Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך תא תצפית התנהגות Drosophila מבוגר פשוט, וכיצד לצלם בהבחנה גבוהה / קטעי וידאו של המורפולוגיה או התנהגות של סוגים שונים של זבובי פירות בתא התצפית באמצעות שיטות פשוטות יחסית ובמחיר סביר.
Abstract
Drosophila melanogaster הוא מודל חזק מאוד במחקר ביולוגי, אבל מודל רע לצילום או וידאו. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה אך יעילה להתבונן ולתעד את ההתנהגות או המורפולוגיה של זבובים. זבובים הונחו בחדר תצפית שקוף C.A. Ø15 x 5 מ"מ (אין אוכל בפנים) או Ø15 x 12 מ"מ (עם חתיכת מזון בגובה 8 מ"מ בפנים). לאחר כיסוי עם מסנן אולטרה סגול (UV)/ברור עם העברת אור גבוהה, התא הוצב תחת מיקרוסקופ סטריאו זום 5-50x, ומיני דיודת פולטת אור (LED) נורו בשני צידי המיקרוסקופ כדי להאיר את התא כדי לקבל אור אחיד, רך, בהיר וכמעט ללא צל. לאחר מכן, מצלמה דיגיטלית קומפקטית עם זום אופטי 3-5x, שיכול להקליט וידאו ברזולוציה גבוהה או ברזולוציה גבוהה יותר של 1080 P (בקצב פריימים של ≥30 fps), חוברה לעין של מיקרוסקופ באמצעות סוגר, ותצלומים או קטעי וידאו צולמו דרך העין. על ידי התאמת ידית הזום של מיקרוסקופ הסטריאו של הזום, היה קל מאוד לעקוב אחר הזבובים ולצלם תמונות תקריב פנורמיות או מפורטות לפי הצורך, בעוד המצלמה הקליטה הכל מתחת למיקרוסקופ. מכיוון שהזבובים יכולים להישאר בכל תנוחה בתא, ניתן לצפות בהם ותיעדו מכל הכיוונים. התמונות או הסרטונים שצולמו הם באיכות תמונה טובה. שיטה זו יכולה לשמש הן למחקר מדעי והן להוראה.
Introduction
Drosophila melanogaster הוא מודל יוצא מן הכלל במחקר ביולוגי; עם זאת, זהו מודל רע לצילום או וידאו, שכן הוא קטן מדי עבור מצלמה או מצלמת וידאו וגדול מדי עבור מיקרוסקופמורכב 1. למרות מחקר מצוין המתואר בספרות, רוב המחקרים סיפקו רק תמונות מטושטשות ולא ברורות, ולא תמונות ברורות וחדות עם פרטים ברורים הממחישים את התנהגות הזבוב המתוארת. יתר על כן, למרות שהתנהגויות זבובים נחקרו בהרחבה (למשל, חיזור ולחימה), רוב המאמרים האלה השתמשו באיורים כדי להסביר לקוראים את המחקר שלהם.
מאמר זה מתאר גישה פשוטה וחסכונית. באמצעות שיטה זו, לא רק את ההתנהגויות השונות של Drosophila ניתן לראות, אלא גם את כל הפרטים שניתן לראות תחת מיקרוסקופ זום סטריאו ניתן להקליט בבירור ובחד. כמובן, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לתעד את המורפולוגיה של זבובים, כמו כאשר הם נכנסים למצב שינה או שינה למחצה, המודל הנייח מאפשר למשתמש לצלם או ערימה של תצלומים עם מישורי מוקד שונים כדי לקבל עומק מורחב של תמונת שדה. שיטות אלה ניתן לממש ללא טכנולוגיה מסובכת וציוד יקר או אפילו מיומנויות ידניות מעולה.
