Visualisation de la formation de volants membranaires à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Summary

La macropinocytose est un processus endocytaire hautement conservé initié par la formation de projections membranaires en feuille riches en F-actine, également connues sous le nom de volants membranaires. L’augmentation du taux d’internalisation du soluté macropinocytotique a été impliquée dans diverses conditions pathologiques. Ce protocole présente une méthode pour quantifier la formation de volants membranaires in vitro à l’aide de la microscopie électronique à balayage.

Abstract

L’ébouriffement membranaire est la formation de protubérances mobiles de membranes plasmiques contenant un maillage de filaments d’actine nouvellement polymérisés. Les volants membranaires peuvent se former spontanément ou en réponse à des facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires et des esters de phorbol. Certaines des protubérances membranaires peuvent se réorganiser en volants membranaires circulaires qui fusionnent à leurs marges distales et forment des coupelles qui se ferment et se séparent dans le cytoplasme sous forme de grandes vacuoles hétérogènes appelées macropinosomes. Au cours du processus, les volants piègent le liquide extracellulaire et les solutés qui s’internalisent dans les macropinosomes. La microscopie électronique à balayage (MEB) à haute résolution est une technique d’imagerie couramment utilisée pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupelles macropinocytaires fermées à la surface de la cellule. Le protocole suivant décrit les conditions de culture cellulaire, la stimulation de la formation de volants membranaires in vitro et la façon de fixer, de déshydrater et de préparer les cellules à l’imagerie à l’aide du MEB. La quantification des volants membranaires, la normalisation des données et les stimulateurs et inhibiteurs de la formation de volants membranaires sont également décrits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la macropinocytose dans les processus physiologiques et pathologiques, à étudier de nouvelles cibles qui régulent la formation des volants membranaires et à identifier des stimulateurs physiologiques encore non caractérisés ainsi que de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de la macropinocytose.

Introduction

La macropinocytose est un processus endocytaire responsable de l’internalisation d’une grande quantité de liquide extracellulaire et de son contenu via la formation de protubérances membranaires dynamiques et entraînées par l’actine appelées volants membranaires¹. Beaucoup de ces volants membranaires forment des coupelles qui se ferment et fusionnent sur la cellule et se séparent de la membrane plasmique sous forme de gros endosomes intracellulaires hétérogènes également connus sous le nom de macropinosomes¹. Bien que la macropinocytose soit induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de stimulation des co....

Protocol

REMARQUE: Ce qui suit est un protocole général utilisé pour quantifier la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 à l’aide de la microscopie SEM. Une optimisation peut être nécessaire pour différents types de cellules.

1. Lignée cellulaire et culture cellulaire

1. Cultiver des macrophages RAW 264,7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂. Remplacez les supports de croissance tous les deux jours.
2. Lor....

Results

Ici, nous décrivons les résultats de la technique présentée. Les images SEM représentatives montrées à la figure 1 montrent la formation de volants membranaires dans les macrophages RAW 264.7 après un traitement par PMA et M-CSF. Les images ont d’abord été capturées à un grossissement de 3 500x à des fins de quantification, puis à des niveaux de grossissement plus élevés (8 500x à 16 000x) pour montrer la membrane plasmique avec plus de détails. Le prétraitement des macrophages avec l’inhibi.......

Discussion

Le protocole d’imagerie SEM actuel fournit un outil pour visualiser et quantifier la formation de volants membranaires, les protubérances circulaires et les coupes macropinocytaires à la surface de la cellule in vitro. Bien que le protocole actuel se concentre sur les macrophages, des études ont montré que la formation de volants membranaires se produit également sur divers autres types de cellules, y compris les cellules dendritiques, les fibroblastes^{, les} neurones et les cellules cancér.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 % Trypsine-EDTA	Gibco	15400-054
2 % Glutaraldéhyde	Microscopie électronique Sciences	16320
4 % Paraformaldéhyde	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-éthyl-N-isopropyl)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Cytomètre
en fluxLanguettes adhésives en carbone	Microscopie électronique Sciences	77825-09
Dimethyl Sulfoxide	Corning	25-950-CQC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated TC-Plaque de culture cellulaire	Falcon	353047
Fetal Bovin Serum	Gemini Bio	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i Incubateur CO2	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR microscope			électronique à balayage
Couvercle de microscope Verre	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Stylo Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-myristate 13-acétate	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrophage	ATCC ATCC	TIB-71
Recombinant Humain M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Sécheur à point critique	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Montures d’échantillon en aluminium	Microscopie électronique Sciences	75220
Cacodylate de sodium	Microscopie électronique Sciences	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Trypan Blue Solution	Thermo Fisher Scientific	15250061
			confocal Zeiss LSM 780