Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van stabiele resting-state functionele magnetische resonantie beeldvorming (rs-fMRI) gegevens van een rat met lage dosis isofluraan in combinatie met lage dosis dexmedetomidine.
Abstract
Resting-state functionele magnetische resonantie beeldvorming (rs-fMRI) is een steeds populairdere methode geworden om de hersenfunctie te bestuderen in een rustende, niet-taaktoestand. Dit protocol beschrijft een preklinische overlevingsmethode voor het verkrijgen van rs-fMRI-gegevens. Het combineren van lage dosis isofluraan met continue infusie van de α2 adrenerge receptor agonist dexmedetomidine biedt een robuuste optie voor stabiele, hoogwaardige gegevensverzameling met behoud van de hersennetwerkfunctie. Bovendien zorgt deze procedure voor spontane ademhaling en bijna normale fysiologie bij de rat. Extra beeldvormingssequenties kunnen worden gecombineerd met resting-state acquisitie en creëren experimentele protocollen met een verdovingsstabiliteit van maximaal 5 uur met behulp van deze methode. Dit protocol beschrijft de opstelling van apparatuur, monitoring van rattenfysiologie tijdens vier verschillende fasen van anesthesie, verwerving van rusttoestandscans, kwaliteitsbeoordeling van gegevens, herstel van het dier en een korte bespreking van nabewerkingsgegevensanalyse. Dit protocol kan worden gebruikt in een breed scala van preklinische knaagdiermodellen om de resulterende veranderingen in het hersennetwerk die in rust optreden te onthullen.
Introduction
Resting-state functional magnetic resonance imaging (rs-fMRI) is een maat voor het bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke (BOLD) signaal wanneer de hersenen in rust zijn en niet betrokken zijn bij een bepaalde taak. Deze signalen kunnen worden gebruikt om correlaties tussen hersengebieden te meten om de functionele connectiviteit binnen neurale netwerken te bepalen. rs-fMRI wordt veel gebruikt in klinische studies vanwege de niet-invasiviteit en de lage hoeveelheid inspanning die van patiënten wordt vereist (in vergelijking met taakgebaseerde fMRI) waardoor het optimaal is voor diverse patiëntenpopulaties1.
Dankzij de technologische vooruitgang kon rs-fMRI worden aangepast voor gebruik in knaagdiermodellen om mechanismen aan het licht te brengen die ten grondslag liggen aan ziektetoestanden (zie referentie2 voor beoordeling). Preklinische diermodellen, waaronder ziekte- of knock-outmodellen, maken een breed scala aan experimentele manipulaties mogelijk die niet van toepassing zijn op mensen, en studies kunnen ook gebruik maken van postmortale monsters om experimenten verder te verbeteren2. Niettemin, vanwege de moeilijkheid in zowel het beperken van beweging als het verminderen van stress, wordt MRI-acquisitie bij knaagdieren traditioneel uitgevoerd onder anesthesie. Verdovende middelen, afhankelijk van hun farmacokinetiek, farmacodynamica en moleculaire doelen, beïnvloeden de hersenbloedstroom, het hersenmetabolisme en beïnvloeden mogelijk neurovasculaire koppelingsroutes.
Er zijn talrijke inspanningen geleverd om verdovingsprotocollen te ontwikkelen die neurovasculaire koppeling en hersennetwerkfunctie3,4, 5,6,7,8behouden . We meldden eerder een verdovingsschema dat een lage dosis isofluraan toepaste samen met een lage dosis van de α2 adrenerge receptoragonist dexmedetomidine9. Ratten onder deze anesthesiemethode vertoonden robuuste BOLD-reacties op snorharenstimulatie in regio's die consistent waren met vastgestelde projectieroutes (ventrolaterale en ventromediale thalamische kernen, primaire en secundaire somatosensorische cortex); grootschalige rusttoestand hersennetwerken, waaronder de standaardmodus netwerk10,11 en salience netwerk12 zijn ook consequent gedetecteerd. Bovendien maakt dit verdovingsprotocol herhaalde beeldvorming bij hetzelfde dier mogelijk, wat belangrijk is voor het monitoren van de ziekteprogressie en het effect van experimentele manipulaties in de lengterichting.