רכיב הווידאו של מאמר זה מציג קטעי וידאו של מספר התנהגויות אופייניות של זבובים. מטרת הצגת הסרטונים הללו היא כפולה: האחד הוא ליידע את הקהל מה ניתן ללכוד ולהציג את איכות התמונה המתקבלת בשיטה זו; השני הוא לאפשר לתלמידים חדשים המעוניינים Drosophila, אבל עד כה לא הייתה להם הזדמנות למעשה להתבונן בהתנהגות של זבובים להבין את ההתנהגות של זבובים (כגון חיזור, לחימה) באמצעות קטעי וידאו ברורים אלה ולא איורים או תמונות מטושטשות.
וידאו משלים: התנהגות זבוב פירות: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית מערכת התצפית/תיעוד
הערה: החומרים הדרושים לבניית מערכת הצפייה/תיעוד של התנהגות הזבוב מוצגים באיור 1, והמערכת שהושלמה מוצגת באיור 2. הפרוטוקול לבניית המערכת וכיצד להשתמש בה מתוארים להלן.
- Make a fly behavior observation chamber (FBOC).
- להשיג מיכל קטן, שקוף (לא שקוף) כדי להפוך FBOC של גודל קוטר (Ø) 15 מ"מ x 20 מ"מ. השתמש פקק בקבוק פלסטיק שקוף בגודל ~ Ø17 מ"מ x 22 מ"מ כדי להפוך FBOC, או לחתוך קטע של ~ 17 מ"מ מן הקצה העבה של קצה פיפטה 5 מ"ל כדי להפוך FBOC.
- יוצקים 1% אגר לתוך FBOC כדי להתאים את העומק שלה. אם מזון צריך להיות ממוקם FBOC (ראה את שיטת ההכנה של המזון), לשפוך את אגר כדי לקבל עומק של 12 מ"מ. אם מזון לא צריך להיות ממוקם FBOC, לשפוך את אגר לעומק של 5 מ"מ כדי לעקוב אחר מקום הימצאם של זבובי פירות בקלות רבה יותר.
- אם משתמשים בקצה פיפטה להכנת FBOC, הניחו את החלק החתוך של טיפ הפיפטה בצלחת Ø35 מ"מ או צלחת פטרי Ø60 מ"מ. יוצקים את ג'ל אגר 1% לתוך צלחת פטרי לעובי של ~ 5 מ"מ, לחכות אגר להתמצק, ולאטום את החלק התחתון של FBOC. לאחר מכן, יוצקים את ג'ל אגר לתוך FBOC לעובי הרצוי.
- הפוך בסיס FBOC על ידי משעמם ~ 10 מ"מ עמוק חור במרכז של חתיכת 60 מ"מ x 60 מ"מ x 15 מ"מ גיליון קצף אתילאמין עם אותו קוטר כמו FBOC. הכנס את FBOC לתוך החור.
הערה: בסיס FBOC שומר על יציבות FBOC ומונע ממנו להתהפך ומאפשר את התנועה של FBOC כדי לעקוב אחר הזבובים במהלך תצפית ו videography. - הפוך מזון זבובים, במידת הצורך, עם שמרים בינוני2, דיאטה מלאכותית3, או סוכרוז טהור / גלוקוז (להשתמש 1% אגר כסוכן gelling), בהתאם למטרת התצפית.
- כדי לקבוע חזותית אם זבובים מאכילים ומגבירים את הניגוד בין זבובים לסביבתם, הוסיפו צבעי מזון (ראו טבלת החומרים)למזון לריכוז סופי של 12.5 מ"ג / 100 מ"ל.
הערה: הבטן של הזבובים לשנות צבע מיד לאחר האכלה. - יוצקים את האוכל המוכן לצלחת פטרי לגובה של 8 מ"מ. לאחר התגבשות, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך חתיכת מזון בגודל 8 מ"מ x 4 מ"מ x 8 מ"מ, ומניחים אותו על חתיכת פלסטיק (כגון עטיפת ממתקים).
