Summary
使用基于微PET / MR成像的方法对小鼠中的产热脂肪库进行功能成像和定量。
Abstract
棕色和米色脂肪细胞现在被认为是肥胖和代谢综合征的潜在治疗靶点。非侵入性分子成像方法对于提供对这些产热脂肪库的关键见解至关重要。在这里，该协议提出了一种基于PET / MR成像的方法，以评估小鼠肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（iWAT）中棕色和米色脂肪细胞的活性。当与MR成像提供的精确解剖信息相结合时，使用[18F]FDG（不可代谢的葡萄糖类似物）作为放射性示踪剂，实现了产热脂肪库的可视化和定量。在冷适应后7 d进行PET/MR成像，并在不同脂肪库中定量[18F]FDG信号，以评估产热脂肪组织的相对动员。去除iBAT大大增加了小鼠iWAT中的冷诱发[18F]FDG摄取。
Introduction
为了响应不断变化的营养需求，脂肪组织作为能量缓存，采用脂质储存或动员模式来满足身体的需求1。此外，脂肪组织在体温调节中也起着关键功能，通过称为非颤抖产热的过程，也称为兼性产热。这通常由棕色脂肪组织（BAT）实现，其表达丰富的线粒体膜蛋白解偶联蛋白1（UCP1）。作为质子载体，UCP1 通过解耦质子传输和 ATP 产生来产生热量2。在冷刺激下，BAT中的产热通过激活交感神经系统（SNS）启动，然后释放去甲肾上腺素（NE）。NE与β3肾上腺素能受体结合，导致细胞内环AMP（cAMP）升高。因此，CREB（cAMP反应元件结合蛋白）的cAMP / PKA依赖性参与通过直接结合CREB反应元件（CRE）2刺激Ucp1转录。除BAT外，白色脂肪组织中还发现了棕色样脂肪细胞，因此被命名为米色或brite（白色棕色）细胞1，3。为了响应特定的刺激（如寒冷），这些原本静止的米色细胞被重塑以表现出多种棕色样特征，包括多位点脂滴，密集的线粒体和增强的UCP1表达3，4，5。
动物研究表明，棕色和米色脂肪细胞除了具有减脂作用外，还具有多种代谢益处，包括胰岛素致敏，降脂，抗炎和抗动脉粥样硬化6，7。在人类中，米色/棕色脂肪的含量与年龄、胰岛素抵抗指数和心脏代谢紊乱呈负相关8。此外，通过冷驯化或β3肾上腺素能受体激动剂激活人体米色/棕色脂肪细胞可防止一系列代谢紊乱4，9，10。这些证据共同表明，诱导棕色和米色脂肪组织是管理肥胖及其相关医学并发症的潜在治疗策略8。
有趣的是，尽管它们具有相似的功能，但米色和经典的棕色脂肪细胞来自不同的前体，并通过重叠但不同的机制激活1。因此，棕色和米色脂肪细胞的 体内 成像和定量对于更好地了解这些脂肪组织的分子控制至关重要。目前 ，18F-氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）正电子发射断层扫描（PET）扫描与计算机断层扫描（CT）相结合仍然是临床研究中表征产热棕色和米色细胞的金标准8。磁共振成像（MRI）使用强大的磁场和射频脉冲来产生详细的解剖结构。与CT扫描相比，MRI以更高的分辨率生成器官和软组织的图像。这里提供的是适应冷暴露后小鼠模型中功能性棕色和米色脂肪的可视化和定量的方案，这是诱导脂肪褐变的常见和最可靠的方法。该方法可用于高精度表征小动物模型中的产热脂肪库。
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Protocol
下文所述的规程遵循香港大学的动物护理指引。研究中使用的动物是8周龄的C57BL / 6J小鼠。
1. 动物外科手术和感冒挑战
- 进行肩胛间 BAT （iBAT） 解剖。
- 通过腹膜内注射氯胺酮/木拉嗪（100mg / kg体重氯胺酮和10mg / kg体重木拉嗪）麻醉小鼠。麻醉后，将小鼠的毛发从颈部剃到肩胛骨正下方。
- 消毒后将小鼠放在加热垫上，并沿着小鼠的背侧中线做一个2厘米的切口。
- 取下iBAT垫（双侧）。在假手术组中，做相同的切口，但保持iBAT垫完好无损。
- 出血停止后，使用7mm不锈钢伤口夹关闭切口。
- 手术后，给予小鼠美洛昔康（5mg / kg饮用水）6天，并将其安置在重症监护室（ICU）14天。伤口愈合后立即取下夹子（7-10天）。
- 小鼠的冷挑战：将小鼠置于热中性（30°C）下14天。第13天，将动物笼子在冷（6°C）中预冷过夜。在第14天，将小鼠置于环境室中6°C7天。在每个笼子里放两只老鼠。
