Summary
Denna metodartikel beskriver de viktigaste stegen för att mäta H + -läckage över det inre mitokondriella membranet med patch-clamp-tekniken, ett nytt tillvägagångssätt för att studera mitokondriernas termogena kapacitet.
Abstract
Mitokondriell termogenes (även känd som mitokondriell frikoppling) är ett av de mest lovande målen för att öka energiförbrukningen för att bekämpa metaboliskt syndrom. Termogena vävnader som bruna och beige fetter utvecklar högspecialiserade mitokondrier för värmeproduktion. Mitokondrier i andra vävnader, som främst producerar ATP, omvandlar också upp till 25% av den totala mitokondriella energiproduktionen till värme och kan därför ha en betydande inverkan på hela kroppens fysiologi. Mitokondriell termogenes är inte bara viktigt för att upprätthålla kroppstemperaturen utan förhindrar också dietinducerad fetma och minskar produktionen av reaktiva syrearter (ROS) för att skydda celler från oxidativ skada. Eftersom mitokondriell termogenes är en viktig regulator för cellulär metabolism, kommer en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process att hjälpa till vid utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion. Viktigt är att de exakta molekylära mekanismerna som styr akut aktivering av termogenes i mitokondrier är dåligt definierade. Denna brist på information beror till stor del på brist på metoder för direkt mätning av frikopplande proteiner. Den senaste utvecklingen av patch-clamp-metodik tillämpad på mitokondrier möjliggjorde för första gången den direkta studien av fenomenet vid ursprunget till mitokondriell termogenes, H + -läckage genom IMM och den första biofysiska karakteriseringen av mitokondriella transportörer som är ansvariga för det, det frikopplande proteinet 1 (UCP1), specifikt för bruna och beige fetter, och ADP / ATP-transportören (AAC) för alla andra vävnader. Detta unika tillvägagångssätt kommer att ge nya insikter om de mekanismer som styr H + -läckage och mitokondriell termogenes och hur de kan riktas för att bekämpa metaboliskt syndrom. Detta dokument beskriver patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier för att studera deras termogena kapacitet genom att direkt mäta H + - strömmar genom IMM.
Introduction
Mitokondrier är kända för att vara cellens kraftverk. De är faktiskt den största källan till kemisk energi, ATP. Vad som är mindre känt är att mitokondrier också genererar värme. Faktum är att varje mitokondrion ständigt genererar de två typerna av energier (ATP och värme) och en fin balans mellan de två energiformerna definierar metabolisk cellhomeostas (Figur 1). Hur mitokondrier fördelar energi mellan ATP och värme är verkligen den mest grundläggande frågan inom bioenergetik, även om det fortfarande är till stor del okänt. Vi vet att ökad mitokondriell värmeproduktion (kallad mitokondriell termogenes) och därmed minska ATP-produktionen ökar energiförbrukningen och detta är ett av de bästa sätten att bekämpa metaboliskt syndrom1.
Mitokondriell termogenes härstammar från H + -läckage över det inre mitokondriella membranet (IMM), vilket leder till frikoppling av substratoxidation och ATP-syntes med därmed produktion av värme, därav namnet "mitokondriell frikoppling"1 (Figur 1). Denna H + -läcka beror på mitokondriella transportörer som kallas frikopplingsproteiner (UCP). UCP1 var det första UCP som identifierades. Det uttrycks endast i termogena vävnader, brunt fett och beige fett där mitokondrier är specialiserade för värmeproduktion 2,3,4. Identiteten av UCP i icke-fettvävnader såsom skelettmuskulatur, hjärta och lever har förblivit kontroversiell. Mitokondrier i dessa vävnader kan ha cirka 25% av den totala mitokondriella energin omvandlad till värme, vilket kan påverka hela kroppens fysiologi avsevärt1. Förutom att upprätthålla kärnkroppstemperaturen förhindrar mitokondriell termogenes också dietinducerad fetma genom att minska kalorierna. Dessutom minskar det produktionen av reaktiva syrearter (ROS) av mitokondrier för att skydda celler från oxidativ skada1. Således är mitokondriell termogenes involverad i normalt åldrande, åldersrelaterade degenerativa störningar och andra tillstånd som involverar oxidativ stress, såsom ischemi-reperfusion. Därför är mitokondriell termogenes en kraftfull regulator för cellulär metabolism, och en mekanistisk förståelse av denna grundläggande process kommer att främja utvecklingen av terapeutiska strategier för att bekämpa många patologier associerade med mitokondriell dysfunktion.
