Summary
Mikropladeføderanalysen tilbyder en økonomisk, høj gennemløbsmetode til kvantificering af flydende fødevareforbrug i Drosophila. En 3D-printet enhed forbinder en 96-brønd mikroplade, hvor fluer er anbragt til en 1536-brønd mikroplade, hvorfra fluer forbruger en fodringsopløsning med et sporstofstof. Opløsningsvolumenfaldet måles spectrophotometrisk.
Abstract
Kvantificering af fødeindtagelse i Drosophila bruges til at studere de genetiske og fysiologiske fundamenter af forbrugsrelaterede træk, deres miljømæssige faktorer og de toksikologiske og farmakologiske virkninger af mange stoffer. Få metoder, der i øjeblikket er implementeret, kan bruges til måling af høj overførselshastighed. Microplate Feeder Assay (MFA) blev udviklet til kvantificering af forbruget af flydende fødevarer til individuelle fluer ved hjælp af absorbans. I denne analyse, fluer forbruge flydende mad medium fra udvalgte brønde af en 1536-brønd mikroplade. Ved at inkorporere et fortyndet sporstofstof i det flydende fødevaremedium og lægge et kendt volumen i hver brønd afspejler absorbansmålinger af det velerhvervede før og efter forbrug den deraf følgende ændring i volumen (dvs. volumenforbrug). For at muliggøre analyse af høj gennemløb med denne metode blev der designet en 3D-printet kobling, der gør det muligt at sortere fluer individuelt i 96-brønd mikroplader. Denne enhed orienterer præcist 96- og 1536-brønd mikroplader for at give hver flue adgang til op til 4 brønde til forbrug, hvilket muliggør kvantificering af fødevarepræferencer ud over regelmæssigt forbrug. Desuden har enheden barriere strimler, der skifter mellem åbne og lukkede positioner for at give mulighed for kontrolleret indeslutning og frigivelse af en kolonne af prøver ad gangen. Denne metode muliggør høje gennemløbsmålinger af forbruget af vandige opløsninger af mange fluer samtidigt. Det har også potentiale til at blive tilpasset andre insekter og til at screene forbruget af næringsstoffer, toksiner eller lægemidler.
Introduction
Drosophila melanogaster har set bred anvendelse som en genetisk model organisme til at studere de biologiske fundamenter af fødeindtagelse og træk forbundet med forbrug1. Det anslås, at 65% af menneskets sygdomsfremkaldende gener har funktionelle homologer i fluer, med en betydelig andel af dem, der udtrykkes i funktionelt ækvivalente væv mellem fluer og mennesker2. Desuden gør D. melanogasters størrelse, kort tid mellem generationerne, simpel vedligeholdelse og genetisk tractability det til en attraktiv model for undersøgelser af forbruget af næringsstoffer3,4 og toksikologiske og farmakologiske virkninger af en række stoffer, herunder insekticider5, forurenende stoffer6, lægemidler7og misbrugsmedicin8,9,10.
I mange tilfælde kræver undersøgelsen af sådanne træk præcis kvantificering af forbruget. Metoder til kvantificering af forbruget er forskellige og omfatter CApillary FEeder (CAFE) assay11, MAnual FEeding (MAFE) assay12, Snabel Extension Response (PER) assay13, sporstofstof udvinding14,15, oligonucleotid tracer ekstraktion16,og radio-isotop ekstraktion5,17. De seneste bestræbelser har fokuseret på at øge gennemløbet af disse assays, som i Expresso assay18 eller plade-baserede Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) system19. På trods af deres nytte, disse analyser kan være kompliceret, dyrt, eller arbejdskrævende, hindrer deres anvendelse i høj gennemløb undersøgelser.
