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Immunology and Infection

间充质干细胞调节巨噬细胞吞噬作用;定量和成像

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62729
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Molloy College

Summary

这里提出的方案用于量化和生成间充质干细胞（MSC）介导的巨噬细胞（MΦ）吞噬作用的动态图像，这些聚氧菌（zymosan）颗粒与pH敏感荧光分子偶联。

Abstract

间充质干细胞（MSC）传统上因其再生特性而受到研究，但最近，它们的免疫调节特性一直处于最前沿。它们与免疫细胞相互作用并调节免疫细胞活性。本研究的重点是巨噬细胞吞噬活性的MSC调节。巨噬细胞（MΦ）吞噬作用是先天免疫系统对感染反应的重要组成部分，MSC调节这种反应的机制正在积极研究中。这里介绍的是一种研究与MSC共培养时与pH敏感荧光分子偶联的非调序酶原颗粒的MΦ吞噬作用的方法。随着吞噬活性的增加和标记的酶聚糖颗粒被封闭在吞噬体的酸性环境中，pH敏感分子的荧光强度增加。在适当的激发和发射波长下，使用荧光分光光度计测量吞噬活性，并将动力学数据显示为70分钟内相对荧光单位的变化。为了支持这些定量数据，使用动态成像可视化吞噬细胞活性的变化。使用该方法的结果表明，在共培养中，MSC增强了幼稚和IFN-γ处理的MΦ的非调子化酶的MΦ吞噬作用。这些数据增加了目前对MSC调节先天免疫系统的知识。这种方法可以应用于未来的研究，以充分描绘潜在的细胞和分子机制。

Introduction

间充质干细胞（MSC）是产生结缔组织细胞的祖细胞。MSC存在于成年哺乳动物组织中，可以从骨髓中分离出来1。由于其免疫调节特性，这些细胞被广泛研究2。早期的研究集中在MSC调节T细胞3，4，5，6，但最近，它们对巨噬细胞（MΦ）的调节，巨噬细胞是先天免疫的主要细胞成分，已经受到越来越多的关注7，8，9，10，11，12，13，14.MSC-MΦ相互作用在炎症性疾病治疗中的重要性通过单核细胞/巨噬细胞的消耗在动物模型8中废除MSC的治疗效果这一事实得到了强调。这里的重点是MSC与MΦ的细胞接触相互作用。MSC有能力通过促进从炎症反应到抗炎反应的转变来调节MΦ的表型，导致组织修复活动8，9，10，11，并且已经做了很多工作来证明这些调节机制。在其他情况下，MSC可以支持或加剧MΦ驱动的炎症反应12，13并增强MΦ吞噬活性14，15。然而，严重缺乏现有数据来确定MSC调节MΦ吞噬活性的机制和条件。

MΦ具有识别调理子化（抗体或补体包被）或非调序化病原体导致吞噬作用的受体家族16。后者的激活和活性研究较少17.在非炎症性体外环境中，MSC增强非调子化病原体的MΦ吞噬作用13。然而，在适应性免疫应答期间暴露于淋巴细胞产生的炎症环境后，MΦ对非调序化病原体的识别可能会减少。由自然杀伤细胞和效应淋巴细胞释放的IFN-γ对非调子化颗粒18的MΦ吞噬作用具有抑制作用。建立了共培养模型，研究了MSC直接接触调节MΦ吞噬作用的机制。这里提出的实验目标是确定在MΦ暴露于IFN-γ后，MSC是否调节非调理性病原体的MΦ吞噬作用（图1）。

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Protocol

注意：所有培养基制备和细胞培养技术均在无菌条件下使用具有层流流动的生物安全柜进行。所描述的所有培养步骤均使用旨在保持37°C，5%CO2和95%湿度的培养箱进行。

