Summary
מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Abstract
תפיחת ממברנה היא היווצרות של בליטות קרום פלזמה תנועתיות המכילות רשת של חוטי אקטין פולימריים חדשים. קפלים ממברנה עשויים להיווצר באופן ספונטני או בתגובה לגורמי גדילה, ציטוקינים דלקתיים ואסטרי פורבול. חלק מבליטות הממברנה עשויות להתארגן מחדש לקפלי ממברנה עגולים המתמזגים בשוליים הדיסטליים שלהם ויוצרים כוסות שנסגרות ונפרדות לתוך הציטופלסמה כשקעים גדולים והטרוגניים הנקראים מקרופינוזומים. במהלך התהליך, קפלים לוכדים נוזל חוץ-תאי ומומסים שמפנימים בתוך מקרופינוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (SEM) היא טכניקת הדמיה נפוצה להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים של ממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות סגורות על פני התא. הפרוטוקול הבא מתאר את תנאי תרבית התאים, את הגירוי של היווצרות קפל הממברנה במבחנה, וכיצד לתקן, לייבש ולהכין תאים להדמיה באמצעות SEM. מתוארים גם כימות של רפרוף ממברנה, נורמליזציה של נתונים, וממריצים ומעכבים של היווצרות קפלים בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידה של מקרופינוציטוזה בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, לחקור מטרות חדשות המווסתות את היווצרותם של ממברנות, ולזהות מגרים פיזיולוגיים שעדיין אינם אופייניים, כמו גם מעכבים פרמקולוגיים חדשניים של מקרופינוציטוזה.
Introduction
מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי האחראי על הפנמת כמות גדולה של נוזל חוץ-תאי ותכולתו באמצעות היווצרות של בליטות ממברנת פלזמה דינמיות ומונעות אקטין הנקראות קפלים ממברנה1. רבים מקפלי הממברנה האלה יוצרים כוסות שנסגרות ומתמזגות בחזרה אל התא ונפרדות מקרום הפלזמה כאנדוזומים תוך-תאיים גדולים והטרוגניים הידועים גם בשם מקרופינוזומים1. למרות שמקרופינוציטוזה מושרית על ידי גורמי גדילה כגון גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) במגוון רחב של סוגי תאים, תהליך ייחודי נוסף, תלוי סידן, המכונה מקרופינוציטוזה מכוננת נצפה גם בתאי חיסון מולדים 2,3,4,5,6,7,8.
הודגם כי יכולתם של תאים להפנים חומר חוץ-תאי באמצעות מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במגוון תהליכים פיזיולוגיים, החל מספיגת חומרים מזינים וכלה בלכידת פתוגנים והצגת אנטיגן 9,10,11. עם זאת, מכיוון שתהליך זה אינו סלקטיבי ובלתי ניתן להשראה, הוא גם היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים. ואכן, מחקרים קודמים הציעו כי מקרופינוציטוזה ממלאת תפקיד חשוב במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סרטן, נפרוליתיאזיס וטרשת עורקים 12,13,14,15,16. יתר על כן, חיידקים ווירוסים מסוימים הראו שהם משתמשים במקרופינוציטוזה כדי להיכנס לתאים המארחים ולגרום לזיהום17,18. מעניין, גירוי של macropinocytosis יכול להיות מנוצל גם עבור משלוח ממוקד של סוכנים טיפוליים במצבי מחלה שונים19,20.
מחקרים קודמים בחנו מקרופינוציטוזה על ידי כימות סמני פאזה נוזלית מופנמים המתויגים באופן פלואורסצנטי בהיעדר ונוכחות של חומרים פרמקולוגיים המעכבים מקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריה של זרימה והדמיה קונפוקלית21,22. כלים פרמקולוגיים זמינים כיום המעכבים מקרופינוציטוזה מוגבלים ומורכבים מ-1) מעכבי פילמור אקטין (ציטוכלאסין D ולטרונקולין), 2) חוסמי PI3K (LY-290042 ו-wortmannin) ו-3) מעכבי מעכבי נתרן ממחליפי מימן (NHE) (אמילוריד ו-EIPA)5,14,15,23,24,25 . עם זאת, מכיוון שלעכבים אלה יש השפעות עצמאיות של אנדוציטוזה, קשה לקבוע באופן סלקטיבי את תרומתה של מקרופינוציטוזה להמסת ספיגה ופתוגנזה של מחלה במיוחד in vivo21.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוא סוג של מיקרוסקופ אלקטרונים המפיק תמונות ברזולוציה גבוהה במיוחד של תאים באמצעות קרן ממוקדת של אלקטרונים26. במחקר מקרופינוציטוזה, הדמיית SEM נחשבת לטכניקת תקן הזהב כדי להמחיש מאפיינים טופוגרפיים ומורפולוגיים של קרום הפלזמה, לכמת את היווצרות הקפלים של הממברנה ולחקור את התקדמותם לקראת הפנמה של מקרופינוזום. יתר על כן, סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים בשילוב עם כימות ספיגת המומס, בנוכחותם ובהיעדר חוסמי מקרופינוציטוזה, מספקת אסטרטגיה אמינה לבחינת הפנמה מקרופינוציטוטית במבחנה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כיצד להכין תאים ל-SEM, לדמיין את פני התא, לכמת את היווצרות הקפלים ולבחון את התקדמותם לקראת סגירת כוסות והפנמה של מקרופינוזום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: להלן פרוטוקול כללי המשמש לכימות היווצרות קפלים בממברנה במקרופאגים RAW 264.7 באמצעות מיקרוסקופיית SEM. אופטימיזציה עשויה להידרש עבור סוגי תאים שונים.
