Summary
माइक्रोप्लेट फीडर परख ड्रोसोफिलामें तरल खाद्य खपत की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक किफायती, उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करता है। एक 3डी-मुद्रित डिवाइस 96-वेल माइक्रोप्लेट को जोड़ता है जिसमें मक्खियों को 1536-वेल माइक्रोप्लेट से घर में ले जाया जाता है जिसमें से मक्खियां ट्रेसर डाई के साथ एक भोजन समाधान का उपभोग करती हैं। समाधान की मात्रा में गिरावट स्पेक्ट्रोफोटोमेटिक रूप से मापी जाती है।
Abstract
ड्रोसोफिला में भोजन के सेवन की मात्रा खपत से जुड़े लक्षणों, उनके पर्यावरणीय कारकों और कई पदार्थों के विषाक्त और औषधीय प्रभावों के आनुवंशिक और शारीरिक आधार का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती है। वर्तमान में लागू किए गए कुछ तरीके उच्च थ्रूपुट माप के लिए उत्तरदायी हैं। माइक्रोप्लेट फीडर परख (एमएफए) को अवशोषण का उपयोग करके व्यक्तिगत मक्खियों के लिए तरल भोजन की खपत की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया था। इस परख में, मक्खियों एक 1536-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के चुनिंदा कुओं से तरल खाद्य माध्यम का उपभोग करते हैं। तरल खाद्य माध्यम में एक पतला ट्रेसर डाई को शामिल करके और प्रत्येक अच्छी तरह से एक ज्ञात मात्रा लोड करके, खपत से पहले और बाद में अच्छी तरह से प्राप्त की गई अवशोषित माप मात्रा में परिणामी परिवर्तन को प्रतिबिंबित करता है (यानी, मात्रा का सेवन)। इस विधि के साथ उच्च थ्रूपुट विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, एक 3 डी-मुद्रित कपलर डिजाइन किया गया था जो मक्खियों को व्यक्तिगत रूप से 96-वेल माइक्रोप्लेट में हल करने की अनुमति देता है। यह डिवाइस खपत के लिए 4 कुओं तक प्रत्येक फ्लाई एक्सेस देने के लिए 96-और 1536-वेल माइक्रोप्लेट को ठीक से उन्मुख करता है, इस प्रकार नियमित खपत के अलावा खाद्य वरीयता मात्राकरण को सक्षम करता है। इसके अलावा, डिवाइस में बाधा स्ट्रिप्स हैं जो खुले और बंद पदों के बीच टॉगल करते हैं ताकि नियंत्रित रोकथाम और एक समय में नमूनों के कॉलम को जारी करने की अनुमति दी जा सके। यह विधि एक साथ कई मक्खियों द्वारा जलीय समाधानों की खपत के उच्च थ्रूपुट माप को सक्षम बनाती है। इसमें अन्य कीड़ों के अनुकूल होने और पोषक तत्वों, विषाक्त पदार्थों या फार्मास्यूटिकल्स की खपत को स्क्रीन करने की क्षमता भी है।
Introduction
ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर ने भोजन के सेवन और उपभोग से जुड़े लक्षणों के जैविक आधार का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक मॉडल जीव के रूप में व्यापक उपयोग देखाहै 1. यह अनुमान लगाया गया है कि मानव रोग पैदा करने वाले जीन के 65% मक्खियों में कार्यात्मक समरूप होते हैं, जिनमें मक्खियों और मनुष्यों के बीच कार्यात्मक रूप से समकक्ष ऊतकों में व्यक्त किए जा रहे लोगों का एक महत्वपूर्ण अनुपातहोताहै। इसके अलावा, डी मेलनोगेस्टर का आकार, लघु अंतरपीढ़ीगत समय, सरल रखरखाव और आनुवंशिक अनुरेखाएं इसे पोषक तत्वों की खपत पर अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाती हैं3,4 और कीटनाशकों सहित विभिन्न पदार्थों के विषविज्ञानी और औषधीय प्रभाव, कीटनाशक5,प्रदूषक6,फार्मास्यूटिकल्स7,और दुर्व्यवहार की दवाएं8,9,10।
कई मामलों में, ऐसे लक्षणों के अध्ययन के लिए खपत के सटीक मात्राकरण की आवश्यकता होती है। खपत की मात्रा निर्धारित करने के तरीके विविध हैं और इसमें सीपिलरी फ्यूडर (कैफे) परख11,मनुअल फेडिंग (एमएएफई) परख12,प्रोबोसिस एक्सटेंशन रिस्पांस (प्रति) परख13,ट्रेसर डाई एक्सट्रेक्शन14,15,ओलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्रेसर एक्सट्रेक्शन16,और रेडियो-आइसोटोप निष्कर्षण5,17शामिल हैं। हाल के प्रयासों ने इन परखों के थ्रूपुट को बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित किया है, जैसा कि एक्सप्रेसो परख18 या प्लेट आधारित पूरे पशु खिला FLat (WAFFL) प्रणाली19में । उनकी उपयोगिता के बावजूद, ये परख जटिल, महंगे या श्रम-प्रधान हो सकते हैं, जो उच्च थ्रूपुट अध्ययनों में उनके उपयोग में बाधा डालते हैं।