2. 微型PET/MR校准和工作流程设置
注：微PET/MR成像使用顺序PET/MR系统进行（见 材料表）。将每只鼠标放置在成像床上;首先使用MR扫描解剖学参考（侦察视图），然后前进到PET视场（FOV）的中心进行静态[18F]FDG PET采集，然后进行MR成像以进行解剖参考。在扫描仪操作软件中创建成像工作流程（请参见 材料表），以便在成像会话之前实现自动、连续的 PET/MR 扫描。
- 在操作软件中创建成像工作流程，包括静态 PET 采集、用于衰减校正的 MRI 采集以及分别使用 T1 3D 成像和 T2 加权 2D 成像的解剖参考。
- 要获得PET，设置400-600 keV水平判别，F-18研究同位素，1-5重合模式和20分钟扫描。
- 要获取 T1 加权 MR（用于衰减校正），请设置梯度 Echo-3D（TE = 4.3 ms，TR = 16 ms，FOV = 90 x 60 mm，激发次数 （NEX） = 3，28 个切片，厚度为 0.9 mm，体素大小 = 0.375 x 0.375 x 0.9 mm）。
- 要获取 T2 加权 MR（解剖学参考），请设置 Fast-spin Echo 2D（TE = 71.8 ms，TR = 3000 ms，FOV = 90 x 60 mm，NEX = 5，32 个切片，厚度为 0.9 mm，体素大小 = 0.265 x 0.268 x 0.9 mm3）。
- 要重建 PET，请使用 Tera-Tomo 3D （TT3D） 算法（8 次迭代，6 个子集），具有 1-3 重合模式，并具有衰减、死区时间、随机、衰减和散射校正功能，以创建总体素大小为 0.3 mm3 的图像。
- 在成像研究开始前一天对微型PET / MR扫描仪进行PET活性测试，以检查PET定量的准确性。
- 按照制造商指南的建议，准备一个装满[18F]FDG的5 mL注射器（在水或盐水中为140-220μCi / 5-8 MBq）。
- 使用剂量校准器记录注射器的活性（见 材料表）并注意测量时间。
- 选择 插值椭圆 ROI 以在重建的图像上绘制感兴趣体积 （VOI），以将恢复的活动与如上所述测量的值进行比较。校准良好的扫描仪的恢复活性准确度在 ±5% 以内。
3. 注射[18F]五龙类化合物
- 从供应商处订购临床剂量 [18F]FDG （10 mCi/370 MBq），以便在首次预定注射前约 30 分钟到达成像实验室。收到含有放射性物质的包裹时，确保穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验室外套，手套，个人辐射剂量计（例如手指）和全身。定期更换手套，以防止放射叉污染，并尽可能增加与放射源的距离。
- 使用镊子小心地将[18F]FDG库存小瓶转移到L块桌面防护罩后面。
- 分配等分试样的[18F]FDG，并用灭菌盐水稀释，在100-150μL中得到200-250μCi / 7-9 MBq的总活性浓度。
- 将[18F]FDG溶液用针头吸入1 mL注射器中（见 材料表），使用设置为F-18的剂量校准器测量放射性，并记录测量时间。
- 在注射前记录鼠标的重量。通过尾静脉注入准备好的[18F]FDG溶液。注意注射时间和注射器放射性的残留，以便进行衰变校正。
- 将鼠标放回笼子中，在PET扫描之前允许[18F]FDG摄取60分钟。
- 使用以下公式计算注入的 [18F]FDG 活性11：
注入活性（μCi/MBq）
=注射前注射器中的活性
- 注射后注射器中的活性
4. 微型PET/MR采集
- 打开鼠标床的空气加热器，让暖空气通过它。
- 使用5%异氟醚（1 L / min医用O2）麻醉小鼠。诱导后，将小鼠转移到温暖的小鼠床，并通过鼻罩锥体保持2%-3%异氟醚的麻醉。将鼠标头俯卧在咬杆上，并确保鼠标不会突出到床的直径之外。涂抹眼部润滑剂，避免干燥和角膜溃疡的形成。
- 分别通过热探头和呼吸垫监测体温和呼吸频率。通过调节异氟醚水平，将体温保持在36-37°C，呼吸频率保持在每分钟70-80次呼吸（bpm）。
- 执行侦察视图以确定鼠标位置。调整鼠标床的位置以包括整个鼠标主体，并确保MR的中心视场位于鼠标主体的中心。