- חותכים את המזון לפירמידה מרובעת או פירמידת פרוסטם מרובעת, כפי שמוצג באיור 3, כדי לאפשר התבוננות ותיעוד של התנהגות זבוב מזוויות שונות כשהזבובים נוחתים על המזון באופן אקראי. השתמש בפלסטיק מתחת למזון הוא כדי למנוע את הצבע במזון מתפזר לתוך אגר ב FBOC. השתמש פינצטה למקם את האוכל במרכז FBOC.
- כדי לקבוע חזותית אם זבובים מאכילים ומגבירים את הניגוד בין זבובים לסביבתם, הוסיפו צבעי מזון (ראו טבלת החומרים)למזון לריכוז סופי של 12.5 מ"ג / 100 מ"ל.
- בכמה תצפיות התנהגותיות, ודא כי הזבובים מורעבים מראש. יוצקים 1% ג'ל אגר (1 גרם אגר/100 מ"ל מים, 600 μL של חומצה פרופיונית) לתוך בקבוק ריק ונקי לעובי של 1-2 ס"מ, ומניחים בטמפרטורת החדר במשך 1-2 שעות. מעבירים זבובים לבקבוק ומניחים ב-25 מעלות צלזיוס למשך ≥36 שעות.
הערה: זבובים יכולים לספוג מים מג'ל אגר, ולכן אין צורך להוסיף מים מעת לעת4,5. - העבר זבוב אחד או יותר לתוך FBOC באמצעות שאיפה. אם השימוש בשאיפה קשה, לצנן ולהפעיל את הזבובים בקרח כתוש, מיין אותם על חבילת קרח, והעביר אותם ל- FBOC כמתואר קודם לכן6.
הערה: השימוש בהקפאה מקל מאוד על העברת זבובים; הזבובים המצונן יכולים לחזור להכרה תוך דקה אחת, הרבה יותר מהר מאלה שהושמדו עם CO2. למרות מצמרר יכול להיות השפעות מזיקות על ההתנהגות של זבובים, למשל, השהיית הזדווגות מוגברת של זבובים מ 5 דקות7 עד 40 דקות8, זה לא משנה התנהגות זבוב (כגון התנהגות חיזור). לפיכך, השיטה המצמררת עשויה לשמש להעברת זבובים לתצפית כללית (כגון ניסויי הוראה) ווידאו-וגרפיה. עם זאת, אם יש להשתמש בתצפיות בדו"ח מדעי, מומלץ מאוד לא לחשוף את הזבובים לכל הרדמה. - לאחר העברת הזבובים ל-FBOC, כסו אותו במסנן UV/clear בגודל 30-40 מ"מ למצלמה כדי ליצור קומפלקס FBOC(איור 4). מקם את קומפלקס FBOC מתחת לסטריאומיקוסקופ לתצפית.
הערה: כדי לקבל תמונות ברורות וחדות, מומלץ מאוד להשתמש מסנן UV / ברור באיכות גבוהה עם העברת אור גבוהה (>98%) והתלקחות מופחתת. עיין בכמה הצעות שתוארו בעבר9,10; למרות שאין צורך לקנות מסננים יקרים, להימנע מכיסוי FBOC עם זכוכית כגון המכסה של צלחת פטרי. - להאיר את FBOC. הר מיני נורות וידאו LED כדי להבהב תציעי הרכבה חם ולמקם אותם בצד שמאל וימין של FBOC(איור 2). הפעל את נורות ה- LED והגדר את הבהירות ל- 100% ואת טמפרטורת הצבע ל- 5000-5600 K.