चित्रा 1:माइक्रोप्लेट फीडर परख के घटक। (A)3D असेंबल माइक्रोप्लेट फीडर परख का प्रतिपादन। 1536-वेल माइक्रोप्लेट 3डी-मुद्रित कपलर द्वारा उन्मुख है ताकि निचले 96-वेल माइक्रोप्लेट के प्रत्येक कुएं में ऊपरी 1536-वेल माइक्रोप्लेट के चार कुओं तक पहुंच हो। कुओं तक पहुंच को कपलर के माध्यम से स्लॉट किए गए बैरियर स्ट्रिप्स की स्थिति को समायोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है। (ख)माइक्रोप्लेट फीडर परख के प्रत्येक कुएं का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व । खपत समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से एक सीलिंग फिल्म है कि मक्खी द्वारा उपयोग की अनुमति के लिए छिद्रित किया गया है का उपयोग कर बनाए रखा जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:माइक्रोप्लेट फीडर परख में प्रक्रियाओं का अवलोकन। यह आंकड़ा एक प्रवाह आरेख दिखाता है जो प्रोटोकॉल के चरण 4.1-5.8 से मेल खाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इन बाधाओं को दूर करने के लिए, माइक्रोप्लेट फीडर परख (एमएफए; चित्रा 1) विकसित किया गया था। इस परख में, मक्खियों को 96-वेल माइक्रोप्लेट में व्यक्तिगत रूप से रखे जाते हैं। प्रत्येक माइक्रोप्लेट एक कस्टम, 3 डी मुद्रित डिवाइस का उपयोग कर एक १५३६ अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के लिए युग्मित है । डिवाइस ठीक दो प्लेटों को इस तरह से उन्मुख करता है कि प्रत्येक फ्लाई ९६-वेल प्लेट के अपने संबंधित कुएं में १५३६-वेल माइक्रोप्लेट के 4 कुओं तक पहुंच है । एक अथाह 1536-अच्छी तरह से प्लेट और सीलिंग फिल्मों का उपयोग करके, समाधान का चयन कुओं में तिरस्कृत कर रहे हैं और मक्खियों तक पहुंच प्रदान करने के लिए सटीक 0.25 मिमी व्यास सुइयों के साथ छिद्रित। गंभीर रूप से, माइक्रोप्लेट से सीधे खपत की अनुमति देने से माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके तत्काल अवशोषण-आधारित माप की अनुमति देता है। एक पतला ट्रेसर डाई खपत माध्यम में शामिल किया जाता है, और जोखिम के बाद अवशोषण में परिवर्तन का उपयोग खपत की मात्रा(चित्रा 2 और चित्रा 3)निर्धारित करने के लिए किया जाता है। चूंकि प्रत्येक में तरल तरल पदार्थ के एक स्तंभ का अनुमान है, इसलिए वॉल्यूमेट्रिक अंतर कॉलम की ऊंचाई में अंतर के रूप में प्रकट होगा। (चित्रा 3A) बीयर-लैम्बर्ट कानून20के अनुसार:
जहां एक अवशोषण है, ε तनु विश्लेषण के लिए मोलर अवशोषण गुणांक है, एल ऑप्टिकल पथ लंबाई है, और सी तनु विश्लेषण की एकाग्रता है । इस प्रकार, लगातार मोलर अवशोषण गुणांक और एकाग्रता के साथ, अवशोषण में परिवर्तन पूरी तरह से ऑप्टिकल प्रकाश पथ में परिवर्तन के कारण होते हैं, यानी, किसी दिए गए कुएं के भीतर तरल पदार्थ का स्तर। एक्सपोजर से पहले और बाद में अवशोषण को मापने से, अवशोषण में आनुपातिक परिवर्तन मात्रा(चित्रा 3B)में आनुपातिक परिवर्तन को दर्शाता है।
चित्र 3:अच्छी मात्रा का अवशोषण आधारित मात्रा। (A)ज्ञात इनपुट तीव्रता का घटना प्रकाश(मैं0)प्रत्येक अच्छी तरह से पार करता है। विभिन्न भरने की मात्रा में प्रकाश का क्षीणन विभिन्न उत्पादन तीव्रता(I)पैदा करता है, जो मात्रा और अवशोषण के बीच एक रैखिक संबंध का प्रदर्शन करता है। (ख)अवशोषण बनाम मात्रा का अनुभवजन्य माप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
