Summary
Bu protokol, düşük doz deksmedetomidin ile birlikte düşük doz izofluran kullanan bir sıçandan kararlı istirahat durumu fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (rs-fMRI) verilerini elde etmek için bir yöntem açıklar.
Abstract
Dinlenme durumu fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (rs-fMRI), dinlenme, görev dışı bir durumda beyin fonksiyonlarını incelemek için giderek daha popüler bir yöntem haline gelmiştir. Bu protokol, rs-fMRI verilerini elde etmek için klinik öncesi bir sağkalım yöntemini açıklar. Düşük doz izofluran ile α sürekli infüzyonubirleştirildiğinde, 2 adrenerjik reseptör agonist dekmedetomidinin beyin ağı fonksiyonunu korurken istikrarlı, yüksek kaliteli veri toplama için sağlam bir seçenek sağlar. Ayrıca, bu prosedür sıçanda spontan solunuma ve normale yakın fizyolojiye izin verir. Ek görüntüleme dizileri, bu yöntem kullanılarak 5 saate kadar anestezik stabiliteye sahip deneysel protokoller oluşturan dinlenme durumu kazanımı ile birleştirilebilir. Bu protokol, ekipmanın kurulumunu, anestezinin dört farklı aşamasında sıçan fizyolojisinin izlenmesini, dinlenme durumu taramalarının edinimini, verilerin kalite değerlendirmesini, hayvanın kurtarılmasını ve işlem sonrası veri analizinin kısa bir tartışmasını açıklar. Bu protokol, istirahatte meydana gelen beyin ağı değişikliklerini ortaya çıkarmak için çok çeşitli preklinik kemirgen modellerinde kullanılabilir.
Introduction
Dinlenme durumu fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (rs-fMRI), beyin dinlendiğinde ve belirli bir görevle meşgul olmadığında kan-oksijen seviyesine bağımlı (BOLD) sinyalin bir ölçüsüdür. Bu sinyaller, sinir ağları içindeki işlevsel bağlantıyı belirlemek için beyin bölgeleri arasındaki korelasyonları ölçmek için kullanılabilir. rs-fMRI, invazivliği ve hastaların ihtiyaç duyduğu düşük efor miktarı nedeniyle klinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır (görev tabanlı fMRI ile karşılaştırıldığında) çeşitli hasta popülasyonları için en uygun hale getirmektedir1.
Teknolojik gelişmeler, rs-fMRI'nın hastalık durumlarının altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için kemirgen modellerinde kullanılmak üzere uyarlanmasına izin verdi (bkz. gözden geçirme için referans2). Hastalık veya nakavt modelleri de dahil olmak üzere preklinik hayvan modelleri, insanlarda geçerli olmayan çok çeşitli deneysel manipülasyonlara izin verir ve çalışmalar ayrıca deneyleri daha da geliştirmek için ölüm sonrası örneklerden yararlanabilir2. Bununla birlikte, hem hareketi sınırlama hem de stresi azaltmadaki zorluk nedeniyle, kemirgenlerde MRI alımı geleneksel olarak anestezi altında gerçekleştirilir. Anestezik ajanlar, farmakokinetiklerine, farmakodinamiklerine ve moleküler hedeflerine bağlı olarak beyin kan akışını, beyin metabolizmasını etkiler ve potansiyel olarak nörovasküler bağlantı yollarını etkiler.
Nörovasküler kavramayı ve beyin ağı fonksiyonu 3 , 4,5,6,7,8'ikoruyan anestezik protokoller geliştirmek için çok sayıda çaba olmuştur. Daha önce düşük dozda izofluran ve düşük dozda α2 adrenerjik reseptör agonist deksmedetomidin uygulanan bir anestezi rejimi bildirdik9. Bu anestezi yöntemi kapsamındaki sıçanlar, yerleşik projeksiyon yollarıyla (ventrolateral ve ventromedial talamik nüklei, birincil ve ikincil somatosensör korteks) tutarlı bölgelerde bıyık stimülasyonuna sağlam BOLD yanıtları gösterdi; varsayılan mod ağı10 , 11ve salience network12 de dahil olmak üzere büyük ölçekli dinlenme durumu beyin ağları da sürekli olarak algılanmıştır. Ayrıca, bu anestezik protokol, hastalığın ilerlemesini ve deneysel manipülasyonların etkisini uzunlamasına izlemek için önemli olan aynı hayvan üzerinde tekrarlanan görüntülemeye izin verir.
