Is er ikke glasslegemet, data bør ikke samles inn på områder som ser ut som dette eksempelmikrografen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
On-the-fly bildebehandling kan bidra til å plukke opp feil og problemer med datainnsamling, og det anbefales alltid der det er mulig. For eksempel kan overdreven bevegelse i mikrografer indikere at autoloader turbopumpen er aktiv, eller data samles inn på et sprukket rutenett der isen beveger seg betydelig i elektronstrålen, noe som indikerer at rutenettet skal hoppes over. På farten kan CTF-estimering avdekke omstendigheter der et positivt fokuspunkt (i stedet for defokus) påføres (der CTF-estimeringsprogrammer og parametere for å finne disse punktene brukes), og bestemme faseskiftet der en Volta faseplate48 brukes. På rørledningene for behandling av flybilder inneholder ofte et grafisk sammendrag av dataene (figur 4A) for å gjøre det enklere for brukere å vurdere mikrografkvaliteten raskt og avgjøre om det kreves datainnsamlingsendringer.
Valg av partikler fra mikrografer, samtidig som man unngår «falske positiver» som forurensning eller rutenettstøttefilm, kan kreve optimalisering. Imidlertid fungerer partikkelplukkere som crYOLO ofte tilstrekkelig godt ved hjelp av standardparametere for en "første omgang" av dataene (figur 4B), noe som muliggjør progresjon til 2D-klassegjennomsnitt der det kan være lettere å vurdere kvaliteten på dataene og sannsynligheten for nedstrøms suksess. For de fleste prosjekter bør 2D-klassifisering av ~ > 10k partikler begynne å avsløre klasser som har sekundærstrukturdetaljer. For å gå videre til 3D, bør 2D-klassifiseringsfasen vanligvis avsløre klasser som representerer en rekke partikkelretninger. Hvis en foretrukket orientering avsløres, kan det være nødvendig med flere gjentakelser av prøvepreparering16 eller ytterligere datainnsamling med prøven vippet49. Alle klasser som viser sekundærstrukturdetaljer, bør velges for å gå videre til 3D-analyse, mens "søppelpartikler" kastes (figur 4C).
Figur 4: Innledende bildebehandlingstrinn. A) Utgang fra et "på farten" bildebehandlingsskript. B) Eksempelmikrograf (venstre) med passende automatisk plukkede partikler identifisert ved hjelp av crYOLO generell modell (høyre, med partikler avgrenset av røde firkanter) Skalastenger (hvit) er 50 nm. C) Resultater fra 2D-klassifisering som viser klasser som ble kassert i den røde firkanten, og klasser hvorfra partikler ble valgt for videre behandling i grønt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En liten undergruppe av partikler kan brukes til å generere en innledende modell (figur 5A). Denne første modellen kan deretter brukes som startmodell i 3D-klassifisering og raffinement. Når det gjelder RagAB, inneholdt datasettet tre forskjellige konforme som kan separeres under 3D-klassifisering (figur 5B). Partikler som bidrar til hver av disse klassene kan deretter behandles uavhengig og brukes til å avgrense et EM-tetthetskart som deretter kan bli gjenstand for videre tolkning og modellbygging.
Figur 5: Genererer tetthetskart for 3D EM. A) Typisk innledende modell generert ved hjelp av RELION. B) 3D-klassifisering over 5 klasser som viser separasjon av partikler i tre distinkte konformasjonstilstander: åpen åpen (grønn), åpen lukket (blå), lukket lukket (lilla). C) Prosessen med maskeoppretting. Kartet fra 3D-raffinement (venstre) skal visualiseres i chimera. Volumviseren kan deretter brukes til å identifisere den laveste terskelen som kartet er fritt for usammenhengende, støyende tetthet (midten). Denne terskelverdien legges inn som innledende binariseringsterskel i opprettingsjobben for RELION-maske. Et eksempel på maskeutdata vises i grått (til høyre). D) Høyoppløselig EM tetthet kart over åpen lukket tilstand RagAB (EMD-10245), filtrert og farget av lokal oppløsning (Å). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
I denne protokollen har vi beskrevet en grunnleggende rørledning som gjelder for prøver som kan brukes til rutinemessig SPA. Selv om denne filterpapir blottingsmetoden for tynn filmdannelse og vitrifisering utvilsomt er vellykket gitt bruken i de aller fleste SPA-prosjekter til dags dato, kommer den med en rekke ulemper. Disse inkluderer prøvesvekke, de langsomme tidsskalaene (sekunder) som kreves for å danne den tynne filmen og fryse prøven, rapporterte irreproducibility27 og rapporterte negative effekter av å bruke filterpapir for å utslette overflødig væske50. Nylig har nye teknologier blitt utviklet for å forbedre reproduserbarheten av tynn filmproduksjon51,52. Andre teknologier er utviklet som reduserer tiden mellom prøveapplikasjon og vitrifisering53,54,55. Mens filterpapirbaserte metoder for tynn filmdannelse forblir den mest allestedsnærværende metoden for SPA cryoEM prøvepreparering i skrivende stund, kan disse nye teknologiene gi en rekke fordeler når det gjelder effektivitet og reproduserbarhet av rutenett vitrifisering, samt skape nye muligheter til å bringe inn ytterligere eksperimentelle dimensjoner, for eksempel tidsoppløsning og rask blanding før vitrifisering.