मात्रा में परिवर्तन के आधार पर, किसी भी निगलने वाले यौगिक की मात्रा की गणना फीडिंग समाधान में उसकी ज्ञात एकाग्रता से की जा सकती है। परख के लिए आवश्यक भागों लागत में कम कर रहे है और पुनः प्रयोज्य की एक उच्च डिग्री है, काफी परख की आवर्ती लागत को कम करने । इस प्रकार, यह प्रक्रिया खपत को ठीक से निर्धारित करने की एक सस्ती, उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करती है।
Protocol
1. भुखमरी प्लेट की तैयारी
- 250 एमएल ग्लास बीकर में 1.5 ग्राम एग्रास का वजन करें।
- बीकर में आसुत एच2ओ का 100 एमएल डालें।
- माइक्रोवेव रुक-रुककर जब तक कि एगर उठे पूरी तरह से पिघला हुआ न हो जाए।
नोट: बीकर का निरीक्षण करें क्योंकि एगर उठे पर उबलने की संभावना है। - पिघला हुआ agarose डालो एक अभिकर्मक गर्त में उठी और पिघला हुआ ag के ८० μL बांटना एक ९६ के प्रत्येक कुएं में अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर । कमरे के तापमान पर कवर करते समय प्लेटों को इलाज करने की अनुमति दें। एक सीलबंद बैग में एक सप्ताह तक के लिए बचे हुए एगरेजर को ठंडा करें और अतिरिक्त प्लेटें बनाने के लिए इसे फिर से पिघलाएं।
2. मक्खी छंटाई और भुखमरी
- बैरियर स्ट्रिप चैनलों में बैरियर स्ट्रिप डालकर कपलर तैयार करें। यदि बाधा स्ट्रिप्स बहुत ढीली हैं, तो उन्हें चैनलों में पकड़ने के लिए वक्रता देने के लिए उंगली के चारों ओर कुंडल करें।
- एक भुखमरी की थाली के लिए कपलर प्रत्यय। कपलर का उपयोग प्लेट में हेरफेर करने के लिए न करें क्योंकि कपलर फिसल सकता है। सुनिश्चित करें कि कपलर्स सही ढंग से उन्मुख हैं (यानी, यह सुनिश्चित करें कि कपलर का कोण वाला कोना माइक्रोप्लेट के कोण वाले कोने से मेल खाता है)।
- सीओ2 संज्ञाहरण(सामग्री की तालिका) केतहत, 3-5 दिन पुरानी मक्खियों को सॉर्ट करें। भुखमरी प्लेट में कॉलम द्वारा व्यक्तिगत मक्खियों को लोड करें।
नोट: हालांकि मक्खियों को कॉलम द्वारा लोड किया जाता है, लेकिन नीचे कॉलम के बजाय प्लेट की पंक्तियों के नीचे नमूनों के समूहों को वितरित करने की सिफारिश की जाती है (प्लेट लेआउट उदाहरण के लिए चित्र 4 देखें)। - प्रत्येक कॉलम को बंद करें क्योंकि यह अपनी बाधा पट्टी को बंद स्थिति में समायोजित करके भरता है।
चित्रा 4:प्रतिनिधि भुखमरी प्लेट लेआउट। आरेख वाष्पीकरण नियंत्रण के संगठन से पता चलता है और पुरुष और महिला इस अध्ययन में इस्तेमाल एक ९६ अच्छी तरह से थाली में मक्खियों । पंक्तियों ए और एच में वाष्पीकरण नियंत्रण वाले पुरुषों और महिलाओं की बारी-बारी पंक्तियों सहित वैकल्पिक विन्यास का भी उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
- सावधानी से माइक्रोप्लेट के भीतर नमूना लेआउट रिकॉर्ड करें। एक बार भुखमरी की प्लेट भर जाने के बाद, मक्खियों को सीओ2 को हटाने के बाद अनायास ठीक होने की अनुमति दें और उन्हें अपने प्रारंभिक एनेस्थेटाइजेशन समय से शुरू करने वाले 6 घंटे के लिए भूखा रखें।
3. तरल भोजन की तैयारी
नोट: तरल भोजन को हर दिन ताजा बनाएं।
- डिस्टिल्ड एच2ओ में एफडीएंडसी ब्लू #1 का डाई स्टॉक सॉल्यूशन 10 मिलीग्राम/एमएल तैयार करें।
नोट: यह 6 महीने तक के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है । - तरल भोजन के 10 मिलीएल (4% सुक्रोज, 1% खमीर निकालने, एफडी एंड सी ब्लू #1 के 40 μg/mL) को 15 एमएल शंकु नली में 0.4 ग्राम सुक्रोज और 0.1 ग्राम खमीर निकालने में 10 मिलियन डिस्टल एच2ओ वोर्टेक्स ट्यूब को पूरी तरह से भंग करने तक तैयार करें। डाई स्टॉक समाधान के 40 μL जोड़ें और समाधान को समरूप बनाने के लिए ट्यूब को बार-बार उलटा करें।
- तरल भोजन को 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ इत्तला दी गई 10 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें। एक समय में समाधान के ~ 1.5 एमएल को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें। समाधान युक्त सिरिंज को अलग रखें और फीडर प्लेट तैयार करने के दौरान आवश्यकतानुसार अतिरिक्त समाधान को फ़िल्टर करें।
