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Immunology and Infection

मैक्रोफेज फागोसिटोसिस का मेसेंचिमल स्टेम सेल रेगुलेशन; क्वांटिटेशन और इमेजिंग

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62729
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Molloy College

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल के लिए मात्रा और mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) मैक्रोफेज (MΦ) गैर opsonized खमीर (zymosan) कणों कि एक पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित है की phagocytosis के विनियमन मध्यस्थता की गतिशील छवियों का उत्पादन है ।

Abstract

मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) पारंपरिक रूप से उनके पुनर्योजी गुणों के लिए अध्ययन किया गया है, लेकिन हाल ही में, उनकी इम्यूनोरेगुलेटरी विशेषताएं सबसे आगे रही हैं। वे प्रतिरक्षा कोशिका गतिविधि के साथ बातचीत करते हैं और उन्हें विनियमित करते हैं। इस स्टडी का फोकस एमएससी रेगुलेशन ऑफ मैक्रोफेज फैगोसाइटिक एक्टिविटी है। मैक्रोफेज (MΦ) फैगोसाइटोसिस संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और जिन तंत्रों के माध्यम से एमएससी इस प्रतिक्रिया को संशोधित करता है, उनकी सक्रिय जांच की जा रही है। यहां प्रस्तुत एमएससी के साथ सह-संस्कृति में, जबकि पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट अणु के लिए संयुग्मित गैर-opsonized zymosan कणों के MΦ phagocytosis का अध्ययन करने के लिए एक विधि है । जैसे-जैसे फैगोसाइटिक गतिविधि बढ़ जाती है और लेबल किए गए ज़िमोसन कण फागोलिसोसोम के अम्लीय वातावरण के भीतर संलग्न होते हैं, पीएच-संवेदनशील अणु की फ्लोरेसेंस तीव्रता बढ़ जाती है। उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ, फगोसाइटिक गतिविधि को फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है और गतिज डेटा को 70 मिनट की अवधि में सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों में परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस मात्रात्मक डेटा का समर्थन करने के लिए, फागोसाइटिक गतिविधि में परिवर्तन गतिशील इमेजिंग का उपयोग करके कल्पना की जाती है। इस विधि का उपयोग करने वाले परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि जब सह-संस्कृति में, एमएससी भोले और आईएफएन-γ दोनों के गैर-opsonized zymosan के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है MΦ इलाज किया जाता है। ये आंकड़े जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के एमएससी नियमन के वर्तमान ज्ञान को जोड़ते हैं। इस विधि को अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र को पूरी तरह से चित्रित करने के लिए भविष्य की जांच में लागू किया जा सकता है।

Introduction

मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) जनक कोशिकाएं हैं जो संयोजी ऊतक कोशिकाओं को जन्म देती हैं। एमएससी वयस्क स्तनधारी ऊतकों में मौजूद हैं और बोन मैरो1से अलग किया जा सकता है। उनके इम्यूनोमॉडी गुणों के कारण, इन कोशिकाओं का व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है2। टी-सेल3,4,5,6 के एमएससी नियमन पर केंद्रित प्रारंभिक अध्ययन लेकिन हाल ही में, जन्मजात प्रतिरक्षा के एक प्रमुख सेलुलर घटकमैक्रोफेज कोशिकाओं (MΦ) के उनके नियमन पर ध्यान7, 8,9,10,11,12, 13,14प्राप्त हुआहै। . भड़काऊ रोग के उपचार में एमएससी-MΦ इंटरैक्शन के महत्व को इस तथ्य से रेखांकित किया जाता है कि मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की कमी पशु मॉडल8में एमएससी के चिकित्सीय प्रभावों को समाप्त कर देती है । यहां फोकस एमएससी की सेल कॉन्टैक्ट इंटरैक्शन विद MΦ है। एमएससी में भड़काऊ से लेकर विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं तक स्विच को बढ़ावा देकर MΦ के फेनोटाइप को विनियमित करने की क्षमता है, जिससे ऊतक मरम्मत गतिविधियां8,9,10, 11हो रही हैं और इन नियामक तंत्रों को प्रदर्शित करने के लिए बहुत कुछ किया गया है । अन्य परिस्थितियों में, एमएससी MΦ संचालित भड़काऊ प्रतिक्रिया12, 13 का समर्थन या बढ़ा सकता है और MΦ फागोसाइटिक गतिविधि14,15को बढ़ा सकता है। हालांकि, मौजूदा आंकड़ों की एक महत्वपूर्ण कमी है जो तंत्र की पहचान करती है जिससे और एमएससी MΦ फैगोसाइटिक गतिविधि को विनियमित करती है ।

MΦ रिसेप्टर्स के परिवार होते हैं जो या तो ओपोनाइज्ड (एंटीबॉडी या पूरक लेपित) या गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों को पहचानते हैं जिससे फैगोसाइटोसिस16 होताहै। बाद की सक्रियता और गतिविधि का अध्ययन कम अच्छी तरह से किया जाता है17. एक गैर-भड़काऊ इन विट्रो वातावरण में, एमएससी गैर-opsonized रोगजनकों के MΦ फागोसिटोसिस को बढ़ाता है13। हालांकि, MΦ द्वारा गैर-ओपोनाइज्ड रोगजनकों की मान्यता एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान लिम्फोसाइट्स द्वारा उत्पादित भड़काऊ वातावरण के संपर्क में आने के बाद कम हो सकती है। प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और प्रभावक लिम्फोसाइट्स द्वारा जारी आईएफएन-γ, गैर-opsonized कणों के MΦ फागोसिटोसिस पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है18। MΦ फैगोसाइटोसिस के एमएससी डायरेक्ट कॉन्टैक्ट रेगुलेशन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति मॉडल विकसित किया गया था। यहां प्रस्तुत प्रयोग का लक्ष्य यह निर्धारित करना है कि एमएससी MΦ गैर-opsonized रोगजनकों के phagocytosis को विनियमित करने के बाद MΦ IFN-γ(चित्रा 1)के संपर्क में आ गया है ।

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Protocol

नोट: सभी मध्यम तैयारी और सेल संस्कृति तकनीकों को लेमिनार प्रवाह के साथ जैवसिफेन कैबिनेट का उपयोग करके एसेप्टिक परिस्थितियों में किया जाता है। वर्णित सभी संस्कृति इनक्यूबेशन कदम 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% आर्द्रता के वातावरण को बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किए गए इनक्यूबेटर का उपयोग करके किए जाते हैं।