Mitokondriell andning var den första tekniken som avslöjade mitokondriell termogenes avgörande roll i cellulär metabolism och är fortfarande den mest populära i samhället1. Denna teknik är baserad på mätning av syreförbrukning av mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) som ökar när mitokondriell H + -läcka aktiveras. Denna teknik, även om den är instrumentell, kan inte direkt studera mitokondriell H + -läcka över IMM1, vilket gör den exakta identifieringen och karakteriseringen av proteinerna som är ansvariga för det svårt, särskilt i icke-fettvävnader där värmeproduktionen är sekundär jämfört med ATP-produktion. Nyligen gav utvecklingen av patch-clamp-tekniken som tillämpas på mitokondrier den första direkta studien av H + -läckage över hela IMM i olika vävnader 5,6,7.
Mitokondriell patch-klämma för hela IMM etablerades först på ett reproducerbart sätt av Kirichok et al.8. De beskrev den första direkta mätningen av mitokondriella kalcium uniporterströmmar (MCU) 2004 med hjälp av mioplaster från COS-7 cellinjer8. Senare visade Kirichok-labbet kalciumströmmar från IMMs av mus9 och Drosophila-vävnader 9. Andra laboratorier använder nu rutinmässigt denna teknik för att studera de biofysiska egenskaperna hos MCU 10,11,12,13,14. Hela IMM-patch-clamp-analys av kalium- och kloridkonduktans är också möjlig och har nämnts i flera artiklar men har ännu inte varit huvudämnet för en publikation 6,7,9. Den första mätningen av H+ strömmar över IMM rapporterades 2012 från musbruna fett mitokondrier6 och från musbeige fett mitokondrier 20177. Denna ström beror på det specifika frikopplingsproteinet i termogena vävnader, UCP1 6,7. Nyligen publicerat arbete 2019 karakteriserade AKK som det huvudsakliga proteinet som är ansvarigt för mitokondriell H + -läcka i icke-fettvävnader som hjärtat och skelettmuskeln5.
Detta unika tillvägagångssätt möjliggör nu en direkt högupplöst funktionell analys av mitokondriella jonkanaler och transportörer som är ansvariga för mitokondriell termogenes. För att underlätta expansionen av metoden och för att komplettera andra studier såsom mitokondriell andning beskrivs ett detaljerat protokoll nedan för att mäta H + - strömmarna som bärs av UCP1 och AAC. Tre viktiga steg beskrivs: 1) mitokondriell isolering från musbrunt fett för att analysera UCP1-beroende H + -ström och mitokondriell isolering från hjärtat för att analysera AAC-beroende H + -ström, 2) beredning av mioplaster med en fransk press för mekanisk bristning av det yttre mitokondriella membranet (OMM), 3) patch-clamp-inspelningar av UCP1- och AAC-beroende H + -strömmar över hela IMM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som utfördes överensstämmer med Riktlinjerna för National Institutes of Health och godkändes av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
OBS: Mitokondriell isoleringsproceduren är baserad på differentiell centrifugering och varierar något från vävnad till vävnad. Till exempel, eftersom brun fettvävnad är extremt rik på lipider, kräver det ett ytterligare steg för att separera cellskräp och organeller från lipidfasen innan mitokondrierna skördas. För att undvika förvirring beskrivs de två mitokondriella isoleringsförfarandena (en från det bruna fettet och det andra från hjärtat) nedan.
1. Mitokondriell isolering från mus interscapular brunt fett (modifierat från Bertholet et al. 2020)15
- Avliva C57BL/6 manlig mus med CO 2-kvävning och efterföljande cervikal dislokation, enligt rekommendation från American Veterinary Medical Association Panel och IACUC-kommittén.
- Efter att ha placerat musen med magen vänd mot bordet, spraya alkohol för att rengöra och blöta håret (modifierad från Mann et al., 2014)16.
- Gör ett snitt på 2 cm i övre delen av ryggen efter att ha tagit tag i huden med pincett.
- Extrahera musens bruna interscapularfett som motsvarar ett tvåflikigt organ med en fjärilsform16.
- Överför det bruna fettet till en 35 mm petriskål fylld med 5 ml kall isoleringsbuffert (tabell 1) som tidigare placerats på is.
- Rengör det bruna fettet från det vita fettet under en kikare.
- Överför det bruna fettet till en 10 ml bägare med 5 ml kall isoleringsbuffert (tabell 1) för att hugga upp det i tunna bitar. Överför till den iskylda 10 ml glashomogenisatorn (plastmaterial polytetrafluoretylen (PTFE).
- Använd en omrörare för att homogenisera den förskurna vävnaden på is med sex mjuka slag med en kontrollerad hastighet på 275 rotationer/min.