הערה: נורות וידאו מיני LED עם אור לעמעם, 5600 K טמפרטורת צבע יכול לספק תאורה אחידה, בהירה, כמעט ללא צל. באמצעות מקור האור העליון שמגיע עם מיקרוסקופ סטריאו, תאורת טבעת ה- LED, או מאיר הסיבים האופטיים לא הניבו תוצאות משביעות רצון. עדיף להשתמש באספקת חשמל רציפה (שנאים) עבור נורות וידאו LED. - התבוננות וצילום וידאו של התנהגות זבוב
- הפעל את נורות הווידאו LED והתאם את מיקרוסקופ הזום הסטריאו עד שניתן יהיה לראות בבירור את קצה ה- FBOC בעין בלתי. העבר את ה- FBOC למרכז שדה הראייה.
- חברו את המהדק של מתאם המצלמה הדיגיטלית של הטלסקופ האוניברסלי לעין של מיקרוסקופ הסטריאו, ולאחר מכן חברו מצלמה דיגיטלית קומפקטית למתאם באופן מאובטח על-ידי סיבוב לסירוגין של בורג הרכבה של המצלמה ובורג תיקון המצלמה(איור 2).
- הפעל את המצלמה הדיגיטלית וסובב את ידיות כוונון עדין אופקיות/אנכיות עד שקצה ה- FBOC יופיע בבירור במרכז שדה הראייה המעגלי הבהיר במסך ה- LCD של המצלמה. סובב את חיוג המצב למצב אוטומטי בעדיפות צמצם, לחץ על המוקד על הבורר הרב-בורר, בחר תקריב מאקרוולאחר מכן לחץ על לחצן אישור. הזז את מתג הזום מקצה הזווית הרחבה לקצה הטלפוטו, והגדל את התצוגה לתמונה המעגלית עד שהחלק המרכזי שלו ימלא את מסך ה-LCD המלא. לחץ על לחצן הקלטת הסרט כדי להתחיל להקליט (לחץ שוב על הלחצן כדי לסיים את ההקלטה).
הערה: אם התמונה כהה מדי או בהירה מדי, לחץ על צד חיוג הבקרה קרוב לסמל פיצוי החשיפה (איור 1) וסובב את החוגה כדי לשנות את ערך החשיפה (EV) המוצע על-ידי המצלמה כדי להשיג את האפקט הרצוי. EVs חיובי הופכים את התמונה לבהירה יותר, ו- EVs שלילי הופך את התמונה לכהה יותר. התמונה חייבת להיות אחידה, בהירה, ללא תוחם. - סובב את ידית המיקוד של המיקרוסקופ עד שהזבובים ב- FBOC גלויים בבירור. בחר את התנהגות הזבוב של עניין עבור התבוננות או הקלטת וידאו. סובב את ידית הזום כדי להגדיל ולהקטין כדי להשיג את ההגדלה הרצויה לתצפית או הקלטת וידאו.
הערה: שיטה זו של צילום תמונות מתחת למיקרוסקופ דרך השעונים חלה על כל מיקרוסקופ עם שעונים. כדי לצלם תמונות של תוצאות ניסוי, השתמש במצלמה שיכולה לצלם בפורמט RAW, מכיוון שקבצי תמונה RAW עדיפים על JPEGs. השתמש במסך ה-LCD של המצלמה כצג כדי לבחון את התנהגות זבובי הפירות, ולהבטיח שלמיקרוסקופ הזום הסטריאו יש לפחות זום של פי 5-50.
2. פרוטוקולים לתצפית וצילום וידאו של התנהגות זבוב
- הכנת הזבובים
- תרבות הזבובים על תירס בינוני ב 25 °C (60%, לחות) מחזור בהיר /כהה 12 שעות. לאסוף זבובים בתוך 6 ימים של בקיעה לתצפית (למעט חיזור והתנהגות לחימה).
הערה: כאן, המדיום היה מורכב 1000 מ"ל של מים, 105 גרם קמח תירס, 75 גרם של סוכרוז, 15 גרם אגר, 40 גרם אבקת שמרים, 28 מ"ל של 10% מתיל פרבן (w / v ב 95% אתנול), ו 6.25 מ"ל של חומצה פרופיונית.