1. सेल संस्कृति

  1. विकास माध्यम की तैयारी
    1. एमएससी और लैडमैक के लिए एफबीएस की 50 एमएल और 100x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक मिक्स की 500 मिलील को हाई ग्लूकोज डीएमईएम के 500 एमएल में जोड़ें।
    2. MΦ के लिए, एफबीएस के 50 एमएल, लाडमैक कंडीशन मीडियम के 100 एमएल (सेक्शन 1.2 के कदमों के बाद तैयार) और 100x एंटीबायोटिक मिक्स के 5 एमएल को हाई ग्लूकोज डीएमईएम के 500 एमएल में जोड़ें।
      नोट: LADMAC कोशिकाओं MΦ कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए आवश्यक कॉलोनी उत्तेजक कारक (CSF-1) का उत्पादन ।
  2. लैडमैक वातानुकूलित माध्यम की तैयारी
    1. जमे हुए स्टॉक से LADMAC कोशिकाओं बीज करने के लिए, पांच T75 सेमी2 सेल संस्कृति में से प्रत्येक में धारा १.१ से विकास माध्यम के 19 एमएल जोड़ें फ्लास्क और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में जगह 15 मिनट के लिए संतुलन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस ।
    2. इस बीच, 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेटिंग करके या जब तक यह गल न जाए तब तक 106 जमे हुए कोशिकाओं का एक एलिकोट जल्दी गल जाए। 15 एमएल या 50 एमएल बाँझ शंकु नली में ताजा एमएससी विकास माध्यम के 9 एमएल में कोशिकाओं को जोड़ें और 5 मिनट के लिए एक झूल बाल्टी रोटर में 125 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    3. सुपरनेट को एस्पिरेट या डिकंट करें, ताजा विकास माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और सेल पेलेट को फिर से खर्च करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    4. एक बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पांच T75 सेमी2 फ्लास्क में से प्रत्येक में सेल निलंबन का 1 एमएल जोड़ें और उन्हें सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    5. हर 2-3 दिनों में, 7-10 दिन की अवधि में मध्यम का एक अतिरिक्त 10 एमएल जोड़ें। फिर, कोशिकाओं और सुपरनैटेंट को बाँझ 50 एमएल शंकु नलियों में बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट और सेंट्रलाइज का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 125 x ग्राम पर एकत्र करें।
    6. सुपरनैंट को सेल पेलेट से अलग करें और बाँझ 0.2 माइक्रोन बाँझ एकल-उपयोग वैक्यूम फिल्टर इकाई का उपयोग करके सुपरनैंट को फ़िल्टर करें।
      1. एस्पिरेटर असेंबली को पैकेज से निकालें और एस्पिरेटर पंप से वैक्यूम ट्यूबिंग का उपयोग करके कनेक्ट करें। सुपरनेट को ऊपर के डिब्बे में डालें और कवर को बदल दें। एस्पिरेटर पंप को नीचे के डिब्बे में फ़िल्टर करने के लिए चालू करें।
      2. 50 एमएल बाँझ शंकु ट्यूबों में पाइपिंग करके एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    7. सेल पेलेट को फ्रीज करने के लिए, फ्रीजिंग मीडियम में 106 सेल/एमएल पर रीसस्पेंड करें, फ्रीजिंग कंटेनर में रखें, और फिर उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें । 24 घंटे के बाद, एलएन2 स्टोरेज में स्थानांतरित करें।
  3. सह-संस्कृति की तैयारी में प्रकोष्ठों का प्रचार
    1. जमे हुए स्टॉक से एमएससी और MΦ कोशिकाओं को बीज करने के लिए, चार १०० मिमी सेल संस्कृति में से प्रत्येक में धारा १.१ में तैयार उपयुक्त विकास माध्यम के 9 मिलीलीटर प्रत्येक सेल प्रकार के लिए व्यंजन का इलाज किया और 15 मिनट के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में जगह है ।
    2. इस बीच, जल्दी गल 10 6 जमेहुए कोशिकाओं के aliquots उन्हें 2-3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेटिंग या जब तक बस गल । फिर, फ्रेश एमएससी ग्रोथ मीडियम के 9 एमएल में गल्ड एमएससी सेल्स को जोड़ें और गल्ड MΦ सेल्स को 15 या 50 एमएल बाँझ शंकु ट्यूबों में 9 एमएल फ्रेश MΦ ग्रोथ मीडियम में डालें और 5 मिनट के लिए झूलने वाली बकेट रोटर में १२५ एक्स जी पर सेंट्रलाइज करें ।
    3. सुपरनेटेंट को एस्पिरेट या डिकेंट करें और प्रत्येक गोली को उचित ताजा विकास माध्यम के 4 एमएल में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से खर्च करें। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए चार 100 मिमी व्यंजनों में से प्रत्येक में सेल निलंबन का 1 एमएल जोड़ें जिन्हें चरण 1.3.1 में बराबर कर दिया गया है।
    4. इनक्यूबेटर को कोशिकाओं के साथ व्यंजन वापस करें। 70%-80% ढुलमुल होने तक हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें।

2. प्रायोगिक व्यंजनों में बीज एमएससी, दिन 1

नोट: एमएससी सीडिंग से पहले, फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के लिए प्रायोगिक 96-अच्छी प्लेट लेआउट और गतिशील इमेजिंग के लिए चैंबर स्लाइड डिजाइन करें। ९६-अच्छी थाली के लिए, कोशिकाओं युक्त कुओं के साथ पार्श्व प्रयोगात्मक कुओं लेकिन परख में उनका उपयोग नहीं करते । रिएजेंट ब्लैंक (आरबीएल) के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले कम से कम चार कुओं को चिह्नित करें। एक उदाहरण के लिए तालिका 1 देखें 96-वेल टेम्पलेट और टेबल 2 4-वेल चैंबर स्लाइड टेम्पलेट के उदाहरण के लिए। स्पष्ट नीचे से काले या सफेद 96-अच्छी तरह से प्लेटों की सिफारिश की जाती है। 1.5 मिमी बोरोसिलिकेट ग्लास चैंबर स्लाइड इष्टतम है, लेकिन कक्षों की संख्या को अध्ययन डिजाइन पर निर्भर समायोजित किया जा सकता है। अनुसरण करने वाले तरीकों का सारांश प्रवाह चार्ट चित्र 2में शामिल है ।