1. 细胞培养

  1. 生长培养基的制备
    1. 对于 MSC 和 LADMAC，将 50 mL FBS 和 5 mL 100x 抗生素/抗真菌剂混合物加入 500 mL 高糖 DMEM 中。
    2. 对于MΦ，加入50 mL FBS，100 mL LADMAC条件培养基（按照第1.2节的步骤制备）和5 mL 100x抗生素混合物到500 mL高葡萄糖DMEM中。
      注意：LADMAC细胞产生支持MΦ细胞生长所必需的集落刺激因子（CSF-1）。
  2. LADMAC条件培养基的制备
    1. 为了从冷冻储备中播种LADMAC细胞，在五个T75 cm 2细胞培养处理的烧瓶中，从1.1 节的每个培养基中加入19mL生长培养基，并置于细胞培养箱中15分钟以平衡至37°C。
    2. 同时，通过在37°C水浴中孵育2-3分钟或直到解冻，快速解冻10个6个冷冻细胞的等分试样。将细胞加入15 mL或50 mL无菌锥形管中的9mL新鲜MSC生长培养基中，并在摆动的桶转子中以125×g离心5分钟。
    3. 吸出或倾析上清液，加入5mL新鲜生长培养基，然后轻轻地上下移液以重悬细胞沉淀。
    4. 使用无菌血清移液管将1mL细胞悬浮液加入5个T75 cm2 烧瓶中的每个烧瓶中，并将其置于细胞培养箱中。
    5. 每 2-3 天，在 7-10 天内再加入 10 mL 培养基。然后，使用无菌血清学移液管将细胞和上清液收集到无菌的50mL锥形管中，并以125×g离心5分钟。
    6. 将上清液从细胞沉淀中分离出来，并使用0.2μm无菌一次性真空过滤装置无菌过滤上清液。
      1. 从包装中取出吸气器组件，然后使用真空管连接到吸气器泵。将上清液倒入顶部隔间并更换盖子。打开吸气器泵，过滤到底部隔间。
      2. 通过将移液到50mL无菌锥形管中并储存在-20°C下来制备等分试样。
    7. 为了冷冻细胞沉淀，重悬于106 cell / mL的冷冻培养基中，置于冷冻容器中，然后将其置于-80°C冰箱中。24小时后，转移到LN2 储存。
  3. 繁殖细胞以准备共培养
    1. 为了从冷冻的储备中接种MSC和MΦ细胞，将9mL在每种细胞类型的四个100mm细胞培养皿中，在每个1.1节中制备的适当生长培养基，并置于细胞培养箱中15分钟。
    2. 同时，通过将10 6个冷冻细胞在37°C水浴中孵育2-3分钟或直到刚刚解冻，快速解冻106个冷冻细胞的等分试样。然后，将解冻的MSC细胞加入9mL新鲜MSC生长培养基中，并将解冻的MΦ细胞加入9mL新鲜MΦ培养基中，在15或50mL无菌锥形管中，并在摆动桶转子中以125×g离心5分钟。
    3. 吸出或倾析上清液，并通过轻轻上下移液将每个沉淀重悬于4mL适当的新鲜生长培养基中。将1mL细胞悬浮液加入到步骤1.3.1中已平衡的每种细胞类型的四个100mm培养皿中。
    4. 将带有细胞的培养皿返回培养箱。每2-3天更换培养基，直到70%-80%汇合。

2. 实验菜中的种子MSC，第1天

注意：在接种MSC之前，设计用于荧光分光光度法的实验性96孔板布局和用于动态成像的腔室载玻片。对于96孔板，侧翼实验孔含有含有细胞的孔，但不在测定中使用它们。标记至少四个孔以用于试剂空白（RBL）。参见 表1 的96孔模板示例和 表2 的4孔室载玻片模板的示例。建议使用底部透明的黑色或白色96孔板。1.5 mm硼硅酸盐玻片室载玻片是最佳的，但腔室的数量可以根据研究设计进行调整。 图 2中包含了后续方法的汇总流程图。

