Summary
Ce protocole de marquage immunofluorescent des protéines virales végétales et des protéines d’insectes vecteurs dans les intestins d’insectes excisés peut être utilisé pour étudier les interactions entre les insectes virus et vecteurs, les fonctions des protéines d’insectes et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transmission du virus.
Abstract
La plupart des virus végétaux dans la nature sont transmis d’une plante à l’autre par des insectes hémiptères. Une forte densité de population d’insectes vecteurs qui sont très efficaces pour la transmission du virus joue un rôle clé dans les épidémies de virus dans les champs. L’étude des interactions virus-insecte vecteur peut faire progresser notre compréhension de la transmission virale et des épidémies dans le but de concevoir de nouvelles stratégies pour contrôler les virus végétaux et leurs insectes vecteurs. Le marquage par immunofluorescence a été largement utilisé pour analyser les interactions entre les agents pathogènes et les hôtes et est utilisé ici chez la cicadelle à dos blanc (WBPH, Sogatella furcifera), qui transmet efficacement le virus nain strié noir du riz du sud (SRBSDV, genre Fijivirus, famille Reoviridae), pour localiser les virions et les protéines d’insectes dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen. À l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales de l’intestin moyen, la localisation cellulaire des protéines d’insectes et la colocalisation de virions et d’une protéine d’insecte. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les activités virales chez les insectes, les fonctions des protéines d’insectes et les interactions entre le virus et l’insecte vecteur.
Introduction
La plupart des virus végétaux décrits sont transmis par des insectes de l’ordre des hémiptères qui comprend les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips 1,2. Les pièces buccales perçantes-suceuses des insectes hémiptères percent le tissu végétal pour nourrir et sécréter de la salive, transmettant simultanément efficacement le virus2. Différents mécanismes de transmission des virus végétaux par les insectes vecteurs ont été décrits. Ceux-ci incluent non persistant, semi-persistant et persistant. Le type persistant est soit non multiplicatif, soitmultiplicateur 3,4, mais pour ces deux types, le virus transmis doit se déplacer dans tout le corps de l’insecte. En mode de propagation persistante, les virus infectent et se répliquent d’abord dans les cellules épithéliales de l’intestin de l’insecte, puis se disséminent dans différents tissus, et éventuellement dans les glandes salivaires, d’où ils peuvent ensuite être introduits dans une plante par la salive lors de l’alimentation des insectes 5,6. Les virus transmis de manière persistante se déplacent à travers différents organes et se répliquent dans leurs insectes vecteurs, ce qui nécessite des interactions spécifiques entre les composants du virus et du vecteur à différents stades 7,8.
Les protéines virales et les protéines d’insectes doivent interagir pour faciliter les processus critiques de reconnaissance, d’infection, de réplication ou de dissémination du viruschez les insectes vecteurs 9,10. Bien que la microscopie optique puisse être utilisée pour observer les structures cellulaires chez les insectes, elle ne peut pas montrer la distribution du virion, la localisation cellulaire ou la colocalisation des protéines virales et des protéines d’insectes, ou l’ultrastructure des tissus et des cellules des insectes. Le marquage par immunofluorescence a d’abord été effectué par Coons et al. dans les cellules phagocytaires de la souris au moyen du marquage d’anticorps spécifiques à la fluorescéine, et maintenant il est largement utilisé11. La technique d’immunofluorescence, également connue sous le nom de technique des anticorps de fluorescence, est l’une des premières techniques de marquage immunologique développées et est basée sur la réaction de liaison spécifique entre l’antigène et l’anticorps11,12. L’anticorps connu est d’abord marqué avec de la fluorescéine, qui est utilisée comme sonde pour détecter les antigènes correspondants dans les cellules ou les tissus13,14. Une fois que l’anticorps marqué à la fluorescéine s’est lié à l’antigène correspondant dans les cellules ou les tissus, la sonde émettra une fluorescence brillante lorsqu’elle est irradiée avec des longueurs d’onde d’excitation et vue avec un microscope à fluorescence pour localiser l’antigène15.