Bu çalışmada, ilgili deneysel kurulum, hayvan hazırlama ve fizyolojik izleme prosedürlerini detaylandırıyoruz. Özellikle, her aşamada spesifik anestezik evreleri ve taramaların alımını açıklıyoruz. Veri kalitesi, her dinlenme durumu taramasından sonra değerlendirilir. Tarama sonrası analizin kısa bir özeti de tartışmaya dahildir. Sıçanlarda rs-fMRI kullanma potansiyelini ortaya çıkarmakla ilgilenen laboratuvarlar bu protokolü yararlı bulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler 9.4 T MRI tarayıcıda yapıldı ve Dartmouth Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Aşağıdaki video ve rakamlarda kullanılan hayvanları kaydetmek ve göstermek için ek onay alındı.
1. Taramadan önce hazırlıklar
- Deri altı infüzyon hattı
- İğne noktasının steril kalması için paketinden 23 G'lık bir iğneyi kısmen çıkarın.
- İğnenin göbeğini güvenli bir şekilde tutun ve iğne milinin göbekle buluştuğu yeri puanlamak için bir jilet kullanın.
- Bir iğne tutucuyu, puanlamanın hemen altındaki şaftın etrafına sıkıştırın ve şaftı merkezden hafifçe kırın.
- İğne milinin 1/3'ü (künt uç) daha önce sterilize edilmiş PE50 hattına, ilaç pompasından mıknatıs deliğinin içindeki hayvana uzanacak kadar hat uzunluğu ile yerleştirin.
- Deksmedetomidin ve atipamezol seyreltilmesi
- Açık, steril bir cam şişede 9,5 mL steril salin ile karıştırılmış 0,5 mL 0,5 mg/mL stok kullanarak seyreltilmiş dekmedetomidin hidroklorür çözeltisi hazırlayın (seyreltilmiş konsantrasyon = 0,025 mg/mL).
- Açık, steril bir cam şişede (seyreltilmiş konsantrasyon = 0,05 mg/mL) 9,9 mL steril salin ile karıştırılmış 0,1 mL 5 mg/mL stok kullanarak seyreltilmiş atipamezole çözeltisi hazırlayın.
- Parametreleri tarama
- Tarama dizileri hazırlamak için Tablo 1'de sunulan parametreleri kullanın.
2. Faz 1 anestezi: Hayvan indüksiyonu ve hazırlanması
- Kurulum
- Oksijen ve hava karıştırıcı, ısıtma yastığı ve aktif çöp atma sistemi de dahil olmak üzere tüm ekipmanların açık olduğundan ve düzgün çalıştığından emin olun (bkz. Şekil 1).
- Isıtma sisteminin sıcaklık ayar noktasını 37,5 °C olarak ayarlayın.
- Hayvan indüksiyonu
- Hayvanı (90 günlük, erkek Sprague Dawley sıçanı) indüksiyon odasına yerleştirin ve% 30 oksijenle zenginleştirilmiş havada% 2.5 izofluran ile anesteziye neden edin.
NOT: Çok çeşitli hayvan yaşları ve her iki cinsiyet de kullanılabilir. - Hayvan uyuşturulduktan sonra, odadan çıkarın, hayvanı tartın ve hazırlık alanında ısıtma yastığının üzerine burun konisine (% 2.5 izoflurane) yerleştirin.
- Hayvanı (90 günlük, erkek Sprague Dawley sıçanı) indüksiyon odasına yerleştirin ve% 30 oksijenle zenginleştirilmiş havada% 2.5 izofluran ile anesteziye neden edin.