  1. 在70%-80%汇合时，从100mm培养皿中的培养物中吸取生长培养基，并加入5mL PBS以分离MSC。
  2. 吸出PBS，加入2mL 0.05%胰蛋白酶/ EDTA，并将其置于培养箱中3-5分钟。
  3. 3分钟后，使用倒置显微镜检查细胞脱离。如果单元格已分离，请继续执行下一步;如果没有，继续孵育1-2分钟。不要孵育超过5-6分钟。
  4. 将5mL新鲜生长培养基加入具有分离细胞的培养皿中。使用胰蛋白酶/培养基混合物冲洗培养皿，并使用无菌血清学移液管将细胞收集到干净，无菌的50 mL锥形管中。
  5. 在125 x g下离心5分钟。吸出上清液，并通过轻轻上下移液将细胞沉淀重悬于10mL新鲜生长培养基中。
  6. 为了计数细胞，将10μL细胞悬浮液加入1.5mL微量离心管中的30μL0.4%台盼蓝溶液中。然后，在血细胞计数器计数室的盖玻片下移液10μL混合物。
  7. 使用倒置或明场显微镜，使用10倍物镜，在1 mm2 正方形中的四个中计数未染色（活）细胞。使用以下公式计算细胞数：细胞数/mL = 细胞计数/# 1 mm2 平方 x 稀释因子 x 104。
    注意：对于此示例，计数的1 mm2 正方形的数量为4，稀释因子为4。
  8. 使用等式C1V1 = C2V2 计算并制备1 x 105 细胞/ mL悬浮液。根据板设计，为要填充的96孔板的每个柱准备1 mL细胞/ mL悬浮液，为要填充的4孔室载玻片的每个腔室准备0.75 mL。
    注意：C1 = 细胞计数，V1 = 正在计算的内容，C2 = 1 x 105，V2 = 5.50 mL。
  9. 确定V1，从所需的总体积的5.50mL中减去它，以确定准备悬浮液所需的新鲜培养基的体积。将原始悬浮液中的细胞体积（V1）加入新鲜培养基的体积中，共5.50 mL，1×105 个细胞/ mL。
  10. 根据板设计，使用多通道微量移液器向96孔板的每个孔中加入100μL1×105 个细胞/ mL悬浮液，并根据板设计使用微量移液管向腔室载玻片的每个孔中加入530μL。孵育过夜。
    注：对于本实验，将MSC接种在96孔板的1，2，3和6柱中（表1）以及4孔室载玻片的孔1和2（表2）。因此，制备至少5.50mL的1×105 细胞/ mL悬浮液。在80%汇合处的MΦ在MSC接种在实验板中的同一天用炎症介质处理。

3. 第 1 天使用 IFN-γ激活 MΦ

  1. 准备活化培养基和IFN-γ的储备。
    1. 对于200mL活化培养基，使用0.2μm无菌一次性真空过滤器单元向200mL无血清高葡萄糖DMEM和无菌过滤器中加入40mg BSA。
    2. 要制备0.1%BSA / PBS，将20mg BSA添加到20 mL PBS中。涡流溶解。使用0.2μm无菌注射器过滤器过滤成干净，无菌的50 mL锥形管。
    3. 将1mL无菌0.1%BSA / PBS溶液加入100μg冻干IFN-γ中，以获得100μg/ mL的储备溶液。在-20°C下储存在50μL等分试样中。
  2. 使用 IFN-γ 激活 MΦ
    1. 每1毫升所需培养基加入2.5μL 100μg/mLIFN-γ储备液。对于每100 mm培养皿，准备10 mL含有IFN-γ的活化培养基，浓度为250 ng / mL。
    2. 从MΦ培养物中吸取生长培养基，并用5mL无IFN-活化培养基代替其冲洗γ。
    3. 吸出用于冲洗的培养基，并用10 mL IFN-γ补充的活化培养基代替实验培养皿，并用10 mL非补充活化培养基代替对照。将培养物孵育16-24小时。

4. 分离MΦ并准备共培养物，第2天

  1. 从MΦ细胞中取出活化培养基，并用5mL新鲜生长培养基代替。用细胞提升器轻轻刮擦，将细胞收集到50 mL锥形管中。
  2. 使用台盼蓝排除和血液细胞术计数细胞，如MSC中所述，步骤2.6-2.7。
  3. 使用步骤2.8-2.9中的等式，制备两种2×105 个细胞/ mL的单独悬浮液，一种含有来自对照的细胞，另一种含有来自处理过的MΦ培养物的细胞。
    注意：根据板设计，为要填充的96孔板的每个柱准备1 mL细胞/ mL悬浮液，为要填充的4孔室载玻片的每个腔室准备0.75 mL。
  4. 从含有MSC的96孔板的实验孔中轻轻吸出培养基。使用多通道微量移液管，根据板设计，在有或不带MSC的适当实验孔中加入100μL处理的和对照MΦ细胞悬浮液。孵育过夜。
  5. 从含有MSC的4孔室载玻片中轻轻吸出培养基，并使用微量移液器，根据设计将530μLMΦ细胞悬浮液加入适当的孔中。孵育过夜。