  1. 70%-80% की आपूर्ति पर, 100 मिमी व्यंजनों में संस्कृतियों से विकास माध्यम को बढ़ाता है और एमएससी को अलग करने के लिए पीबीएस के 5 एमएल जोड़ते हैं।
  2. पीबीएस को एस्पिरेट करें, 0.05% ट्राइप्सिन/ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ें, और इसे 3-5 मिनट के लिए संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें।
  3. 3 मिनट के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल टुकड़ी की जांच करें। यदि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, अगले कदम के लिए जारी; यदि नहीं, तो एक और 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेशन जारी रखें। 5-6 मिनट से अधिक समय तक न करें।
  4. अलग कोशिकाओं के साथ पकवान के लिए ताजा विकास माध्यम के 5 एमएल जोड़ें। ट्रिप्पसिन/मीडियम मिक्सचर का इस्तेमाल कर डिश को कुल्ला करें और कोशिकाओं को बाँझ सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके एक साफ, बाँझ 50 एमएल शंकु नली में एकत्र करें।
  5. 125 x gपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सेल पेलेट को ताजा विकास माध्यम के 10 एमएल में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपिंग करके फिर से खर्च करें।
  6. कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के 30 माइक्रोल में सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोल जोड़ें। फिर, एक हीमोसाइटोमीटर गिनती कक्ष के कवरलिप के नीचे मिश्रण के 10 माइक्रोल पिपेट करें।
  7. 10x उद्देश्य के साथ एक उल्टे या उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, 1 मिमी2 वर्गों में से चार में अन दाग (व्यवहार्य) कोशिकाओं की गणना करें। सूत्र का उपयोग कर सेल संख्या की गणना करें: कोशिकाएं/एमएल = सेल काउंट/# 1 मिमी2 वर्ग x कमजोर पड़ने कारक x 104।
    नोट: इस उदाहरण के लिए, गिना 1मिमी 2 वर्गों की संख्या चार है, और कमजोर पड़ने का कारक 4 है।
  8. समीकरण सी1वी1 = सी2वी2 के लिए गणना और एक 1 x 105 सेल/एमएल निलंबन तैयार करने के लिए प्रयोग करें । 96-वेल प्लेट के हर कॉलम को भरने के लिए सेल/एमएल सस्पेंशन का 1 एमएल और प्लेट डिजाइन के अनुसार भरे जाने वाले 4-वेल चैंबर स्लाइड के हर चैंबर के लिए ०.७५ एमएल तैयार करें ।
    नोट: सी1 = सेल काउंट, वी1 = क्या गणना की जा रही है, सी2 = 1 x 105,V2 = 5.50 एमएल।
  9. वी1निर्धारित करें, निलंबन तैयार करने के लिए आवश्यक ताजा माध्यम की मात्रा निर्धारित करने के लिए कुल मात्रा के वांछित 5.50 एमएल से घटाएं। कोशिकाओं की मात्रा (वी 1) मूल निलंबन से ताजा माध्यम की मात्रा में 1 x105 कोशिकाओं/एमएल के साथ कुल5.50 एमएल के लिए जोड़ें।
  10. प्लेट डिजाइन के अनुसार 1 x 105 सेल/एमएल सस्पेंशन के 100 माइक्रोल जोड़ें प्लेट डिजाइन के अनुसार एक मल्टीचैनल माइक्रोपाइपेटर और 530 माइक्रोल का उपयोग करके प्लेट डिजाइन के प्रत्येक कुएं में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके। रात भर इनक्यूबेट।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, एमएससी कॉलम 1, 2, 3, और ९६ के 6-अच्छी तरह से थाली(तालिका 1)और कुओं 1 और 4 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड(तालिका 2)के 2 में चढ़ाया जाता है । इसलिए 1 x 10 5 सेल/एमएल सस्पेंशन का कम से कम5.50 एमएल तैयार किया जाता है। 80% संगम पर MΦ भड़काऊ मध्यस्थों के साथ व्यवहार किया जाता है उसी दिन एमएससी प्रायोगिक प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं।

3. IFN-γ, दिन 1 के साथ MΦ को सक्रिय करें

  1. एक्टिवेशन मीडियम और आईएफएन-γ स्टॉक तैयार करें।
    1. एक्टिवेशन माध्यम के 200 एमएल के लिए, 0.2 माइक्रोन बाँझ एकल-उपयोग वैक्यूम फिल्टर यूनिट का उपयोग करके सीरम-मुक्त उच्च ग्लूकोज डीएमईएम और बाँझ फिल्टर के 200 मिलीग्राम में 40 मिलीग्राम बीएसए जोड़ें।
    2. 01% बीएसए/पीबीएस तैयार करने के लिए, पीबीएस के 20 मिलीग्राम बीएसए को 20 मिलीग्राम जोड़ें। भंवर भंग करने के लिए। एक साफ, बाँझ 50 मिलीएल शंकुस ट्यूब में फिल्टर करने के लिए एक 0.2 μm बाँझ सिरिंज फिल्टर का प्रयोग करें।
    3. स्टॉक समाधान के 100 माइक्रोग्राम/एमएल को प्राप्त करने के लिए 100 माइक्रोन ऑफ ल्योफिलाइज्ड आईएफएन-γ में बाँझ 0.1% बीएसए/पीबीएस समाधान जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 μL aliquots में स्टोर करें।
  2. IFN-γ के साथ MΦ सक्रिय
    1. आवश्यक माध्यम के प्रत्येक 1 एमएल के लिए आईएफएन-γ स्टॉक के 100 μg/ml के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। सक्रिय होने के लिए, 250 एनजी/एमएल की एकाग्रता पर आईएफएन-γ युक्त एक्टिवेशन माध्यम के 10 एमएल तैयार करें।
    2. MΦ संस्कृतियों से विकास माध्यम को नीचे रखें और इसे आईएफएन-γ के बिना सक्रियण माध्यम के 5 एमएल से प्रतिस्थापित करें।
    3. इसे रिनसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम को एस्पिरेट करें और इसे आईएफएन के 10 एमएल से प्रतिस्थापित करें- γ प्रायोगिक पकवान के लिए पूरक सक्रियण माध्यम और नियंत्रण के लिए 10 एमएल गैर-पूरक सक्रियण माध्यम के साथ। 16-24 घंटे के लिए संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।