- תרבות הזבובים על תירס בינוני ב 25 °C (60%, לחות) מחזור בהיר /כהה 12 שעות. לאסוף זבובים בתוך 6 ימים של בקיעה לתצפית (למעט חיזור והתנהגות לחימה).
- החזרת ההכרה מהרדמה על ידי מצמרר
- מצננים את הזבובים כמתואר קודם לכן. 6 העבר את הדרוזופילה מקופסת הקרח ל- FBOC באמצעות פינצטה. הקלט את תהליך הזבוב מאי פעילות ליציבה רגילה בוידאו.
- שינה מעופפים, האכלה, הפרשה והתנהגות חברתית
- להרעיב זבובים במשך 36 שעות. מעבירים 4-6 זבובי פירות ל- FBOC עם מזון מוכתם. התבונן והקלט התנהגות זבוב בווידאו.
הערה: זבובים שנשארים ללא תנועה במשך יותר מ 5 דקות להציג התנהגות שינה11. Drosophila יכול לישון על מזון או על קיר FBOC אנכי (הגוף מאונך לקיר תא התצפית). למרות שהגוף אינו זז בעת השינה, ניתן לראות את הבטן גלית. התנהגות ההאכלה באה לידי ביטוי כאשר הזבוב מותח את הפרובוסיה שלו, נע על המזון תוך מציצה מתמדת, והבטן שלו הופכת לכחולה. במהלך האכלה קבוצתית או פעילויות אחרות, זבובי פירות מתחו את רגליהם כדי לגעת בגופם של זבובי פירות אחרים בצורה ידידותית. זו התנהגות חברתית.
- להרעיב זבובים במשך 36 שעות. מעבירים 4-6 זבובי פירות ל- FBOC עם מזון מוכתם. התבונן והקלט התנהגות זבוב בווידאו.
- התנהגות טיפוח זבובים
- צ'ילנו את הזבובים כמתואר6. זורקים את הזבובים הקפואים לאבקת אגר, ומגלגלים כדי לכסות אותם באבקת אגר. העבר את הזבובים ל- FBOC. התבונן ותיעד התנהגות טיפוח.
הערה: כאשר זבוב הפירות חוזר להכרה מהקפאה, הוא ינער במהירות את אבקת אגר מגופו וינקה כל חלק בגופו עם רגליו12,13. ניתן לראות התנהגות טיפוח גם במהלך האכלה, חיזור והתנהגויות אחרות.
- צ'ילנו את הזבובים כמתואר6. זורקים את הזבובים הקפואים לאבקת אגר, ומגלגלים כדי לכסות אותם באבקת אגר. העבר את הזבובים ל- FBOC. התבונן ותיעד התנהגות טיפוח.
- חיזור זבובים והתנהגות לחימה
- לאסוף זבובים נקבה וזכר כמתואר בעבר7. כדי לצפות בהתנהגות החיזור של זבובים, הנח זבוב נקבה וזכר לטוס לתוך FBOC להתבונן ולתעד 6 התנהגויות חיזור (מוצלחות ונכשלות).
- כדי להתבונן בהתנהגות הלחימה של זבובים, למקם שני זכרים ב FBOC. התבונן ותיעד את התנהגותם של דחיפה ודחיפה אחד את השני.
- התנהגות הטלת ביצים מעופפים
- הכן זבובים נשיים כמתואר קודם לכן5. מעבירים 4 זבובים נשיים ל-FBOC עם אוכל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צילום דרך מסנן UV לקבלת תמונות ברורות וחדות
בצע ניסוי פשוט כדי לבחון את ההבדל בין מסנן UV וזכוכית רגילה במעבדה. קח מקטורון תרבות זבוב, להסיר את פקק, למקם אותו תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, ולכסות אותו (לסירוגין) עם מסנן UV ומכסה צלחת פטרי. התמונות שצולמו בשני המקרים האלה מוצגות באיור 5. התמונה שצולמה דרך מסנן UV ברורה וחדה, דומה מאוד לתמונה שצולמה כאשר מקטורינת התרבות אינה מכוסה. איכות התמונה שצולמה דרך צלחת הפטרי גרועה מאוד גם כאשר המוקד מדויק. זכוכית רגילה (או גיליון אקרילי) אינו מצופה, ההמשדר הגבוה ביותר הוא 92%14,15, ואת מסנן ברור / UV עם ציפוי רב שכבתי יש העברת אור של 98-99%.