4. फीडर प्लेट तैयार
नोट: अच्छी तरह से बुलबुले या बूंदों के गठन को रोकने के लिए भरने के बाद फीडर प्लेटों को धीरे से संभालें जो अवशोषण रीडिंग को प्रभावित कर सकता है।
- सीलिंग फिल्म के साथ 1536-वेल माइक्रोप्लेट के नीचे सील करके एक फीडर प्लेट तैयार करें। फिल्म का अच्छी तरह पालन करने के लिए सीलिंग पैडल का इस्तेमाल करें। एक रेजर ब्लेड के साथ बाएं और दाएं किनारों से अतिरिक्त फिल्म ट्रिम करें।
- 1536-वेल माइक्रोप्लेट के उपयुक्त कुओं में फ़िल्टर किए गए तरल भोजन कॉलम-वार (चित्रण के लिए चित्र 5 देखें) के 10 माइक्रोल को वितरित करें। चार कुओं के प्रत्येक क्लस्टर के लिए ऊपरी-बाएं हाथ में अच्छी तरह से बांटना (चित्रण के लिए चित्रा 5 देखें)।
चित्रा 5:1536-वेल फीडर प्लेट के लिए ऑर्डर और अच्छी तरह से स्थान भरें। आरेख प्रोटोकॉल के चरण 4.2 दिखाता है। तीर उस क्रम को दिखाते हैं जिसमें फीडर प्लेट एक कॉलम में कॉलम 1 से 12 तक एक समय में फीडिंग समाधान पेश किया जाता है। नमूना B1 को 1-पसंद और 2-पसंद परख के लिए फीडिंग समाधानों के स्थान का एक उदाहरण दिखाने के लिए बढ़ाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
- एक बार सभी कुएं भर जाने के बाद थाली के ऊपर सीलिंग फिल्म लगाएं। फिल्म का अच्छी तरह पालन करने के लिए सीलिंग पैडल का इस्तेमाल करें। एक रेजर ब्लेड के साथ बाएं और दाएं किनारों से अतिरिक्त फिल्म ट्रिम करें। प्लेटों की वांछित संख्या के लिए दोहराएं।
- तरल पदार्थ को व्यवस्थित करने के लिए 10 एस के लिए 200 x ग्राम पर प्लेटों को सेंट्रलाइज करें। प्लेट को ठंडा होने की अनुमति न दें क्योंकि इससे कुओं में संघनन का निर्माण हो सकता है, अवशोषण रीडिंग अस्पष्ट हो सकती है।
5. एक्सपोजर
- एक बार जब मक्खियों की खपत परख के लिए तैयार हो जाते हैं, तो प्लेट की शीर्ष सतह पर कुओं को 0.25 मिमी व्यास सुई से लैस सुई जांच उपकरण के साथ छिद्रित करें। समाधानों को वितरित करते समय उपयोग किए जाने वाले छिद्रित करने के लिए उसी क्रम का उपयोग करें। प्लेट को पलटें और नीचे के कुओं को छिद्रित करें। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए समाधानों के बीच सुई को मिटा दें। सावधान रहें कि छिद्रों को न छुएं क्योंकि यह कुओं से समाधान को बात करता है।
- बिना ढक्कन के 630 एनएम पर थाली का अवशोषण पढ़ें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए शीर्ष सीलिंग फिल्म पर एक आंतरिक ढक्कन रखें कि संघनन के छल्ले छिद्रित कुओं को घेरते हैं। प्लेट पर बाहरी ढक्कन रखें।
- फीडर प्लेट को कपलर पर फेस-अप रखें ताकि गाइड फीडर प्लेट और भुखमरी प्लेट के उपयुक्त छेद को संरेखित करें। सुनिश्चित करें कि कपलर और प्लेटें सही ढंग से उन्मुख हैं (यानी, कपलर के कोण वाले कोने को सुनिश्चित करें और प्लेटें मेल खाती हैं)। कपलर को एक साथ पकड़ने के लिए ऊपर और नीचे प्लेटों के चारों ओर लोचदार बैंड लपेटें। फीडर प्लेट और कपलर के बीच संरेखण और अंतराल की जांच करें।
- एक बार जब सभी फीडर प्लेटें कपलर्स पर लोड हो जाती हैं, तो कपलर पर बैरियर स्ट्रिप्स को समायोजित करके प्लेटों के लिए कुओं को खोलें। कपलर/प्लेट असेंबलिंग को सेकेंडरी कंटेनर में रखें। प्रत्येक माध्यमिक कंटेनर छह विधानसभाओं तक समायोजित कर सकते हैं ।
- आर्द्रता प्रदान करने के लिए प्रत्येक माध्यमिक कंटेनर में भिगोए हुए पेपर तौलिए वाले पिपेट बॉक्स के निचले आधे हिस्से को रखें। माध्यमिक कंटेनरों के ढक्कन को बंद करें और उन्हें नियंत्रित वातावरण (25 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता नियंत्रित, 12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र) में स्थानांतरित करें। मक्खियों को 22 घंटे तक उपभोग करने की अनुमति दें।