Figur 1: Komponenter i mikropladeføderanalysen. (A) 3D-gengivelse af den samlede mikropladeføderanalyse. Den 1536-brønd mikroplade er orienteret af 3D-printet kobling således, at hver brønd af den nederste 96-brønd mikroplade har adgang til fire brønde af den øverste 1536-brønd mikroplade. Adgang til brøndene kan styres ved at justere placeringen af barriere strimler slidset gennem koblingen. (B) En grafisk gengivelse af hver brønd i mikropladeføderanalysen. Forbrugsløsninger opbevares i hver brønd ved hjælp af en forseglingsfilm, der er perforeret for at give adgang til fluen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over procedurerne i mikropladeføderanalysen. Figuren viser et flowdiagram, der svarer til trin 4.1-5.8 i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at overvinde disse forhindringer, microplate Feeder Assay (MFA; Figur 1) blev udviklet. I denne analyse er fluer anbragt individuelt i 96-brønd mikroplader. Hver mikroplade er koblet til en 1536-brønd mikroplade ved hjælp af en brugerdefineret, 3D-printet enhed. Enheden orienterer præcist de to plader, så hver flyve i sin respektive brønd af 96-brøndspladen har adgang til 4 brønde af den 1536-brønd mikroplade. Ved at bruge en bundløs 1536-brønd plade og forsegling film, er løsninger dispenseret i udvalgte brønde og perforeret med præcise 0,25 mm diameter nåle til at give adgang til fluerne. Kritisk, tillader forbrug direkte fra en mikroplade giver mulighed for øjeblikkelig absorbans-baserede målinger ved hjælp af en mikropladelæser. Et fortyndet sporstofstof indarbejdes i forbrugsmediet, og ændringen i absorbansen efter eksponering anvendes til at bestemme det forbrugte volumen (figur 2 og figur 3). Da væsken i hver brønd tilnærmer en kolonne af væske, vil volumetriske forskelle manifestere sig som forskelle i kolonnens højde. (Figur 3A) Ifølge Beer-Lambert lov20:
hvor A er absorbansen, ε er molarabsorptionskoefficienten for den formildende analysand, l er den optiske stilængde, og c er koncentrationen af den formildende analysand. Således, med konstant molar absorption koefficient og koncentration, ændringer i absorbans skyldes udelukkende ændringer i den optiske lys sti, dvs væskeniveauet i en given brønd. Ved at måle absorbansen før og efter eksponering afspejler den proportionale ændring i absorbansen den proportionale ændring i volumen (figur 3B).
Figur 3: Absorbansbaseret kvantificering af brøndvolumen. (A) Hændelseslys af kendt inputintensitet (I0) krydser hver brønd. Dæmpning af lys ved forskellige fyldmængder giver forskellige outputintensiteter(I),der udviser en lineær sammenhæng mellem volumen og absorbans. (B) Empirisk måling af absorbans vs. volumen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Baseret på ændringen i volumen kan mængden af enhver indtaget forbindelse beregnes ud fra dens kendte koncentration i foderopløsningen. De dele, der er nødvendige for analysen er lave i omkostninger og har en høj grad af genanvendelighed, væsentligt at reducere de tilbagevendende omkostninger ved analysen. Således tilbyder denne procedure en overkommelig, høj gennemløbsmetode til præcist kvantificering af forbruget.
Protocol
1. Forberedelse af sulteplade
- Der afvejes 1,5 g agarose i et 250 mL glasbæger.
- Tilsæt 100 mL destilleret H2O til bægerglasset.
- Mikroovn periodisk, indtil agarose er helt smeltet.
BEMÆRK: Overhold bægeret, da agarose er tilbøjelig til at koge over. - Hæld den smeltede agarose i et reagenstrug og dispenser 80 μL smeltet agarose i hver brønd af en 96-brønd mikroplade ved hjælp af en multikanal pipette. Lad pladerne hærde, mens de er dækket af stuetemperatur. Køle resterne opstod i op til en uge i en forseglet pose og smelte det igen for at gøre yderligere plader.