4. MΦ को अलग और सह संस्कृतियों, 2 दिन तैयार

  1. MΦ कोशिकाओं से एक्टिवेशन मीडियम निकालें और इसे फ्रेश ग्रोथ मीडियम के 5 एमएल से रिप्लेस करें। एक सेल लिफ्टर के साथ धीरे-धीरे परिमार्जन करें और कोशिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में इकट्ठा करें।
  2. ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन और हीमोसाइटोमेट्री का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें जैसा कि एमएससी के लिए वर्णित है, चरण 2.6-2.7।
  3. चरण 2.8-2.9 में समीकरण का उपयोग करना, 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल के दो अलग निलंबन, नियंत्रण से कोशिकाओं के साथ एक और इलाज MΦ संस्कृतियों से कोशिकाओं के साथ एक तैयार करते हैं ।
    नोट: ९६-वेल प्लेट के हर कॉलम को भरने के लिए सेल/एमएल सस्पेंशन का 1 एमएल तैयार करें और प्लेट डिजाइन के अनुसार भरे जाने वाले 4-वेल चैंबर स्लाइड के हर चैंबर के लिए ०.७५ एमएल ।
  4. एमएससी युक्त ९६-अच्छी तरह से प्लेट के प्रायोगिक कुओं से माध्यम को धीरे से आकांक्षी । एक मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्लेट डिजाइन के अनुसार एमएससी के साथ और बिना उचित प्रयोगात्मक कुओं में इलाज और नियंत्रण MΦ सेल निलंबन के 100 माइक्रोन जोड़ें। रात भर इनक्यूबेट।
  5. धीरे-धीरे एमएससी युक्त 4-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड से माध्यम को एस्पिरेट करें, और, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, डिजाइन के अनुसार उपयुक्त कुओं में MΦ सेल निलंबन के 530 माइक्रोन जोड़ें। रात भर इनक्यूबेट।

5. Phagocytosis परख, गतिज फ्लोरोसेंट ९६-अच्छी तरह से थाली पढ़ें, 3 दिन

  1. परख मापदंडों को निर्धारित करें
    1. परख के दिन फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर और कंप्यूटर चालू करें- सिस्टम पर तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
    2. सिस्टम प्रो सॉफ्टवेयर खोलें और ऊपरी-बाएं कोने में इंस्ट्रूमेंट आइकन की जांच करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि उपकरण कंप्यूटर से जुड़ा हुआ है या नहीं। यदि एक लाइन के साथ लाल सर्कल दिखाई दे रहा है, तो इंस्ट्रूमेंट आइकन पर क्लिक करें और कनेक्शन बनाने के लिए पॉप-अप विंडो में इंस्ट्रूमेंट चुनें।
    3. प्लेट सेट-अप हेल्पर पॉप-अप विंडो तक पहुंचने के लिए नए प्रयोग का चयन करें। प्लेट सेट-अप हेल्पर मेनू से, अपनी अधिग्रहण सेटिंग्स को कॉन्फ़िगरकरें।
    4. ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन के लिए सेटिंग्स मेनू से मोनोक्रोमेटर चुनें। पढ़ने वाले प्रकार के लिए रीड मोड और गतिज के लिए FL (फ्लोरेसेंस) का चयन करें।
    5. एक ही विन्यास खिड़की में, श्रेणीके तहत, तरंगदैर्ध्यपर क्लिक करें, और फिर विसर्जन के लिए 9 एनएम और उत्सर्जन के लिए 15 एनएम के लिए बैंडविड्थ सेट करें।
    6. वेवलेंथ जोड़ों की संख्या 1 सेट करें। वेवलेंथ एलएम 1 को उत्तेजन के लिए 510 एनएम और उत्सर्जन के लिए 540 एनएम निर्धारित करें।
    7. श्रेणियों के माध्यम से जारी रखें और प्लेट टाइप नेक्स्ट चुनें। उपयोग किए जा रहे प्लेट प्रकार से मेल खाता है कि विकल्प का चयन करें।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि चयन प्लेट प्रकार से मेल खाता है। पढ़ी-लिखी ऊंचाइयों को चयन के अनुसार सिस्टम द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    8. इसके बाद, रीड एरिया का चयन करें और प्रायोगिक डिजाइन में शामिल 96-अच्छी प्लेट के क्षेत्र को हाइलाइट करें।
    9. पीएमटी और ऑप्टिक्सका चयन करें , पीएमटी गेन को हाई और फ्लैश ्स के लिए सेट करें 6. यदि एक स्पष्ट नीचे की प्लेट का उपयोग कर नीचे से पढ़ने के लिए अगले बॉक्स की जांच करें ।
    10. समय का चयन करें और एक 70 मिनट की अवधि में 10 मिनट के अंतराल के लिए सेट करें।
    11. शेकका चयन करें, पहले पहले पढ़ें बॉक्स की जांच करें, और 5 एस के लिए सेट करें। बीच में पढ़ता बॉक्स की जांच करें और 3 एस के लिए सेट करें । कम और रैखिकदोनों के लिए शेक तीव्रता निर्धारित करें ।
    12. खिड़की बंद करो। जब प्लेट सेट-अप हेल्पर विंडो पॉप अप हो, तो कॉन्फ़िगर योर प्लेट लेआउटचुनें। प्लेट डिजाइन के बीएल कुओं को हाइलाइट करें और प्लेट ब्लैंकपर क्लिक करें।
    13. प्रत्येक प्रायोगिक पंक्तियों को हाइलाइट करें, ऐडपर क्लिक करें, समूह का नाम दें, और फिर एक रंग चुनें।
    14. प्लेट डिज़ाइन के नीचे असाइनमेंट विकल्पों के तहत, श्रृंखलाका चयन करें, और फिर खिड़की में श्रृंखला को परिभाषित करें और ओकेपर क्लिक करें। प्रत्येक समूह के लिए दोहराएं।
  2. zymosan निलंबन तैयार
    1. सिस्टम का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने का इंतजार करते हुए लाइव सेल इमेजिंग मीडियम के 5 एमएल में 1 मिलीग्राम जाइमोसन कणों को रीसुस्पेंड करें।
      1. कणों से युक्त शीशी में लाइव-सेल इमेजिंग माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और उन्हें एक ग्लास कल्चर ट्यूब में इकट्ठा करें। इमेजिंग समाधान के अतिरिक्त 1 एमएल के साथ शीशी कुल्ला और सभी कणों को स्थानांतरित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक ही ग्लास ट्यूब के लिए स्थानांतरित करें। कण निलंबन के 0.2 मिलीग्राम/
    2. 30-60 एस के लिए त्वरित दालों के साथ भंवर। इसके बाद 60 त्वरित दालों के साथ सोनिकेट करने के लिए जांच सोनिकेटर का इस्तेमाल करें।
      नोट: कणों का समरूप निलंबन बनाना बहुत महत्वपूर्ण है और प्रायोगिक कुओं को जोड़ने से पहले निलंबन को बहुत लंबा नहीं बैठने देना चाहिए। झुरमुट तेजी से होता है। प्रति कोशिका घनत्व कण को उपयोग किए जाने वाले MΦ के स्रोत, उपचार और घनत्व के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। प्रस्तुत अध्ययनों में, संयुग्मित जाइमोसन कणों का उपयोग किया गया था। हालांकि, संयुग्मित ई कोलाई और एस ऑरियस भी उपलब्ध हैं।
  3. zymosan जोड़ें और थाली पढ़ें
    1. प्रायोगिक कुओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और लाइव-सेल इमेजिंग समाधान के 100 माइक्रोन के साथ 1x कुल्ला करें। लाइव सेल इमेजिंग समाधान के साथ आरबीएल कुओं कुल्ला के रूप में अच्छी तरह से।
    2. प्रायोगिक और आरबीएल कुओं से लाइव-सेल इमेजिंग समाधान को एस्पिरेट करें और इसे धारा 5.2 में तैयार ज़िमोसन कण निलंबन के 100 माइक्रोन के साथ प्रतिस्थापित करें।
    3. टचपैड इंटरफेस का उपयोग कर फ्लोरोसेंट रीडर की प्लेट ट्रे खोलें। ऊपरी-बाएं कोने में A1 अच्छी तरह से के साथ ट्रे में ढक्कन के बिना, प्लेट सेट करें। टचपैड का इस्तेमाल कर ट्रे बंद करें और टॉप मेन्यू में ग्रीन रीड बटन पर क्लिक करें।
    4. जब पढ़ा पूरा हो जाता है, तो फ़ाइल को उचित फ़ोल्डर पर सहेजें और फ़ाइल पर क्लिक करके और निर्यात का चयन करके स्प्रेडशीट प्रारूप में डेटा का निर्यातकरें।
    5. स्प्रेडशीट(अनुपूरक फ़ाइल1) में प्रत्येक दोहराने वाले समूह (10 मिनट, 20 मिनट, 30 मिनट, आदि) के लिए मतलब ± एसईएम सापेक्ष फ्लोरेसेंस की गणना करें और डेटा को ग्राफिंग सॉफ्टवेयर में स्थानांतरित करें।
    6. डेटा प्रस्तुत करने के लिए एक लाइन ग्राफ प्रारूप का उपयोग करें और दो तरह के ANOVA (समय एक्स उपचार/कारकों के रूप में एमएससी) लागू करने के बाद Tukey के कई तुलना परीक्षण के लिए व्यक्तिगत समूहों के बीच मतभेदों को निर्धारित करते हैं ।
      नोट: जबकि ९६ अच्छी तरह से थाली पढ़ें प्रगति पर है, समय चूक छवि अधिग्रहण के लिए गतिशील इमेजिंग प्लेट तैयार करते हैं । सुनिश्चित करें कि गतिशील इमेजिंग एक समय में अच्छी तरह से एक प्रयोगात्मक के विश्लेषण के साथ आय।