- Hayvan hazırlığı
- Kurumasını önlemek için her göze oftalmik yağlama merhem uygulayın.
- Anestezinin derinliğini parmak sıkışması tepkisi eksikliği ile onaylayın.
- Hayvanın sırtının alt bel bölgesinde (yani kuyruğun hemen üstünde) 2" ile 2" kare alanı tıraş etmek için makas kullanın.
- Deksmedetomidin çözeltisinin 0.015 mg/kg'ını intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile (örneğin, 300 g sıçan 0.18 mL alır) 25 G iğne kullanarak karnın sağ alt çeyreğine sürün.
- Hazırlık alanından hayvan beşiğine izoflurane akışını değiştirin.
- Hayvanı hayvan beşiğine taşıyın. Sıçanın ön dişlerini ısırık çubuğuna güvenli bir şekilde yerleştirin. Sıkı bir uyum sağlamak için burun konisini burnun üzerine itin.
NOT: Burun konisi alt çeneyi kapatmazsa, burun konisinin etrafını kapatırken çeneyi hafifçe kapalı tutmak için bir parafin filmi kullanın. - Solunum pedini sıçanın karnının altına göğüs kafesinin altına yerleştirin ve solunum dalga formu her nefeste ortalanmış derin bir oluk gösterene kadar yeniden konumlandırın (Şekil 2'dekisolunum dalga formuna bakın).
- Fizyoloji izleme yazılımını kullanarak hayvanın nefes alışını izleyin. Solunum 40 nefes/dk'dan az olduğunda anestezinin bir sonraki aşamasına geçin (bpm; dekmedetomidin enjeksiyonundan yaklaşık 5 dk sonra).
3. Faz 2 anestezi: Hayvan kurulumu
- Sıçanın kafasını hayvan beşiğinde stabilize etmek için kulak çubuğuna kulak çubukları yerleştirin. Bir kez konumlandıktan sonra, ısırık çubuğunu öne çekin ve başın hareket etmediğini onaylayın. Burun konisini ve parafin filmini gerektiği gibi yeniden ayarlayın (bkz. Şekil 3a).
- Sıcaklık probını önceden yağlanmış, tek kullanımlık bir prob kapağına yerleştirin. Sıcaklık probunu rektuma yaklaşık 1/2" hafifçe yerleştirin ve tıbbi bantla kuyruğun tabanına bantlayın.
- Nabız oksimetre klipsini arka ayağın metatarsal bölgesine yerleştirin ve ışık kaynağının ayağın dibinde (avuç içi) olmasını sağlayın.
NOT: Klibin dönüşü sinyali etkileyebilir; böylece, pençeyi ve klibi dik tutmak için bir tutucu oluşturmak daha fazla stabiliteye yol açacaktır. Ayrıca, sıçan normal vücut sıcaklığına gelene kadar oksijen doygunluğunun düşük olabileceğini unutmayın (%<95). - Deksmedetomidinin 0.015 mg/ kg / s'sini çıkarmak için infüzyon oranını hesaplamak için sıçanın ağırlığını kullanın (300 g sıçan 0.18 mL / s alır).
- İlaç pompasını hesaplanan infüzyon oranını dışarı atacak şekilde ayarlayın.
- 3 mL'lik bir şırıngayı steril, seyreltilmiş dekmedetomidin çözeltisi ile doldurun ve iğnenin ucunu sterilize edilmiş infüzyon hattının açık ucuna yerleştirin (daha önce takılı olan deri altı iğnesi ile ilaç pompasından hayvan beşiğine kadar uzanır). Hattı doldurun ve şırınnayı ilaç pompasının şırınna tutucusuna sabitleyin.
- Pistona dokunana kadar itici bloğu ileriye doğru hareket ettirin ve ilaç iğneden dışarı atılır ve infüzyon hattının tamamen doldurulmasını sağlayın.
- Alkol mendili kullanarak, başıboş tüyleri çıkarmak için tıraş edilen bölgeyi temizleyin.