1. קו תאים ותרבית תאים
- הגדל RAW 264.7 מקרופאגים במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 IU/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור לח ב-37 °C ו-5% CO2. החלף את מדיית הצמיחה כל יומיים.
- כאשר התאים הופכים ל-80% מפגש, שטפו את הצלחת פעמיים באמצעות PBS סטרילי.
- נתק תאים על ידי הוספת 1,000 μL של 0.5% טריפסין-EDTA ודגירה של צלחת תרבית התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- בחנו את הצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר את הדיסוציאציה של התאים. הוסף 10 מ"ל של מדיית צמיחה המכילה 10% FBS כדי להשבית טריפסין.
- אספו את מתלי התא בצינור חרוטי של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע החייאה עדינה של תאים במדיום תרבית התאים השלם ולקבוע את ספירת התאים ואת יכולת הקיום באמצעות צביעת טריפאן בלו (0.4%).
הערה: הכדאיות המינימלית המומלצת לניסוי זה היא >90%. - מניחים כיסויי זכוכית סטריליים בבארות של צלחת בעלת 24 בארות באמצעות מלקחיים אוטוקלביים. תאי זרעים על כיסויים בצפיפות של 1 x 106 תאים /מ"ל ודגירה של הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- שנה את המדיה של כל באר עם מדיה מלאה 500 μL טרייה לפני הטיפול. מקרופאגים לפני טיפול ברכב (DMSO או ממסים אחרים המשמשים להמסת EIPA) או מעכב המקרופינוציטוזה 5-(N-אתיל-N-איזופרופיל)-אמילוריד (EIPA, 25 μM21) למשך 30 דקות.
- טפל בתאים עם כלי רכב וממריצים של מקרופינוציטוזה כדי לקדם את התרסקות הממברנה: פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA, 1 μM, 30 דקות21) וגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF, 100 ng/mL, 30 דקות3).
הערה: מעכבים חלופיים [למשל, latrunculin A (1 μM, 30 דקות) או cytochalasin D (1 μM, 30 דקות)] וממריצים [למשל, גורם גדילה אפידרמלי (EGF, 100 ng/mL, 10 דקות) או גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF, 100 ng/mL, 15 דקות)] של מקרופינוציטוזה יכולים לשמש גם לאפיון מקרופינוציטוזה במקרופאגים ובסוגי תאים אחרים16,27, 28,29. תאים עשויים לדרוש הרעבה בסרום בן לילה לפני הטיפול בממריצים פיזיולוגיים של מקרופינוציטוזה. חשוב לציין כי הריכוזים וזמני הדגירה היעילים ביותר יצטרכו להיקבע כדי לעורר מקרופינוציטוזה בסוגי תאים אחרים.
2. קיבוע SEM
- לאחר הטיפול, לשאוף את המדיה מבארות ולשטוף כיסויים עם PBS קר כקרח פעמיים.
- לתקן תאים (4% paraformaldehyde ו-2% glutaraldehyde ב 0.1 M נתרן cacodylate) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה לילה בקיבוע ב 4 °C (76 °F).
- לשטוף בעדינות ולדגום כיסויים עם 500 μL של ריאגנטים הבאים מבלי להפריע למונולאי התא.
- יש לשטוף פעם אחת ב-0.1 מ' נתרן קקודילאט ולדגום למשך 15 דקות.
- יש לשטוף פעמיים עם dH2O עם דגירה של 10 דקות בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 25% אתנול עם 10 דקות דגירה בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 50% אתנול עם 10 דקות דגירה בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 75% אתנול עם 10 דקות דגירה בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 80% אתנול עם 10 דקות דגירה בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 95% אתנול עם 10 דקות דגירה בכל שטיפה.