La plupart des insectes vecteurs des virus végétaux sont des hémiptères. Une densité de population plus élevée d’insectes vecteurs ayant une efficacité de transmission élevée du virus végétal peut entraîner des épidémiesvirales 5. Le virus du nain strié noir du riz méridional (SRBSDV, genre Fijivirus, famille Reoviridae), l’un des agents pathogènes les plus graves du riz, s’est rapidement propagé dans les zones rizicoles d’Asie de l’Est et du Sud-Est et a causé de graves pertes de rendement depuis 201016,17. Les adultes et les nymphes de la cicadelle à dos blanc (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmettent le SRBSDV au riz de manière persistante et multiplicatrice avec une grande efficacité. Des études sur le terrain ont montré que les éclosions de naines noires du riz induites par le SRBSDV coïncident généralement avec la migration massive sur de longues distances des globules du riz occidental, un facteur crucial dans les épidémies de SRBSDV 7,8,18. La protéine membranaire associée aux vésicules 7 (VAMP7) est un récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur sensible au N-éthylmaléimide (SNARE), qui peut servir de médiateur dans le transport de substances par fusion de vésicules. VAMP7 interagit avec la protéine de capside majeure externe du SRBSDV in vitro, ce qui indique que VAMP7 pourrait être étroitement associé à la transmission du virus16.
Dans le protocole présenté ici, nous avons excisé l’intestin de l’HPBT virulifère à titre d’exemple pour marquer les virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen16. En tant que site d’invasion initial du virus, l’épithélium de l’intestin moyen joue un rôle essentiel dans l’infection, la réplication et la transmission du virus. Tout d’abord, nous avons détaillé les étapes pour exciser l’intestin des nymphes et des adultes de WBPH. Deuxièmement, nous avons utilisé des anticorps spécifiques marqués à la fluorescéine pour marquer les virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales intestinales. Ensuite, nous avons observé les cellules épithéliales et l’emplacement cellulaire des virions et VAMP7 via un microscope confocal à balayage laser. Les résultats ont montré que les virions SRBSDV et VAMP7 pouvaient colocaliser dans le cytoplasme des cellules épithéliales de l’intestin moyen, suggérant que la fonction spécifique de VAMP7 pourrait être liée à la dissémination des virions des cellules épithéliales de l’intestin moyen.
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Protocol
1. Élevage d’insectes non virulifères
- Collecter les WBPH dans les rizières et les élever avec des plants de riz dans des béchers en verre de 1 L recouverts d’un filet anti-insectes dans un incubateur à 28 °C avec 16 h de lumière et 8 h d’obscurité. Comme le SRBSDV n’est pas transmis par les œufs, les nymphes nouvellement écloses ne sont pas virulifères.
- À l’aide d’un stylo-brosse, brosser doucement les insectes du bécher dans un nouveau bécher de plants de riz frais chaque semaine jusqu’à ce que les nymphes WBPH aient éclos. Continuez à élever ces nymphes non virulifères écloses à 2 ou 3 étoiles.
REMARQUE: Brossez soigneusement pour éviter que les WBPH ne s’envolent du bécher ou ne les endommagent.
2. Acquisition de virus et collecte d’insectes virulifères
- Transférer les insectes non virulifères des béchers de verre sur des plants de riz frais infectés par le SRBSDV recouverts d’un filet à l’épreuve des insectes pendant une période d’accès à l’acquisition du virus (PAA) de 2 jours en se nourrissant de plantes. Ensuite, collectez les insectes dans des béchers en verre contenant des plants de riz frais.
- Après 2 jours, collectez les insectes dans des béchers en verre avec un aspirateur manuel pour la dissection et l’excision de l’intestin.
REMARQUE: Le PAA minimum du SRBSDV est de 5 min pour les nymphes et les adultes de l’HPBW, mais les insectes devraient être autorisés à se nourrir de plants de riz frais infectés par le SRBSDV pendant 2 jours pour atteindre une efficacité d’acquisition allant jusqu’à 80%.
3. Préparation du réactif
- Dissoudre 8,5 g de NaCl, 3,5 g de Na2HPO4·12H2O et 0,25g de NaH2PO4 dans 1mL de ddH2O pour préparer une solution saline tamponnéeau phosphate (PBS) 0,01 M.
- Ajouter 4 g de paraformaldéhyde à 100 mL de PBS pour préparer 4% (m/v) de paraformaldéhyde dans du PBS.
- Ajouter 2 mL de Triton X-100 dans 98 mL de PBS pour préparer 2% (v/v) Triton X-100.
4. Dissection des adultes et excision des intestins
- Utilisez une pipette pour placer 100 μL de PBS sur une lame de verre. Placez la lame sur la scène d’un microscope optique.
