Summary
Evnen til å nøyaktig oppdage nevromuskulære koblingskomponenter er avgjørende for å evaluere modifikasjoner i arkitekturen på grunn av patologiske eller utviklingsmessige prosesser. Her presenterer vi en komplett beskrivelse av en enkel metode for å oppnå bilder av høy kvalitet av helmonterte nevromuskulære veikryss som kan brukes til å utføre kvantitative målinger.
Abstract
Det nevromuskulære krysset (NMJ) er et spesialisert kontaktpunkt mellom motornerven og skjelettmuskelen. Denne perifere synapsen utviser høy morfologisk og funksjonell plastisitet. I mange nervesystemforstyrrelser er NMJ et tidlig patologisk mål som resulterer i nevrotransmisjonssvikt, svakhet, atrofi og til og med i muskelfiberdød. På grunn av sin relevans kan muligheten til kvantitativt å vurdere visse aspekter av forholdet mellom NMJ-komponenter bidra til å forstå prosessene knyttet til montering / demontering. Det første hinderet når du arbeider med muskler er å få den tekniske kompetansen til raskt å identifisere og dissekere uten å skade fibrene. Den andre utfordringen er å bruke deteksjonsmetoder av høy kvalitet for å få NMJ-bilder som kan brukes til å utføre kvantitativ analyse. Denne artikkelen presenterer en trinnvis protokoll for dissekering av ekstensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også bruken av immunfluorescens for å visualisere pre- og postsynaptiske elementer av helmonterte NMJs. Oppnådde resultater viser at denne teknikken kan brukes til å etablere den mikroskopiske anatomien til synapsen og identifisere subtile endringer i statusen til noen av komponentene under fysiologiske eller patologiske forhold.
Introduction
Pattedyret neuromuskulært kryss (NMJ) er en stor kolinrgisk trepartssynapse som består av motorisk nevronnervenden, den postsynaptiske membranen på skjelettmuskulaturfiberen og de terminale Schwann-cellene1,2,3. Denne synapsen viser høy morfologisk og funksjonell plastisitet4,5,6,7,8, selv under voksen alder når NMJs kan gjennomgå dynamiske strukturelle modifikasjoner. For eksempel har noen forskere vist at motoriske nerveender kontinuerlig endrer form på mikrometerskalaen9. Det er også rapportert at morfologien til NMJ svarer på funksjonelle krav, endret bruk, aldring, trening eller variasjoner i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Dermed representerer trening og mangel på bruk essensiell stimulans for å endre noen egenskaper ved NMJ, for eksempel størrelse, lengde, spredning av synaptiske vesikler og reseptorer, samt nerveterminalgrening14,16,17,18,19,20.
Videre har det vist seg at enhver strukturell endring eller degenerasjon av dette vitale krysset kan føre til motorisk nevroncelledød og muskelatrofi21. Det antas også at endret kommunikasjon mellom nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterte NMJ-endringene og muligens for ødeleggelsen i patologiske tilstander. Neuromuscular kryss demontering spiller en avgjørende rolle i utbruddet av amyotrofisk lateral sklerose (ALS), en nevrodegenerativ sykdom som utgjør et av de beste eksemplene på nedsatt muskel-nerve samspill3. Til tross for de mange studiene som utføres på motorisk nevron dysfunksjon, er det fortsatt diskutert om forverringen observert i ALS oppstår på grunn av direkte skade på motornevronen og deretter strekker seg til kortiko-spinal projeksjonene22; eller hvis det skal betraktes som en distal axonopati der degenerasjon begynner i nerveendene og utvikler seg mot motornevronen somas23,24. Gitt kompleksiteten i ALS-patologi, er det logisk å vurdere at en blanding av uavhengige prosesser oppstår. Siden NMJ er den sentrale aktøren i det fysiopatiske samspillet mellom muskel og nerve, representerer destabiliseringen et sentralt punkt i opprinnelsen til sykdommen som er relevant for å bli analysert.