- יש לשטוף פעמיים עם 100% אתנול. בצע 10 דקות של דגירה בכל שטיפה.
הערה: שינוי/החלפה של ריאגנטים צריכים להיעשות במהירות כדי למנוע ייבוש אוויר של תאים. ניתן להשאיר כיסויים ב-100% אתנול למשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, הוסיפו 100% אתנול נוספים וכסו בארות עם פרפילם כדי למנוע ייבוש אוויר של הדגימה.
3. ייבוש נקודה קריטית
- מניחים כיסויים במייבש נקודה קריטית ומכסים ב-100% אתנול. לחץ על לחצן ההפעלה ופתח את מיכל CO2 .
- לחץ על לחצן Cool במשך כ-30 שניות עד שהטמפרטורה יורדת ל-0°C. לחצו על הלחצן 'מילוי' עד להופעת בועה בחלון החדר.
- לחץ על כפתור הטיהור עד שריח האתנול מפליטת הטיהור ייעלם. לחץ שוב על כפתור קירור עד שהטמפרטורה יורדת ל- 0 °C (74 °F).
- לחץ על כפתורי המילוי והטיהור כדי לכבות אותם ולסגור את מיכל ה- CO2. לחץ/י על הכפתור ״קירור״ כדי לכבות אותו ולחץ/י על הכפתור ״חום״.
- הגדר את הטמפרטורה על 42 ° C ולחץ על 1,200 psi. לאחר שהלחץ והטמפרטורה מתייצבים, לחץ על לחצן Bleed כדי לאפשר ללחץ לרדת לאט.
- ברגע שלחץ התא מגיע ל-150 psi, לחצו על כפתור ה-Vent והמתינו עד שהלחץ יורד ל-0 psi. כבו את מייבש הנקודה הקריטית והסירו את הכיסויים.
- הר כיסויים על תושבות דגימת אלומיניום SEM באמצעות לשוניות דבק פחמן וכפוף לציפוי פיזור באמצעות זהב / פלדיום במעיל sputter.
- הפעילו את לחצן ההפעלה והמתינו עד שהוואקום יגיע ל-30 mTorr. שטפו את התא כדי להסיר לחות ואוויר על ידי כיבוי מתג הגז והפיכת שסתום הגז העדין נגד כיוון השעון.
- ברגע שהוואקום גדל ל-200 mTorr כבה את מתג הגז והמתן עד שהוואקום יגיע ל-30 mTorr. חזור על שלב זה 3 פעמים.
- לחץ על כפתור הטיימר והתאם את ידית המתח עד שהמד יקרא 10 mA. מוציאים כיסויים מצופים מהתא.
הערה: פעל בהתאם להוראת היצרן כדי לבצע ייבוש נקודות קריטיות וציפוי פיזור של הדגימה.
4. הדמיה וכימות
- הכנס כיסויי דגימה לתוך החדר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סגור את הדלת ולחץ על כפתור Evac .
- פתח את תוכנת ההפעלה SEM. הגדר את המתח המאיץ ל- 15 kv ואת מרחק העבודה ל- 10 מ"מ.
- לחץ על הלחצן קואורדינטות והתקדם סביב הבקר עד שהתאים יופיעו במרכז מסך התצפית. הגדר את ההגדלה ל- 3,500x וצייר את הדגימה על-ידי לחיצה על לחצן תמונה.
הערה: השתמש ברמה גבוהה יותר של הגדלה (8,500x עד 16,000x) כדי להציג את קרום הפלזמה בפרטים גדולים יותר. - צלם תמונות מלפחות 10 מיקומים אקראיים על הכיסויים, וודא שכל שדה מיקרוסקופי מכיל תאים מרובים. שמור תמונות כקבצים .tif.
- מתוך התמונות, אתרו את קפלי הממברנה, המוגדרים כקפלים בולטים דמויי שמיכה של קרום הפלזמה, שגודלם גדול מ-500 ננומטר (איור 1). תספור את מספר הקפלים לכל תא.