- Centrifugera homogenatet vid 8 500 x g i 10 minuter vid 4 °C i ett 15 ml iskallt koniskt rör. Kassera supernatanten som innehåller lipidfasen.
- Resuspendera pelleten i 5 ml iskall isoleringsbuffert (tabell 1) och homogenisera, en andra gång, suspensionen på is med sex långsamma slag med en hastighet av 275 rotation /min.
- Överför homogenatet i ett 15 ml iskallt koniskt rör och centrifugera det vid 700 x g i 10 minuter vid 4 °C för att pelletera alla kärnor och obrutna celler.
- Samla supernatanten i ett nytt 15 ml rör och lägg det på is.
- Centrifugera supernatanten vid 8 500 x g i 10 minuter vid 4 °C för att erhålla en pellet innehållande mitokondrier.
- Resuspendpellet innehållande mitokondrier i 3,8 ml iskall hypertonisk-mannitolbuffert (tabell 2) och inkubera mitokondriell suspension på is i 10-15 min.
2. Mitokondriell isolering från mushjärtat (modifierad från Garg et al. 2019)17
- Avliva C57BL/6 manlig mus med CO 2-kvävning och efterföljande cervikal dislokation, enligt rekommendation från American Veterinary Medical Association Panel och IACUC-kommittén.
- Efter att ha placerat musen på ryggen, spraya alkohol för att rengöra och blöta håret. Gör sedan ett 2 cm snitt på bröstkorgen efter att ha tagit tag i huden med pincett.
- Dissekera hjärtat från djurets bröstkorg och skölj det för att ta bort allt blod i en 10 ml bägare med 5 ml av den kalla isoleringslösningen (tabell 1).
- När hjärtat har rensats från spår av blod, överför det till en annan 10 ml bägare som innehåller 5 ml kallisoleringsbuffert (tabell 1) för att hugga upp det i tunna bitar. Överför sedan till en iskyld 10 ml glashomogenisator (PTFE-stöt).
- Använd en omrörare för att homogenisera den förskurna vävnaden på is med sex mjuka slag med en kontrollerad hastighet på 275 rotationer/min.
- Överför homogenatet till ett 15 ml iskallt koniskt rör och centrifugera det vid 700 x g i 10 minuter vid 4 °C till pelletskärnor och obrutna celler.
- Samla supernatanten i ett nytt 15 ml rör och lägg det på is.
- Centrifugera supernatanten vid 8 500 x g i 10 minuter vid 4 °C för att erhålla en pellet innehållande mitokondrier.
- Resuspendera mitokondriell pellet i 3,8 ml iskall hypertonisk-mannitolbuffert (tabell 2) och inkubera mitokondriell suspension på is i 10-15 min.
3. Beredning av mitoplaster med en fransk press för mekanisk bristning av OMM.
OBS: Det franska pressförfarandet gör det möjligt att frigöra IMM från OMM med dess integritet bevarad, inklusive matrisen och crista (figur 2)18. Mitokondrier förinkuberas i en hypertonisk-mannitolbuffert (tabell 2) och utsätts för ett lägre tryck under den franska pressproceduren för att undvika drastisk sträckning av IMM när OMM bryts.
- Fyll mitokondriell-hypertonisk-mannitolsuspensionen i en kyld minitryckcell (kolvdiameter 3/8 ") i den franska pressen (figur 3A).
- Välj mediumläget för den franska pressen och komprimera suspensionen genom minitryckcellen vid 110 på urtavlan på french press för de bruna fett mitokondrierna och vid 140 för hjärtat mitokondrier (~ 2,000 psi). Se till att suspensionen kommer ut ur minitryckcellen med en hastighet av cirka 1 droppe / s.
- Samla dropparna i ett 15 ml iskylt koniskt rör.
- Centrifugera suspensionen vid 10 500 x g i 10 min vid 4 °C.
- Resuspendera mitoplastpelleten i 0,5-2 ml iskall hypertonisk-KCl-buffert (tabell 3) och förvara suspensionen på is.
OBS: Brunt fett och hjärtmioplaster är redo för patch-clamp-inspelningar och bör förbli användbara i cirka 3-6 timmar.
4. Elektrofysiologiska registreringar av H+ läckage genom UCP1 och AAC 5,7,15
OBS: Använd följande elektrofysiologiska inställning (figur 3B): inverterat mikroskop med differentiell interferenskontrast (DIC), 60x vatten nedsänkningsmål, vibrationsisoleringsbord och en Faraday-bur, en standardförstärkare som stöder inspelningar med låg ljudnivå, en standarddigitaliserare som används för elektrofysiologisk installation, pClamp 10, en mikromanipulator, badreferenselektrod (3 M KCl-agarsaltbro införd i en mikroelektrodhållare innehållande en silver / silverkloridpellets gjuten in i hållarkroppen (beskriven i Liu et al. 2021)19, perfusionskammare med en 0,13 mm glasöverdragsbotten, ansluten till ett tyngdkraftsmatat perfusionssystem.