לכן, התמונה שצולמה דרך זכוכית רגילה (או גיליון אקריליק) אינה ברורה כמו התמונה שצולמה דרך מסנן ברור / UV. פגם חשוב נוסף של זכוכית רגילה, כגון המכסה של צלחת מעבדה, הוא המשטח הלא אחיד שלה. ניתן לראות באיור 5 כי בשל חוסר אחידות משטח הזכוכית, חלק מהתמונה ברור וחלק מטושטש. לכן, מסנני ברורים / UV יש להשתמש במקום להשתמש זכוכית רגילה או יריעות אקריל כדי לכסות את FBOC. מסנן ה- UV המשמש בפרוטוקול זה (איור 5) היה זול (~ $ 10), לא ממותג, והעברת האור שלו לא ידועה. במילים אחרות, גם אם זה מסנן UV זול, התמונה שנתפסה דרכו עשויה להיות הרבה יותר ברורה וחדה מזו שנתפסה דרך זכוכית רגילה.
איכות טובה ללא ציוד יקר
התנהגות הזבוב נרשמה באמצעות מצלמת JPEG בלבד עם חיישן קטן בהרבה (1/2.3 אינץ'). רזולוציית הווידאו היא 1920 x 1080 פיקסלים (ב- 30 frames per second, fps); איכות הסרט משביעת רצון. מסנן UV זול שימש לכיסוי FBOC, ומיקרוסקופ זום סטריאו לא היה ממותג. עלות נורית ה- LED (לדוגמה, GODOX led-p120) הייתה כ - $70 עבור שתי חבילות (ראה טבלת החומרים). במילים אחרות, הציוד ששימש היה חסכוני מאוד; עם זאת, איכות הווידאו טובה, מראה בבירור את הפנורמה של כמה התנהגויות של זבובים, כגון חיזור ולחימה, ואת הפרטים של כמה התנהגויות, כגון oviposition ו הפרשה. במילים אחרות, גם אם מדובר במסנן UV זול, התמונה שנלכדה דרכו עשויה להיות ברורה וחדה יותר מזו שנלכדה דרך זכוכית רגילה.
איור 6 הוא תצלום שצולם מהקלטת הווידאו המציגה את פרטי כל חלק בגופו של הזבוב. ברור, השימוש במצלמה ומיקרוסקופ סטריאו עם איכות תמונה טובה יותר יניבו קטעי וידאו או תצלומים עם איכות תמונה גבוהה יותר. אם למצלמה יש קצב פריימים של ≥60 fps עם איכות תמונה טובה, ניתן ללכוד הרבה יותר פרטים בבהירות רבה יותר בהתנהגות עם הרבה פעולה או תנועה. יתרון נוסף של מערכת זו הוא שמכיוון שהמצלמה מחוברת למיקרוסקופ סטריאו זום, קל מאוד לצלם מצילום פנורמי לצילומי תקריב באמצעות מערכת הזום.
הקלטה מסביב
התבוננות ווידאו-וגרפיה נעשים בדרך כלל מלמעלה; עם זאת, כמו זבובים יכולים להישאר על כל חלק של FBOC: קיר FBOC אנכי, משטח המזון נוטה, ואפילו מסנן UV (עם הבטן פונה כלפי מעלה), וגופם מאונך למשטחים אלה, התנהגותם ניתן לראות ולתעד מזוויות צפייה מרובות. לדוגמה, ניתן לראות בבירור באיור 7 כי הזבוב הנשי משפשף ללא הרף את האוביפוסיטור ברגליה האחוריות במהלך תהליך הטלת הביצים. פרט זה של התנהגות הטלת ביצים לא ניתן לראות בבירור מהצד5.