In deze studie beschrijven we de experimentele opzet, de voorbereiding van dieren en de fysiologische monitoringprocedures. In het bijzonder beschrijven we de specifieke verdovingsfasen en het verkrijgen van scans tijdens elke fase. De gegevenskwaliteit wordt beoordeeld na elke resting-state scan. Een korte samenvatting van de analyse na de scan is ook opgenomen in de discussie. Laboratoria die geïnteresseerd zijn in het blootleggen van het potentieel van het gebruik van rs-fMRI bij ratten zullen dit protocol nuttig vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd op een 9.4 T MRI-scanner en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Dartmouth College. Aanvullende goedkeuring werd verkregen om de dieren die in de onderstaande video en cijfers worden gebruikt, vast te leggen en weer te geven.
1. Voorbereidingen voor het scannen
- Subcutane infusielijn
- Verwijder een 23 G naald gedeeltelijk uit de verpakking zodat het naaldpunt steriel blijft.
- Houd de naaf van de naald stevig vast en gebruik een scheermesje om de naaldschacht te scoren waar deze de naaf ontmoet.
- Klem een naaldhouder rond de as direct onder de score en breek de as voorzichtig van de naaf.
- Steek 1/3 van de naaldas (stomp uiteinde) in de eerder gesteriliseerde PE50-lijn met voldoende lijnlengte om zich uit te strekken van de medicijnpomp naar het dier in de magneetboring.
- Verdunning van dexmedetomidine en atipamezol
- Bereid een oplossing van verdunde dexmedetomidinehydrochloride met 0,5 ml 0,5 mg/ml bouillon gemengd met 9,5 ml steriele zoutoplossing in een heldere, steriele glazen fles (verdunde concentratie = 0,025 mg/ml).
- Bereid een oplossing van verdunde atipamezol met 0,1 ml 5 mg/ml bouillon gemengd met 9,9 ml steriele zoutoplossing in een heldere, steriele glazen fles (verdunde concentratie = 0,05 mg/ml).
- Scanparameters
- Gebruik de parameters in tabel 1 om scansequenties voor te bereiden.
2. Fase 1 anesthesie: Dierlijke inductie en voorbereiding
- Setup
- Zorg ervoor dat alle apparatuur is ingeschakeld en goed werkt, inclusief de zuurstof- en luchtmixer, het verwarmingskussen en het actieve opruimsysteem (zie figuur 1).
- Stel het instelpunt van het verwarmingssysteem in op 37,5 °C.
- Dierlijke inductie
- Plaats het dier (90 dagen oude, mannelijke Sprague Dawley rat) in de inductiekamer en induceer anesthesie met 2,5% isofluraan in 30% zuurstofverrijkte lucht.
OPMERKING: Een breed scala aan dierenleeftijden en beide geslachten kunnen worden gebruikt. - Zodra het dier is verdoofd, verwijdert u het uit de kamer, weegt u het dier en plaatst u het in de neuskegel (bij 2,5% isofluraan) op het verwarmingskussen in de voorbereidingsruimte.
- Plaats het dier (90 dagen oude, mannelijke Sprague Dawley rat) in de inductiekamer en induceer anesthesie met 2,5% isofluraan in 30% zuurstofverrijkte lucht.
- Dierlijke voorbereiding
- Breng oogheelkundige smeerzalf aan op elk oog om uitdroging te voorkomen.
- Bevestig de diepte van anesthesie door een gebrek aan teenknijpreactie.
- Gebruik tondeuses om een vierkant gebied van 2 bij 2" op het onderste lumbale gebied van de rug van het dier te scheren (d.w.z. direct boven de staart).
- Dien 0,015 mg/kg van de dexmedetomidineoplossing toe met een intraperitoneale (d.w.z.) injectie (bijv. een rat van 300 g zou 0,18 ml krijgen) in het kwadrant rechtsonder in de buik met behulp van een naald van 25 G.
- Schakel de isofluraanstroom van de bereidingsruimte naar de dierenwieg.
- Verplaats het dier in de dierenwieg. Plaats de voortanden van de rat stevig over en in de bijtbeugel. Duw de neuskegel over de neus om een strakke pasvorm te garanderen.