הערה: קפלים בצורת C זוהו כבליטות קרום מעוקלות שלא התמזגו בקצוות הצדדיים שלהם [(איור 1 (טיפול M-CSF) ואיור 2B]. קפלים של קרום עגולים שהתמזגו, לפני סגירתם, זוהו כגביעים מקרופינוציטוטיים (איור 2C). - לנרמל את מספר הקפלים הממברניים למספר הכולל של התאים בשדה המיקרוסקופי המוערך. חזור על ניתוח זה עבור הדגימות מכל קבוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן נתאר את התוצאות מהטכניקה המוצגת. תמונות SEM מייצגות המוצגות באיור 1 מדגימות היווצרות קפלים בקרום במקרופאגים RAW 264.7 לאחר טיפול ב-PMA וב-M-CSF. התמונות צולמו תחילה בהגדלה של פי 3,500 למטרות כימות ולאחר מכן ברמות גבוהות יותר של הגדלה (פי 8,500 עד פי 16,000) כדי להראות את קרום הפלזמה בפרטים גדולים יותר. טיפול מקדים של מקרופאגים עם מעכב המקרופינוציטוזה EIPA החליש את היווצרות קפל הממברנה (איור 1). ניתן לחלק את פעילויות ממברנת הפלזמה הקשורות למקרופינוציטוזה לחמישה שלבים עוקבים: 1) התחלת רחש הממברנה, 2) מעגליות, 3) היווצרות כוסות, 4) סגירת כוסות, ו-5) הפנמה של נוזל חוץ-תאי והמומסים הקשורים אליו באמצעות היווצרות מקרופינוזום. איור 2 מציג תמונות מייצגות של פעילויות ממברנות פלזמה מורפולוגיות שונות אלה בעקבות גירוי M-CSF. קפלים גדולים דמויי יריעות (איור 2A), קפלים מעוגלים בצורת C (איור 2B) וכוסות מקרופינוציטיות (איור 2C) נלכדו בהגדלה של פי 6,000 עד פי 7,000. ניתן להשתמש במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של פני התא, אך לא ניתן להשתמש בה כדי להמחיש מקרופינוזומים מופנמים. כימות של קפלים בקרום לאחר טיפול PMA ו-M-CSF מוצג באיור 3. ניתן לאשר היווצרות מקרופינוזומים על ידי טכניקות הדמיה חלופיות, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית, כפי שמוצג באיור 4. לבסוף, יש להשלים את כימות ה-SEM של רפרוף הממברנה על-ידי כימות ציטומטריה של זרימה של סמן פאזה של נוזל פלואורסצנטי (לדוגמה, FITC- או טקסס רד-דקסטרן) כדי לאשר גירוי של מקרופינוציטוזה (איור 5).
איור 1: סריקת תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים של מקרופאגים RAW 264.7. מקרופאגים RAW 264.7 טופלו מראש באמצעות כלי רכב (בקרת DMSO) או EIPA (25 μM) במשך 30 דקות והודגמו עם PMA (1 μM, 30 דקות) או M-CSF (100 ננוגרם/מ"ל, 30 דקות) כדי לעורר את התרסקות הממברנה. תמונות מימין מראות הגדלה גבוהה יותר של פני התא. חצים אדומים: קפלים קרום. חץ ירוק: קפל בצורת c. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שלבים מורפולוגיים של מקרופינוציטוזה שנלכדו על ידי סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים. מקרופאגים RAW 264.7 טופלו ב-M-CSF (100 ng/mL) במשך 30 דקות והתאים עובדו להדמיית SEM. (A) בליטה דמוית יריעה של ממברנה, (B) קפל ממברנה בצורת C ו- (C) מקרופינוציטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כימות של היווצרות קפלים בקרום. מקרופאגים RAW 264.7 טופלו מראש באמצעות כלי רכב (בקרת DMSO) או EIPA (25 μM) במשך 30 דקות והודגמו עם PMA (1 μM, 30 דקות) או M-CSF (100 ננוגרם/מ"ל, 30 דקות) כדי לעורר את התרסקות הממברנה. גרף עמודות מציג את מספר קפלי הממברנה המנורמלים למספר התא הכולל (n = 3). הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. ANOVA חד כיווני; *p < 0.05 לעומת רכב, #p < 0.05 לעומת טיפול PMA או M-CSF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: היווצרות מקרופינוזום. התאים טופלו מראש ב-PMA במשך 30 דקות והודגמו עם טקסס אדום-דקסטרן (25 מיקרוגרם/מ"ל, אדום) ו-FM4-64 (5 מיקרוגרם/מ"ל, ירוק) במשך 10 דקות. ההדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. חצים כחולים: ממברנה מתפתלת, חצים צהובים: מקרופינוזום המכיל טקסס אדום-דקסטרן, חצים ירוקים: מקרופינוזומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: כימות של מקרופינוציטוזה. מקרופאגים RAW 264.7 טופלו מראש באמצעות כלי רכב (בקרת DMSO) או EIPA (25 μM) במשך 30 דקות ודגירה עם PMA (1 μM) ו-FITC-dextran (100 מיקרוגרם/מ"ל; 70,000 מגה-וואט) למשך שעתיים. גרף עמודות מראה את שינוי הקפל הממוצע בעוצמת פלואורסצנציה (MFI) מנורמל לטיפול ברכב (n = 3, המבוצע בטריפליקטים). הנתונים מייצגים את הממוצע ± SEM. ANOVA חד כיווני; *p < 0.05 לעומת רכב, #p < 0.05 לעומת PMA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. אף על פי שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד במקרופאג'ים, מחקרים הראו כי היווצרות קפלים בממברנה מתרחשת גם בסוגי תאים שונים אחרים, כולל תאים דנדריטיים, פיברובלסטים, נוירונים ותאים סרטניים 11,12,14,21,30. בהתחשב בכך, אופטימיזציה של תנאי תרבית תאים ושימוש בממריצים שונים או בתנאי טיפול עשויים להידרש להדמיה של קפלים ממברנה בסוגי תאים אחרים.