איור 1: ציוד צילום ואביזרים אחרים המשמשים לבניית מערכת התבוננות ותיעוד התנהגות זבובים. קיצור: LED = דיודת פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מערכת תצפית והקלטה של התנהגות Drosophila. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: איור של גודל וצורת המזון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איור של מתחם FBOC. קיצור: FBOC = תא תצפית התנהגות זבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין התמונות שצולמו דרך מסנן ה- UV, דרך המכסה של צלחת הפטרי במעבדה, וצולמו ישירות ללא כל כיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונה שנלקחה מהקלטת הווידאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נקודת מבט יוצאת דופן להתבונן בהתנהגות הטלת הביצים של זבובי הפירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האור נמצא בלב הצילום והווידאו והוא הגורם המכריע להשגת תמונות באיכות גבוהה16. כאן, שני נורות וידאו LED עם בהירות מתכווננת וטמפרטורת צבע שימשו כמאירים, וחומר שקוף נבחר כדי להפוך את FBOC. לוחות תאורת ה-LED משני הצדדים סיפקו בהירות מספקת, והחומר השקוף התרכך והתפזר, ובסופו של דבר יצר אור אחיד, רך ובהיר כדי להאיר את הזבובים ב- FBOC, מבלי לייצר אזורים לא נעימים חשיפת יתר או חשיפת יתר. התאורה האידיאלית יכולה להיות מושגת ללא ציוד תאורה מתוחכם ויקר. כאן, מסנן UV / ברור בשימוש היה העברת אור גבוהה מאוד והשתקפות נמוכה כדי לכסות את FBOC, ואת אובדן האור הוא קטן מאוד. אמצעים אלה הבטיחו תמונות ברורות וחדות.
חיברנו מצלמה דיגיטלית לעין של מיקרוסקופ זום סטריאו דרך סוגר וצילמנו תמונות או קטעי וידאו דרך העין. ניתן היה להקליט את כל התמונות שניתן היה לצפות בהן מתחת למיקרוסקופ. על ידי סיבוב לחצן המיקוד והרמת המיקרוסקופ, היה קל מאוד לעקוב אחר הזבובים בחלל הצר של ה- FBOC ולהגדיל או להקטין לפי הצורך כדי להקליט פרטים מקומיים או דינמיקה כללית, שלא ניתן להשיג באמצעות מקליט וידאו או מצלמה לצילום וידאו ישיר של ה- FBOC. יחד עם זאת, ניתן לבחור את המצלמה בהתאם לדרישות איכות התמונה. למעשה, מצלמה דיגיטלית יכולה להיות מחוברת לכל מיקרוסקופ עם עין דרך סוגר. המחבר המקביל של מאמר זה רשם בהצלחה תוצאות ניסיוניות בדרך זו במשך שנים רבות.
המצלמה הדיגיטלית הקומפקטית המשמשת לתיעוד ההתנהגות של זבובי פירות חייבת להיות זום אופטי 3-5x (זום דיגיטלי לא אמור לשמש להקלטת וידאו). קצה הטלפוטו של מצלמות אלה (~ אורך מוקד 100 מ"מ) משמש להגדלת התמונה במרכז שדה הראייה למסך כולו, כך שהתמונה הסופית המתקבלת היא תמונה נעימה ללא קישוטים סביבו. אם למצלמה יש רק עדשת מיקוד קבועה בזווית רחבה, או עדשת זום אופטית מעל 7x, תהיה פחות או יותר תוחם לא נעים סביב התמונה שנתפסה. לא מצלמות רפלקס דיגיטליות של עדשה אחת ולא מצלמות וידאו מתאימות לשיטה המתוארת במאמר זה. המצלמה חייבת להיות מסוגלת להקליט וידאו ברזולוציה של לפחות 1080 P ב 30 fps. אם המצלמה אינה יכולה להיות מופעלת על-ידי חשמל רציף, יש לרכוש סוללות נוספות חלופיות להחלפה בכל עת.