OPMERKING: Als de neuskegel de onderkaak niet bedekt, gebruik dan een paraffinefilm om de kaak voorzichtig gesloten te houden en tegelijkertijd rond de neuskegel af te sluiten. - Plaats het ademhalingskussen onder de buik van de rat onder de ribbenkast en plaats het opnieuw totdat de ademhalingsgolfvorm een diepe trog toont die op elke ademhaling is gecentreerd (zie ademhalingsgolfvorm in figuur 2).
- Bewaak de ademhaling van het dier met behulp van de fysiologiebewakingssoftware. Ga naar de volgende fase van anesthesie wanneer de ademhaling minder dan 40 ademhalingen/min is (bpm; ongeveer 5 min na dexmedetomidine-injectie).
3. Fase 2 anesthesie: Dierlijke opstelling
- Steek oorstangen in de gehoorgang om het hoofd van de rat in de dierenwieg te stabiliseren. Eenmaal geplaatst, trekt u naar voren op de bijtstang en bevestigt u dat het hoofd niet beweegt. Pas de neuskegel en paraffinefilm indien nodig opnieuw aan (zie figuur 3a).
- Plaats de temperatuursonde in een voorgesmeerde, wegwerpsondeafdekking. Steek de temperatuursonde voorzichtig ongeveer 1/2" in het rectum en plak deze met medische tape op de basis van de staart.
- Plaats de pulsoximeterklem op het middenvoetsbeentje van de achtervoet en zorg ervoor dat de lichtbron zich op de onderkant van de voet (handpalm) bevindt.
OPMERKING: Rotatie van de clip kan het signaal beïnvloeden; het creëren van een houder om de poot rechtop te houden en rechtop te knippen, zal dus leiden tot meer stabiliteit. Houd er ook rekening mee dat totdat de rat op normale lichaamstemperatuur is, de zuurstofverzadiging laag kan zijn (<95%). - Gebruik het gewicht van de rat om de infusiesnelheid te berekenen om 0,015 mg/kg/h dexmedetomidine uit te werpen (een rat van 300 g krijgt 0,18 ml/h).
- Stel de medicijnpomp in om de berekende infusiesnelheid uit te werpen.
- Vul een spuit van 3 ml met de steriele, verdunde dexmedetomidine-oplossing en steek de punt van de naald in het open uiteinde van de gesteriliseerde infusielijn (die zich uitstrekt van de medicijnpomp tot de dierenwieg met de eerder bevestigde onderhuidse naald). Vul de lijn en bevestig de spuit in de spuithouder van de medicijnpomp.
- Beweeg het duwblok naar voren totdat het de zuiger raakt en het medicijn wordt bij de naald verdreven, zodat de infusielijn volledig is gevuld.
- Maak met een alcoholdoekje het geschoren gebied schoon om zwerfhaar te verwijderen.
- Knijp de huid ongeveer twee vingerbreedtes boven de basis van de staart. Steek 1/3 van de naald van de infusielijn in de tenthuid.
- Bevestig de naald aan de huid met een 3" stuk brede medische tape. Plaats een tweede stuk brede medische tape over de eerste, over de rat, en bevestigd aan beide zijden van de dierenwieg (zie figuur 4).
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de ferromagnetische naald goed is vastgezet om beweging tijdens de scan te voorkomen. - Begin met de infusie van subcutane dexmedetomidine.
- Plaats een stuk gaas op de brug van de neus van de rat om een vlak oppervlak voor de spoel te creëren. Gebruik papieren tape, die het MRI-signaal niet verstoort, om de spoel aan het hoofd van de rat te vastzetten en deze over de hersenen te centreren (zie figuur 3b, c).
- Beveilig alle leidingen en kabels in de dierenwieg met labtape en controleer of alle fysiologiesignalen stabiel zijn (zie figuur 2).
- Leg papieren handdoeken over het dier en zet ze vast aan de dierenwieg met laboratoriumtape. Als u een luchtverwarmingssysteem gebruikt, wikkelt u een plastic vel om de hele houder om de warme lucht te bevatten.
- Beweeg het dier in de boring en stem de magneet af.
4. Fase 3 anesthesie: Anatomische scan acquisitie
- Verminder isofluraan tot 1,5%, wat resulteert in een gestage toename van de ademhaling tot ongeveer 45-50 bpm. Blijf op dit niveau gedurende de duur van de anatomische scan.