- Cildi kuyruğun tabanından yaklaşık iki parmak genişliğinde kıstırın. Infüzyon hattı iğnesinin 1/3'ü çadırlı cilde yerleştirin.
- İğneyi 3" geniş tıbbi bant parçasıyla cilde sabitleyin. İlkinin üzerine, sıçanın üzerine ve hayvan beşiğinin her iki tarafına bağlı ikinci bir geniş tıbbi bant yerleştirin (bkz. Şekil 4).
NOT: Tarama sırasında hareketi önlemek için ferromanyetik iğnenin iyi sabitlenerek sabitlenmeleri kritik öneme sahiptir. - Deri altı deksmedetomidinin infüzyonunu başlatın.
- Bobin için seviyeli bir yüzey oluşturmak için sıçanın burnunun köprüsüne bir parça gazlı bez yerleştirin. Bobini farenin kafasına sabitlemek için MRI sinyalini engellemeyen kağıt bant kullanın ve beynin üzerine ortaleyin (bkz. Şekil 3b,c).
- Hayvan beşiği içindeki tüm hatları ve kabloları laboratuvar bandı ile sabitleyin ve tüm fizyoloji sinyallerinin kararlı olup olmadığını kontrol edin (bkz. Şekil 2).
- Kağıt havluları hayvanın üzerine yerleştirin, laboratuvar bandı ile hayvan beşiğine sabitleyin. Bir hava ısıtma sistemi kullanıyorsanız, sıcak havayı içermesi için tüm beşiğin etrafına plastik bir tabaka sarın.
- Hayvanı deliğe taşıyın ve mıknatısı ayarlayın.
4. Faz 3 anestezi: Anatomik tarama alımı
- Izoflurane%1,5'e düşürün, bu da solunumda yaklaşık 45-50 bpm'ye doğru sürekli bir artışa neden olabilir. Anatomik tarama süresince bu seviyede kalır.
- Beynin mıknatıs izomerkeziyle hizalı olduğundan emin olmak için FLASH yerelleştirici taramasını kullanın (Şekil 5a). Hayvanı yeniden konumlandırın ve gerekirse tekrarlayın.
- Daha yüksek çözünürlüklü RARE yerelleştirici taramasını çalıştırın ve beyinde ortalanmış 15 sagittal dilimi hizalamak için bu tarama çıktısını kullanın (soldan sağa, Şekil 5b).
- Orta sagittal dilimi kullanarak, orta eksenel dilimi koyu bir nokta olarak görünen ön komiserin deküsyona hizalayın (Şekil 5c). Daha sonra dinlenme durumu taramalarında kullanılacak dilim uzaklığını not edin.
- Tarama sonrası analiz sırasında ortak bir alana kaydolmaya yardımcı olmak için hem FLASH hem de RARE eksenel protokollerini kullanarak 23 dilim alıp alın.
- PRESS dizisini kullanarak tüm beyinde shim.
5. Aşama 4: Dinlenme durumu tarama alımı
- Anatomik taramaları tamamladıktan sonra, izofluranları% 0.5 ila% 0.75'e düşürün, hayvanın solunumu dakikada 60-65 nefes olacak şekilde ayarlayın. Stabiliteyi sağlamak için dinlenme durumu taramasına başlamadan önce en az 10 dakika bu seviyede kal.
- Fizyoloji kararlı olduğunda (solunum aralığı nefes nefese veya düzensizlik olmadan 60-75 bpm, çekirdek vücut sıcaklığı 37,5 ± 1,0 °C ve oksijen doygunluğu% 95 veya daha büyük) anatomik eksenel seri ile aynı dilim ofsetini kullanarak 15 dilim EPI taraması alın.
- Her dinlenme durumu taraması tamamlandıktan sonra, verileri uzamsal ve zamansal bileşenlere ayrıştırmak için bağımsız bir bileşen analizi (ICA) kullanarak kaliteyi kontrol edin.
- En az üç yüksek kaliteli dinlenme durumu taraması alın.