- Dra borosilikatglasfilamenten på inspelningsdagen med en mikropipettdragare. Ställ in ett program på avdragaren som används för att generera pipetter med hög grad av reproducerbarhet20.
OBS: Denna programdesign kräver flera försök att få pipetter optimerade för IMM-patchklämman. En standardpipett har fina spetsar med en progressiv konisk form. - Sätt i en glasfilament i avdragaren och dra för att få nästan två identiska lapppipetter från en borosilikatfilament.
- Justera programmet när pipetter blir inkonsekventa mellan dragcykler på grund av åldrandet av avdragarens värmeboxfilament.
- Placera pipetten inuti pipettpoleraren och placera spetsen nära glödtråden under 100x förstoring för att eldpolera den.
- Tryck på fotpedalen flera gånger för att värma glödtråden utan att täppa till eller skada spetskurvan.
- Polera tills pipetter med en resistans mellan 25 och 35 MΩ erhålls när de fylls med TMA-baserad pipettlösning (TMA för tetrametylammoniumhydroxid, tabell 4).
- Förinkubatöverdrag (5 mm diameter, 0,1 mm tjocklek) med 0,1% gelatin för att minska mitoplastens vidhäftning och skölj dem med KCl-badlösningen (tabell 5) innan mitoplastsuspensionen deponeras.
- Bered en rå utspädning genom att blanda ~35 μL av den koncentrerade mitoplastsuspensionen med 500 μL av KCl-badlösningen (tabell 5) och placera den på täckglas som tidigare placerats i en brunn på en 4-brunnsplatta.
- Inkubera på is i 15 till 20 min för mitoplaster till sediment på täckglaset.
- Fyll badkammaren helt med ~50 μL av KCl-badlösningen (tabell 5).
- Överför en täckglas med mitoplaster i kammaren med tunn mikrodissektionspincett med en böjd spets.
- Ordna täckglaset längst ner i kammaren. Genomskinlägg inte kammaren för att hålla mitoplasterna stabila på täckglaset.
- Välj en individuell icke-självhäftande mitoplast i form av 8 genom att skanna täckglaset under mikroskopet med ett 60x mål.
- Ladda pipetten med pipettlösningen (~ 50 μL) och placera den i pipetthållaren.
- Ta pipetten in i badlösningen med en mikromanipulator och närma dig den strax ovanför den valda mitoplasten för att komma nära IMM. Förstärkarprogrammet ger pipettens motstånd när den väl är i badlösningen. Håll membranpotentialen vid 0 mV och applicera 10 mV pulser med membrantestkommandot i förstärkarprogrammet.
- Applicera lätt undertryck för att snabbt skapa en gigaseal med IMM (figur 2B).
- Höj pipetten med mitoplasten fäst för att hålla dem borta från täckglaset för att undvika tätningsbrott på grund av pipettdriften under experimentet.
- Kompensera de herrelösa kapacitanstransienstransienterna med kommandot "membrantest" i förstärkarprogrammet innan du testar hela mitoplastkonfigurationen för att få en korrekt kapacitansmätning (Cm) för mitoplastmembranet efter inbrottet.
- Applicera kortvariga (5-15 ms) spänningspulser (250-600 mV) med förstärkarprogrammet för att bryta membranplåstret under glaspipetten och uppnå konfigurationen för hela mitoplasten (figur 2C). Framgångsrikt inbrott återspeglas av återkomsten av kapacitanstransienstransienser.
- Efter inbrottet, passa kapacitanstransienstransienserna med förstärkarprogrammets membrantestalternativ för att bedöma membrankapacitansen (vilket återspeglar mitoplastens storlek) och dess åtkomstmotstånd Ra (vilket återspeglar kvaliteten på hela mitoplastkonfigurationen). Efter inbrottet bör Ra vara mellan 40 och 80 MΩ. Mitoplaster (2-6 μm i storlek) som används för patch-clamp-experiment har vanligtvis membrankapacitanser på 0,5-1,1 pF.
- Omedelbart efter inbrottet, ersätt KCl-badlösningen (tabell 5) med HEPES-badlösningen (tabell 6) genom att starta perfusionen.
- Applicera ett 850 ms rampprotokoll utformat med förstärkarprogrammet, från -160 mV till +100 mV med ett intervall på 5 s, medan du håller mitoplasten vid 0 mV. Detta protokoll fungerar för UCP1 6,7,15 och AAC5 studier (figur 4 och figur 5).