2. Fluesortering og sult
- Forbered koblinger ved at indsætte barriere strimler i barrieren strip kanaler. Hvis barriere strimler er for løs, spole dem rundt om fingeren for at give dem krumning til at holde dem i kanalerne.
- Sæt koblingen på en sulteplade. Brug ikke koblingen til at manipulere pladen, da koblingen kan glide af. Sørg for, at koblingerne er korrekt orienteret (dvs. sørg for, at koblingens vinklede hjørne matcher mikropladens vinklede hjørne).
- Under CO 2-anæstesi (Materialetabel)sorteres 3-5-dages gamle fluer. Læg individuelle fluer med kolonne ind i sultepladen.
BEMÆRK: Selvom fluer er indlæst efter kolonne, anbefales det at distribuere grupper af prøver ned rækker af pladen i stedet for ned kolonner (se figur 4 for plade layout eksempel). - Luk hver kolonne, når den fyldes, ved at justere barrierestrimlen til den lukkede position.
Figur 4: Repræsentativt udsultningstaldelayout. Diagrammet viser organiseringen af fordampningskontroller og mandlige og kvindelige fluer i en 96-brønd plade, der anvendes i denne undersøgelse. Alternative konfigurationer, herunder skiftende rækker af mænd og kvinder med fordampningskontrol i række A og H, kan også bruges. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Registrer omhyggeligt prøvelayoutet i mikropladen. Når sultepladen er fyldt, skal fluerne komme sig spontant efter fjernelse af CO2 og sulte dem i 6 timer startende fra deres første bedøvelsestid.
3. Flydende tilberedning af fødevarer
BEMÆRK: Lav flydende mad frisk hver dag.
- Forbered en 10 mg/mL farvestof lager opløsning af FD &C Blue # 1 i destilleret H2O.
BEMÆRK: Dette kan opbevares ved stuetemperatur i op til 6 måneder. - Der fremstilles 10 mL flydende fødevarer (4% saccharose, 1% gærekstrakt, 40 μg/mL FD&C Blue #1) i et 15 mL konisk rør ved opløsning af 0,4 g saccharose og 0,1 g gærekstrakt i 10 mL destilleret H2O. Vortex røret, indtil faste stofferne er helt opløst. Der tilsættes 40 μL farvestofopløsning, og røret vendes gentagne gange for at homogenisere opløsningen.
- Den flydende fødevare overføres til en 10 mL sprøjte tippet med et 0,45 μm filter. Filter ~1,5 mL af opløsningen ad gangen i et 1,7 mL mikrocentrifugerør. Sæt sprøjten, der indeholder opløsningen, til side, og filtrer den ekstra opløsning efter behov under præparatet af foderplader.
4. Fremstilling af foderplader
BEMÆRK: Håndter fødepladerne forsigtigt efter påfyldning for at forhindre dannelse af bobler eller dråber i brønden, der kan påvirke absorbansaflæsningerne.
- Forbered en feederplade ved at forsegle bunden af en 1536-brønd mikroplade med en forseglingsfilm. Brug en tætning padle til at klæbe til filmen grundigt. Trim overskydende film fra venstre og højre kant med et barberblad.
- Dispenser 10 μL af den filtrerede flydende fødevaresøjlevis (se figur 5 for illustration) i de relevante brønde på 1536-brøndens mikroplade. Dispenser i øverste venstre brønd for hver klynge af fire brønde (se figur 5 for illustration).
Figur 5: Fyld rækkefølge og godt placering for 1536-brønd feeder plade. Diagrammet illustrerer trin 4.2 i protokollen. Pile viser den rækkefølge, som fodringsopløsningen introduceres i fødepladen en kolonne ad gangen fra kolonne 1 til 12. Prøve B1 forstørres for at vise et eksempel på placeringen af fodringsløsninger til 1-choice og 2-choice-analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Når alle brønde er fyldt, anvende en forsegling film til toppen af pladen. Brug en tætning padle til at klæbe til filmen grundigt. Trim overskydende film fra venstre og højre kant med et barberblad. Gentag for det ønskede antal plader.