Pattedyrets nevromuskulære system er funksjonelt organisert i diskrete motorenheter, bestående av en motorisk nevron og muskelfibrene som utelukkende er innervated av nerveterminalen. Hver motorenhet har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funksjonelle egenskaper25. Motor neuron selektiv rekruttering gjør det mulig å optimalisere muskelrespons på funksjonelle krav. Nå er det klart at pattedyr skjelettmuskulaturen består av fire forskjellige fibertyper. Noen muskler er navngitt i henhold til egenskapene til deres mest tallrike fibertype. For eksempel bærer soleus (en bakre muskel i bakre lem involvert i vedlikehold av kroppsstillingen) et flertall av langsomme rykninger (type 1) og er anerkjent som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) i hovedsak sammensatt av enheter med lignende raske rykninger (type 2 fibre) og er kjent som en rask muskel spesialisert for fasiske bevegelser som trengs for bevegelse. Med andre ord, selv om voksne muskler er plastiske i naturen på grunn av hormonelle og nevrale påvirkninger, bestemmer fibersammensetningen kapasiteten til å utføre forskjellige aktiviteter, sett i soleus som opplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL som viser en raskere enkelt rykning. Andre funksjoner som er variable blant forskjellige typer muskelfibre er relatert til deres struktur (mitokondrieinnhold, utvidelse av sarkoplasmisk retikulum, tykkelsen på Z-linjen), myosin ATPaseinnhold og myosin tung kjedesammensetning26,27,28,29.
For gnager NMJs er det betydelige forskjeller mellom muskler28,29. Morfometriske analyser utført i soleus og EDL fra rotter avslørte en positiv sammenheng mellom synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større enn i EDL raske fibre), men forholdet mellom NMJ-området og fiberstørrelsen er lik i begge musklene30,31. Også i forhold til nerveterminalene var endeplaten absolutte områder i type 1 fibre lavere enn i type 2 fibre, mens normaliseringen med fiberdiameter gjorde områder av nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Imidlertid fokuserer svært få studier på morfometrisk analyse for å vise tegn på endringer i noen av NMJ-komponentene33,34. På grunn av relevansen av NMJ i organismens funksjon, hvis morfologi og fysiologi endres i ulike patologier, er det viktig å optimalisere disseksjonsprotokoller av forskjellige typer muskler med kvalitet nok til å tillate visualisering av hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendig å evaluere forekomsten av pre- eller postsynaptiske endringer i forskjellige eksperimentelle situasjoner eller forhold som aldring eller trening35,36,37,38. I tillegg kan det være nyttig å bevise mer subtile endringer i NMJ-komponenter som endret nevrofilamentfosforylering i terminale nerveender som rapportert i ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene i nasjonal lovgivning N° 18611 for pleie av dyr som brukes til eksperimentelle formål. Protokollen ble godkjent av Institutional Ethical Committee (CEUA IIBCE, Protokollnummer 004/09/2015).
1. Muskel disseksjon (Dag 1)
MERK: Før du begynner, lag 40 ml 0,5% paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 i Dulbeccos fosfatsaltin (DPBS). Alternativt kan du lage 20 ml 4% PFA. Forbered 5 ml aliquots og frys ved -20 °C. På dagen for disseksjon, tine en 4% aliquot og tilsett 35 ml DPBS for å oppnå 40 ml 0,5% PFA.
-
Isolering av EDL (hurtigrykninger muskel)
- Euthanize en rotte. Plasser dyret med magen vendt oppover. Lag et innledende snitt ved hjelp av et kirurgisk blad mellom tærne mot bakre lem.
MERK: I dette tilfellet ble en intraperitoneal injeksjon på 90:10 mg/Kg ketamin:xylazin gitt for å avlive rotten, men andre alternativer for anestesi er også tillatt. - Skrell av huden, trekk den oppover til rotte kneet er utsatt.
- For å finne EDL, følg fot sener opp til ringformet ligament. Dette ligamentet sirkler rundt to sener. Klipp ligamentet mellom de to senene med uniband saks (eller lignende). Identifiser EDL-senen ved å løfte begge og velg den som får tåene til å bevege seg oppover.