- 22 घंटे के एक्सपोजर के बाद, मृत मक्खियों के लिए प्रत्येक प्लेट की जांच करें और तदनुसार प्लेट लेआउट को अपडेट करें। सभी प्लेटों की जांच के बाद, माध्यमिक कंटेनर के अंदर सीओ2 पंप करके मक्खियों को सामूहिक रूप से एनेस्थेटाइज करें। ~ 60 एस के बाद, सुनिश्चित करें कि सभी मक्खियों को स्थिर किया गया है। धीरे-धीरे मक्खियों को भुखमरी की प्लेट में कूटना और प्लास्टिक बाधा स्ट्रिप्स को बदलें। पढ़ने के लिए फीडर प्लेटें हटा दें।
- 630 एनएम पर प्लेट के अवशोषण को फिर से पढ़ें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी प्लेटें न पढ़ी जा न दें।
6. डेटा विश्लेषण
नोट: विश्लेषण अन्वेषक के पसंदीदा सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ किया जा सकता है।
- 22 घंटे के संपर्क में आने के दौरान मरने वाली किसी भी मक्खियों को छोड़ दें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से, खपत की मात्रा की गणना करें:
C - वॉल्यूम खपत (μL)
V - प्रारंभिक अच्छी तरह से मात्रा (यानी, 10 μL)
एबीएस0 - प्री-एक्सपोजर अवशोषण
एबीएस1 - पोस्ट-एक्सपोजर अवशोषण
नोट: खपत गणना में एक सकारात्मक मात्रा के रूप में चिह्नित है । - वाष्पीकरण के लिए खाते में, संबंधित प्लेटों के भीतर फ्लाई खपत मूल्यों से मतलब वाष्पीकरण की मात्रा घटाना। 2-पसंद/वरीयता परीक्षण के लिए, अपने संबंधित समाधान द्वारा हर अच्छी तरह से समायोजित करें,उदाहरणके लिए, वाष्पीकरण नियंत्रण में "पसंद 1" द्वारा "पसंद 1" कुओं को समायोजित करें।
- वाष्पीकरण के लिए समायोजित करने के बाद, शून्य से कम खपत मूल्य वाले किसी भी नमूने को छोड़ दें।
- 2-पसंद परीक्षण के लिए, प्रत्येक के लिए वरीयता की गणना करें:
पी - वरीयता सूचकांक (सकारात्मक दिशा वरीयता इंगित करता है)
एफए - तरल खाद्य खपत युक्त योजक की मात्रा (विकल्प 2)
एफएन - सामान्य तरल भोजन की मात्रा खपत (विकल्प 1)
7. माइक्रोप्लेट और कपलर वाशिंग प्रोटोकॉल।
नोट: माइक्रोप्लेट के नीचे से नुकसान को रोकने के लिए ध्यान रखें, क्योंकि नुकसान सीलिंग को प्रभावित कर सकता है।
- 1536-वेल माइक्रोप्लेट्स से फिल्मों और लेबल को हटा दें। कपलर और बैरियर स्ट्रिप्स को अलग करें। बैरियर स्ट्रिप्स को सीलबंद कंटेनर में रखें, जैसे बोतल। गर्म नल के पानी, हल्के डिटर्जेंट समाधान, गर्म नल के पानी की एक श्रृंखला में तेजी से मिलाते हुए बाधा स्ट्रिप्स धोएं, और फिर आसुत एच2ओ।
- गर्म नल के पानी के नीचे 1536-वेल माइक्रोप्लेट और कपलर कुल्ला। माइक्रोप्लेट के लिए, प्रत्येक माइक्रोप्लेट के कुओं के माध्यम से नल का पानी चलाएं ताकि जितना संभव हो उतना समाधान और मलबे को साफ किया जा सके। यदि आवश्यक हो, तो मलबे को उखाड़ फेंकने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें; प्लेटों पर धातु या कांच के बर्तनों का प्रयोग न करें।
- प्रत्येक प्लेट और कपलर को हल्के डिटर्जेंट समाधान (जैसे, 1% v/v Aquet) के साथ कवर करें। प्लेटों के लिए, एक दस्ताने हाथ से सतहों को साफ़ करें। कपलर्स के लिए ब्रश का इस्तेमाल करें।
- नल के पानी के साथ प्रत्येक प्लेट को अच्छी तरह से कुल्ला, और फिर आसुत एच2O के साथ सुनिश्चित करें कि कुओं को विशेष रूप से पानी के प्रवाह के नीचे धोया जाता है।
- प्लेटों और कपलर्स को कमरे के तापमान पर कवर की गई हवा को सूखने दें। उपयोग होने तक एक साफ भंडारण बिन में स्टोर करें।
नोट: दस्ताने के बिना १५३६-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट कभी नहीं संभाल । त्वचा से अवशिष्ट तेल सीलिंग में बाधा डाल सकते हैं, जिससे अच्छी तरह से रिसाव और वाष्पीकरण हो सकता है।
Representative Results