- Centrifugere pladerne ved 200 x g for 10 s at afregne væsken. Lad ikke pladen køles af, da dette kan medføre kondens til at opbygge i brøndene, tilsløring absorbans aflæsninger.
5. Eksponering
- Når fluerne er klar til forbrugsanalysen, perforere brøndene på pladens øverste overflade med nålesondeværktøjet udstyret med en 0,25 mm diameter nål. Brug den samme rækkefølge til at perforere, som det blev brugt ved dispensering af løsningerne. Vend pladen og perforere brøndene på bunden. Tør nålen af mellem opløsninger for at forhindre krydskontaminering. Pas på ikke at røre ved perforeringer, da dette væger opløsningen fra brøndene.
- Læs pladens absorbans ved 630 nm uden låg.
- Placer et internt låg på den øverste forseglingsfilm for at sikre, at kondensringe omkranser de perforerede brønde. Placer det udvendige låg på pladen.
- Placer fødepladen med forsiden nedad på koblingen, så guiderne justerer de relevante huller på fødepladen og sultepladen. Sørg for, at koblingen og pladerne er korrekt orienteret (dvs. sørg for, at koblingens vinklede hjørne og pladerne passer). Wrap elastikker omkring toppen og bundpladerne for at holde koblingen sammen. Kontroller, om der er justering og mellemrum mellem fødepladen og koblingen.
- Når alle feederpladerne er indlæst på koblingerne, skal du åbne brøndene til pladerne ved at justere barrierestrimlerne på koblingen. Placer koblings-/pladesamlingerne i den sekundære beholder. Hver sekundær beholder kan rumme op til seks samlinger.
- Placer den nederste halvdel af en pipettekasse, der indeholder gennemblødte papirhåndklæder, i hver sekundær beholder for at give fugtighed. Luk låget på de sekundære beholdere, og overfør dem til et kontrolleret miljø (25 °C, luftfugtighedstyret, 12 timer lys:mørke cyklusser). Lad fluerne forbruge i 22 timer.
- Efter 22 timers eksponering skal du kontrollere hver plade for døde fluer og opdatere pladelayoutet i overensstemmelse hermed. Når alle pladerne er kontrolleret, bedøver fluerne i massevis ved at pumpe CO2 inde i den sekundære beholder. Efter ~ 60 s skal du sørge for, at alle fluerne er immobiliseret. Tamp forsigtigt fluerne ind i sultepladen og udskift plastbarrieresten strimlerne. Fjern fødepladerne til læsning.
- Genlæs pladens absorbans ved 630 nm. Gentag, indtil alle plader er blevet læst.
6. Dataanalyse
BEMÆRK: Analyse kan udføres med investigators foretrukne softwarepakke.
- Udelade eventuelle fluer, der døde i løbet af 22 timers eksponering.
- For hver brønd beregnes den forbrugte mængde som:
C - Forbrugt volumen (μL)
V - Indledende Brønd Volumen (dvs. 10 μL)
ABS0 - Præeksponeringsabsorbering
ABS1 - Post-eksponering absorbans
BEMÆRK: Forbruget er angivet som en positiv volumen i beregningen. - For at tage højde for fordampning trækkes den gennemsnitlige fordampningsvolumen fra flyveforbrugsværdier inden for de respektive plader. For 2-valg / præference test, justere hver brønd ved sin respektive løsning, f.eks., justere "valg 1" brønde ved "valg 1" i fordampning kontrol.
- Efter justering for fordampning, drop alle prøver med en forbrugsværdi mindre end nul.
- For 2-valg test, beregne præference for hver samt:
P - Præferenceindeks (positiv retning angiver præference)
FA - Volumen af flydende fødevarer, der forbruges indeholdende additiv (Valg 2)
FN - Volumen af normal flydende mad forbruges (Valg 1)
7. Mikroplade og kobling vask protokol.
BEMÆRK: Sørg for at undgå skader på bunden af mikropladerne, da skader kan påvirke forseglingen.