Prosessen med nettscreening for de fleste brukere er for tiden en kvalitativ prosess som innebærer oppkjøp av lave forstørrelsesatlaser etterfulgt av å ta bilder med høy forstørrelse over hele rutenettet for å vurdere partikkelfordeling. Selv om dette er en tilstrekkelig robust tilnærming for noen typer prøver, kan det være vanskelig å vurdere for øyet om prøven faktisk er det forskeren håper å bilde eller har en foretrukket orientering, for eksempel med små (<200 kDa) prøver eller hvor lavoppløsningsmorfologien gjør det vanskelig å identifisere for øyet hvis en rekke partikkelfordelinger er til stede. For noen prosjekter er det umulig å avgjøre om prøven er som ønsket, for eksempel hvor en ligand er bundet eller hvor prøven blir screenet for å vurdere om en liten (f.eks. 10 kDa) underenhet fortsatt er til stede i forbindelse med et kompleks. For disse prosjektene vil helautomatiske rørledninger for dataanalyse kombinert med en "kort" 0,5- 1-timers samlinger, som kan gå gjennom bildebehandlingstrinn til 2D-klassifisering eller til og med 3D-klassifisering og raffinement, bidra til å effektivt avgjøre om en lengre samling er berettiget. Disse rørledningene er fortsatt under utvikling og er ikke mye implementert for tiden, men de har potensial til å forbedre effektiviteten av kryoEM rutenettscreening, spesielt for utfordrende prøver.
Forbedringer i direkte elektrondetektorer, samt modifikasjoner i mikroskopi kombinert med fremskritt innen bildebehandling som innsamling av bildeskiftdata, har økt gjennomstrømningen og kvaliteten på bilder som produseres under datainnsamlingen. Denne økningen i datahastigheten som samles inn fremhever behovet for grundig screening av cryoEM-rutenett før mange TB data blir samlet inn.
CryoEM SPA har blitt en virkelig mainstream strukturell biologi teknikk, og i mange tilfeller "gå til" tilnærming for noen klasser av prøver, for eksempel heterogene og labile makromolekylære komplekser. Mens protokollen her beskriver en grunnleggende oversikt over SPA-rørledningen, er hver seksjon som dekkes her (rutenett vitrifisering og screening, kryoEM og bildebehandling) et tema i seg selv og verdig leting under utviklingen av et SPA-prosjekt. Etter hvert som prøveforberedelses- og mikroskopiteknologier utvikler seg, og nye bildebehandlingsalgoritmer og tilnærminger kommer på nettet, vil SPA fortsette å utvikle seg som en rørledning, og hjelpe forskere med å få innsikt i komplekse biologiske systemer.
Disclosures
Det rapporteres ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen. J B. R. White er finansiert av Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). FEI Titan Krios mikroskoper ble finansiert av University of Leeds (UoL ABSL award) og Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Vi takker M Iadanza for bruken av hans mikrografanalysemanus. Vi anerkjenner Diamond Light Source for tilgang og støtte av cryo-EM-anleggene på Storbritannias nasjonale Electron Bio-imaging Centre (eBIC) finansiert av Wellcome Trust, MRC og BBRSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt tweezers | Agar Scientific | AGT5022 | |
| Cryo EM round storage box | Agar Scientific | AGG3736 | |
| CryoEM autogrid boxes | ThermoFisher Scientific | 1084591 | |
| CryoEM grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ethane gas | Boc | 270595-F | |
| LN2 foam dewar | Agar Scientific | AG81760-500 | |
| LN2 storage dewar | Worthington industries | HC 34 | |
| Pipette | Gilson | 10082012 | |
| Pipette tips | Star labs | s1111-1706 | |
| Syringe | BD | BD 300869 | |
| Type II lab water | Suez | select fusion | |
| Vitrobot | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot filter paper | Whatman | 1001-055 | |
| Vitrobot styrophome container assembly | ThermoFisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot tweesers | ThermoFisher Scientific | 72882-D | |
| Software | |||
| EPU | ThermoFisher Scientific | 2.8.1.10REL | |
| TEM server | ThermoFisher Scientific | 6.15.3.22415REL | |
| Tia | ThermoFisher Scientific | 5.0.0.2896REL | |
| Titan krios microscope | ThermoFisher Scientific | Titan Krios G2 |
References
- Kuehlbrandt, W.