- Prélever les adultes infectés par le SRBSDV dans des béchers en verre à l’aide d’un aspirateur manuel et les placer dans des tubes de 1,5 mL. Placez les tubes sur de la glace pour paralyser les insectes, puis transférez un adulte paralysé dans les 100 μL de PBS sur la lame avec l’abdomen vers le haut.
NOTE: Les insectes seront complètement paralysés après 5 minutes sur la glace. - Utilisez une pince à épiler dans une main pour serrer le corps, puis retirez la tête avec une autre pince à épiler dans l’autre main.
- Serrez les côtés de l’abdomen avec une pince à épiler et serrez l’ovipositeur ou l’organe copulatoire de la queue avec l’autre ensemble. Ensuite, retirez soigneusement la membrane intersegmentaire d’un segment abdominal et exposez lentement l’intestin dans l’abdomen.
- Continuez à arracher la membrane et retirez progressivement l’intestin complet de l’abdomen. Retirez doucement la queue, qui est reliée à l’extrémité de l’intestin, pour enlever l’intestin complet.
REMARQUE: Tirez très prudemment ou l’intestin sera endommagé. - Placez les intestins excisés dans un tube à centrifuger de 200 μL, ajoutez 200 μL de PBS dans le tube et aspirez doucement la solution avec une pipette pour bien laver les intestins.
5. Dissection des nymphes et excision des intestins
REMARQUE: Les corps des nymphes sont plus fragiles que les corps adultes et l’intestin est facilement endommagé lorsqu’il est tiré de la queue. Par conséquent, la méthode la plus fiable pour exciser l’intestin de la nymphe consiste à tirer de la tête.
- Utilisez une pipette pour placer 100 μL de PBS sur une lame de verre. Placez la lame sur la scène d’un microscope optique.
- Prélever les nymphes infectées par le SRBSDV dans des béchers en verre à l’aide d’un aspirateur manuel et les placer dans des tubes de 1,5 mL. Placez les tubes sur de la glace pour paralyser les insectes. Ensuite, transférez une nymphe paralysée dans les 100 μL de tampon sur la lame avec l’abdomen tourné vers le haut.
- Utilisez une pince à épiler pour détacher la queue de la nymphe. Ensuite, serrez le corps de l’insecte pour fixer doucement et utilisez l’autre ensemble pour serrer la tête. Éloignez doucement la tête du corps tout en maintenant son attachement à l’intestin afin que la tête soit détachée du corps, mais que l’intestin soit toujours attaché au thorax et à l’abdomen.
REMARQUE: Une fois la tête détachée, le corps adiposum de la nymphe s’écoule, rendant le PBS trouble. Retirer la solution trouble de PBS et la changer avec 100 μL de PBS frais. - Avec la pince à épiler toujours en serrant le corps, utilisez l’autre ensemble pour déplacer la tête avec précaution et retirez progressivement l’intestin.
- Détachez doucement l’intestin de la tête avec une pince à épiler et obtenez éventuellement un intestin intact sans endommager le corps de la cicadelle.
- Placez les intestins excisés dans un tube à centrifuger de 200 μL, ajoutez 200 μL de PBS dans le tube et aspirez doucement la solution avec une pipette pour bien laver les intestins.
REMARQUE: Les intestins excisés doivent être bien nettoyés avec du PBS pour éliminer tout corps graisseux contaminant de la cavité abdominale; Ils peuvent interférer avec le protocole de coloration.
6. Protocoles d’étiquetage des virions du SRBSDV et d’une protéine d’insecte
- Préparez les anticorps et le support de montage utilisés dans ce test. Les anticorps sont des anticorps anti-SRBSDV marqués avec Dylight 549 (rouge) contre les virions SRBSDV 18, des anticorps anti-VAMP7 marqués avec Dylight 488 (vert) contre la protéine d’insecte VAMP716,19, Dylight 633 phalloïdine (bleu) et un support de montage contenant du 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu).
- Placer immédiatement les boyaux WBPH fraîchement excisés et lavés au PBS dans 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % (m/v) dans un tube centrifuge de 200 μL et maintenir pendant 2 h à température ambiante.
REMARQUE: Les intestins WBPH fraîchement excisés ne doivent pas être trempés dans PBS pendant une plus longue durée, sinon les cellules épithéliales seront endommagées. - Retirer 4 % (m/v) de paraformaldéhyde à l’aide d’une pipette, puis ajouter 200 μL de PBS dans le tube à centrifuger de 200 μL. Après 10 min, retirer le PBS à l’aide d’une pipette pour éliminer tout paraformaldéhyde.
- Répétez cette étape de lavage PBS deux fois.