6. फागोसिटोसिस परख, गतिशील इमेजिंग, 3 दिन

  1. इमेजिंग सिस्टम और कंप्यूटर चालू करें। सॉफ्टवेयर खोलने के लिए डबल क्लिक करें। प्रो प्रोग्राम मोड का चयन करें।
  2. चरण क्षेत्र की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई नमूने मौजूद नहीं हैं और मंच की गति में कुछ भी बाधा नहीं है। फिर, अब कैलिब्रेटपर क्लिक करें ।
  3. दाईं ओर साइडबार पर इनक्यूबेशन मेन्यू के तहत एच यूनिट एक्सएल के बगल में बॉक्स चेक कर इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने से पहले इनक्यूबेटेड चरण लगभग तापमान तक है जब तक रुको।
  4. इमेजिंग माध्यम के 750 माइक्रोन के साथ पहले प्रायोगिक अच्छी तरह से कुल्ला और धारा 5.2 में तैयार zymosan कण निलंबन के 400 μL के साथ इसे बदलें। बचे हुए कुओं को ग्रोथ मीडियम में छोड़ दें।
    नोट: भंवर के लिए आवश्यक हो सकता है और कण निलंबन फिर से संक्षेप में सोनीकेट अगर यह 15 मिनट से अधिक के लिए बस गया है ।
  5. इमेजिंग सिस्टम के इनक्यूबेटेड स्टेज पर स्लाइड रखें। 10 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें।
  6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, पता लगाने टैब के तहत ब्राइटफील्ड का चयन करें, और फिर नीचे सिस्टम विन्यास खिड़की में आईपीस आइकन पर क्लिक करें। जगह में 10x उद्देश्य के साथ, आंख का उपयोग करें और घुंडी ध्यान केंद्रित करने के लिए कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
  7. अधिग्रहण टैब का चयन करें, प्रयोग ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करें, और फिर तरंगदैर्ध्य का एक सेट चुनें जिसमें पीएच-संवेदनशील डाई के 509 एनएम एक्सटिटेशन 533 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य को समायोजित करने के लिए EGFP फ़िल्टर सेट शामिल है।
  8. जब टाइमर पर ~2 मिनट बचा हो, तो ऑब्जेक्टिव मेन्यू में 20x आइकन पर क्लिक करके ऑब्जेक्टिव को 20x में बदलने के लिए सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करें ।
    1. चैनल मेनू पर क्लिक करें, ईजीएफपी फिल्टर का चयन करें और फैगोलियोसोम में संलग्न होने के बाद पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोफोर का पता लगाने के लिए एक्सपोजर समय को 400 एमएस तक सेट करने के लिए एक्सपोजर मेनू का उपयोग करें।
    2. लाइव पर क्लिक करें और फोकसिंग नॉब का उपयोग करके फोकस को समायोजित करें।
  9. लाइट बंद करने के लिए स्टॉप पर क्लिक करें और शीर्ष पर टाइम-लैप्स प्रायोगिक सेटिंग के बगल में बॉक्स की जांच करें।
  10. फोकसिंग स्ट्रैटजी मेनू में सॉफ्टवेयर ऑटोफोकसका चयन करें। ऑटोफोकस मेन्यू में ड्रॉप-डाउन से, लाइट के एक्सपोजर के समय को कम करने के लिए स्मार्ट और मोटे सेटिंग्स का चयन करें जबकि ऑटोफोकस चल रहा है।
  11. समय-चूक मेनू में, अधिग्रहण की वांछित संख्या 30-60 और अंतराल समय 1 मिनट के लिए निर्धारित करें।
  12. समय-चूक मापदंडों को सेट करने के बाद और पहली अच्छी तरह से कणों के अलावा के 10 मिनट के बाद, अधिग्रहण शुरू करने के लिए शुरू प्रयोग बटन पर क्लिक करें ।
  13. जब अधिग्रहण पहले प्रयोगात्मक कुएं का उपयोग करके पूरा हो जाता है, तो शेष प्रायोगिक कुओं में से प्रत्येक के लिए 6.4-6.12 कदम दोहराएं।
  14. शीर्षक में तारीख और मापदंडों के साथ सभी प्रयोग फ़ाइलों को उचित फ़ोल्डर के लिए सहेजें।
  15. सॉफ्टवेयर बंद कर दो। प्रोसेसिंग मोड में सॉफ्टवेयर को फिर से खोलें और एक्सपोर्ट मेनू का उपयोग करके एमपी 4 प्रारूप में फाइलों का निर्यात करें।