- 在研究列表窗口中的 PET 采集下，选择“先前采集的扫描范围”以使用如上所述的侦察视图位置。单击“准备”将动物床从 MR 移动到 PET。选择“确定”以启动 PET 扫描。在放射性药物编辑器中记录[18F]FDG给药前后测量的注射剂量和时间。在“主题信息”菜单下输入鼠标的粗细。
- PET 扫描完成后，选择 准备 移动到 MR 并在研究列表窗口中完成所有 MR 采集。选择 “确定” 以启动 MR 扫描。
- 完成整个工作流程后，使用后处理软件简要评估采集的MR图像的质量（参见 材料表）。单击“ 主页 ”按钮将鼠标床从MR移动到原始位置。
- 小心地从扫描仪中取出鼠标，并将其放回干净的外壳笼中，下面有加热垫，以便在温暖的环境中恢复。为老鼠提供食物和水。系统现在已准备好等待队列中的下一个鼠标。
- 要重建数据，请在原始扫描菜单下选择 PET 采集以加载已完成的 PET 扫描。选择 T1 加权 MR 采集以创建材质贴图。如上所述重建数据（请参阅步骤 2.5）。
- 遵守当地和机构有关PET成像后小鼠的护理和处理的规定。将所有用过的注射器/针头、手套、床上用品和粪便视为放射性废物，需要根据当地法规进行特殊处理/处置。
5. 成像后分析
- 打开 图像分析 软件（请参阅 材料表），然后单击 加载DICOM数据 以检索相应的MR和PET图像。
- 通过将 MR 和 PET 图像拖动到显示窗口来执行这些图像的共同配准。单击 自动注册 功能。
- 在“注册设置”下拉菜单中选择“刚性变换”。选中刚性/仿射菜单下的移位和旋转。
- 在“全局角色选择”菜单下选择 T1 加权 MR 采集作为参考，选择 PET 采集作为“许可证”。
- 检查所有三个维度的套准，以确保MR和PET图像之间完美对齐。要手动调整它，请单击“ 手动注册”。
- 使用插值椭圆ROI在感兴趣的组织上绘制VOI，即iBAT和腹股沟白色脂肪组织（iWAT），使用MR图像作为参考。使用画笔工具和橡皮擦工具定义VOI边框;因此，组织的解剖结构。通过使用PET图像确保没有重叠摄取，以避免来自邻近器官的溢出。逐张幻灯片重复该过程，直到整个 VOI 被描绘出来。如有必要，请编辑 VOI 以保持每个鼠标之间的 VOI 音量一致。
- 使用 椭球体 VOI 在肺上绘制一个 3 mm3 VOI 作为参考器官。避免来自邻近心脏和肌肉的任何溢出物。
- 完成后，单击“ 显示 ROI 表” 以重命名每个 VOI。将 VOI 和组织体积的平均放射性记录到电子表格中。将 VOI 图纸和成像数据存档到数据存储设备。
- 使用以下等式计算所有 VOI 的标准化摄取值 （SUV）11：
SUVmean = VOI放射性（以kBq为单位）（衰变 - 校正注射剂量，以kBq为单位/小鼠体重（以kg为单位），假设组织密度为1 g / mL。
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Representative Results
在这项研究中，三组小鼠（每组n = 3）接受了微PET / MR成像，其中它们被安置在热中性（30°C）或冷（6°C）下7天。一组小鼠（n = 3）在冷处理前将其iBAT（iBATx）移除（图1A）。该方法导致所有三只小鼠中白色脂肪组织活性的改变。特别是，使用微PET/MR成像在iWAT中观察到[18F]FDG摄取显着增加（图1B-C）。这种共同配准的成像数据被证明为最大强度投影（MIP），其中iWAT被清楚地描绘出来，以量化[18F]FDG摄取。一致地，与假手术组相比，多地点脂肪细胞是米色脂肪细胞的特征形态，在iBATx小鼠的iWAT中更为明显（图1D）。
为了验证是否可以通过微PET / MR成像监测这种长时间冷诱导的iBAT和iWAT活性的变化，对暴露于30°C和6°C的小鼠进行了成像研究，并比较了组间的结果。PET/ MR成像还表明，在假手术小鼠中，经6°C的小鼠对iBAT的FDG摄取显着升高[18F]（图2A），这与先前报道的文献一致11。在冷处理前去除iBAT（iBATx）的小鼠在30°C和6°C组中显示出iWAT中最高的[18F]FDG摄取（图2B）。使用基于SUV的方法进一步量化PET图像。在iBAT中，与30°C组相比，冷暴露导致[18F]FDG摄取量增加7倍。在iWAT中，[18F]适应寒冷的iBATx小鼠的FDG摄取高于其余组（图2C）。与热中性小鼠相比，在寒冷诱导的小鼠中去除iBAT导致iWAT的摄取量增加8倍，而当iBAT存在于小鼠中时，仅观察到适度增加（2倍）。