- Retirez le PBS et ajoutez 200 μL de détergent non ionique Triton X-100 (2 %, v/v). Perméabiliser les échantillons dans le détergent non ionique pendant 30 min à température ambiante.
- Retirer le Triton X-100 à 2 % (v/v) à l’aide d’un pipeteur, puis laver tout détergent restant avec trois lavages de 10 minutes avec 200 μL de PBS (voir les étapes 6.3 et 6.4).
- Anticorps anti-SRBSDV dilués marqués par Dylight 549 (rouge) et anticorps anti-VAMP7 marqués par Dylight 488 (vert) 1:50 avec 50 μL d’albumine sérique de taureau (3%, m / v).
- Ajouter les anticorps dilués dans le tube et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 °C.
- Retirer le diluant d’anticorps avec un pipeteur, puis laver le diluant d’anticorps restant avec trois lavages de 10 minutes avec 200 μL de PBS.
- Diluer 1 μL de phalloïdine Dylight 633 avec 50 μL de PBS.
- Ajouter 50 μL de phalloïdine diluée dans le tube et incuber les échantillons pendant 2 h à température ambiante.
- Retirer le diluant de phalloïdine avec un pipeteur, puis laver le reste de la phalloïdine avec trois lavages de 10 minutes avec 200 μL de PBS.
REMARQUE: Des lavages minutieux sont essentiels pour réduire le bruit de fond et la fixation non spécifique. - Placez une goutte de support de montage contenant du DAPI sur une lame de microscope et transférez les boyaux sur le milieu.
REMARQUE: Dépliez délicatement chaque intestin avec une pince à épiler et évitez de créer des bulles. Il y a environ 15 boyaux par diapositive. - Placez délicatement un verre de couverture sur les échantillons sans créer de bulles.
REMARQUE: La lame doit être maintenue à 4 ° C dans l’obscurité pour empêcher la trempe de fluorescence avant l’observation avec un microscope confocal à balayage laser. - Visualisez tous les échantillons avec un microscope confocal à balayage laser. Capturez les images à l’aide de la lumière bleue et enregistrez les fichiers sur un ordinateur.
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Representative Results
La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : élevage d’insectes, acquisition de virus, excision de l’intestin, marquage immunofluorescent et fabrication de la lame.
Les intestins de WBPH excisés des adultes ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4% (m / v), perméabilisés avec 2% (v / v) Triton X-100, puis incubés avec Dylight 633 phalloïdine10,18. La micrographie confocale à balayage laser de la figure 2 montre les trois parties de l’intestin excisé après marquage à la phalloïdine, et ce sont respectivement l’intestin antérieur, l’intestin moyen et l’intestin postérieur. Parmi ces trois parties, l’intestin moyen est le site d’infection initial du SRBSDV. La structure cellulaire épithéliale monocouche de l’intestin facilite l’étude de la localisation cellulaire des protéines d’insectes et la colocalisation des protéines virales et insectes.
Nous avons également excisé les intestins de WBPH et les avons incubés avec l’anticorps anti-VAMP7 marqué Dylight 488 (vert) et les virions SRBSDV avec l’anticorps anti-SRBSDV marqué Dylight 549 (rouge), respectivement17,18,19. La figure 3 montre VAMP7 dans le cytoplasme des cellules épithéliales de l’intestin moyen de l’HPBW. Il a été démontré que les virions VAMP7 et SRBSDV colocalisent dans le cytoplasme avec un microscope confocal à balayage laser, ce qui suggère que VAMP7 pourrait jouer un rôle dans la transmission du virus in vivo.