- Klipp senen med uniband saks. Deretter, mens du holder senen med fine biologiske pinsett, begynner du sakte å skille EDL-muskelen fra tibialis fremre, peroneus brevis og peroneus longus40 (se figur 1A).
MERK: Sørg for at muskelen er separert uten skade. Gjør dette ved å kutte resten av laterale muskler for å åpne en bane mellom dem (EDL har ikke et overfladisk sted) mens du holder og løfter EDL-muskelen. - For å isolere muskelen helt, kutt senen festet til rotte kneet med uniband saks.
- Senk den dissekerte muskelen i 5 ml 0,5% PFA og la den stå i 24 timer ved 4 °C. Eventuelt stifte muskelen i et stykke papp og snu den med muskelen vendt ned. Senk den deretter helt ned i 8 ml av den fikseringsløsningen. Dette trinnet bidrar til å opprettholde muskelen langstrakt under fikseringsprosessen.
- Euthanize en rotte. Plasser dyret med magen vendt oppover. Lag et innledende snitt ved hjelp av et kirurgisk blad mellom tærne mot bakre lem.
-
Isolering av soleus (sakte rykk muskel)
- Vend dyret (magen vender nå nedover). Gjennom huden, kutt calcaneal senen ved hjelp av et kirurgisk blad.
- Ved hjelp av de biologiske pinsettene og uniband saks, skille gastrocnemius muskelen fra beinene, skape et "muskuløst lokk". Sålen vil være på innsiden av muskellokket. Det kan identifiseres fordi det er rødt i farge og har en flat morfologi.
- Med et par biologiske pinsett, nå og løft soleus senen som ligger over gastrocnemius (se figur 1B).
- Klipp senen med uniband saks. Løft hele muskelen mens du kutter noen av de svake festepunktene (dvs. nevrovaskulære elementer). Til slutt, for å frigjøre soleusmuskelen helt, kutt sålen fascicle som danner calcaneal senen med uniband saks.
- Gjenta trinn 1.1.6 for å fikse dissekert soleusmuskel.
2. Ertet fiberpreparat (Dag 2)
- Etter 24 timers fiksering, skyll musklene med 6 ml DPBS-oppløsning 3x i 10 minutter hver før du isolerer muskelfibrene.
- For å isolere fibrene, legg en muskel på et mikroskop lysbilde. Bruk et stereomikroskop til å holde en av senene forsiktig med ett par biologiske pinsett. Deretter, med de andre biologiske pinsettene, begynner å klemme senen sakte for å skille muskelfibrene. Deretter trekker du sakte det klemte vevet oppover mot motsatt muskelsenne. Det vil være nødvendig å gjenta denne handlingen flere ganger til du får flere små, isolerte bunter.
- Plasser dem forsiktig på et forhåndsbehandlet lysbilde (silanisert). Det er nødvendig å holde alle fibrene i orden slik at de ikke overlapper. På dette tidspunktet lufttørker fibrene i 24 timer.
3. Immunfluorescens
-
Primær antistoffinkubasjon (dag 3)
MERK: Alle trinnene ble utført ved romtemperatur, unntatt hvis annet er oppgitt. Den mest effektive måten å fjerne de forskjellige løsningene uten å løsne fibre fra lysbildet er å bruke en insulinsprøyte.- For å starte immunoppfatningsprosessen, omkranser de tørkede isolerte muskelfibrene med en pappenn for å skape en vanntett barriere.
- For å hydrere muskelfibrene, tilsett 200 μL destillert vann i 5 min, og bytt deretter vannet til 200 μL DPBS for neste 5 min inkubasjon. På dette tidspunktet, start immunfluorescence merking.
- Inkuber fibre med 300 μL av en blokkeringsbuffer (BB) som inneholder 50 mM glycin, 1% BSA og 1% Triton X-100 i 30 minutter.