אף על פי שקיים מרחב פעולה מסוים להכנת דגימה, יש לבצע את שלבי ההתייבשות וייבוש הנקודות הקריטיות בדיוק כדי לשמר את ארכיטקטורת פני השטח של התא. בנוסף, נוכחות של מים או ממיסים אחרים כגון אתנול תפריע לוואקום, שהוא חיוני להדמיית SEM ולכן, יש להסיר אותו באופן מבוקר כדי לשמור על המורפולוגיה של הדגימה שלמה14.
מיקרוסקופי אלקטרונים משתמשים בקרן של אלקטרונים מואצים כמקור להארה. מיקרוסקופי האלקטרונים הראשונים פותחו כאשר אורך הגל הפך לגורם המגביל במיקרוסקופי אור31. לאלקטרונים יש אורכי גל קצרים בהרבה ולכן למיקרוסקופי אלקטרונים יש כוח רזולוציה גבוה יותר מאשר למיקרוסקופים קלים וניתן להשתמש בהם כדי לספק תמונות ברזולוציה גבוהה ולחקור את מבנה האולטרה-מבנה של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות. מגבלה מרכזית של שיטה זו סובבת סביב העובדה ש- SEM מספק רק תמונת מצב של המורפולוגיה של קרום הפלזמה, בניגוד להדמיית התאים החיים הפלואורסצנטיים, אשר תאפשר הדמיה של קפלים ממברנה, המעבר שלהם לכוסות מקרופינוציטיות והיווצרות מקרופינוזומים. הדמיית תאים חיים, מיקרוסקופ אלקטרונים של הולכה (TEM) ומבחני ספיגה פלואורסצנטיים של דקסטרן יכולים לשמש כדי לחקור את הפנמת המומסים הפלואורסצנטיים באמצעות מקרופינוציטוזה, טרנסלוקציה והתבגרות של מקרופינוזומים, ומנגנוני איתות תוך תאיים המווסתים את המקרופינוציטוזה. מאחר ש-SEM דורש קיבוע על כיסויים, ניתן לדמיין רק את הצד הגבי ואת האזור ההיקפי של התא, וזו מגבלה נוספת לטכניקה זו.
ברצוננו להוסיף כי לעיתים קשה להבחין בין היווצרות בלתי תלויה במקרופינוציטוזה של בליטות ממברנה לבין ריפוד ממברנה מקרופינוציטית. תיקנו את הכימות שלנו על ידי זיהוי קפלים של ממברנה עם מרחק מינימלי של 0.5 מיקרומטר לפחות בין כל שתי נקודות בקצה הבליטה. מספר הקפלים הממברניים לתא משתנה מאוד ותלוי בגורמים רבים, כולל הממריץ, ריכוזו, זמן הדגירה שלו וסוג התא32. עם PMA ו-M-CSF, ראינו תאים עם קפלים מרובים של ממברנה, אך בחרנו תמונות מייצגות שמייצגות טוב יותר את הנתונים המכומתים שלנו (1-2 קפלים לכל תא). SEM נותרה טכניקת תקן הזהב להערכת מאפיינים טופוגרפיים ומורפולוגיים של קרום הפלזמה במבחנה. השילוב של שיטה זו יחד עם הדמיית תאים חיים וניתוח ציטומטריה של זרימה של הפנמה מומסת מספק אסטרטגיה אמינה לניתוח מקרופינוציטוזה בסוגי תאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים לליבי פרי (אוניברסיטת אוגוסטה) על עזרתה בהכנת הדגימה של SEM. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01HL139562 (G.C.) ו- K99HL146954 (B.S.)] ואיגוד הלב האמריקאי [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