- Fjern filmene og etiketterne fra de 1536-brønd mikroplader. Adskil koblinger og barriere strimler. Placer barriere strimler i en tætning beholder, såsom en flaske. Vask barrierestrimlerne ved kraftigt at ryste i en række varmt vand fra hanen, mildt vaskemiddelopløsning, varmt vand fra hanen og derefter destilleret H2O.
- Skyl 1536-brønd mikroplader og koblinger under varmt vand fra hanen. For mikroplader skal du køre vand fra hanen gennem hver mikroplades brønde for at rydde så meget opløsning og snavs som muligt. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge en pipettespids til at fjerne snavs; Brug ikke metal- eller glasredskaber på pladerne.
- Dæk hver plade og kobling med en mild vaskemiddelopløsning (f.eks. 1% v/v Aquet). Til pladerne skal du skrubbe overfladerne med en behandsket hånd. For koblingerne skal du bruge en børste.
- Skyl hver tallerken grundigt med postevand, og med destilleret H2O. Sørg for, at brøndene skylles specifikt ud under vandstrømmen.
- Lad pladerne og koblingerne lufttørre dækket ved stuetemperatur. Opbevar i en ren opbevaringsbeholder, indtil den bruges.
BEMÆRK: Håndter aldrig de 1536 brønde mikroplader uden handsker. Resterende olier fra huden kan hindre forsegling, hvilket fører til godt lækage og fordampning.
Representative Results
For at afgøre, om der findes korrelationer blandt brøndene på de enkelte plader, blev fordampningen kvantificeret for hver brønd (n = 96 brønde / plade til tre plader). Fordampning viste sig at være -0,036 μL ± 0,003 μL (gennemsnit ± SEM hele vejen igennem). (Figur 6A) Pearson korrelationer blev beregnet til at evaluere tendenser mellem fordampning og godt steder. Korrelationskoefficienten (Figur 6B, C) for fordampning versus rækker var -0,04 (p = 0,4949) og for fordampning vs kolonner var -0,23 (p = 0,0001). Grupperne blev efterfølgende fordelt mellem kolonner for at afbøde de milde, men statistisk signifikante korrelationer på tværs af kolonner.
Figur 6: Fordampning i MFA. (A) Massefyldesfordeling af fordampningsændringer med middelværdi ± SD angivet med den stiplede linje. Korrelationer mellem fordampning og rækker (B) eller kolonner (C) med Pearson korrelationskoefficienten og p-værdien som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at fastslå protokollens gyldighed blev forbruget kvantificeret for 3-5 dage gamle Kanton-S B-fluer (n = 36/køn/plade og n = 24 fordampningskontroller/plade til tre plader) (Figur 7). Fordampningen blandt kontroltrøndene var signifikant forskellig fra nul (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; en prøve t-test vs nul). To prøver blev udeladt (begge mænd) fra datasættet, den ene på grund af døden under natten eksponering og den anden på grund af negativ forbrugsværdi efter justering for fordampning. Dette gav en > 99% prøvefastholdelse sats.
Figur 7: Forbrugskvantificering ved hjælp af MFA. (A) Forbruget blev visualiseret ved hjælp af et specialfremstillet glaskammer. Fluer blev observeret drikke fra perforerede brønde og udstillet blå abdominal farvning efter indtagelse af den farvede opløsning. Se også Supplerende video S.1. (B) Forbrugsværdier (middelværdi ± SEM) blandt fordampningskontroller, hanfluer og hunfluer. Parvis post hoc t-test med ulige varians blev udført for statistiske sammenligninger, med betydning angivet af søjler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efterfølgende blev en Analyse af Varians (ANOVA) model konstrueret som beskrevet af Y = μ + S + P + SxP + e, med Y som gruppen betyder, μ som det samlede middel, S som den faste effekt af køn, P som den faste effekt af plade, SxP som samspillet mellem Køn og Plade, og e som den resterende variabilitet. ANOVA viste ingen signifikant plade-til-plade variabilitet (p = 0,671) eller kønsspecifikke interaktioner med plader (p = 0,104) til forbrug, mens sex alene bidrog væsentligt til den observerede variation i forbruget (p = 4,17 x 10-18). En post hoc t-testviste, at mænd forbruges betydeligt mindre end kvinder (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17, to prøve t-test med ulige varians).