- Erstatt BB med det primære antistoffet i en konsentrasjon foreslått av produsenter. Bruk BB til å fortynne antistoffet. Dette eksperimentet brukte 400 μL SMI 32 eller SMI 31 som anerkjente ikke-fosforilert (Nf) eller fosforilert (Fos-Nf) nevrofilament H ved 1/800 fortynning for å oppdage NMJ presynaptisk komponent.
MERK: Når du bestemmer deg for å gjenkjenne hele presynaptisk element i stedet for å evaluere nevrofilament fosforylering, velg antistoffer mot synapsin, synaptofysin eller SV2a som tidligere var vellykket ansatt. - Inkuber fibrene med den primære antistofffortynning ved 4 °C over natten (eventuelt kan inkubasjon utføres ved 37 °C i 1 time). I begge tilfeller vil det være viktig å utføre inkubasjonen ved hjelp av et fuktig kammer.
-
Immunfluorescens: Sekundær antistoffinkubasjon (dag 4)
- Fjern det primære antistoffet og skyll fibrene 3x i 10 minutter hver med 500 μL DPBS og siste gang med BB.
- Fjern denne siste vasken og tilsett det fluorescerende merkede sekundære antistoffet fortynnet i BB. For dette eksperimentet ble 500 μL geit antimus Alexa Fluor 488 ved 1/1000 fortynning i BB brukt. For å se det postsynaptiske elementet i NMJs ble 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotin-XX konjugat lagt til sekundær antistofffortynning.
MERK: Tilsetningen av Btx-biotin XX gir bedre signal-til-støy-bilder når de er oppdaget med streptavidin som forsterker signalet. I tillegg økte streptavidin-konjugering til forskjellige fluoroforer fargekombinasjoner i co-merkingsanalyser. Alternativt tillater fluorescerende merket Btx å skaffe bilder av lignende kvalitet. - Inkuber det sekundære antistoffet og Btx i 2 timer ved romtemperatur eller 1 time ved 37 °C beskyttet mot lys.
- Fjern det sekundære antistoffet og Btx. Vask 3x i 10 minutter hver med 500 μL DPBS og den siste skyllingen med BB.
- Inkuber med 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 ved 1/1000 fortynning med BB i 1 time ved romtemperatur. På dette tidspunktet, om ønskelig, legg til en sonde for å motvirke kjernene, for eksempel diaminofenylindol ved en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml.
- Fjern inkubasjonsløsningen og vask fibrene 3x i 10 min hver med 500 μL DPBS. Monter deretter fibrene.
-
Montering
- Plasser 4 prikker med gjennomsiktig neglelakk på mikroskopet glir som om de var toppunktene på en firkant. La dem tørke 1-2 min. Dette vil være punktene der dekslene vil hvile, noe som bidrar til å unngå vevsknusing.
- Fjern den siste DPBS-vasken og tilsett nok monteringsmedier (~ 200 μL) til å dekke fibrene; unngå tørking.
MERK: For å klargjøre 10 ml av monteringsmedieblandingen, bruk Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glyserol i en 4:1 (v:v). - Bruk en 200 μL pipettespiss for å spre monteringsmediet forsiktig over fibrene for å sikre en fullstendig nedsenking av dem alle. Fjern luftbobler før du plasserer dekkglasset.
- Plasser dekslene på prøvene og prøv å forhindre generering av luftbobler. Denne bevegelsen kan gjøres ved hjelp av tang.
4. Mikroskopi og morfometrisk analyse
- Bilde de ertet fiberpreparatene ved hjelp av laser konfikal mikroskopi.
- Ta en serie optiske seksjoner (30 μm Z stabler) over hele synapsen ved hjelp av et intervall på ett mikrometer. Hvis du vil angi stakken, bruker du Btx-signalet. Bilde minst 15-20 NMJs for hver muskeltilstand med en oppløsning på 2048 piksler x 2048 piksler. Denne metoden ble valgt for å skaffe bilder med tilstrekkelig optisk kvalitet og oppløsning for den morfometriske analysen.