OBS: Det rekommenderas för UCP1- och AAC-beroende H + -strömmätningar att förvärva alla elektrofysiologiska data vid 10 kHz och att filtrera vid 1 kHz med hjälp av adekvat programvara som driver förstärkaren och digitaliseraren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvecklingen av patch-clamp-metoden som tillämpas på mitokondrier gav den första direkta studien av H + -läckage genom IMM och mitokondriella transportörer, UCP1 och AAC, som är ansvariga för det. Den elektrofysiologiska analysen av UCP1- och AAC-beroende H + -läckor kan ge en första blick på mitokondriernas termogena kapacitet. I resultatavsnittet beskrivs standardprocedurerna för att mäta H+- läckage via UCP1 och AAC.
UCP1-beroende H+ strömmätning (figur 4)6,7,15
Tillämpning av spänningsrampprotokollet inducerar en stor amplitud H + -ström över IMM av brunt fett utan tillsats av exogena fettsyror (FA), de nödvändiga aktivatorerna för UCP (figur 4A). Detta är en specifik egenskap hos brunt och beige fett IMM på grund av den lokala produktionen av FA genom en fosfogidasaktivitet associerad med membranet. När H + -strömmen utvecklas som svar på rampprotokollet är det viktigt att vänta på att strömamplituden stabiliseras. Kvantifiering av H+-strömamplituden via UCP1 kräver bestämning av baslinjen som motsvarar en noll UCP1-ström. När stabiliteten hos H + -strömamplituden har uppnåtts rekommenderas det att perfusera antingen UCP1-hämmare Guanosindifosfat (BNP - 1 mM, figur 4A) eller en FA-kelator (0,5% FA-fritt bovint serumalbumin, visas inte) eller 10 mM metyl betacyklodextrin (MβCD) för det endogena membranet FA-extraktion, figur 4B, svart spår). Restströmmen är den ström från vilken amplituden för UCP1-strömmarna kommer att bestämmas. För att hjälpa till att jämföra amplituderna för UCP1-strömmar i olika mitoplaster beräknas strömtätheten (pA / pF) för varje mitoplast genom att normalisera UCP1-strömmarna med mitoplastkapacitansen (Cm)5,7. Strömmen kan återaktiveras genom tillsats av exogen långkedjig FA med användning av arakidonsyra (AA) eller oljesyra (OA) (1-2 μM). Eftersom både bruna och beige feta IMMs har PLA2-aktivitet, regenereras endogena membran-FA delvis inom några minuter efter att MβCD / albumin tvättats från badet, vilket leder till reaktivering av H + -strömmen via UCP1 6,7. Som förväntat försvinner denna ström helt i IMM för UCP1-/- möss (figur 4A)6,7.
Ett mer exakt sätt att jämföra densiteten och aktiviteten hos UCP1 hos olika mitoplaster i samma vävnad eller hos mitoplaster från olika vävnader (brunt och beige fett) är att kontrollera FA-koncentrationen vid ytan av IMM 6,7. Faktum är att H + strömamplitud kan variera mellan mitoplaster på grund av UCP1-proteinmängden per IMM men också på grund av produktionen av endogen FA. Således rekommenderas att extrahera endogen FA från IMM och att återaktivera UCP1-beroende H + -ström genom att tillsätta exogen FA vid en känd koncentration. För att göra detta måste endogena FAs först extraheras från IMM genom att perfusera en HEPES-badlösning (tabell 6) som innehåller 10 mM MβCD. För att sedan tillåta reaktivering av H+-strömmen via UCP1 genom endast en exakt koncentration av exogena FAs, kommer den senare att perfuseras på en HEPES/MβCD-bakgrund för att kontinuerligt extrahera FA som produceras från IMM.
Studien av konkurrensen mellan purinnukleotiden och FA för bindning till UCP1 är också möjlig med patch-clamp-tekniken 6,7,15. Hämning av UCP1 med purinnukleotider (t.ex. Mg2+-fri ATP) kan jämföras med två olika koncentrationer av FA (helst 10-faldigt). För detta ändamål avlägsnas endogent membran FA först genom applicering av 10 mM MβCD (figur 4B, svart spår). Applicering av exogena FAs (t.ex. här visas endast 0,5 mM FA) applicerade på en bakgrund av 10 mM MβCD möjliggör exakt kontroll av koncentrationen av aktiverande FAs eftersom lokalt producerade FAs omedelbart extraheras från membranet. I detta tillstånd är exogena FAs främst ansvariga för utvecklingen av H + -strömmen. Olika koncentrationer av ATP tillsätts därefter till OA/MβCD-lösningen för att bedöma IC50ATP för varje testad FA-koncentration och därmed fastställa om FA konkurrerar med purinnukleotider för bindning till UCP1.