For at påvise, at analysen kan anvendes til to-valg præference kvantificering, fluer fik et valg mellem en 4% saccharose opløsning med 1% gær ekstrakt og en 4% saccharose opløsning suppleret med 15% ethanol og 1% gær ekstrakt. Både hanner og hunner viste overvældende præference for opløsningen med ethanol- og gærekstrakt med præferenceindekser på 0,974 ± 0,026 for mænd og 0,876 ± 0,06 for kvinder (gennemsnitlig ± SEM) (Figur 8).
Figur 8: Præference kvantificering ved hjælp af MFA. Forbrug af 4% saccharose versus 4% saccharose suppleret med 15% ethanol og gær ekstrakt for mandlige og kvindelige fluer (n = 33 for hvert køn). Hanfluer forbruges mere af ethanolopløsningen end kontrolsucroseopløsningen (0,511 μL ± 0,029 μL mod 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; to-prøve t-test). Hunfluer forbruges også mere ethanolopløsning end kontrolsucroseopløsningen (0,939 μL ± 0,044 μL mod 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; t -testmed to prøver). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video S.1: Videoen viser en flue fodring fra perforeret godt og akkumulere blå abdominal farvning, mens indtagelse af den farvede opløsning. Der vises et stillbillede i figur 7A. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende fil S.2: Microplate Feeder Assay Kobling. Dette er en 3D-printbar konstruktion af koblingen, der anvendes i MFA. Trykmateriale Nylon PA12 blev brugt til MFA. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S.3: Mikroplade feeder assay barriere strimmel. Dette indeholder designet af plastbarriere strimler bruges til at skifte eksponering af fluer til feeder plade. En enkelt kobling kan bruge op til tolv barriere strimler. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil S.4: Udpaknings- og fabrikationsinstruktioner til microplate feeder-analysen. Instruktioner er inkluderet til udpakning af koblingen og barrierestrimlerne. Fabrikationsinstruktioner er inkluderet for det indvendige låg, yderlåget og den sekundære beholder, der bruges til at begrænse fordampning under eksponering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Fil S.5:Omkostningssammenligning af Microplate Feeder Assay (MFA) og en 1-valg enkelt flyve CApillary FEeder (CAFE) assay. Test 72 fluer / sex for en enkelt linje ville kræve to sæt MFA udstyr (koblinger + plader + barriere strimler), mens CAFE ville kun brug for 1 kapillær for hver kultur hætteglas. På trods af den store forskel i de oprindelige investeringer for MFA, den store forskel i tilbagevendende omkostninger ($ 14,80 vs $ 46,08, henholdsvis) ville gøre det muligt for up-front omkostninger, der skal inddrives efter test kun 4 linjer (break-even punkt). Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Undersøgelsen beskriver en ny protokol til kvantificering af forbruget i Drosophila:Microplate Feeder Assay (MFA). I denne analyse forbruger fluer fra forseglede brønde af en mikroplade på 1536 brønde gennem perforeringer i kontrolleret størrelse (figur 1, figur 2; Supplerende video S.1). Da flydende fødevarer farves og leveres via mikroplade, kan målinger af fødevarens optiske absorbans opnås ved hjælp af et mikropladespektrofotometer (figur 3). På denne måde bestemmes forbruget ved at sammenligne absorbansen før og efter forbrug og derefter anvende denne andel på den kendte mængde, der udleveres før forbrug. Dette blev verificeret empirisk ved at måle absorbansen af forskellige mængder af det farvede medium (figur 3B).