- For å utføre målingene, bruk projeksjonsbildene av stabler med hvilken som helst analyseprogramvare.
MERK: Selv om den forklarte morfometriske analysen ble gjort manuelt, er det to nylig utviklede Image J-baserte verktøy for å studere mange forskjellige aspekter av pre og postsynaptisk NMJ morfologi33,34. - Hvis du vil hente verdiene for Totalt NMJ-område, velger du den ytre kantlinjen (ekstern omriss av det fargede området, se figur 2) for sluttplaten ved hjelp av det magnetiske lassomeringsverktøyet i Photoshop og bestemmer antall markerte bildepunkter i histogramvinduet. Deretter kan pikselområdene konverteres til firkantede mikrometre ved hjelp av skalaen som er angitt av den konfølale programvaren.
- Med det samme lassoverktøyet velger du den indre kantlinjen (omriss av det fargede området innenfor endeplaten, se figur 2) og bestemmer det ikke-fargede området i hele strukturen (eller det tomme området) som beskrevet ovenfor (trinn 4.4.). Verdiene for postsynaptisk område oppnås etter at totalområdet er trukket fra det tomme området for hver NMJ.
- Få det presynaptiske området, som er definert som området med anti-nevrofilament immunfluorescence, på samme måte som total NMJ-området.
MERK: Alle disse parameterne ble brukt til å bestemme postsynaptisk tetthetsindeks (postsynaptisk område /totalområde) og NMJ-dekning (presynaptisk område/ postsynaptisk område). En høyere postsynaptisk tetthetsindeks innebærer en tettere eller mer kompakt endeplate, mens en mindre NMJ-dekning gjenspeiler en mye dårligere interaksjon mellom nerveterminal og sluttplate (begge kompatible med en denervasjonsprosess). I tilfelle vist her, siden fosforylaterte og ikke-fosforierte former for nevrofilamenter ble påvist på nerveterminalnivå, ble fosforylatert / ikke-fosforylatert presynaptisk signalforhold og fosforylatert / ikke-fosforilert dekningsforhold beregnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tilbyr en enkel metode for å isolere og immunopprette muskelfibre fra to forskjellige typer muskler (raske og langsomme muskler, se figur 1). Ved hjelp av de riktige markørene og /eller sondene kan NMJ-komponenter oppdages og evalueres siden et kvantitativt synspunkt for å vurdere noen av de morfologiske endringene som kan oppstå som følge av sykdomsprogresjon eller en bestemt legemiddelbehandling. I den nåværende studien ble presynaptiske og postsynaptiske komponenter i NMJ fluorescerende merket med anti-Nf- eller anti-Fos-Nf-antistoffer og Btx henholdsvis (Figur 2, øvre paneler). Hvert høyoppløselig konfokalbilde av en NMJ oppnådd etter at immuniseringen ble brukt til å bestemme de morfometriske målingene og indeksene som er angitt i protokolldelen (tabell 1) som bruker parametrene som er beskrevet i bunnpanelene i figur 2.
For å demonstrere at dette helmonterte NMJ-preparatet perfekt beholdt synapsearkitekturen, slik at visualiseringen av effekten som har en progressiv nervesystemsykdom på den, ble ertet fibre av transgene rotter som uttrykker menneskelig gen SOD1G93A (en ALS-modell) immunostert ved hjelp av protokollen (Figur 3). Sammenslåingsbildene av pre- og postsynaptiske signaler med kjernene farget med DAPI viste at forskjeller mellom NMJene mellom transgene og ikke-transgene alderstilpassede dyr er tydelig synlige og kompatible med resultatene som litteraturen forventer.
I tillegg gjorde kvaliteten på bildene det mulig å kvantifisere endringene som ble observert ved å utføre den morfometriske analysen. For eksempel viser figur 4 bevis på at det postsynaptiske signalet hos transgene dyr ser ut til å være mer kompakt (ca. 20%), hovedsakelig på grunn av reduksjonen av NMJ totalareal.