6. Tarama sonrası kurtarma
- Tarama tamamlandığında, izofluranları% 2'ye çıkarın ve deri altı dekmedetomidin infüzyonunu durdurun.
- Hayvan beşiğini mıknatıs denden çıkarın, hayvanı çözün ve kulak çubuklarını, sıcaklık probunu, nabız oksimetre klipsini ve deksmedetomidin iğnesini çıkarın.
- Seyreltilmiş atipamezole çözeltisinin 0.015 mg/kg'ını 25 G iğneli 1 mL şırınga kullanarak sıçanın arka bacak kasına enjekte edin (yani, 300 g'lık bir sıçan 0.09 mL alır).
- Sıçanı ev kafesine bir ısıtma yastığının üzerine geri yerleştirin ve hayvan ambülatör olana kadar izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her dinlenme durumu taramasından sonra, kararlılık bağımsız bir bileşen analizi (ICA; Tamamlayıcı Dosyalar'dabulunan örnek komut dosyası) kullanılarak değerlendirilir. Şekil 6, dinlenme durumu taramalarından elde edilen bileşen çıkışlarına örnekler gösterir. Şekil 6a, yüksek stabiliteye sahip bir taramadan bir sinyal bileşeni gösterir. Mekansal olarak, bileşenin yüksek bölgeselliğe sahip olduğunu unutmayın. Uzaysal bileşenin altındaki zaman diliminde, sinyal kararlıdır ve tahmin edilemez, gerçek beyin aktivitesinin göstergesidir. Alttaki güç spektrumu ağırlıklı olarak düşük frekansları gösterir. Şekil 6b, Şekil 6a ile aynı taramadan gürültüyü temsil eden bir bileşeni gösterir. Uzamsal bileşendeki bölgesel olmayanlığa, yüksek frekanslı zaman seyrine ve güç spektrumundaki yüksek frekanslı tepe noktasına dikkat edin. Son olarak, Şekil 6c kararsız anestezi ile bir taramadan bir bileşen gösterir. Zaman dilimi değişken ve düzensizdir. Bu durumda, anestezi protokolünde, genellikle burun konisinin sızdırmazlığı ve atık gazların atılması için iyileştirmelere ihtiyaç vardır.
Şekil 1: Hazırlık alanı ve MRI hayvan beşiği. a) Hazırlık alanı. Vakum, hayvan beşiğindeki hem indüksiyon odasından hem de burun konisinden atık gazları toplar. Isıtma yastığı, hem Faz 1 hem de geri kazanım sırasında hayvan sıcaklığını korumaya yardımcı olur. b) MRI hayvan beşiği. Üst kısım, Faz 2'deki hayvan kurulumunun bileşenlerini gösterir. Altta bir sıçanın tamamen ayarlı ve taramaya hazır olduğu görülüyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fizyolojik tarama çıktısı. Tarama seansı boyunca oksijen doygunluğu (PulseOx, %96), kalp atış hızı (dakikada 325 BPM[atım]), solunum hızı (61 nefes/dk) ve çekirdek vücut ısısı (T1, 37,5 °C) sürekli izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Burun konisi ve bobin yerleşimi. (a)Hayvanın burnu ve alt çenesinin etrafına kapatılmış burun konisinin yakın görünümü. (b) Yüzey bobininin beyne hizalamasının tepegöz görünümü. (c) Bobin hizalamasının hayvanın gözünün orta noktasıyla yan görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deri altı dekmedetomidin infüzyon hattı ve iğne yerleşimi. (a) Hayvanın sırtının alt bel bölgesine iğne yerleştirilmesi. (b) İğneyi hayvanın derisine sabitleyen bant. (c) Ferromanyetik iğnenin hareketini önlemek için hayvan beşiği boyunca bantleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Anatomik tarama hizalaması. (a) Hayvanın beynini mıknatıs izomerine hizalamak için lokalizatör taraması, artı işareti ile not edilir. (b) Beyin boyunca soldan sağa hizalanmış sagittal dilimler. (c) Beyaz okla gösterilen ön komiserin deküsyona hizalama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bağımsız bileşen analizi kullanılarak kalite değerlendirmesi. (a) Sabit anestezi sırasında sinyal bileşeni. (b) Sabit anestezi sırasında gürültü bileşeni. (c) Kararsız anestezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Taramak | Sıra | Yönelim | FOV (mm x mm) | Matris | Dilim | Dilim Kalınlığı (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Ortalamalar | Yankı Aralığı (ms) | Nadir Faktör | Tekrarlamaların | Tarama Süresi |