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Representative Results

सभी समय बिंदुओं पर प्रत्येक समूह के लिए मतलब ± एसईएम की गणना करने के बाद, डेटा को वाई-एक्सिस के साथ लाइन ग्राफ प्रारूप में सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता और एक्स-एक्सिस के रूप में समय के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। अनुपूरक फ़ाइल 1 स्प्रेडशीट प्रारूप में 96-वेल प्लेट के गतिज पढ़ने से कच्चे डेटा का एक उदाहरण प्रदान करता है।

इस अध्ययन में, चित्रा 3 एऔर तालिका 3 में प्रस्तुत इष्टतम परिणाम यह प्रदर्शित करते हैं कि एमएससी के साथ सह-संस्कृति मैक्रोफेज की फैगोसाइटिक गतिविधि को बढ़ाती है, 2) आईएफएन-वाई उपचार मैक्रोफेज की गतिविधि को कम करता है, और 3) एमएससी के साथ सह-संस्कृति आंशिक रूप से MΦ फेगोटिक गतिविधि को बचाती है। इन अध्ययनों में इष्टतम कोशिका घनत्व महत्वपूर्ण हैं, और जब MΦ घनत्व के बहुत कम पर चढ़ाया जाता है, तो फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन का पता नहीं लगाया जा सकता है(चित्रा 3 बी)। चित्रा 3C एक अध्ययन से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है जहां MΦ एक घनत्व और फ्लोरेसेंस तीव्रता के बहुत अधिक पर चढ़ाया गया था सभी समूहों में तेजी से ऊंचा है, और मतभेदों को समझा नहीं जा सकता है । गतिशील इमेजिंग वीडियो पुष्टि करते हैं कि फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन फैगोसाइटोसिस से होता है और माध्यम का अम्लीकरण नहीं होता है। वे गुणात्मक डेटा और फागोसाइटिक गतिविधि(चित्र 4)की दर और सीमा का एक दृश्य प्रतिनिधित्व भी प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्र 1:प्रस्तुत आंकड़ों के केंद्रीय प्रश्न को दर्शाते हुए एक उदाहरण, जो यह है कि "क्या एमएससी IFN-γ की फैगोसाइटिक गतिविधि को ठीक कर सकता है MΦ का इलाज किया जाता है?". कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सह-संस्कृति और फैगोसाइटोसिस परख वर्कफ़्लो का अवलोकन। एमएससी के साथ सह-संस्कृति में MΦ फैगोसाइटोसिस गतिविधि के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह की रूपरेखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:काइनेटिक से प्रतिनिधि मात्रात्मक डेटा इष्टतम और उप-इष्टतम परिणामों को पढ़कर पढ़ता है। (ए)में, डेटा इष्टतम MΦ सेल घनत्व के साथ एक प्रयोग के प्रतिनिधि हैं,(बी)डेटा सबऑप्टिमल के साथ एक प्रयोग के प्रतिनिधि हैं जो सेल घनत्व MΦ बहुत कम है, और(सी)में, डेटा सबऑप्टिमल MΦ सेल घनत्व के साथ एक प्रयोग का प्रतिनिधि है। सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों (आरएफयू) में मापा गया सापेक्ष फ्लोरेसेंस तीव्रता वाई-एक्सिस पर प्लॉट किया जाता है, जबकि समय एक्स-एक्सिस पर प्लॉट किया जाता है। इष्टतम और उप-इष्टतम प्रयोगों के बीच आरएफयू की सीमा में अंतर पर ध्यान दें। एकमें, एमएससी आंशिक रूप से एक ७० मिनट की अवधि में IFN-γ दमन की स्थापना में phagocytic गतिविधि MΦ बचाव । आरएफयू को एसईएम, एन = 6 ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। विश्लेषण एक महत्वपूर्ण दो तरह के ANOVA, बातचीत प्रभाव पी = 0.0001, समय प्रभाव पी = 0.0001, और उपचार/ प्रतीक कई तुलना परीक्षणों के परिणामों को निरूपित करते हैं। = एमएससी/MΦ + IFN के बीच महत्वपूर्ण अंतर- γ बनाम MΦ + IFN-γ, Ŧ = MΦ बनाम MΦ + IFN-γ के बीच महत्वपूर्ण अंतर, और † = एमएससी/MΦ बनाम MΦ के बीच महत्वपूर्ण अंतर । कई तुलना परीक्षणों के विस्तृत परिणामों के लिए तालिका 3 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4:MΦ में शामिल होनेके बाद लेबल वाले जाइमोसन कणों के अम्लीय सक्रियण से फ्लोरेसेंस में सेल-विशिष्ट वृद्धि की दृश्य पुष्टि प्रदान करने वाले गतिशील इमेजिंग वीडियो। समय-चूक सेटिंग्स 400 एमएस और ईजीएफपी फिल्टर सेट के एक्सपोजर समय का उपयोग करके 30 मिनट की अवधि में हर 1 मिनट में अधिग्रहण किया गया था। (ए)एमएससी के साथ सह-संस्कृति में मोनोकल्चर में MΦ,(बी)MΦ MΦ, एमएससी के साथ सह-संस्कृति में आईएफएन-γ (२५० एनजी/एमएल) और(डी)के साथ व्यवहार किया γ MΦ । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
B सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
C सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
D सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
E सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
F सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
G सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल
H सीबीएल एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+ सीबीएल आरबीएल