På den annen side viser figur 5 at nmjenes presynaptiske område i transgene dyr også reduseres. Kvaliteten på dette helmonterte NMJ-preparatet ble bevist ved å analysere omfanget av nerveterminalens tilbaketrekning og ved å oppdage endringer angående nevrofilament fosforyleringstilstander. Dette faktum vil være viktig for å få en dyp innsikt i NMJ-demonteringsprosessen knyttet til ALS-sykdom i modellen som brukes. Det minste presynaptiske området som ble oppdaget var det som var merket med antifosforylatt nevrofilament (Figur 5B, E, C, F).
Bruken av dekningsindeksen (figur 6) gjorde det mulig å fastslå at de transgene NMJ-ene var delvis denervated. Det kan også bestemme at dekningsindeksene til fosforylatert nevrofilament er lavere enn det som oppnås med ikke-fosforylatert nevrofilament. Disse resultatene viser status for helmontert NMJ og at det kan være nyttig å introdusere studiet av nevrofilament fosforyleringstilstand (en viktig determinant for filamentplastisitet og stabilitet) ved hjelp av dette helmonterte NMJ-preparatet.
Til slutt tilbyr metoder presentert i dette arbeidet den største NMJ-kvaliteten for å identifisere, vurdere og evaluere selv subtile endringer i NMJ som helhet eller i en av komponentene.
Figur 1: EDL og soleus anatomiske landemerker. Bildeutheving (A) EDL og (B) soleus plassering blant de andre musklene i rotte nedre bakre lem. Insets viser ordninger av bakre lem muskler nær EDL (rød) og soleus (grønn) muskler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Helmontert nevromuskulært kryss av EDL muskelfibre. (A) Postsynaptisk komponent i NMJ oppdaget ved hjelp av alfa-bungarotoxin (Btx, magenta), en sonde som binder seg spesielt til acetylkolinreseptorene (AChR). (B) Motorterminal oppdaget ved hjelp av anti-nevrofilamenter (anti-Nf, grønn). (C,D) Synaptiske komponenter schematiseres for å illustrere parametrene (eksterne og interne grenser) som definerte målingene (Total Area, Presynaptic and Postsynaptic Area) som brukes for den morfometriske analysen som er beskrevet i protokollen. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Pre- og postsynaptiske endringer observert i NMJs av en ALS-modell. Representative konfokale bilder hentet fra helmonterte NMJs oppnådd i preparater fra EDL muskelfibre farget for å oppdage nevrofilamenter (grønn), AChR (magenta) og kjerne (blå) fra enten ikke-transgene (-/-) eller transgene (hSOD1G93A/-) rotter. (A,C) Ikke-transgene rotter har normal NMJ-morfologi (pretzel-form) både når motorenden visualiseres ved hjelp av anti-Fos-Nf (A) eller anti-Nf (C). (B,D) Transgene rotter presenterer mer kompakt postsynaptisk område og mindre presynaptiske terminaler med en reduksjon i nevrofilament fosforyleringssignalet. Skalastang = 50 μm.