5. 吞噬作用测定，动力学荧光96孔板读数，第3天

  1. 设置检测参数
    1. 在测定当天，打开荧光板读数器，并将系统上的温度设置为37°C。
    2. 打开系统 Pro 软件并检查左上角的仪器图标，以确定仪器是否已连接到计算机。如果带有线条的红色圆圈可见，请单击仪器图标，然后在弹出窗口中选择仪器以进行连接。
    3. 选择"新建实验"以访问"平板设置助手"弹出窗口。从"平板设置助手"菜单中，选择"配置采集设置"。
    4. 从光学配置的设置菜单中选择单 色器 。选择 FL（ 荧光）作为读取模式， 选择动力学 作为读取类型。
    5. 在同一配置窗口中的" 类别"下，单击" 波长"，然后将带宽设置为 9 nm（用于激发）和 15 nm（用于发射）。
    6. 将波长对数设置为 1。将波长LM1设置为 510 nm 用于激发，将波长设置为 540 nm 用于发射。
    7. 继续浏览类别，然后选择" 板类型"。 选择与所用板类型匹配的选项。
      注意：选择与板类型匹配非常重要。读取高度由系统根据所选内容进行设置。
    8. 接下来，选择 读取区域 并突出显示实验设计中包含的96孔板的区域。
    9. 选择 PMT 和光学，将 PMT 增益设置为 高电平 ，并将每次读取的闪光设置为 6。如果使用透明底板，请 选中"从底部读取 "旁边的框。
    10. 选择" 计时 "，并在 70 分钟内设置为 10 分钟的间隔。
    11. 选择 "摇动"，选中 "首次读取之前 "框，然后设置为 5 秒。选中 "读取之间 "框并设置为 3 秒。将抖动强度设置为 "低" 和" 线性"。
    12. 关闭窗口。当弹出 "板设置帮助程序 "窗口时，选择" 配置板布局"。突出显示板设计的 BL 孔，然后单击 板坯。
    13. 突出显示每个实验行，单击" 添加"，为组命名，然后选择一种颜色。
    14. 在板设计下方的 "分配选项" 下，选择" 系列"，然后在窗口中定义序列并单击" 确定"。对每组重复此步骤。
  2. 准备酶氨悬浮液
    1. 在等待系统温度达到37°C的同时，将1mg酶嘧啶颗粒重悬于5mL活细胞成像培养基中。
      1. 将1mL活细胞成像培养基加入含有颗粒的小瓶中，并将它们收集到玻璃培养管中。用额外的1 mL成像溶液冲洗小瓶，然后转移到同一个玻璃管中，以确保所有颗粒都被转移。加入3 mL额外的成像溶液，以获得0.2mg / mL的颗粒悬浮液。
    2. 涡旋与快速脉冲30-60秒。然后，使用探针超声仪用60个快速脉冲超声处理。
      注意：创建均匀的颗粒悬浮液非常重要，并且在添加到实验孔之前不要让悬浮液停留太长时间。结块迅速复发。每个细胞的颗粒密度可能需要根据所用MΦ的来源，处理和密度进行优化。在提出的研究中，使用了共轭的酶魟桑颗粒。然而，共轭 大肠杆菌 和 金黄色葡萄球菌 也可用。
  3. 加入祦子糖并阅读盘子
    1. 从实验孔中吸出培养基，并用100μL活细胞成像溶液冲洗1x。同时用活细胞成像溶液冲洗RBL孔。
    2. 从实验孔和RBL孔中吸出活细胞成像溶液，并用5.2节中制备的100μL酶嘧啶颗粒悬浮液代替。
    3. 使用触摸板界面打开荧光读取器的板托盘。将不带盖子的盘子放在托盘中，A1孔位于左上角。使用触摸板关闭托盘，然后单击顶部菜单中的绿色" 读取 "按钮。
    4. 读取完成后，将文件保存到相应的文件夹，然后单击" 文件 "并选择"导出"，以电子表格格式 导出数据。
    5. 在电子表格（补充文件1）中计算每个重复组在每个时间点（10分钟，20分钟，30分钟等）的SEM相对荧光±平均值，并将数据传输到图形软件。
    6. 使用折线图格式呈现数据并应用双向方差分析（时间 x 处理/MSC 作为因子），然后应用 Tukey 的多重比较检验来确定各个组之间的差异。
      注：在进行96孔板读取时，准备动态成像板以进行延时图像采集。确保动态成像继续进行一次一个实验孔的分析。