图1：小鼠腹股沟白色脂肪组织（iWAT）的Micro-PET / MR成像。 肩胛间棕色脂肪组织通过手术切除（iBATx）。恢复后，将小鼠在6°C下放置7天，然后进行分析。（一）手术及后续手术流程图。（B） 鼠标和 PET/MR 扫描仪位置的图示。（C） 共同注册的PET/MR图像的最大强度投影（MIP）。白色箭头：iWAT 的位置。答：前 L：左。（D）冷暴露后假小鼠和iBATx小鼠iWAT的血氧菌素和曙红（HE）染色。比例尺 = 100 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图2：肩胛间区域（iBAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（iWAT）的棕色脂肪组织中具有代表性的 体内 [18F]FDG摄取。 将饲养在热中性（30°C），冷适应（6°C）和冷适应+ iBATx的小鼠进行[18F]FDG PET / MR成像。（A）显示小鼠iBAT的PET / MR图像的矢状部分。（B） 显示双侧iWAT的PET/MR图像的轴向截面。（C） [18F]在iBAT（左）和iWAT（右）中吸收率的定量分析。黄色箭头：iBAT 的位置。白色箭头：iWAT 的位置。n = 每组 3。SUVratio 的值显示为平均值 ±SD。 请单击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在本研究中，描述了基于PET / MR的小动物功能性棕色和米色脂肪组织的成像和定量。该方法使用不可代谢的葡萄糖类似物[18F]FDG作为成像生物标志物，以便以非侵入性方式识别具有高葡萄糖需求的脂肪组织。MR提供良好的软组织对比度，可以更好地将脂肪脂肪组织与邻近的软组织和肌肉区分开来。当与PET结合使用时，由于高葡萄糖利用，这可以对活化的脂肪细胞进行成像和定量。这里概述的实验条件强调了使用[18F]FDG PET在体内研究iBAT和iWAT的 上调的可行性，并且对于评估新候选药物的产热影响具有潜在用处。此外，通过使用专门设计的动物床同时对多只小鼠进行成像，该协议可以很容易地修改为高通量格式，从而以更低的成本和时间增加成像数据的统计能力和置信度12，13。
目前，[18F]FDG PET/CT仍然是人类和啮齿动物中可视化BAT的最常见方法，标准方案已经得到充分确立8，11。近年来，还有几项研究使用[18F]FDG PET/MR成像来评估人类中的BAT14，15，16。相比之下，没有关于[18F]FDG PET/MRI用于小动物的详细说明。这里描述的是一个详细的方案，它依赖于在小鼠中使用PET和MR组合成像系统。这种方法利用了MRI的更高分辨率，特别是在检测脂肪组织方面，与常用的CT方法相比，它们易于识别和分割。因此，与PET / CT方法相比，当前的方法能够提高PET定量的准确性，这对于具有更脆弱脂肪库的小动物的研究具有重要价值。当分析目标组织在基线摄取时的结果时，MRI成为准确绘制VOI的重要工具，以确保小鼠之间体积的一致性并避免包含邻近器官。此外，精确的图像处理（如图像配准和 VOI 描绘）对于实现可靠的定量也很重要。葡萄糖反应性BAT的解剖位置在人和小鼠之间是不同的。虽然功能性 BAT 位于肩胛间区域，但基于 FDG PET/MR 成像的分析主要识别人类锁骨上区域的功能性 BAT14，15，16。
在进行[18F]FDG摄取实验时，还应考虑小鼠的禁食或喂养状态。在一些研究中，小鼠在摄取实验前禁食数小时甚至过夜，因为据推测内源性葡萄糖将与[18F]FDG竞争。在协议中，测量了进食状态下的[18F]FDG，并且在iBAT和iWAT中仍观察到强烈的摄取信号。因此，这表明没有必要将小鼠置于禁食状态以获得强大的摄取信号，这在生理上不太相关。实际上，在检查禁食动物中的BAT和米色脂肪细胞时应谨慎，因为先前的发现已经报道下丘脑神经肽Y（NPY）介导的饥饿信号作用于髓质运动系统，通过减少交感神经支配来抑制BAT的产热17。一直以来，在人类中，人们认为在高热量饮食中，产热脂肪细胞会燃烧掉额外的卡路里，以维持能量平衡。相反，在营养物质剥夺时，反调节机制被激活以抑制能源浪费。