- Gebruik de FLASH-lokalisatiescan om ervoor te zorgen dat de hersenen zijn uitgelijnd met het magneetisocentrum (figuur 5a). Plaats het dier en herhaal indien nodig.
- Voer de ZELDZAME lokalisatiescan met een hogere resolutie uit en gebruik deze scanuitvoer om 15 sagittale segmenten uit te lijnen die gecentreerd zijn over de hersenen (van links naar rechts, figuur 5b).
- Lijn met behulp van het middelste sagittale segment het middelste axiale segment uit op de decussatie van de voorste commissure, die verschijnt als een donkere vlek (Figuur 5c). Noteer de segmentverschuiving die later in de resting-state scans moet worden gebruikt.
- Verkrijg 23 segmenten met behulp van zowel de FLASH- als de RARE-axiale protocollen om te helpen bij de registratie van een gemeenschappelijke ruimte tijdens de analyse na de scan.
- Shim door de hele hersenen met behulp van de PRESS-sequentie.
5. Fase 4: Resting-state scan acquisitie
- Na het voltooien van anatomische scans, verminder isofluraan tot 0,5% tot 0,75%, aanpassen zodat de ademhaling van het dier 60-65 ademhalingen per minuut is. Blijf minstens 10 minuten op dit niveau voordat u begint met het scannen van de rusttoestand om stabiliteit te garanderen.
- Wanneer de fysiologie stabiel is (ademhalingsbereik is 60-75 bpm zonder snakken of onregelmatigheden, kern lichaamstemperatuur is 37,5 ± 1,0 °C, en zuurstofverzadiging is 95% of meer), verkrijg een 15-delige EPI-scan met dezelfde segmentverschuiving als de anatomische axiale reeks.
- Nadat elke rusttoestandscan is voltooid, controleert u de kwaliteit met behulp van een onafhankelijke componentanalyse (ICA) om de gegevens te ontleden in ruimtelijke en temporele componenten.
- Verkrijg ten minste drie hoogwaardige rusttoestandscans.
6. Herstel na de scan
- Wanneer het scannen is voltooid, verhoogt u de isofluraan tot 2% en stopt u de subcutane dexmedetomidine-infusie.
- Verwijder de dierenhouder van de magneetboring, pak het dier uit en verwijder oorstangen, temperatuursonde, pulsoximeterclip en de dexmedetomidinenaald.
- Injecteer 0,015 mg/kg van de verdunde atipamezoloplossing in de achterpootspier van de rat met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 25 G (d.w.z. een rat van 300 g krijgt 0,09 ml).
- Plaats de rat terug in de huiskooi bovenop een verwarmingskussen en controleer tot het dier ambulant is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na elke resting-state scan wordt de stabiliteit beoordeeld met behulp van een onafhankelijke componentanalyse (ICA; voorbeeldscript opgenomen in Aanvullende bestanden). Figuur 6 toont voorbeelden van componentuitvoer van resting-state scans. Figuur 6a toont een signaalcomponent van een scan met hoge stabiliteit. Merk op dat het onderdeel ruimtelijk een hoge regionaliteit heeft. Binnen de tijdsverloop onder de ruimtelijke component is het signaal stabiel en niet voorspelbaar, wat wijst op echte hersenactiviteit. Het vermogensspectrum onderaan toont overwegend lage frequenties. Figuur 6b toont een component uit dezelfde scan als figuur 6a die ruis weergeeft. Let op de niet-regionaliteit in de ruimtelijke component, de hoogfrequente tijdsloop en de hoogfrequente piek in het vermogensspectrum. Ten slotte toont figuur 6c een component van een scan met instabiele anesthesie. De tijdscursus is variabel en onregelmatig. Wanneer dit gebeurt, zijn verbeteringen nodig aan het verdovingsprotocol, meestal aan het afdichten van de neuskegel en het opruimen van afvalgassen.