AAC-beroende H+ strömmätning (figur 5)5
Till skillnad från brunt fett utvecklar IMM för icke-fettvävnader som skelettmuskulatur och hjärta inte en mätbar H+ omedelbart efter inbrottet (figur 5, svarta spår). För att inducera en mätbar H+ ström genom AAC är det viktigt att applicera HEPES-badlösningen (tabell 6) som innehåller 1-2 μM exogen FA (AA, figur 5A, rött spår). Detta kan tyda på att IMM för icke-fettvävnader inte har en FA-produktionsmaskin i IMM som finns i IMM för bruna och beige fetter.
Baslinjen (eller nollströmmen) för kvantifieringen av H+- strömamplituden via AAC motsvarar HEPES-badlösningen (tabell 6) perfuserad på ytan av IMM före tillsats av FA. För att bekräfta att den uppmätta H+ strömmen bärs av AKK är det viktigt att applicera specifika hämmare av AKK tillsatt till FA, 1 μM karboxytractyloside (CATR, figur 5A) eller 4 μM bonkgrekinsyra (BKA, visas inte)5, som nästan helt hämmar H+ ström. Denna ström försvinner helt i IMM hos AAC1-/- möss (figur 5A), AAC1 är den dominerande isoformen i hjärtat5.
Patch-clamp-analys av interaktionen mellan FA-beroende H + -läckage och nukleotider är också möjlig med AAC5. Det finns dock en viktig skillnad mellan AAC och UCP1: AAC bär inte bara H + utan dess huvudsakliga funktion är att transportera adeninnukleotider ADP och ATP21. För att studera hur adeninnukleotidutbyte påverkar FA-beroende H+ läckage tillsätts 1 mM Mg2+-fri ADP till pipettlösningen. Sedan perfuseras FA för att aktivera H + - ström via AAC. Endast ADP i pipettlösningen stör inte H + - strömmen5. När en stabil H + strömamplitud har uppnåtts perfuseras ADP samtidigt med FA. Endast när ADP finns på båda sidor av membranet för att generera ett aktivt nukleotidutbyte via AAC uppnås en konstant men aldrig fullständig hämning av H + -läckage (figur 5B). Detta kan tyda på att de två transportsätten för AAC (FA-H+ ström och ADP/ATP-utbyte) konkurrerar och sannolikt kommer att ske via samma omlokaliseringsväg. ADP/ADP-homobytet valdes för att undvika den ytterligare ström som är associerad med den fysiologiska ADP/ATP-heteroexchange5.
Figur 1: Mitokondriell energifördelning mellan värme- och ATP-produktion. Mekanismer för mitokondriell ATP och värmeproduktion. Mitokondrier har två membran [OMM (lila) och IMM (orange)], som innehåller maskineriet för ATP och värmeproduktion. ETC genererar en elektrokemisk gradient av H + över IMM, som används av ATP-syntas (AS) för att producera ATP och används av UCP för att generera värme. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mitokondriell patch-clamp-teknik (modifierad från Bertholet et al. 2020)15. (A) Mitokondrier isoleras från vävnadslysat genom centrifugering (OMM i lila och IMM i orange). (B) Fransk press med lågt tryck bryter OMM för att frigöra IMM som ger en mitoplast. Vänster panel representerar en mitoplast, som antar en 8-formad form med rester av OMM fäst vid IMM. En glaspipett närmar sig IMM för att bilda en gigaohm-tätning (mitoplast-fäst konfiguration). Ett fotografi av den mitoplast-anslutna konfigurationen visas i den högra panelen. (C) Konfigurationen av hela IMM (diagram i den vänstra panelen) erhålls efter att membranplåstret under pipetten har brutits med flera spänningspulser (200-500 mV). Ett fotografi av hela IMM-konfigurationen visas i den högra panelen. Inåtströmmar (I, röd) är negativa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fransk press och elektrofysiologisk inställning. (A) Bild av fransk press, som hjälper till att bryta OMM för att släppa IMM. (B) Bild av en Faraday-bur, inverterat mikroskop med differentiell interferenskontrast (DIC), 60x vatten nedsänkningsmål, ett vibrationsisoleringsbord och en mikromanipulator. Standardförstärkaren, en standarddigitaliserare och PC-dator visas inte på bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: H+ ström via UCP1 i brunt fett. Kontrollen H + strömspår som visas i svart motsvarar den stabiliserade strömamplituden efter att IMM har brutits. 