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या व्यक्तिगत प्लेटों के कुओं के बीच कोई सहसंबंध मौजूद है, वाष्पीकरण को हर कुएं के लिए निर्धारित किया गया था (एन = 96 कुएं/प्लेट तीन प्लेटों के लिए)। वाष्पीकरण -0.036 μL ± 0.003 μL (मतलब ± SEM भर में पाया गया था) । (चित्रा 6A) पियर्सन सहसंबंधों की गणना वाष्पीकरण और अच्छी तरह से स्थानों के बीच प्रवृत्तियों का मूल्यांकन करने के लिए की गई थी। वाष्पीकरण बनाम पंक्तियों के लिए सहसंबंध गुणांक(चित्रा 6B,सी)था -0.04 (पी = 0.4949) और वाष्पीकरण बनाम कॉलम के लिए -0.23 (पी = 0.0001)। बाद में कॉलम में हल्के लेकिन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण सहसंबंधों को कम करने के लिए समूहों को कॉलम के बीच वितरित किया गया।
चित्र 6:एमएफए में वाष्पीकरण। (ए)वाष्पीकरण का घनत्व वितरण धराशायी रेखा द्वारा दर्शाए गए ± एसडी के साथ वाष्पीकरण परिवर्तन । वाष्पीकरण और पंक्तियों(बी)या कॉलम(सी)के बीच सहसंबंध पियर्सन सहसंबंध गुणांक और पी-वैल्यू के साथ संकेत के रूप में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
प्रोटोकॉल की वैधता स्थापित करने के लिए, खपत 3-5 दिन पुराने कैंटन-एस बी मक्खियों (एन = 36/सेक्स/प्लेट और एन = 24 वाष्पीकरण नियंत्रण/तीन प्लेटों के लिए प्लेट)(चित्रा 7)के लिए निर्धारित किया गया था । नियंत्रण कुओं के बीच वाष्पीकरण शून्य (-0.030 माइक्रोन ± 0.006 माइक्रोल, पी = 4.81 x 10-6;एक नमूना टी-टेस्टबनाम शून्य) से काफी अलग था। दो नमूनों को डेटासेट से (दोनों पुरुष) छोड़ दिया गया, एक रात भर एक्सपोजर के दौरान मौत के कारण और दूसरा वाष्पीकरण के लिए समायोजन के बाद नकारात्मक खपत मूल्य के कारण । इससे 99 फीसद सैंपल रिटेंशन रेट > मिले।
चित्र 7:एमएफए का उपयोग करके उपभोग मात्राकरण। (ए)उपभोग को कस्टम मनगढ़ंत ग्लास कक्ष का उपयोग करके कल्पना की गई थी। मक्खियों को छिद्रित कुओं से पीते हुए देखा गया और रंगे समाधान के घूस के बाद नीले पेट के धुंधला का प्रदर्शन किया गया। वाष्पीकरण नियंत्रण, नर मक्खियों और मादा मक्खियों के बीच अनुपूरक वीडियो एस 1. (बी)उपभोग मान (मतलब ± एसईएम) भी देखें। असमान विचरण के साथ जोड़ीवार पोस्ट हॉक टी-टेस्टसांख्यिकीय तुलनाओं के लिए किया गया था, जिसमें सलाखों द्वारा इंगित महत्व था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इसके बाद, विचरण (ANOVA) मॉडल का विश्लेषण वाई = μ + एस + पी + SxP + ई द्वारा वर्णित किया गया था, वाई के साथ समूह का मतलब है, समग्र मतलब के रूप में μ, एस सेक्स के निश्चित प्रभाव के रूप में, प्लेट के निश्चित प्रभाव के रूप में पी, सेक्स और प्लेट के बीच बातचीत के रूप में SxP, और ई के रूप में अवशिष्ट परिवर्तनशीलता । ANOVA कोई महत्वपूर्ण प्लेट से प्लेट परिवर्तनशीलता (पी = 0.671) या खपत के लिए प्लेटों (पी = 0.104) के साथ सेक्स विशिष्ट बातचीत दिखाया, जबकि अकेले सेक्स काफी खपत में मनाया भिन्नता के लिए योगदान (पी = 4.17 x10-18). एक पोस्ट हॉक टी-टेस्टसे पता चला है कि पुरुषों ने महिलाओं की तुलना में काफी कम खपत की (0.500 माइक्रोन ± 0.017 माइक्रोएल बनाम 0.811 माइक्रोन ± 0.028 माइक्रोन, पी = 1.13 x 10-17,दो नमूना टी-अकृषण के साथ परीक्षण)।
यह प्रदर्शित करने के लिए कि परख का उपयोग दो-पसंद वरीयता मात्राकरण के लिए किया जा सकता है, मक्खियों को 1% खमीर निकालने और 15% इथेनॉल और 1% खमीर निकालने के साथ पूरक 4% सुक्रोज समाधान के साथ 4% सुक्रोज समाधान के बीच एक विकल्प दिया गया था। पुरुषों और महिलाओं दोनों ने पुरुषों के लिए 0.974 ± 0.026 के वरीयता सूचकांकों के साथ इथेनॉल और खमीर निकालने के साथ समाधान के लिए भारी वरीयता दिखाई और महिलाओं के लिए 0.876 ± 0.06 (औसत ± एसईएम)(चित्रा 8)।