| Yerelleştiriciye | FLAŞ | Tüm uçaklar | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 sn | ||
| Yerelleştiriciye | NADİR | Tüm uçaklar | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 dk |
| Anat | NADİR | Sagittal | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 dk |
| Anat | FLAŞ | Eksenel | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 dk 36 sn | ||
| Anat | NADİR | Eksenel | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 dk |
| Dolgu | BASIN | Tüm uçaklar | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 sn | ||||||
| Dinlenme Durumu | EPİ | Eksenel | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | Her biri 6 dakika |
Tablo 1: Tarama parametrelerinin başvuru tablosu. protokolde özetlenen sıralar için parametreler. FLASH = Hızlı Düşük Açılı Çekim, RARE = Gevşeme Geliştirme ile Hızlı Alım, BASIN = Nokta YENIDEN Çözüldü Spektroskopisi, EPI = Yankı Düzlemsel Görüntüleme.
Tamamlayıcı Dosyalar: ICA kalite değerlendirmesi için örnek komut dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvanın hem fiziksel hem de fizyolojik olarak stabilitesi, yüksek kaliteli dinlenme durumu verileri elde etmenin anahtarıdır. Bu protokol anestezinin dört farklı aşamasında ilerleyerek stabiliteyi elde eder. Hayvanın anestezinin bir sonraki aşamasına geçmeden önce belirlenen fizyolojik eşikleri karşılamış olması zorunludur; Bu yöntem fizyolojik otoregülatör mekanizmalara dayandığından, bireysel hayvanlar her anestezi aşamasında biraz farklı miktarlarda zaman gerektirebilir. Deneyimlerimize göre, her aşamada daha fazla zaman almak, sıçanın fizyolojisine yerleşmek için yeterli zaman vermeden önceki aşamalarda acele etmekten daha verimlidir. Stabiliteye izin veren temel bileşenler burun konisinin uyumu ve uygun atık gaz atmadır.
Düzgün bir şekilde kapatılmış burun konisi ve atma, hayvanın düzenli aralıklı solunum ve sabit oksijen doygunluk seviyeleri ile sabit kalmasını sağlar. Nefes darlığı, düzensiz aralık, nefes tutma veya azalan oksijen doygunluk seviyeleri meydana gelirse, burun konisi sızdırmazlığını ve atma işini iyileştirmek için çalışılmalıdır. Burun konisi yakından oturmalı ancak burun köprüsüne itmemelidir. Özel bir burun konisi imal edilmesi gerekebilir. Üreticimizin orijinal burun konisi çok küçük bir hava çıkış vanasına sahipti, bu yüzden bir şahin tüpü hayvana daha yakın daha büyük bir sızdırmaz vakum hattı ile donatılmıştı. Bu, süresi dolan CO2'nin daha iyi temizlenmesine ve sabit oksijen doygunluğuna neden oldu. Protokolde belirtildiği gibi, parafin filmi burun konisinin alt çenesine ve kenarına sarılabilir, ancak çok sıkı sarılırsa nefes almayı kısıtlayabilir ve kararsızlığa yol açabilir. Ek olarak, kulak çubuklarının ve ısırık çubuğunun yanlış yerleştirilmesi sadece görüntüleme için başın gerekli stabilitesini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda nefes almayı da etkileyebilir; hayvandan sürekli yanıp sönme veya duyulabilir gürültü, yanlış kulak çubuğu yerleşiminin muhtemel bir göstergesidir. Ön dişler ısırık çubuğuna güvenli bir şekilde oturmalı ve sıkı bir uyum sağlamak için kulak çubuğu yerleştirildikten sonra öne çekilmelidir. Sıçanın dili ağızda çok geriye oturursa ve uygun nefes almayı kısıtlarsa öne çekilmesi gerekebilir.