6. 吞噬作用测定，动态成像，第3天

  1. 打开成像系统和计算机。双击以打开该软件。选择 专业 版程序模式。
  2. 检查载物台区域，确保不存在样品，并且没有任何东西阻碍载物台的移动。然后，单击 立即 校准。
  3. 在右侧侧边栏的" 孵化 "菜单下，选中 H Unit XL 旁边的框，并将其设置为 37 °C。
    注意：等到孵育阶段接近温度后再准备样品进行成像。
  4. 用750μL成像培养基冲洗第一个实验孔，并用400μL在第5.2节中制备的酶嘧啶颗粒悬浮液代替。将剩余的油井留在生长培养基中。
    注意：如果颗粒悬浮液沉降超过15分钟，则可能需要再次短暂涡旋和超声处理。
  5. 将载玻片放在成像系统的培养台上。设置一个计时器10分钟。
  6. 使用成像软件，在"定位"选项卡下选择"明场"，然后单击下面系统配置窗口中的目镜图标。10倍物镜就位后，使用目镜和对焦旋钮聚焦在细胞上。
  7. 选择" 采集 "选项卡，使用" 实验 "下拉菜单，然后选择一组波长，其中包括 EGFP 滤光片集，以适应pH敏感染料的509 nm激发533 nm发射波长。
  8. 当计时器还剩下约2分钟时，使用软件通过单击物镜菜单中的20x图标将物镜更改为20倍。
    1. 单击 通道 菜单，选择 EGFP 过滤器，然后 使用曝光菜单 将曝光时间设置为 400 ms，以便在 pH 敏感的绿色荧光团封闭在吞噬溶酶体中后对其进行检测。
    2. 单击" 实时 "并使用对焦旋钮调整焦点。
  9. 单击" 停止"以关闭灯光，然后选中顶部" 延时" 实验设置旁边的框。
  10. 在" 对焦策略 "菜单中，选择" 软件自动对焦"。从 自动对焦 菜单的下拉菜单中，选择 "智能 "和" 粗略 "设置，以缩短自动对焦运行时的曝光时间。
  11. 在" 延时摄影 "菜单中，将所需的采集次数设置为 30-60，将间隔时间设置为 1 分钟。
  12. 设置延时参数后，向第一个孔添加颗粒10分钟后，单击" 开始实验 "按钮开始采集。
  13. 使用第一个实验井完成采集后，对其余每个实验井重复步骤6.4-6.12。
  14. 将标题中包含日期和参数的所有实验文件保存到相应的文件夹中。
  15. 关闭软件。在 处理 模式下重新打开软件，然后使用"导出"菜单以MP4格式 导出 文件。

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Representative Results

在所有时间点计算每组的平均±SEM后，数据以折线图格式显示，Y轴作为相对荧光强度，X轴作为时间。 补充文件1 以电子表格格式提供了来自96孔板动力学读取的原始数据的示例。

在这项研究中，图3A和表3中呈现的最佳结果表明，1）与MSC共培养增强巨噬细胞的吞噬活性，2）IFN-y处理降低巨噬细胞的活性，以及3）与MSC共培养部分挽救MΦ吞噬活性。在这些研究中，最佳细胞密度至关重要，当MΦ以过低的密度接种时，无法检测到荧光强度的变化（图3B）。图3C代表了一项研究的数据，其中MΦ被镀在过高的密度下，并且荧光强度在所有组中都迅速升高，并且无法识别差异。动态成像视频证实，荧光强度的变化是由吞噬作用而不是培养基的酸化引起的。它们还提供定性数据和吞噬活性速率和程度的视觉表示（图4）。