चित्र 8:एमएफए का उपयोग करके वरीयता मात्राकरण। 4% सुक्रोज बनाम 4% सुक्रोज की खपत पुरुष और महिला मक्खियों के लिए 15% इथेनॉल और खमीर निकालने के साथ पूरक (एन = प्रत्येक लिंग के लिए 33)। नर मक्खियों ने नियंत्रण सुक्रोज समाधान (0.511 माइक्रोन ± 0.029 माइक्रोएल बनाम 0.00 माइक्रोल ± 0.017 माइक्रोएल; पी = 4.06e-10;दो-नमूना टी-परीक्षण) की तुलना मेंइथेनॉल समाधान का अधिक सेवन किया। महिला मक्खियों ने नियंत्रण सुक्रोज समाधान (0.939 माइक्रोन ± 0.044 माइक्रोएल बनाम 0.132 माइक्रोएल ± 0.044 माइक्रोएल; पी = 7.38e-17;दो-नमूना टी-टेस्ट) की तुलना मेंअधिक इथेनॉल समाधान का भी सेवन किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक वीडियो एस 1: वीडियो छिद्रित अच्छी तरह से एक मक्खी खिला और रंगे समाधान निगलना जबकि नीले पेट धुंधला जमते से पता चलता है । चित्रा 7Aमें एक स्टिल इमेज दिखाई गई है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फाइल एस 2: माइक्रोप्लेट फीडर परख कपलर। यह एमएफए में उपयोग किए जाने वाले कपलर का 3डी-प्रिंटेबल निर्माण है। एमएफए के लिए प्रिंटिंग मटेरियल नायलॉन पीए12 का इस्तेमाल किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाइल एस 3: माइक्रोप्लेट फीडर परख बैरियर पट्टी। इसमें फीडर प्लेट में मक्खियों के जोखिम को टॉगल करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्लास्टिक बाधा स्ट्रिप्स का डिजाइन शामिल है। एक एकल कपलर बारह बैरियर स्ट्रिप्स तक का उपयोग कर सकता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाइल एस 4: माइक्रोप्लेट फीडर परख के लिए अनपैकिंग और निर्माण निर्देश। दोवर और बैरियर स्ट्रिप्स को अनपैक करने के लिए निर्देश शामिल किए गए हैं। निर्माण निर्देश आंतरिक ढक्कन, बाहरी ढक्कन, और माध्यमिक कंटेनर के लिए शामिल हैं जो एक्सपोजर के दौरान वाष्पीकरण को सीमित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाइल एस 5:माइक्रोप्लेट फीडर परख (एमएफए) और एक 1-विकल्प एकल फ्लाई सीफिलरी फ्यूईडर (कैफे) परख की लागत तुलना। एक ही पंक्ति के लिए ७२ मक्खियों/सेक्स का परीक्षण एमएफए उपकरण (कपलर्स + प्लेटें + बैरियर स्ट्रिप्स) के दो सेट की आवश्यकता होगी, जबकि कैफे को प्रत्येक संस्कृति शीशी के लिए केवल 1 केशिका की आवश्यकता होगी । एमएफए के लिए प्रारंभिक निवेश में बड़े अंतर के बावजूद, आवर्ती लागत ($ 14.80 बनाम $ 46.08, क्रमशः) में बड़ा अंतर केवल 4 लाइनों (ब्रेक-इडब्ल्यूई पॉइंट) के परीक्षण के बाद अप-फ्रंट लागतों को ठीक करने की अनुमति देगा। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
अध्ययन ड्रोसोफिलामें खपत की मात्रा के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: माइक्रोप्लेट फीडर परख (एमएफए)। इस परख में, मक्खियां नियंत्रित आकार के छिद्रों के माध्यम से 1536-कुएं माइक्रोप्लेट के सीलबंद कुओं से उपभोग करती हैं(चित्र 1, चित्रा 2; अनुपूरक वीडियो एस 1)। चूंकि तरल भोजन को माइक्रोप्लेट के माध्यम से रंगा और प्रदान किया जाता है, इसलिए भोजन के ऑप्टिकल अवशोषण के माप माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर(चित्रा 3)का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं। इस तरीके से, खपत से पहले और बाद में अवशोषण की तुलना करके निर्धारित किया जाता है, और फिर खपत से पहले तिरस्कृत ज्ञात मात्रा के लिए इस अनुपात को लागू करता है। यह रंगे माध्यम(चित्रा 3B)के विभिन्न संस्करणों के अवशोषण को मापने के द्वारा अनुभवजन्य रूप से सत्यापित किया गया था ।
इस परख को विकसित करने के लिए, एक उपकरण की जरूरत थी जो खपत के अवशोषण-आधारित मात्राकरण का लाभ उठा सके। माइक्रोप्लेट प्रारूप में मक्खियों का परीक्षण आकर्षक है क्योंकि यह भोजन को वितरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोप्लेट का पूरक है और कपलर ज्यामिति को समायोजित करके कई प्लेट प्रारूपों (जैसे, 6-, 12-, 48-, या 96-अच्छी तरह से प्रारूपों) से चयन करने में लचीलेपन की अनुमति देता है। व्यक्तिगत फ्लाई कल्चर के लिए अनुमति देने के लिए 96-वेल माइक्रोप्लेट प्रारूप चुना गया था।