Her sistem benzersiz olduğundan, optimum atma elde etmek için vakum seviyesinin ince ayar yapılması gerekir. Pratik bir rehber olarak, burun konisinin içindeki vakum hattının üzerine bir parmak koyarak veya tüm burun konisinin avuç içiyle açılmasını kapatarak az miktarda emme hissetmek mümkün olmalıdır. Anestezi girişi için eşleşen akış hızı (burada 0.8 L/dk kullanıldı) iyi bir başlangıç noktasıdır. Hayvandaki oksijen doygunluğu tarama boyunca% 95'in üzerinde kalmalıdır. Oksijen doygunluğu azalan bir eğilim gösteriyorsa, bu CO2'nin burun konisinde biriktiği ve atmaların artırılması gerektiğinin bir göstergesi olabilir. Başka bir olasılık, nabız oksimetre klipsinin ayak üzerindeki basıncının ayarlanması, kan akışını iyileştirmek için gevşetilmesi veya güçlü, istikrarlı bir sinyal sağlamak için sıkılaştırılması gerektiğidir. Hayvanın solunumu belirtilen eşiklerden daha yüksekse, bu atma çok yüksek ayarlı olduğunu ve çok fazla izofluran çıkardığını gösterebilir. Nadir durumlarda, deri altı deksmedetomidinin dozunu 0.02 mg / kg / sa'ye çıkarmak gerekebilir, ancak 0.015 mg / kg'ın çok çeşitli sıçan yaşları ve her iki cinsiyette iyi çalıştığını ve farmakolojik çalışmalarda desteklendiğini bulduk4.
fMRI aktivasyonu için gerekli tarama süresi, daha önce Murphy ve ark.13tarafından gösterildiği gibi, etki boyutu, uzamsal sinyal-gürültü oranı (SNR) ve zamansal SNR işlevidir. Küçük bir yüzey bobini (2 cm) ve yüksek manyetik alan (9,4 T) kullanımı SNR ve BOLD hassasiyetini önemli ölçüde artırır. Görüntüleme kurulumumuzla, tek bir 6 dakikalık taramanın, önceki raporumuzla tutarlı, sağlam bir dinlenme durumu işlevsel bağlantı ağını tespit etmek için yeterli olduğunu bulduk10. Bununla birlikte, taramayı genellikle 3 ila 4 kez tekrarlıyoruz ve sonuçları tek tek hayvanlar için işlevsel beyin ağları türetmek için ortalamalıyoruz. Alternatif olarak, işlevsel bağlantı ağları14türetmek için daha uzun süreli (10 dk veya daha fazla) tek bir süre tarayabilirsiniz.
Bu protokolü kullanarak yüksek kaliteli rs-fMRI topladıktan sonra, verileri daha önce yayımlanmış olduğu gibi önceden işle15,16. Hem kulak çubuklarının hem de bir ısırık çubuğunun kullanımıyla, fMRI zaman kursundaki hareket eserleri minimumdur ve hareket düzeltme kullanımının verilerimiz üzerinde gözle görülür bir etkisi olmamıştır. Bireysel dinlenme durumu EPI taramalarının kafatasından çıkarılması ve ortak bir alana kaydedilmeleri gerekir (tek bir temsili sıçan beyni kullanıyoruz)16,17. Her EPI'den başlangıç hacimlerini çıkarın, böylece mıknatıs sabit durumdayken dahil edilenlerin tümü elde edilir (5 zaman noktasını çıkarırız). Tek tek taramaları denoize (sinyal ve gürültü bileşenleri örnekleri için Temsili Sonuçlar'a bakın). Dilim zamanlama düzeltmenin yanı sıra doğrusal ve ikinci dereceden eğilim kaldırma, bant geçişi filtreleme (0,005-0,1 Hz) ve uzamsal yumuşatma (0,6 mm FWHM [maksimum yarım genişlikte]) uygulayın. Ayrıca, ortalama sinyal süresi seyrini doğrusal regresyon yoluyla beyaz maddeden ve ventriküllerden çıkarın. Bu standart ön işleme adımlarından sonra, tohum tabanlı fonksiyonel bağlantı 11 , 15 , 18,19,20,21,22,bağımsız bileşenler analizleri10,20,22ve modülerlik analizleri12,19dahil olmak üzere daha fazla grup düzeyinde analiz yapılabilir.