Figur 4: Morfometrisk evaluering av NMJ postsynaptisk element i EDL-muskler fra 180 dager gamle mannlige hSOD1G93A rotter. Representative konfokale bilder av postsynaptiske komponenter i (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene dyr. Evaluering av (C) postsynaptisk område og (F) postsynaptisk tetthetsindeks i NMJs av ikke-transgene (faste kolonner) og transgene (stripete kolonner) dyr. Mens det postsynaptiske området ble litt redusert hos transgene dyr, økte den postsynaptiske indeksen i større grad graden av NMJ-komprimering som indikert ved redusert totalareal hos transgene dyr som vist i tabell 1. Skalastang = 50 μm. Data som representeres er henholdsvis gjennomsnittlig ± SEM. (*) og (***) indikert p<0,05 og p<0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Morfometrisk evaluering av NMJ presynaptisk element i EDL muskler fra 180 dager gamle mannlige hSOD1G93A rotter. Gitt betydningen av NMJ demontering i ALS sykdom, ble kvaliteten på preparatet evaluert ved å analysere, ikke bare omfanget av nerveterminal tilbaketrekning, men også muligheten for å oppdage endringer i fosforylering av NMJ presynaptisk element. Representative konfokale bilder av den presynaptiske komponenten i (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene dyr oppdaget ved hjelp av (A, B) anti-Fos-Nf eller (D,E) anti-Nf antistoffer. Evaluering av presynaptisk område avgrenset av (C) fosforilert og (F) ikke-fosforilaterte nevrofilamenter i NMJs av ikke-transgene (faste kolonner) og transgene (stripete kolonner) dyr. Merk at disse områdene er svært like hos ikke-transgene dyr, mens de presenterer en betydelig reduksjon i NMJs av transgene dyr. Skalastang = 50 μm. Data som representeres er gjennomsnittlig ± SEM. (****) indikert p<0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Evaluering av innervasjonsstatus ved helmonterte NMJs av EDL hSOD1G93A-fibre. Dekningsindeksen er mye brukt til å evaluere tilstanden til innervering. Det vurderes at "fullt innervated" NMJs presenterer en dekningsindeks 
50%, mens de "delvis innervated" har dekninger mellom ≥20% og ≤50% og de ledige anses som "denervated". Representative konfokale bilder av (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene NMJs som viser presynaptiske og postsynaptiske elementer oppdaget ved hjelp av (A,B) anti-Fos-Nf eller (D,E) anti-Nf anti-Antistoffer for å observere motorterminalen. Evaluering av dekning ved bruk av (C) fosforylaterte og (F) ikke-fosforierte nevrofilamenter i NMJs av ikke-transgene (faste kolonner) og transgene (stripete kolonner) dyr. Bildene og grafikken viser bevis på at NMJs fra transgene dyr presenterer en lavere dekningsindeks enn ikke-transgene. I tillegg, hos transgene dyr, er dekningsindeksene for fosforylaterte nevrofilamenter lavere (18%) enn det som oppnås når den ikke-fosforylaterte formen ( 25%) oppdages. Dette faktumet er bekreftet med forholdet mellom begge indeksene, som vist i tabell 1. Merk at kvaliteten på preparatene gjør det mulig å oppnå 50% av dekningsindeksen som er fastsatt for NMJs forventet som "fullt innervated". Skalastang = 50 μm. Data som representeres er henholdsvis gjennomsnittlig ± SEM. (***) og (****) indikert p<0,001 og p<0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Morfometriske parametere og forhold hentet fra helmonterte NMJs av ikke-transgene og transgene EDL-fibre. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for disseksjon av to rotte skjelettmuskler (en langsom rykning og den andre raske rykninger), fibermuskelisolasjon og immunfluorescensdeteksjon av pre- og postsynaptiske markører for kvantitativt å vurdere NMJ-endringer samt montering / demonteringsprosesser. Denne typen protokoll kan være nyttig i gnagermodeller41,42 for å evaluere NMJ under fysiologiske eller patologiske prosesser som eksemplifisert her i en modell av motorisk nevron degenerasjon som finnes i ALS hSOD1G93A rotter.
For å oppnå suksess og gunstige resultater, er det nødvendig å huske på noen tips. For eksempel tillater protokollen som er beskrevet, umiddelbar bruk av dissekerte muskler. Men når det er nødvendig for å bevare muskelen lenger, tillater bruk av DPBS med 0,05% natriumazid pluss 4 °C lagring å forlenge utmerket muskelbevaring opptil 4 uker. Ved bruk av dette alternativet må det gjøres omfattende vasker med DPBS (5x, 10 min hver) før du starter fargingsprosessen. Et annet nyttig alternativ for å få bilder av god kvalitet inkluderer å senke PFA-konsentrasjonen på 0,5% fordi det reduserte muskelens autofluorescence. Dette må ledsages av lengre fiksering opp til 24 timer ved 4 °C.