3 डी मुद्रित डिवाइस(चित्रा 1)ठीक 96-अच्छी संस्कृति प्लेट के साथ 1536-अच्छी तरह से फीडर प्लेट को उन्मुख करता है, जिससे प्रत्येक फ्लाई को खपत के लिए फीडर प्लेट के 4 कुओं तक पहुंच मिलती है। इसके अलावा, आवास प्लेट में मक्खियों के वितरण के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने और परख दीक्षा को नियंत्रित करने के लिए, डिवाइस में अपने संबंधित कुओं में मक्खियों से युक्त बाधा स्ट्रिप्स और उल्लंघनों को रोकने के लिए शामिल हैं। इन भागों की खरीद या संशोधन के लिए आवश्यक फाइलें(अनुपूरक फाइलें एस 2-एस 3)प्रदान की जाती हैं, साथ ही संबंधित टुकड़ों(अनुपूरक फाइल एस 4)के लिए आवश्यक निर्माण निर्देश भी प्रदान किए जाते हैं।
एमएफए एक साधारण उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करता है जो ड्रोसोफिला फीडिंग व्यवहार की निगरानी के लिए अधिक विस्तृत तरीकों का पूरक है18,21,22. एमएफए भोजन के सेवन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है। थ्रूपुट प्लेट रीडर का उपयोग करके खपत की मात्रा निर्धारित करके बढ़ाया जाता है। यह मैनुअल माप को समाप्त करता है और मैनुअल डेटा प्रविष्टि को समाप्त करता है। डेटा प्रोग्रामेटिक निष्कर्षण और प्रसंस्करण के लिए भी उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, उच्च थ्रूपुट जैविक प्रतिकृति की व्यवहार्य संख्या को बढ़ाता है, विशेष रूप से सांप्रदायिक फीडर डिजाइनों की तुलना में, जो खपत में छोटे मतभेदों का पता लगाने की शक्ति को काफी बढ़ाता है। एमएफए का उपयोग करके, एक भी प्रयोगकर्ता परख के प्रति रात भर 500 से अधिक मक्खियों की खपत या वरीयता की मात्रा निर्धारित कर सकता है। परख के ओवरलैपिंग रन से, 5 दिन की अवधि में 2,000 से अधिक मक्खियों का परीक्षण किया जा सकता है। अंत में, माइक्रोप्लेट और कपलर(अनुपूरक फाइल एस 5)की पुन: प्रयोज्यता के कारण दीर्घकालिक लागत बचत होती है। एमएफए का उपयोग करना, प्रति परख अनुमानित लागत $ 14.80 के रूप में कम हो सकती है, उपकरणों के लिए $ 127.60 अप-फ्रंट लागत के साथ। क्लासिक CApillary FEeder (कैफे) परख है, जो महंगा सटीक microcapillaries की आवश्यकता का उपयोग करना, प्रतिकृति की एक तुलनीय संख्या के लिए परख प्रति अनुमानित लागत $४६.०८ है । इस प्रकार, जबकि आवश्यक उपकरण प्राप्त करने में एक अग्रिम निवेश है, आवर्ती लागत में कमी पर्याप्त बचत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विशेष रूप से उदाहरणों में जहां दोहराया परीक्षण किया जाता है ।
सभी परख के साथ के रूप में, एमएफए कुछ सीमाएं हैं । मुख्यतः, इसके लिए 1536-वेल माइक्रोप्लेट पढ़ने में सक्षम माइक्रोप्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर तक पहुंच की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, मात्राकरण के लिए अवशोषण मापन पर निर्भरता ऑप्टिकल हस्तक्षेप के लिए अतिसंवेदनशील विधि बनाता है । यह परीक्षण किए गए नमूनों के एक छोटे सबसेट के लिए नकारात्मक खपत मूल्यों के रूप में प्रकट होता है। पोषक तत्व, दवाएं, फार्मास्यूटिकल्स, या ब्याज के विषाक्त पदार्थ भी परख के साथ संगत होने के लिए पानी में घुलनशील होना चाहिए।
अपनी सीमाओं के बावजूद, यह विधि ड्रोसोफिलामें खपत व्यवहार की मात्रा निर्धारित करने की एक उच्च थ्रूपुट विधि प्रदान करती है। इसके अलावा, कपलिंग डिवाइस को आसानी से कई प्लेट प्रारूपों को स्वीकार करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जिससे यह विभिन्न प्रकार की कीट प्रजातियों को समायोजित करने की अनुमति देता है।
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय नशीली दवाओं के दुरुपयोग पर संस्थान (U01 DA041613) से टीएफसीएम और आरआरएचए को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
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