1 mM BNP tillsätts sedan till badlösningen (orange). Spänningsrampprotokollet visas ovanför WT-spåren. Bad- och pipettlösningarnas pH visas i pipett-mitoplastdiagrammet. (B) Hämning av UCP1 av purinnukleotider i brunt fett. Representativa UCP1-beroende H + strömspår i olika koncentrationer av ATP på IMM: s cytosoliska yta av brunt fett hos möss vid termoneutralitet. UCP1-beroende H + -ström aktiverades med 0,5 mM oljesyra (OA) blandad med 10 mM MβCD.Spänningsprotokollet anges högst upp. I den nedre panelen representeras samma spår men normaliseras inte med mitoplastmembrankapacitansen. Den bruna fettmitoplasten i denna figur hade en membrankapacitans på 0,624 pF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: FA-beroende H+ ström via AKK i hjärtmioplast. (A) Representativ AAC-beroende H + - ström när den appliceras 2 μM AA i badlösningen (övre panelen, orange) i WT-hjärtmioplaster och hämmas av 1 μM CATR (lila). Representativa spår registrerade i AAC1 −/− hjärtmioplast finns i nedre panelen. Kontrollströmmen är i svart. Spänningsrampprotokollet visas ovanför WT-spåren. Bad- och pipettlösningarnas pH visas i pipett-mitoplastdiagrammet. (B) Medan pipettlösningen innehöll 1 mM ADP, induceras AAC-beroende H + - ström av 2 μM AA (orange) och hämmas genom tillsats av 1 mM ADP till badet (lila). Spänningsrampprotokollet visas ovanför spåret. Bad- och pipettlösningarnas pH visas i pipett-mitoplastdiagrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Slutlig koncentration |
| sackaros | 250 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTS | 1 mM |
| pH justerat till 7,2 med TrisBase |
Tabell 1: Mitokondriell isoleringsbuffert (tonicitet ~ 300 mmol per kg)
| Reagens | Slutlig koncentration |
| sackaros | 140 mM |
| D-mannitol | 440 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTS | 1 mM |
| pH justerat till 7,2 med TrisBase |
Tabell 2: Hypertonisk-mannitolbuffert
| Reagens | Slutlig koncentration |
| KCl | 750 mM |
| HEPES | 20 mM |
| EGTS | 1 mM |
| pH justerat till 7,2 med TrisBase |
Tabell 3: Hypertonisk-KCl-buffert
| Reagens | Slutlig koncentration |
| Tma | 130 mM |
| HEPES | 100 mM |
| EGTS | 1 mM |
| MgCl2 för UCP1-registreringar | 2 mM |
| eller | |
| TrisCl för AKK-inspelningar | |
| pH justerat till 7,0 eller 7,5 med D-glukonsyra |
Tabell 4: TMA-baserad pipettlösning (tonicitet ~ 360 mmol per kg)
| Reagens | Slutlig koncentration |
| KCl | 150 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTS | 1 mM |
| pH justerat till 7,0 med TrisBase |
Tabell 5: KCl badlösning (tonicitet ~ 300 mmol per kg)
| Reagens | Slutlig koncentration |
| sackaros | 100 mM för UCP1-inspelningar |
| eller | |
| 150 mM för AKK-inspelningar | |
| HEPES | 150 mM för UCP1-inspelningar |
| eller | |
| 100 mM för AKK-inspelningar | |
| 1 mM EGTS | |
| pH justerat till 7,0 med TrisBase |
Tabell 6: HEPES badlösning (tonicitet ~ 300 mmol per kg)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metodartikel syftar till att presentera patch-clamp-tekniken som nyligen applicerats på mitokondrier, ett nytt tillvägagångssätt för att direkt studera H + -läckage genom IMM som är ansvarig för mitokondriell termogenes 5,6,7,15. Denna teknik är inte begränsad till vävnader och kan också användas för att analysera H + -läckage och andra konduktanser av IMM i olika standardmodeller av människa och celler såsom HAP1,COS7, C2C12 och MEF-celler. Varje mitokondriell isolering kräver dock vissa justeringar som är specifika för varje cell- eller vävnadstyp.