तालिका 1: 96-अच्छी प्लेट डिजाइन का उदाहरण। सीबीएल - सेल ब्लैंक; एमएससी - वरीयता प्राप्त दिन 1; MΦ + इलाज और अनुपचारित वरीयता प्राप्त दिन 2 MΦ; RBL अभिकर् ता खाली परख दिन 3 पर जोड़ा गया।

1 2 3 4
एमएससी/MΦ एमएससी/MΦ + MΦ MΦ+

तालिका 2: 4-अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड डिजाइन का उदाहरण। एमएससी - चढ़ाया दिन 1; MΦ + इलाज और अनुपचारित चढ़ाया दिन 2 MΦ ।

टुकी की कई तुलना परीक्षण मतलब डिफ। 95.00% सीआई ऑफ डिफ। दहलीज के नीचे? सारांश समायोजित पी वैल्यू
0 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ -3871 -9495 से 1754 नहीं एन एस 0.2836
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 720.3 -4904 से 6345 नहीं एन एस 0.9873
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ -77.17 -5702 से 5548 नहीं एन एस >0.9999
10 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ -3466 -9091 से 2159 नहीं एन एस 0.3817
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 2326 -3299 से 7950 नहीं एन एस 0.7062
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 992 -4633 से 6617 नहीं एन एस 0.968
20 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ -1311 -6936 से 4314 नहीं एन एस 0.9303
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 3315 -2310 से 8940 नहीं एन एस 0.422
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 3146 -2478 से 8771 नहीं एन एस 0.4689
30 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ 384.8 -5240 से 6010 नहीं एन एस 0.998
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 2313 -3312 से 7937 नहीं एन एस 0.7098
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 8726 3101 से 14350 हाँ *** 0.0005
40 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ 2247 -3377 से 7872 नहीं एन एस 0.7278
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 4913 -712.2 से 10537 नहीं एन एस 0.1101
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 16521 10896 से 22145 हाँ **** <0.0001
50 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ 5657 32.12 से 11282 हाँ * 0.0481
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 4932 -692.9 से 10557 नहीं एन एस 0.1079
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 19083 13458 से 24708 हाँ **** <0.0001
60 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ 12376 6752 से 18001 हाँ **** <0.0001
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 9361 3736 से 14986 हाँ *** 0.0002
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 24748 19123 से 30373 हाँ **** <0.0001
70 मिनट
एमएससी/MΦ बनाम MΦ 13770 8145 से 19395 हाँ **** <0.0001
एमएससी/MΦ + IFN-γ बनाम MΦ + IFN-γ 11987 6362 से 17612 हाँ **** <0.0001
MΦ बनाम MΦ + IFN-γ 27264 21639 से 32888 हाँ **** <0.0001

तालिका 3: चित्रा 3 एमें प्रस्तुत आंकड़ों का विस्तृत सांख्यिकीय विश्लेषण । चित्रा 3Aमें प्रस्तुत डेटा के एक महत्वपूर्ण दो तरह के ANOVA के बाद है Tukey कई तुलना परीक्षणों के परिणाम ।

अनुपूरक फाइल 1: इष्टतम प्रयोग से कच्चे गतिज डेटा की एक प्रतिनिधि स्प्रेडशीट फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

पीएच-सेंसिटिव डाई के लिए संयुग्मित जैव-कणों का उपयोग करके फागोसिटोसिस का विश्लेषण एक अपेक्षाकृत नया उपकरण है जो पारंपरिक फ्लोरोसेंटली लेबलवाले कणों12, 19,20पर लाभप्रद साबित हुआ है। पारंपरिक फ्लोरोसेंट-लेबल वाले कणों के साथ, केवल अंतिम बिंदु विश्लेषण संभव है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और/या स्पेक्ट्रोफ्लोरोरोमेट्री के साथ उन कणों को धोने या बुझाने के बाद डिटेक्शन किया जाता है जिन्हें फैगोसाइट द्वारा नहीं लिया गया है । स्पेक्ट्रोफ्लोरोमेट्री से प्राप्त मात्रात्मक डेटा में गैर-घिरा कणों का पता लगाने की क्षमता है, और केवल इंट्रासेलुलर कणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी सिस्टम14का उपयोग करके थकाऊ और समय लेने वाला है। पीएच-संवेदनशील रंगों के लिए संयुग्मित बायोकण केवल फम्ली वातावरण जैसे फग्लिसोसोम में, और इसलिए, थकाऊ धोने और शमन कदम अनावश्यक14हैं। इसके अतिरिक्त, पीएच-संवेदनशील लेबल वाले बायोकणों को गतिज डेटा प्रदान करने का लाभ प्रदान करता है जो फिटसी या अन्य फ्लोरोफोर-कंजूगेट बायोकणों के साथ आसानी से प्राप्त नहीं किया जाएगा।