Figure 1
图1：描述所呈现数据的核心问题的插图，即"MSC可以恢复IFN-γ治疗的MΦ的吞噬活性吗？"。请单击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：共培养和吞噬作用测定工作流程概述。 与MSC共培养中MΦ吞噬活性的定量和定性分析的工作流程概述。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：来自动力学的代表性定量数据，表明最佳和次优结果。在（A）中，数据代表具有最佳MΦ细胞密度的实验，在（B）数据中代表MΦ密度过低的次优实验，而在（C）中，数据代表具有次优过高MΦ细胞密度的实验。以相对荧光单位（RFU）测量的相对荧光强度绘制在Y轴上，而时间绘制在X轴上。请注意最佳和次优实验之间RFU范围的差异。在A中，MSC在IFN-γ抑制的情况下，在70分钟内部分挽救MΦ吞噬活性。RFU 表示为 SEM ±均值，n = 6。使用 Tukey 的多重比较检验进行分析，该检验具有显著的双向方差分析，相互作用效应 P = 0.0001，时间效应 P = 0.0001，处理/MSC 效应 P = 0.0001。符号表示多重比较测试的结果。* = MSC/MΦ + IFN- γ 与 MΦ + IFN-γ之间的显著差异，Ŧ = MΦ 与 MΦ + IFN-γ之间的显著差异，† = MSC/MΦ 与 MΦ 之间的显著差异。有关多重比较测试的详细结果，请参见表3。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：动态成像视频，提供细胞特异性荧光增加的视觉确认，这些荧光来自标记的酶族颗粒的酸性活化后掺入MΦ吞噬溶酶体。 使用400 ms的曝光时间和EGFP滤光片组，在30分钟内每1分钟采集一次延时设置。（A）MΦ 在单一培养中，（B） MΦ 在与 MSC 共培养中，（C）MΦ 用 IFN-γ处理 （250 ng/mL） 和（D）用 IFN-γ （250 ng/mL） 处理的 MΦ 与 MSC 共培养。 请点击此处下载此文件。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
一个 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
B 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
C 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
D 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
E 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
F 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
G 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器
H 断续器 MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+ 断续器 断续器

表 1：96 孔板设计示例。 CBL - 单元格空白;MSC - 播种第1天;MΦ+处理和MΦ未处理第2天播种;在测定第3天加入RBL试剂空白。

1 2 3 4
MSC/MΦ MSC/MΦ+ MΦ MΦ+

表2：4孔室滑盖设计示例。 MSC - 镀层第1天;MΦ+处理和MΦ未处理电镀第2天。

Tukey的多重比较测试 平均差值 95.00% 差分的置信区间 低于阈值？ 总结 调整后的 P 值
0 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ -3871 -9495 到 1754 不 ns 0.2836
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 720.3 -4904 到 6345 不 ns 0.9873
MΦ 与 MΦ + IFN-γ -77.17 -5702 到 5548 不 ns >0.9999
10 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ -3466 -9091 到 2159 不 ns 0.3817
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 2326 -3299 到 7950 不 ns 0.7062
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 992 -4633 到 6617 不 ns 0.968
20 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ -1311 -6936 到 4314 不 ns 0.9303
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 3315 -2310 到 8940 不 ns 0.422
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 3146 -2478 到 8771 不 ns 0.4689
30 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ 384.8 -5240 到 6010 不 ns 0.998
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 2313 -3312 到 7937 不 ns 0.7098
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 8726 3101 到 14350 是的 *** 0.0005
40 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ 2247 -3377 到 7872 不 ns 0.7278
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 4913 -712.2 到 10537 不 ns 0.1101
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 16521 10896 到 22145 是的 **** <0.0001
50 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ 5657 32，12 到 11282 是的 * 0.0481
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 4932 -692.9 到 10557 不 ns 0.1079
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 19083 13458 到 24708 是的 **** <0.0001
60 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ 12376 6752 到 18001 是的 **** <0.0001
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 9361 3736 到 14986 是的 *** 0.0002
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 24748 19123 到 30373 是的 **** <0.0001
70 分钟
MSC/MΦ 与 MΦ 13770 8145 到 19395 是的 **** <0.0001
MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ 11987 6362 到 17612 是的 **** <0.0001
MΦ 与 MΦ + IFN-γ 27264 21639 到 32888 是的 **** <0.0001

表3：图3A所示数据的详细统计分析。图3A所示数据显著的双向方差分析后Tukey的多重比较测试结果。

补充文件1：来自最佳实验的原始动力学数据的代表性电子表格文件。请点击此处下载此文件。

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Discussion

使用与pH敏感染料偶联的生物颗粒分析吞噬作用是一种相对较新的工具，已被证明比传统的荧光标记颗粒12，19，20具有优势。对于传统的荧光标记颗粒，只有终点分析是可行的。在洗涤或淬灭未被吞噬细胞吸收的颗粒后，使用荧光显微镜和/或光谱荧光测定法进行检测。从光谱荧光测定法获得的定量数据具有检测非吞噬颗粒的潜力，并且使用传统的荧光显微镜系统14进行仅量化细胞内颗粒的图像分析既繁琐又耗时。与pH敏感染料偶联的生物颗粒仅在吞噬体等酸性环境中发出荧光，因此，繁琐的洗涤和淬火步骤是不必要的14。此外，pH敏感标记的生物颗粒提供了提供动力学数据的优势，这些数据不容易被FITC或其他荧光团偶联的生物颗粒获取。