Figuur 1: Voorbereidingsruimte en MRI-dierenwieg. a) Voorbereidingsruimte. Het vacuüm verwijdert afvalgassen uit zowel de inductiekamer als de neuskegel bij de dierenwieg. Het verwarmingskussen helpt om de dierlijke temperatuur te handhaven tijdens zowel fase 1 als herstel. b) MRI-dierenwieg. De bovenkant geeft componenten van de dierlijke opstelling in fase 2 aan. De onderkant toont een rat volledig opgezet en klaar om te scannen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Fysiologische scanoutput. Zuurstofverzadiging (PulseOx, 96%), hartslag (325 BPM [slagen per minuut]), ademhalingsfrequentie (61 ademhalingen/min) en kernlichaamstemperatuur (T1, 37,5 °C) worden gedurende de scansessie constant gecontroleerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Plaatsing van de neuskegel en spoel. (a) Sluit omhoog mening van de neuskegel die rond de neus en de onderkaak van het dier wordt verzegeld. (b) Bovenaanzicht van de uitlijning van de oppervlaktespoel met de hersenen. (c) Zijaanzicht van de uitlijning van de spoel met het middelpunt van het oog van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Subcutane dexmedetomidine-infusielijn en naaldplaatsing. (a) Inbrengen van de naald in het onderste lumbale gebied van de rug van het dier. (b) Tape die de naald aan de huid van het dier vastzetten. (c) Tape over de dierenwieg om beweging van de ferromagnetische naald te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Anatomische scanuitlijning. (a) Lokalisatiescan om de hersenen van het dier uit te lijnen op het magneetisocentrum, genoteerd met vizieren. (b) Sagittale plakjes uitgelijnd over de hersenen van links naar rechts. c) Uitlijning met de decussatie van de voorste commissure, aangegeven door de witte pijl. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Kwaliteitsbeoordeling met behulp van onafhankelijke componentanalyse. (a) Signaalcomponent tijdens constante anesthesie. (b) Geluidscomponent tijdens constante anesthesie. (c) Onvaste anesthesie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Scannen | Volgorde | Oriëntatie | FOV (mm x mm) | Matrix | Segmenten | Plakdikte (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Gemiddelden | Echoafstand (ms) | Zeldzame factor | Herhalingen | Scantijd |
| Localizer | FLITS | Alle vliegtuigen | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | ZELDZAAM | Alle vliegtuigen | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 minuut |
| Anat | ZELDZAAM | Sagittale | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 minuut |
| Anat | FLITS | Axiale | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | ZELDZAAM | Axiale | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min |
| Shim | PERS | Alle vliegtuigen | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Ruststaat | EPI | Axiale | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min elk |
Tabel 1: Referentietabel met scanparameters. Parameters voor de sequenties die in het protocol worden beschreven. FLASH = Snelle lage hoek opname, ZELDZAAM = snelle acquisitie met ontspanningsverbetering, PERS = punt resolved spectroscopie, EPI = Echo planaire beeldvorming.
Aanvullende bestanden: Voorbeeldscript voor ICA-kwaliteitsbeoordeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stabiliteit van het dier, zowel fysiek als fysiologisch, is de sleutel tot het verkrijgen van hoogwaardige rusttoestandgegevens. Dit protocol bereikt stabiliteit door vier verschillende fasen van anesthesie te doorlopen. Het is absoluut noodzakelijk dat het dier de vastgestelde fysiologische drempels heeft gehaald voordat het naar de volgende fase van anesthesie gaat; aangezien deze methode afhankelijk is van fysiologische autoregulerende mechanismen, kunnen individuele dieren bij elke anesthesiefase enigszins verschillende hoeveelheden tijd nodig hebben. Het is onze ervaring dat meer tijd nemen in elke fase efficiënter is dan het haasten door eerdere stadia zonder de fysiologie van de rat voldoende tijd te geven om zich te vestigen. De belangrijkste componenten die stabiliteit mogelijk maken, zijn de pasvorm van de neuskegel en de juiste afvoer van afvalgas.