[18F]FDG PET成像的另一个考虑因素涉及放射性示踪剂施用到小鼠中的途径。腹膜内和静脉注射技术是将[18F]FDG注射到小鼠体内的两种常用方法，并且这两种方法导致注射后60分钟小鼠中[18F]FDG的生物分布相对相似18。虽然腹膜内方法相对容易执行，并且可以快速进行注射以避免对小鼠施加不必要的压力，但直接注射意外进入肠道是常见的，并且不会立即识别，导致不可靠的PET结果19。静脉注射方法是本研究的首选方法。当在输注前观察到可见的血液闪回时，可以确定尾静脉注射是否成功，这表明针头在静脉内正确定位以进行输注。这种技术的一个局限性是难以注意到可见的血液闪回，这可能是由于低血压和尾巴上存在黑毛。这可以通过用温暖的毛巾加热尾巴来增加血流量来克服，从而改善静脉插入针头的可见性。
准确的扫描仪和相关设备是可靠PET图像定量的其他重要因素。必须对扫描仪的PET和MR组件进行常规质量控制检查。MR 质量控制涉及对不同 T1 和 T2 加权序列进行信噪比评估，应按照扫描仪制造商的建议每周进行一次。对于PET，必须每周或在重要研究开始之前使用含有已知放射性浓度的注射器来确定活性的准确性。该质量控制测试还可以确定PET和MR图像的共同配准。如果恢复的活动超出建议范围或发现PET和MR图像之间的配准错误，则必须执行校准。此外，应根据制造商指南定期校准剂量校准器，因为这是扫描仪质量控制以及PET成像放射性测量的重要工具。
这项研究表明，在暴露于低温下，可以使用[18F]FDG PET / MR成像可视化和量化小鼠iBAT和iWAT中脂肪库的激活。然而，目前的研究受到以下事实的限制，即[18F]FDG在iWAT中的吸收率相对较低，除非没有iBAT。这表明，与容易被冷刺激激活的iBAT相比，米色脂肪细胞相对不愿意被动员，并且更像是小鼠iBAT的备用产热库。将确定在正常小鼠的iWAT和/或其他脂肪库中诱导[18F]FDG信号的更有效方法，例如使用米色特异性激活剂或更强的冷激发条件，这超出了当前研究的范围。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我們感謝中國國家自然科學基金會（NSFC）-優秀青年科學家基金（香港及澳門）（81922079）、香港研究資助基金會一般研究基金（GRF 17121520 and 17123419）及香港研究資助基金會合作研究基金（CRF C7018-14E）對小動物影像實驗的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sterile saline | BBraun | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| Dose Calibrator | Biodex | Atomlab 500 | |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g | |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle |
| InterView Fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL | |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | 5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL | |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | 3 Tesla MR | |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Wound clips | Reflex 7 | 203-100 | 7mm Stainless steel wound clips, 20 clips |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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