使用这种新工具的研究已经采用流式细胞术和/或成像平台来生成吞噬细胞活性的定量和动力学测量19，20，21。如果吞噬细胞群有限，或者如果有兴趣对下游分析（如遗传筛选）进行分选，流式细胞术是有利的19。已知MSC通过直接接触和通过可溶性因子调节MΦ表型。初步研究表明，来自MSC的条件培养基抑制了MΦ吞噬作用，因此，该方案旨在确定与MSC直接共培养时MΦ吞噬活性的变化。在这些条件下，用于定量的分光荧光测定法和用于可视化和确认吞噬活性的动态成像是最合适的。

这些方法成功的关键是细胞密度的优化。MSC需要以允许与MΦ电池最佳接触的密度进行接种。MΦ需要以一种密度接种在单质培养物和共培养物中，其密度不仅允许最佳接触，而且还允许最佳荧光检测。密度过低将导致低掺入吞噬溶酶体和相对荧光单元的小或平坦变化（图3B）。如果MΦ以太高的密度接种，吞噬作用迅速增加，并且掩盖了组间差异的检测（图3C）。优化每个细胞数标记的酶摩尔颗粒的pH敏感染料的浓度也至关重要。应进行初步实验以优化MSC和MΦ的细胞密度，以及每个MΦ细胞的颗粒数。此外，如果使用其他标记的生物颗粒，则应采取这些优化步骤，例如 大肠杆菌 或 金黄色葡萄球菌。

合适的成像介质也至关重要。这两种方法的培养基应为缓冲培养基，不应含有酚红。酚红会使检测到的荧光发射静音。此外，任何可能使介质酸化的添加剂或条件都会过早地激活标记的颗粒并引入升高的背景。试剂空白对于识别培养基的潜在酸化至关重要。

这些方案不仅可以用于研究MSC调节各种pH敏感生物颗粒的MΦ吞噬作用，而且该方法还可以应用于包括嗜中性粒细胞和其他吞噬细胞在内的各种共培养模型。此外，通过使用该模型，可以通过siRNA或CRISPR介导的下调来探测怀疑参与细胞接触介导的巨噬细胞吞噬活性调节的分子和途径，以验证或反驳可疑的分子靶标。潜在靶标包括粘附分子、吞噬受体和整合素分子。

使用这些方法的工作将揭示有关细胞接触与MSC相互作用后MΦ吞噬反应增加的信号传导机制的新信息，从而进一步了解MSC在调节先天免疫中的作用。诸如此类的研究涉及一个研究不足的领域，并将全面了解MSC对巨噬细胞活性的影响，这对于充分了解它们在免疫中的作用是必要的。

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Disclosures

作者没有利益冲突要声明。

Acknowledgments

这项工作得到了NSF主要研究仪器机制的支持，其授权号为1626093和1919583。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 Well Black Polystyrene Microplate MilliporeSigma CLS3603-48EA
0.4% trypan blue solution MilliporeSigma T8154-20ML
15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 339653
4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells ThermoFisher 155382PK
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco ThermoFisher 15240096
Axiobserver 7 Imaging System Zeiss
Bovine Serum Albumin (BSA) MilliporeSigma A8806-1G
Cell lifter MilliporeSigma CLS3008-100EA
Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered MilliporeSigma C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1] ATCC CRL-12424 Mouse MSC Cell Line
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11965092
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher 16140071
Hemocytometer FisherScientific 02-671-51B
I-11.15 ATCC CRL-2470 Mouse MΦ Cell Line
LADMAC Cell Line ATCC CRL-2420 LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).
Live-Cell Imaging solution ThermoFisher A14291DJ
PBS, pH 7.4 ThermoFisher 10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate ThermoFisher P35365
Recombinant Murine IFN-γ Preprotech 315-05
Spectramax i3X Molecular Devices
Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm ThermoFisher 568-0020
Sterile syringe filters, 0.2 micrometer ThermoFisher 723-2520
Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm MilliporeSigma CLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher 25300054

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References

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免疫学和感染，第173期，
间充质干细胞调节巨噬细胞吞噬作用;定量和成像
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Evans, J. F., Ricigliano, A. E.,… More

Evans, J. F., Ricigliano, A. E., Morante, A. V., Martinez, E., Vargas, D., Thyagaraj, J. Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging. J. Vis. Exp. (173), e62729, doi:10.3791/62729 (2021).

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