Een goed afgesloten neuskegel en aaseters zorgen ervoor dat het dier stabiel kan blijven met regelmatig gespreide ademhaling en stabiele zuurstofverzadigingsniveaus. Als snakken, onregelmatige afstand, het vasthouden van de adem of het verlagen van de zuurstofverzadigingsniveaus optreden, moet men werken aan het verbeteren van de neuskegelafdichting en -opruiming. De neuskegel moet goed passen, maar mag niet in de neusbrug duwen. Een aangepaste neuskegel moet mogelijk worden gefabriceerd. De originele neuskegel van onze fabrikant had een te kleine luchtuitnameklep, dus een valkbuis was uitgerust met een grotere verzegelde vacuümlijn dichter bij het dier. Dit resulteerde in een betere klaring van verlopen CO2 en constante zuurstofverzadiging. Zoals vermeld in het protocol, kan paraffinefilm rond de onderkaak en de rand van de neuskegel worden gewikkeld, maar als het te strak wordt gewikkeld, kan het de ademhaling beperken en leiden tot instabiliteit. Bovendien heeft onjuiste plaatsing van oorstangen en bijtbeugel niet alleen invloed op de noodzakelijke stabiliteit van het hoofd voor beeldvorming, maar kan het ook de ademhaling beïnvloeden; blijven knipperen of hoorbaar geluid van het dier is een waarschijnlijke indicatie van onjuiste plaatsing van de oorschelp. De voortanden moeten stevig op de bijtstang zitten en na plaatsing van de oorstang naar voren worden getrokken om een strakke pasvorm te garanderen. De tong van de rat moet mogelijk naar voren worden getrokken als hij te ver terug in de mond zit en de juiste ademhaling beperkt.
Omdat elk systeem uniek is, is fijnafstelling van het vacuümniveau vereist om een optimale opruiming te bereiken. Als praktische gids moet het mogelijk zijn om een kleine hoeveelheid zuigkracht te voelen, hetzij door een vinger over de vacuümlijnopening in de neuskegel te plaatsen, hetzij door de hele neuskegelopening met de handpalm af te dichten. Het afstemmen van het debiet voor anesthesie-input (hier werd 0,8 L/min gebruikt) is een goed uitgangspunt. De zuurstofverzadiging bij het dier moet gedurende de scan boven de 95% blijven. Als de zuurstofverzadiging een dalende trend vertoont, kan dit een indicatie zijn dat CO2 zich op opbouwt in de neuskegel en dat het opruimen moet worden verhoogd. Een andere mogelijkheid is dat de druk van de pulsoximeterklem op de voet moet worden aangepast, ofwel losgemaakt om de bloedstroom te verbeteren of aangescherpt om een sterk, stabiel signaal te garanderen. Als de ademhaling van het dier hoger is dan de aangegeven drempels, kan dit erop wijzen dat het opruimen te hoog is ingesteld en te veel isofluraan verwijdert. In zeldzame omstandigheden kan het nodig zijn om de dosis subcutane dexmedetomidine te verhogen tot 0,02 mg/kg/uur, maar we hebben vastgesteld dat 0,015 mg/kg goed heeft gewerkt in een breed scala van ratleeftijden en beide geslachten, en wordt ondersteund in farmacologische studies4.
De scanduur die nodig is voor fMRI-activering is een functie van effectgrootte, ruimtelijke signaal-ruisverhouding (SNR) en temporele SNR, zoals eerder getoond door Murphy et al.13. Het gebruik van een kleine oppervlaktespoel (2 cm) en een hoog magnetisch veld (9,4 T) verbetert de gevoeligheid van SNR en BOLD aanzienlijk. Met onze imaging-opstelling hebben we ontdekt dat een enkele scan van 6 minuten voldoende is om een robuust functioneel connectiviteitsnetwerk met rusttoestand te detecteren, in overeenstemming met ons vorige rapport10. Toch herhalen we de scan meestal 3 tot 4 keer en gemiddelden we de resultaten om functionele hersennetwerken voor individuele dieren af te leiden. Als alternatief kan men één keer scannen met een langere duur (10 min of meer) om functionele connectiviteitsnetwerken af te leiden14.