For at udvikle denne analyse var der behov for en anordning, der kunne udnytte den absorberende kvantificering af forbruget. Test fluer i et mikropladeformat er tiltalende, fordi det supplerer den mikroplade, der bruges til at dispensere mad og giver mulighed for fleksibilitet i udvælgelsen fra flere pladeformater (f.eks. 6-, 12-, 48- eller 96-brøndformater) ved at justere koblingsgeometrien. Et 96-brønds mikropladeformat blev valgt for at give mulighed for individuel flyvekultur.
Den 3D-printede enhed (Figur 1) orienterer præcist 1536-brøndsfødepladen med 96-brøndskulturpladen, hvilket giver hver flue adgang til op til 4 brønde af fødepladen til forbrug. Desuden, at give tilstrækkelig tid til distribution af fluer i huset plade og til at kontrollere assay indledning, enheden omfatter tilsende barriere strimler, der indeholder fluerne i deres respektive brønde og forhindre brud. De filer, der er nødvendige for at fremskaffe eller ændre disse dele, leveres (Supplerende filer S.2-S.3) samt de nødvendige fabrikationsinstruktioner for de relevante stykker (Supplerende fil S.4).
MFA giver en simpel høj gennemløbsmetode, der supplerer mere udførlige metoder til at overvåge Drosophila fodringsadfærd18,21,22. MFA tilbyder flere fordele i forhold til andre metoder, der anvendes til at kvantificere fødeindtagelse. Gennemløbet øges ved at kvantificere forbruget ved hjælp af en pladelæser. Dette eliminerer manuelle målinger og undgår manuel dataindtastning. Data er også modtagelige for programmatisk udvinding og behandling. Derudover øger den højere gennemløb det mulige antal biologiske kopier, især sammenlignet med kommunale feederdesign, hvilket øger kraften til at opdage små forskelle i forbruget betydeligt. Ved hjælp af MFA kan en enkelt eksperimentator kvantificere forbruget eller præferencen for over 500 fluer pr. natten over af analysen. Ved overlappende kørsler af analysen, over 2.000 fluer kan testes i en 5-dages periode. Endelig er der langsigtede omkostningsbesparelser på grund af genanvendeligheden af mikroplader og koblinger (Supplerende fil S.5). Ved hjælp af MFA, den anslåede pris pr assay kan være så lavt som $14.80, med en $127.60 up-front omkostninger for udstyret. Ved hjælp af den klassiske CApillary FEeder (CAFE) assay, som kræver dyre præcision mikrokapillærer, den anslåede pris pr assay for et sammenligneligt antal replikper er $46.08. Selv om der på forhånd investeres i at erhverve det nødvendige udstyr, kan reduktionen af tilbagevendende omkostninger føre til betydelige besparelser, navnlig i tilfælde, hvor der udføres gentagne test.
Som med alle analyser har MFA visse begrænsninger. Det kræver først og fremmest adgang til et mikropladespektrofotometer, der kan læse 1536-brønde mikroplader. Derudover gør afhængigheden af absorbansmålinger til kvantificering metoden modtagelig for optisk interferens. Dette manifesterer sig som negative forbrugsværdier for en lille delmængde af testede prøver. Næringsstoffer, lægemidler, lægemidler, eller toksiner af interesse skal også være vandopløselige at være forenelige med analysen.
På trods af sine begrænsninger tilbyder denne metode en høj gennemløbsmetode til kvantificering af forbrugsadfærd i Drosophila. Desuden kunne koblingsanordningen let ændres for at acceptere mange pladeformater, så den kan rumme en række insektarter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) til TFCM og RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L.
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
- Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480 (2020).
- Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
- Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
- Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
- Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834 (2019).
- Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87 (2015).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776 (2020).
- Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