הזבובים יכולים לעמוד על מטוס בכל זווית, גופם מאונך למשטח הזה. גם כאשר הם ישנים, הם יכולים לעמוד ללא תנועה על קיר הבקבוק התרבותי האנכי. לכן, בעת ירי מלמעלה למטה, כל עוד אנו מספקים להם מטוס בזווית מתאימה, ניתן לראות את ההתנהגות של זבוב הפירות ולצלם לכל הכיוונים, ללא צורך לצלם את התנהגותו מהצד של FBOC. זו הסיבה לעיצוב פירמידת המזון הארבע-ראשית.
עם זאת, במערכת זו, המצלמה אינה יכולה להתמקד ולנעול את הזבובים ולירות באופן אוטומטי כשהם נעים על פני המסגרת. הנסיין חייב תמיד להשתמש בפונקציות המיקוד וההגדלה של מיקרוסקופ הסטריאו כדי לעקוב אחר הזבובים לירי. מסיבה זו הקוטר של FBOC צריך להיות קטן, ואת העומק של FBOC צריך להיות רדוד, כך הנסיין יכול לעקוב במהירות אחר זבובי פירות נעים. התנהגויות מסוימות עשויות להיות מתועדות בחושך17,18. מאמר זה אינו דן בהיבטים אלה של התנהגות הזבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופסור לי שיאנגדונג ולצלם מר צ'אנג ג'ינג על דיונים והצעות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט האקספלורציה (20200101) של מרכז ההפגנות להוראה ניסיונית במדעי החיים של האוניברסיטה החקלאית של סין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| compact camera, Nikon P310 | Nikon | 3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video | |
| ethylamine foam | 60 mm x 60 mm x 15 mm | ||
| Food Blue No 1 | CAS 3844-45-9 | ||
| mini LED lights and transformer | GODOX | LED-P120 | have 5000-5600 K color temperature |
| small container (e.g. bottle cap) | about Ø 15 mm x 20 mm | ||
| UV / Clear filter | high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm | ||
| zoom stereo microscope | 5-50x zoom |
References
- Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology: Wild-type and classical mutants. , Academic Press. (2013).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, 15484 (2018).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11, 100-105 (2014).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of visualized experiments : JoVE. (3), e193 (2007).
- Yang, C. -H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. -N. Drosophila egg-laying site selection as a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal Of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59613 (2019).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3795 (2012).
- Barron, A. B. Anesthetizing Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46 (4), 439-442 (2000).
- Cicala, R. My not quite complete protective filter article. , Available from: https://www.lensrentals.com/blog/2017/06/the-comprehensive-ranking-of-the-major-uv-filters-on-the-market (2017).
- Carnathan, B. UV and clear lens protection filters review. , Available from: https://www.the-digital-picture.com/Reviews/UV-and-Clear-Lens-Protection-Filters.aspx (2013).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T.
- Szebenyi, A. L.
- Arkema Inc. Plexiglas : optical and transmission characteristics. , Available from: https://www.plexiglas.com/export/sites/plexiglas/.content/medias/downloads/sheet-docs/plexiglas-optical-and-transmission-characteristics.pdf (2000).
- Fluegel, A. Calculation of the light reflection and transmission. , Available from: https://www.glassproperties.com/reflection/ (2007).
- Hunter, F., Biver, S., Fuqua, P. Light science & magic: an introduction to photographic Lighting. , Routledge. (2015).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Rieger, D., et al. The fruit fly Drosophila melangaster favors dim light and times its activity peaks to early dawn and late dusk. Journal of Biological Rhythms. 22 (5), 387-399 (2007).