Huvudstegen i den direkta mätningen av H + -strömmar genom IMM av brunt fett 5,6 och hjärtat5 sammanfattas här för att illustrera de mekanismer som är ansvariga för mitokondriell termogenes i specialiserade termogena och icke-fettvävnader. Faktum är att utvecklingen av denna teknik för första gången möjliggör högupplöst funktionell analys av de två huvudsakliga UCP: erna (UCP1 och AAC) i deras ursprungliga membranmiljö med exakt kontroll av kritiska experimentella förhållanden såsom: 1) pH för pipett- och badlösningar, 2) kontroll av membranpotential över IMM och 3) exakt sammansättning av lösningar för att utesluta alla joner och metaboliter som är permeabla för IMM andra än H +. De TMA-baserade pipettlösningarna (tabell 4) och HEPES-badlösningarna (tabell 6) är formulerade för att registrera H + -strömmar och innehåller endast salter som dissocierar i stora anjoner och katjoner som normalt är ogenomträngliga för IMM. Medan badlösningen kan ändras med användning av ett perfusionssystem, vilket gör att olika behandlingar kan appliceras på membranets cytosoliska sida, är det inte möjligt att ändra sammansättningen av intrapipettlösningen. Detta begränsar förståelsen av de regleringsmekanismer som förekommer på matrissidan. Faktum är att föreningar måste vara närvarande i intrapipettlösningen vid tidpunkten för fyllning av pipetten. Därför kan H + -läckage studeras isolerat från andra strömmar. Farmakologiska studier och användningen av KO-möss var avgörande för karakterisering och identifiering av proteinerna som är ansvariga för H + -strömmen genom IMM i olika vävnader 5,6,7. Dessa resultat visade att UCP1 är den huvudsakliga UCP för brunt och beige fett och AAC i icke-fettvävnader. Vi kan inte helt utesluta möjligheten att det finns andra H + -strömmar som inte förmedlas av UCP1 och AAC. Men om det finns andra H + -strömmar var deras amplitud bortom upplösningen av vår elektrofysiologiska installation. Vi mäter inte H+ pumpning av ETC under de förhållanden som beskrivs i detta dokument. När vi har nått hela IMM-konfigurationen tvättas mitokondriell matris ut genom perfusion av intrapipettlösningen. Intermembranutrymmet existerar inte längre sedan steget att bryta OMM med den franska pressen. Inga substrat i de andningskomplex som är avgörande för H+ pumpning genom ETC har lagts till. Det är därför osannolikt att utveckla aktiv H + -pumpning under de elektrofysiologiska förhållanden som beskrivs här.
Enkanalsinspelningar av utskurna lappar beskrivs inte i den här artikeln. Även om UCP1- och AAC-beroende H + -strömmar över IMM är robusta på grund av deras höga proteintäthet, kunde enkanalsöppningarna inte lösas eftersom amplituden för UCP1- och AAC-enhetsströmmar förmodligen är för liten.
Till skillnad från biokemiska studier behöver den mitokondriella isoleringen som beskrivs i denna artikel inte resultera i en hög nivå av mitokondriell renhet. Faktum är att mitokondriellt preparat bestående av en mängd individualiserade mioplaster och cellrester skannas under mikroskopet för att hitta en 8-formad mioplast att lappa. Den 8-formade formen av mitoplasten beror på frisättning av IMM genom ett hål i OMM orsakat av det franska pressförfarandet (figur 2). Den mindre täta loben motsvarar IMM15,17. En lämplig beredning kan definieras genom fritt rörliga mitoplaster som lätt kan särskiljas från cellulära skräp. Det är dock viktigt att minska antalet skräp för att undvika kontaminering av IMM, vilket kan påverka kvaliteten på glaspipettens tätning med membranet. Detta skanningssteg under mikroskopet gör det möjligt att välja en mitoplast med hög IMM-integritet som känns igen av en mindre tät lob än den som avgränsas av OMM och ökar därför chanserna för ett framgångsrikt inbrott.
Denna teknik gav för första gången direkt mätning av UCP1- och AAC-beroende H + - strömmar i deras ursprungliga membran. Mitokondriell integritet och uppdelning existerar emellertid inte längre på grund av omm-brottet och förmodligen cristae. Det är därför viktigt att komplettera patch-clamp-analys med andra klassiska metoder såsom mitokondriell andning för att bekräfta den fysiologiska rollen hos nyligen karakteriserade proteiner i intakta mitokondrier.
Patch-clamp-tekniken som tillämpas på mitokondrier erbjuder nya möjligheter att bättre förstå de molekylära mekanismerna som är ansvariga för mitokondriell H + -läcka och termogenes. I kombination med moderna cellulära och molekylära tekniker kommer detta innovativa tillvägagångssätt att ge nya insikter om de mekanismer som styr mitokondriernas termogena kapacitet och hur de kan riktas mot sjukdomar associerade med mitokondriell dysfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Jag tackar Dr. Yuriy Kirichok för den stora vetenskapen jag var en del av i hans labb och medlemmarna i Kirichok-labbet för de hjälpsamma diskussionerna. Jag tackar också Dr Douglas C. Wallace för att ha tillhandahållit AAC1 knockout-möss. Finansiering: A.M.B stöddes av ett American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