- McMullan, G., Faruqi, A. R., Henderson, R.
- Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: the nuts and bolts. Current Opinion in Structural Biology. , (2017).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. , (2020).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. , (2020).
- Conley, M. J., et al. Calicivirus VP2 forms a portal-like assembly following receptor engagement. Nature. 565 (7739), 377-381 (2019).
- Hesketh, E. L., et al. The 3.3 Å structure of a plant geminivirus using cryo-EM. Nature communications. 9 (1), 2369 (2018).
- Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b6 f complex at 3.6 A resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
- Madej, M., et al. Structural and functional insights into oligopeptide acquisition by the RagAB transporter from Porphyromonas gingivalis. Nature Microbiology. , (2020).
- Gallardo, R., et al. Fibril structures of diabetes-related amylin variants reveal a basis for surface-templated assembly. Nature Structural and Molecular Biology. , (2020).
- Scarff, C., et al.
- Scarff, C. A., et al. Structure of the protective nematode protease complex H-gal-GP and its conservation across roundworm parasites. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008465 (2020).
- Wu, M., Lander, G. C. How low can we go? Structure determination of small biological complexes using single-particle cryo-EM. Current Opinion in Structural Biology. , (2020).
- Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., Danev, R. Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nature Communications. , (2017).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 74, Pt 6 560-571 (2018).
- Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadanza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological procedures online. 6, 23-34 (2004).
- Baker, L. A., Rubinstein, J. L.
- Dubochet, J., et al.
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing ‘standard’ sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. , (2019).
- Sgro, G. G., Biosciences, T. R. D. C. F. 2018 Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. researchgate.net. , Available from: http://www.researchgate.net/profile/Tiago_Costa12/publication/326710861_Cryo-EM_Grid_Preparation_of_Membrane_Protein_Samples_for_Single_Particle_Analysis/links_EM-Grid-Preparation-of-Membrane-Protein-Samples-for-Single-Parti (2018).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with sub-1 Å specimen movement. Science. , (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM. Methods in Enzymology. , (2016).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. , (2009).
- Mastronarde, D. N. SerialEM: A program for automated tilt series acquisition on Tecnai microscopes using prediction of specimen position. Microscopy and Microanalysis. , (2003).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. , (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 73, Pt 6 496-502 (2017).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Wagner, T., et al. SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM. Communications biology. 2 (1), 213-218 (2019).
- Bepler, T., et al. TOPAZ: A Positive-Unlabeled Convolutional Neural Network CryoEM Particle Picker that can Pick Any Size and Shape Particle. Microscopy and Microanalysis. , (2019).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 163 (2018).
- Zivanov, J., Nakane, T., Scheres, S. H. W. A Bayesian approach to beam-induced motion correction in cryo-EM single-particle analysis. IUCrJ. , (2019).
- Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What Could Go Wrong? A Practical Guide to Single-Particle Cryo-EM: From Biochemistry to Atomic Models. Journal of Chemical Information and Modeling. , (2020).
- Tagari, M., Newman, R., Chagoyen, M., Carazo, J. M., Henrick, K. New electron microscopy database and deposition system. Trends in Biochemical Sciences. , (2002).
- Berman, H. M., et al.
- Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. EMPIAR: A public archive for raw electron microscopy image data. Nature Methods. , (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. , (2017).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. , (2019).
- Goddard, T. D., et al. UCSF ChimeraX: Meeting modern challenges in visualization and analysis. Protein Science. 27 (1), 14-25 (2018).
- Klebl, D. P., et al. Need for Speed: Examining Protein Behavior during CryoEM Grid Preparation at Different Timescales. Structure. , (2020).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 32 (2018).
- Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
- Zi Tan, Y., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EMthrough tilting. Nature Methods. , (2017).
- Armstrong, M., Han, B. -G., Gomez, S., Turner, J., Fletcher, D. A., Glaeser, R. M. Microscale Fluid Behavior during Cryo-EM Sample Blotting. Biophysical Journal. 118 (3), 708-719 (2020).
- Arnold, S. A., et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. Journal of Structural Biology. , (2017).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. , (2018).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 75, Pt 12 1063-1070 (2019).
- Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation. bioRxiv. , (2020).
- Klebl, D. P., et al. Sample deposition onto cryo-EM grids: From sprays to jets and back. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2020).