Når det gjelder fiberisolasjon, produserer mindre grupper av fibre bedre immunodeteksjonskvaliteter. Fibrene tørket på silaniserte lysbilder må brukes innen 2 til 3 dager. Etter denne tiden er immunodeteksjonene ikke av god kvalitet.
Et alternativ til tørkede fibre på silaniserte lysbilder er å generere et sett med delvis isolerte fibre som holdes sammen av senevevet i en av fibrene (en "tuft" av muskelfibre) og utføre inkubasjoner i mikrocentrifugerør ved den "frittflytende" metoden. Bruk av dette alternativet er nødvendig for å øke antistoffinkubasjonstidene med flere timer (24-48 timer) samt antall vasker (minst 6 av 10 minutter hver).
I forhold til fiberisolasjon uten skade er det nødvendig å utføre "ertingen" ved å fjerne endene der senen forsiktig trekkes i motsatte retninger for å oppnå fiberseparasjon.
Et annet kritisk skritt for å forbedre immunodeteksjon er tillegg av 1% Triton X-100 og 50 mM glycin i BB. Dette er viktig for å oppnå preparater som har homogen farging og litt bakgrunn. Det er også verdt å nevne at det å ha litt bakgrunn kan være gunstig når unstained fibre må avbildes. Fiberdiameteren er god å måle langt fra NMJ-feltet siden det er beskrevet at det kan økes på dette nivået. Derfor, bestem fiberdiameteren på en avstand som er lik verdien av en NMJ-profil.
Ved hjelp av prosedyren som presenteres er det mulig å identifisere og kvantifisere NMJ-komponenter under fysiologiske forhold. Det gjør det også mulig å studere tidlige viktige patologiske hendelser som NMJ demontering24 og tap av fosforylatert nevrofilament i terminalender39 som beskrevet i ALS patogenese. Av denne grunn tilbyr protokollen som er beskrevet en alternativ og enkel tilnærming for å bidra til å få en bedre forståelse av NMJ-ombyggingen, noe som tyder på at morfologiske egenskaper visualisert kan være nyttige verktøy for å diagnostisere degenererende tilstand av NMJs eller for å vurdere forskjellige terapeutiske tilnærminger. Det gjelder også andre sykdomsmodeller som Charcot-Marie-Tooth41 og spinal muskelatrofi42 som presenterer NMJ-forstyrrelser.
I tillegg kan tilnærminger beskrevet i dette arbeidet brukes til å identifisere Schwann-cellene som integrerer denne trepartssynapsen og til slutt å vurdere noen av rollene under NMJ-ombygging43. Studier kan gjøres hos nyfødte til voksne, under fysiologiske forhold eller som et svar på ulike behandlinger som påvirker det nevromuskulære systemet.
Til slutt, til tross for den utmerkede håndteringen som trengs for å dissekere og merke prøver sammen med tid som forbrukes for å gjøre manuelle målinger, muliggjør metodikk presentert her en optimal merking av de forskjellige NMJ-komponentene på grunn av den tilrettelagte penetrasjonen av antistoffer og sonder. Selv om bedre penetrasjon kan oppnås i seksjonerte muskelpreparater, erting bevarer 3D morfologiske integriteten til alle synaptiske komponenter som kan gå tapt i muskelseksjoner. Det unngår også alt preparatet som trengs for å lage seksjoner som inkludering av muskelstykket og ytterligere antigenuthenting for å oppnå mulig anerkjennelse. Videre, sammenlignet med hele monteringspreparater som bevarer de komplette innervasjonsmønstrene, muliggjør erting studiet av isolerte fibre. Dette kan være en betydelig fordel når det er nødvendig for å vurdere fiber heterogeniteten rapportert under patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Tusen takk til CSIC og PEDECIBA for den økonomiske støtten som er gitt til dette arbeidet; til Natalia Rosano for hennes manuskriptkorreksjoner; til Marcelo Casacuberta som lager videoen og til Nicolás Bolatto for å låne stemmen sin for den.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