Figure 1 : Vue d’ensemble des étapes de l’élevage des insectes, de l’excision des intestins et de l’étiquetage des protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie de l’intestin WBPH. La fluorescence de la phalloïdine Dylight 633 (bleu, actine marquante) a été observée avec un microscope confocal à balayage laser. Barre d’échelle, 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Marquage par fluorescence des virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen WBPH vues avec un microscope confocal à balayage laser. Les intestins ont été incubés avec un anticorps anti-SRBSDV marqué avec Dylight 549 (rouge) et un anticorps anti-VAMP7 marqué avec Dylight 488 (vert). Barre d’échelle, 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Pour de meilleurs résultats, quelques points clés doivent être pris en compte. Tout d’abord, un ratio élevé d’insectes virulifères par rapport à la population totale est nécessaire. Bien que le PAA minimum pour le SRBSDV par les nymphes et les adultes de WBPH soit de 5 min17, les insectes devraient être autorisés à se nourrir de plants de riz frais infectés par le SRBSDV pendant 2 jours pour atteindre une efficacité d’acquisition allant jusqu’à 80%. Étant donné que les virions SRBSDV peuvent être détectés dans 80% des intestins moyens18, nous avons excisé et étiqueté les insectes virulifères à 2 j après un AAP de 2 jours dans ce protocole. Deuxièmement, les intestins des adultes et des nymphes sont reliés aux glandes salivaires de la tête et à l’ovipositeur ou à l’organe copulateur de la queue. Ainsi, l’intestin peut être soigneusement excisé en tirant de la tête ou de la queue. Cependant, le technicien doit choisir une méthode appropriée pour tirer en fonction de la taille de l’insecte. L’intestin adulte peut être tiré en un seul morceau intact de la queue après que sa tête a été enlevée, tandis que l’intestin de la nymphe plus fragile est facilement brisé lorsqu’il est tiré de la queue20. De manière plus fiable, l’intestin de la nymphe peut être enlevé en tirant doucement la tête après avoir détaché l’intestin de sa queue. En utilisant ces méthodes de dissection / excision, nous pouvons rapidement obtenir des intestins intacts et préserver l’ultrastructure native des cellules épithéliales intestinales. En outre, les autres organes et l’enveloppe externe du corps des cicadelles ne sont pas détruits, maintenant ainsi l’intégrité d’autres tissus et organes tels que les glandes salivaires et l’hémolymphe pour explorer les activités et les interactions virales21.
Même si le marquage par immunofluorescence est largement utilisé, les signaux fluorescents puissants peuvent être difficiles à obtenir sans protocoles d’étiquetage appropriés, ce qui entraîne un gaspillage coûteux de matériel expérimental et de temps22,23. Avant l’étiquetage, les intestins excisés doivent être bien nettoyés avec du PBS pour exclure les corps graisseux contaminants de la cavité abdominale. Les corps graisseux contaminants pourraient empêcher les anticorps de pénétrer dans la cellule et rendre le champ de vision incertain lorsqu’ils sont observés au microscope confocal à balayage laser. Après ce nettoyage, les intestins doivent être fixés immédiatement pour préserver la structure cellulaire. Assurez-vous que le temps de traitement de perméabilisation n’est pas trop long pour éviter le débordement de l’antigène. De plus, les intestins perméabilisés doivent être soigneusement nettoyés après l’incubation avec des anticorps conjugués à la luciférine afin de réduire le bruit de fond et la liaison non spécifique. Avant de presser le verre de couverture, dépliez délicatement chaque intestin avec une pince à épiler et essayez d’éviter les bulles. Lorsque la lame est prête, elle doit être stockée à 4 °C sans lumière pour empêcher l’extinction de fluorescence avant l’observation au microscope confocal à balayage laser24,25.
La transmission du virus par l’insecte vecteur est une étape cruciale dans l’épidémiologie de nombreuses maladies virales des plantes. Perturber cette transmission est donc une stratégie efficace contre les maladies virales7,8, de sorte que l’élucidation du mécanisme de transmission de ces virus est d’une grande importance théorique et pratique. L’immunofluorescence est donc très utile pour localiser les virus végétaux transmis de manière persistante et étudier la fonction de leurs protéines in vivo pour comprendre les différentes étapes de la transmission du virus. Ces dernières années, l’immunofluorescence et la microscopie confocale à balayage laser ont été des outils essentiels responsables des percées dans la compréhension des interactions virales dans les cellules et les tissus vecteurs lors de la transmission de virus végétaux. En utilisant le protocole actuel, nous avons pu localiser les virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen des adultes et des nymphes et déterminer toute colocalisation. La phalloïdine a été utilisée pour marquer l’actine afin de visualiser le contour de la membrane cellulaire épithéliale de l’intestin moyen, et le DAPI a été utilisé pour marquer le noyau. Les structures de l’intestin WBPH et des cellules épithéliales de l’intestin moyen sont distinctes lorsqu’elles sont observées par microscopie confocale à balayage laser. Ce protocole est une méthode fiable pour visualiser l’anatomie du tube digestif des insectes, localiser les virions, d’autres agents pathogènes et les protéines d’insectes, et étudier les activités des agents pathogènes chez les insectes, les fonctions des protéines des insectes et les interactions entre les agents pathogènes et les protéines des insectes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31630058 à X.W. et 31772134 à W.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
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