इस नए उपकरण का उपयोग करने वाले अध्ययनों में फगोसाइट गतिविधि 19 ,20,21के मात्रात्मक और गतिज माप उत्पन्न करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री और/या इमेजिंग प्लेटफार्मों कोनियोजितकिया गया है । यदि सीमित फागोसाइट जनसंख्या है या यदि कोई आनुवंशिक स्क्रीन19जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए छंटाई करने में रुचि रखता है तो फ्लो साइटोमेट्री लाभप्रद है । एमएससी दोनों प्रत्यक्ष संपर्क के माध्यम से और घुलनशील कारकों के माध्यम से फेनोटाइप MΦ को विनियमित करने के लिए जाना जाता है । प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि एमएससी से वातानुकूलित माध्यम MΦ फगोसाइटोसिस को दबा दिया गया था, और इसलिए, इस प्रोटोकॉल को एमएससी के साथ प्रत्यक्ष सह-संस्कृति में MΦ फैगोसाइटिक गतिविधि में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इन स्थितियों के तहत, स्पेक्ट्रोफ्लोरोरोमेट्री कल्पना और पुष्टि करने के लिए कल्पना और गतिशील इमेजिंग की मात्रा करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं।

इन तरीकों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण सेल घनत्व का अनुकूलन है। एमएससी को घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए जो MΦ कोशिकाओं के साथ इष्टतम सेल संपर्क की अनुमति देता है। MΦ को एक घनत्व पर मोनो और सह-संस्कृतियों में वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता होती है जो न केवल इष्टतम संपर्क के लिए अनुमति देता है बल्कि इष्टतम फ्लोरेसेंस डिटेक्शन की अनुमति देता है। घनत्व के बहुत कम होने से सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाइयों(चित्रा 3 बी)में फागोलियोसोम और छोटे या फ्लैट परिवर्तनों में कम समावेश होगा। यदि MΦ को घनत्व के बहुत अधिक वरीयता प्राप्त हैं, तो फागोसाइटोसिस तेजी से बढ़ता है, और समूहों के बीच मतभेदों का पता लगाना नकाबपोश(चित्रा 3C)है। प्रति सेल संख्या पीएच-संवेदनशील डाई लेबल zymosan कणों की एकाग्रता का अनुकूलन भी महत्वपूर्ण है। प्रारंभिक प्रयोग एमएससी और MΦ के सेल घनत्व को अनुकूलित करने के लिए किया जाना चाहिए, और प्रति MΦ सेल कणों की संख्या । इसके अतिरिक्त, इन अनुकूलन कदम उठाए जाने चाहिए यदि अन्य लेबल वाले जैवकणों का उपयोग किया जाता है, जैसे ई कोलाई या एस ऑरियस।

उपयुक्त इमेजिंग माध्यम भी महत्वपूर्ण है। दोनों तरीकों के लिए माध्यम एक बफर माध्यम होना चाहिए और इसमें फिनोल लाल नहीं होना चाहिए। फिनॉल रेड फ्लोरोसेंट उत्सर्जन का पता लगाने को म्यूट कर देगी। इसके अलावा, किसी भी योजक या स्थिति है कि माध्यम को अम्लीय कर सकते है समय से पहले लेबल कणों को सक्रिय करने और ऊंचा पृष्ठभूमि शुरू करेगा । मध्यम के संभावित अम्लीकरण की पहचान करने के लिए रिएजेंट ब्लैंक महत्वपूर्ण है।

न केवल इन प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न प्रकार के पीएच-संवेदनशील जैव-टीसीकाइल्स के MΦ फैगोसाइटोसिस के एमएससी नियमन की जांच करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि विधि को विभिन्न प्रकार के सह-संस्कृति मॉडलों पर भी लागू किया जा सकता है जिसमें न्यूट्रोफिल और अन्य फैगोसाइट्स शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल का उपयोग करके, अणुओं और मैक्रोफेज फैगोसाइटिक गतिविधि के सेल संपर्क-मध्यस्थता विनियमन में शामिल होने के संदेह में रास्ते सिरना या CRISPR मध्यस्थता नीचे विनियमन के माध्यम से जांच की जा सकती है को मान्य या संदिग्ध आणविक लक्ष्यों का खंडन । संभावित लक्ष्यों में आसंजन अणु, फागोसाइटिक रिसेप्टर्स और इंटीग्रीन अणु शामिल हैं।

इन तरीकों का उपयोग कर काम एमएससी के साथ सेल संपर्क बातचीत के बाद MΦ की वृद्धि हुई phagocytic प्रतिक्रियाओं अंतर्निहित संकेत तंत्र के बारे में नई जानकारी को उजागर करेगा, जिससे जन्मजात प्रतिरक्षा को विनियमित करने में भूमिका एमएससी खेलने की हमारी समझ को आगे बढ़ाने । इस तरह के अध्ययनों के रूप में इन पते एक कम अध्ययन क्षेत्र और प्रभाव एमएससी मैक्रोफेज गतिविधि है, जो प्रतिरक्षा में उनकी भूमिका की पूरी समझ के लिए आवश्यक है पर है की एक पूरी तस्वीर निकलेगा ।

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Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को 1626093 और 1919583 अनुदान संख्या के तहत एनएसएफ मेजर रिसर्च इंस्ट्रूमेंट मैकेनिज्म ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 Well Black Polystyrene Microplate MilliporeSigma CLS3603-48EA
0.4% trypan blue solution MilliporeSigma T8154-20ML
15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 339653
4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells ThermoFisher 155382PK
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco ThermoFisher 15240096
Axiobserver 7 Imaging System Zeiss
Bovine Serum Albumin (BSA) MilliporeSigma A8806-1G
Cell lifter MilliporeSigma CLS3008-100EA
Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered MilliporeSigma C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1] ATCC CRL-12424 Mouse MSC Cell Line
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11965092
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher 16140071
Hemocytometer FisherScientific 02-671-51B
I-11.15 ATCC CRL-2470 Mouse MΦ Cell Line
LADMAC Cell Line ATCC CRL-2420 LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1).
Live-Cell Imaging solution ThermoFisher A14291DJ
PBS, pH 7.4 ThermoFisher 10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate ThermoFisher P35365
Recombinant Murine IFN-γ Preprotech 315-05
Spectramax i3X Molecular Devices
Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm ThermoFisher 568-0020
Sterile syringe filters, 0.2 micrometer ThermoFisher 723-2520
Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm MilliporeSigma CLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher 25300054

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 173
मैक्रोफेज फागोसिटोसिस का मेसेंचिमल स्टेम सेल रेगुलेशन; क्वांटिटेशन और इमेजिंग
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Evans, J. F., Ricigliano, A. E.,… More

Evans, J. F., Ricigliano, A. E., Morante, A. V., Martinez, E., Vargas, D., Thyagaraj, J. Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging. J. Vis. Exp. (173), e62729, doi:10.3791/62729 (2021).

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