Na het verzamelen van rs-fMRI van hoge kwaliteit met behulp van dit protocol, worden de gegevens voorbewerkt zoals eerder is gepubliceerd15,16. Met het gebruik van beide oorstaven en een bijtbeugel zijn bewegingsartefacten in de fMRI-tijdcursus minimaal en heeft het gebruik van bewegingscorrectie geen merkbaar effect gehad op onze gegevens. Individuele episcans in rusttoestand moeten worden gestript en geregistreerd in een gemeenschappelijke ruimte (we gebruiken één representatief rattenbrein)16,17. Verwijder de beginvolumes van elke EPI, zodat de meegeleverde volumes allemaal worden verkregen wanneer de magneet in steady-state is (we verwijderen 5 tijdpunten). Denoise individuele scans (zie Representatieve resultaten voor voorbeelden van signaal- en ruiscomponenten). Pas slice timing correctie toe, evenals lineaire en kwadratische trendverwijdering, band pass filtering (0,005-0,1 Hz) en ruimtelijke vloeiendheid (0,6 mm FWHM [volledige breedte bij half maximum]). Verwijder bovendien de gemiddelde signaaltijdkoers van de witte stof en ventrikels door lineaire regressie. Na deze standaard voorverwerkingsstappen kan verdere analyse op groepsniveau worden uitgevoerd, waaronder op zaad gebaseerde functionele connectiviteit11,15,18,19,20,21,22, onafhankelijke componentenanalyses10,20,22en modulariteitsanalyses12,19.
Er zijn twee belangrijke voordelen van het huidige protocol: 1) het zorgt voor spontane hersenactiviteit; en 2) het houdt het dier op bijna normale fysiologie. Alternatieve verdovingsmethoden (zoals propofol21, α-chloralose15, en pancuroniumbromide in combinatie met een ander verdovingsmiddel21,23) zijn ook gebruikt om rusttoestandgegevens te verkrijgen. Het is echter aangetoond dat het gebruik van een combinatie van lage dosis isofluraan met dexmedetomidine met een lage dosis, zoals beschreven in dit protocol, de functies van het hersennetwerk slechts minimaal verstoort en tegelijkertijd de fysiologische stabiliteit biedt die nodig is om functionele connectiviteitsgegevens9, 10,18,24in rusttoestand te verkrijgen . Bovendien kunnen BOLD-reacties van somatosensorischestimulatie 9 en mechanische snorharenafbuiging11 worden waargenomen op of na een periode van 90 minuten bij het gebruik van dit protocol, wat wijst op een consistent opwindingsniveau. Interessant is dat het gebruik van dexmedetomidine in isolatie epileptische activiteit kan opwekken; deze activiteit werd echter afgeschaft met aangevuld isofluraan8. Een ander voordeel van het huidige protocol is dat het de noodzaak van kunstmatige ventilatie elimineert. Hoewel mechanische ventilatie kan leiden tot een kleiner bereik van gedeeltelijke kooldioxide en zuurstofverzadiging bij dieren, kan het handhaven van fysiologische parameters zonder intubatie in longitudinale studies leiden tot minder complicaties en ongewenste bijwerkingen.
De interesse in rusttoestand fMRI is de afgelopen 10 jaar aanzienlijk gegroeid en daarmee een behoefte om hoogwaardige, preklinische rusttoestandscans van knaagdieren te verkrijgen. Dit overlevingsprotocol bereikt stabiele anesthesie voor maximaal 5 uur met bijna normale fysiologie tijdens het verkrijgen van rusttoestand. Omdat het protocol zeer stabiel is, kunnen eenvoudig extra sequenties (structureel, stimulatie, farmacologische MRI, enz.) worden toegevoegd om het gewenste experimentele ontwerp te bereiken. De combinatie van lage dosis isofluraan met dexmedetomidine die in dit protocol wordt gebruikt, maakt een breed scala aan preklinische studies mogelijk voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de knaagdierhersenen in zijn rusttoestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van het National Institute of Health (NIH)'s National Institute on Drug Abuse (NIDA) [DJW, EDKS, and EMB were supported by Grant R21DA044501 awarded to Alan I. Green and DJW was supported by Grant T32DA037202 to Alan J. Budney] and the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413]. Aanvullende steun werd verleend via het begiftigde fonds van Alan I. Green als raymond Sobel professor in de psychiatrie in Dartmouth.
Hanbing Lu wordt ondersteund door het National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
De auteurs willen wijlen Alan I. Green erkennen en bedanken. Zijn niet aflatende toewijding aan het gebied van co-voorkomende aandoeningen hielp om samenwerking tussen de auteurs tot stand te brengen. We danken hem voor zijn mentorschap en begeleiding, die zeer gemist zullen worden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