Mevcut protokolün iki ana avantajı vardır: 1) spontan beyin aktivitesine izin verir; ve 2) hayvanı normale yakın fizyolojide tutar. Alternatif anestezik yöntemler (propofol21, α-kloraloz15ve panküronyum bromür gibi) başka bir anestezik21,23ile birlikte dinlenme durumu verilerini elde etmek için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokolde açıklandığı gibi, düşük doz deksmedetomidin ile düşük doz izofluran kombinasyonunun kullanılması, beyin ağı işlevlerini sadece minimum düzeyde bozduğu ve aynı zamanda kaliteli dinlenme durumu fonksiyonel bağlantı verilerini elde etmek için gereken fizyolojik stabiliteyi sağladığı gösterilmiştir9,10,18,24. Ayrıca, somatosensör stimülasyon9 ve mekanik bıyık saptırma11'den gelen BOLD yanıtları, bu protokolü kullanırken 90 dakikalık bir süre içinde veya sonrasında görülebilir ve bu da tutarlı bir uyarılma seviyesi düşündürmektedir. İlginçtir ki, deksmedetomidinin izolasyonda kullanılması epileptik aktiviteyi ortaya çıkarır; ancak, bu faaliyet ekli isoflurane8ile kaldırıldı. Mevcut protokolün bir diğer avantajı da yapay havalandırma ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Mekanik ventilasyon hayvanlar arasında daha dar bir kısmi karbondioksit ve oksijen doygunluğu aralığına yol açsa da, boyuna çalışmalarda, entübasyona gerek kalmadan fizyolojik parametrelerin korunması daha az komplikasyona ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir.
Dinlenme durumu fMRI'sına olan ilgi son 10 yılda önemli ölçüde arttı ve bununla birlikte kemirgenlerden yüksek kaliteli, klinik öncesi dinlenme durumu taramaları elde etme ihtiyacı. Bu sağkalım protokolü, istirahat durumu kazanımı sırasında normale yakın fizyoloji ile 5 saate kadar stabil anestezi elde eder. Protokol son derece kararlı olduğundan, istenen deneysel tasarımı elde etmek için ek diziler (yapısal, stimülasyon, farmakolojik MRI vb.) kolayca eklenebilir. Bu protokolde kullanılan deksmedetomidin ile düşük doz izofluran kombinasyonu, kemirgen beynini dinlenme durumunda incelemek isteyen araştırmacılar için çok çeşitli klinik öncesi çalışmalara izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (NIH) Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü'nün (NIDA) [DJW, EDKS ve EMB, Alan I. Green'e verilen Grant R21DA044501 tarafından desteklendi ve DJW, Alan J. Budney'e Grant T32DA037202 ve Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü (NIAAA) [Emily D. K. Sullivan'a Grant F31AA028413] tarafından desteklendi. Dartmouth'taki Raymond Sobel Psikiyatri Profesörü olarak Alan I. Green'in bağışlanan fonu aracılığıyla ek destek sağlandı.
Hanbing Lu, Nih Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
Yazarlar merhum Alan I. Green'e teşekkür etmek ve teşekkür etmek istiyor. Birlikte ortaya çıkan bozukluklar alanına olan sarsılmaz bağlılığı, yazarlar arasında işbirliğinin kurulmasına yardımcı oldu. Kendisine büyük özlenecek olan akıl hocalığı ve rehberliği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
