Summary
Denne protokollen presenterer en teknikk for høyoppløselig kartlegging av replikeringssteder i strukturelt bevart kromatin in situ som bruker en kombinasjon av pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold merking og ChromEMT.
Abstract
Prinsipper for DNA-folding i cellekjernen og dens dynamiske transformasjoner som oppstår under oppfyllelsen av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, segregering, etc.) forblir dårlig forstått, delvis på grunn av mangel på eksperimentelle tilnærminger til høyoppløselig visualisering av spesifikk kromatin loci i strukturelt bevarte kjerner. Her presenterer vi en protokoll for visualisering av replikeringsdomener i monolayercellekultur in situ, ved å kombinere EdU-merking av nylig syntetisert DNA med påfølgende etikettdeteksjon med Ag-forsterkning av Nanogold-partikler og ChromEM-farging av kromatin. Denne protokollen muliggjør høykontrast, høyeffektiv forhåndsinnbyggingsmerking, kompatibel med tradisjonell glutaraldehydfiksering som gir den beste strukturelle bevaringen av kromatin for prøvebehandling ved romtemperatur. En annen fordel med forhåndsinnbygging av merking er muligheten til å forhåndsbestille celler av interesse for inndeling. Dette er spesielt viktig for analysen av heterogene cellepopulasjoner, samt kompatibilitet med elektrontomografi tilnærminger til høyoppløselig 3D-analyse av kromatinorganisasjon på replikeringssteder, og analyse av postreplikativ kromatin omorganisering og søsterkromotid segregering i interfasen.
Introduction
DNA-replikasjon er en grunnleggende biologisk prosess som kreves for trofast kopiering og overføring av genetisk informasjon under celledeling. Ved høyere eukaryoter blir DNA-replikasjon utsatt for stram romlig-temporal regulering, som manifesteres i sekvensiell aktivering av replikasjonsopprinnelse1. Nærliggende replikeringsopprinnelsesopprinnelse som avfyres synkront, danner klynger av svar2. På nivået av optisk mikroskopi oppdages steder med pågående DNA-replikasjon som replikasjonsfokus av forskjellig antall og størrelse. Replikasjonsfokus viser spesifikke mønstre for romlig fordeling i cellekjernen, avhengig av replikeringstidspunktet for det merkede DNA 3,4, som igjen er tett korrelert med genaktiviteten. Takket være veldefinert sekvens av DNA-replikasjon, strengt bestilt i rom og tid, er replikering en kraftig metode for presis DNA-merking, ikke bare for studiet av replikeringsprosess i seg selv, men også for å diskriminere en bestemt DNA-subfraksjon med definert transkripsjonsaktivitet og komprimeringsnivå. Visualisering av replikering av kromatin utføres vanligvis ved påvisning av store proteinkomponenter i DNA-replikasjonsmaskiner (enten ved immunstaining eller ved uttrykk for fluorescerende proteinkoder 5,6) eller ved inkorporering av modifiserte DNA-synteseforløpere 7,8,9,10 . Av disse er det bare metoder basert på inkorporering av modifiserte nukleotider i nylig replikert DNA som gjør det mulig å fange opp konformasjonsendringer i kromatin under replikering, og spore oppførselen til replikeringsdomener etter at replikeringen er fullført.
I høyere eukaryoter legger DNA-emballasje til kromatin et annet nivå av kompleksitet til regulering av grunnleggende genetiske funksjoner (transkripsjon, replikasjon, oppreisning, etc.). Kromatinfolding påvirker tilgjengeligheten av DNA til regulatoriske transfaktorer og DNA-konformasjonsendringer (dobbel helix-avslapping) som kreves for malsyntesen. Derfor er det generelt akseptert at DNA-avhengige syntetiske prosesser i cellekjernen krever en strukturell overgang av kromatin fra kondensert, undertrykkende tilstand til en mer tilgjengelig, åpen konformasjon. Cytologisk er disse to kromatinstatene definert som heterokromatin og eukromatin. Det er imidlertid fortsatt ingen konsensus om modusen for DNA-folding i kjernen. Hypotesene spenner fra en "polymersmelting" modell11, hvor nukleosomal fiber oppfører seg som en tilfeldig polymer som pakketettheten styres av faseseparasjonsmekanismer, til hierarkiske foldemodeller som postulerer sekvensiell dannelse av kromatinfiberlignende strukturer med økende tykkelse12,13. Hierarkiske foldemodeller fikk nylig støtte fra molekylære tilnærminger basert på analysen av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformasjonsfangst, 3C), som demonstrerer eksistensen av hierarkiet av kromatinstrukturelle domener14. Det er viktig å merke seg at replikeringsenheter korrelerer veldig godt med disse kromatindomenene15. Den største kritikken av disse modellene er basert på potensiell kunstig kromatinaggregering forårsaket av prøveprepareringsprosedyrer, for eksempel permeabilisering av cellemembraner og fjerning av ikke-kromatinkomponenter, for å forbedre kromatinkontrast for ultrastrukturelle studier samtidig som kromatintilgjengeligheten for ulike sonder (f.eks. antistoffer). Nylige tekniske fremskritt innen selektiv DNA-farging for elektronmikroskopi ved DNA-bindende fluoroformediert fotooksidasjon av diaminobenzidin (ChromEMT6) har tillatt eliminering av dette hinderet. De samme hensynene gjelder imidlertid for elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Her beskriver vi en teknikk som muliggjør samtidig høyoppløselig ultrastrukturell kartlegging av nylig syntetisert DNA og total kromatin i intakte aldehyd-krysskoblede celler. Teknikken kombinerer deteksjon av EdU-merket DNA av Click-kjemi med biotinylerte sonder og streptavidin-Nanogold, og ChromEMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er optimalisert for adherentceller og ble testet på HeLa-, HT1080- og CHO-cellelinjer.
1. Cellemerking og fiksering
- Plateceller på syrerengjorte dekslerlips i en 3 cm Petri-tallerken. Utvid cellene i mediet som anbefales for cellelinjen som brukes til 70 % samløp.
- Tilsett EdU (5-ethynyl-2'-deoksyuridin) fra 10 mM lager til 10 μM sluttkonsentrasjon og plasser cellene i inkubatoren i 10 minutter eller lenger (avhengig av eksperimentmålet). For kortere pulser (opptil 2 min), lag en Petri-tallerken med forvarmede friske kulturmedier supplert med 10 μM EdU, og overfør coverlips i den, i stedet for å legge EdU til cellene direkte.
MERK: Alle påfølgende trinn utføres ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt. - Fest de merkede cellene med 2,5% glutaraldehyd, fersk laget ved å fortynne 25% lager i 100 mM kaktocylatbuffer, i 1 time.
MERK: De påfølgende EdU-deteksjonstrinnene er følsomme for fikseringstid. Lengre fikseringstider kan påvirke EdU-merkingen negativt, noe som forårsaker lavere signal-til-støy-forhold. - Fjern glutaraldehyd ved å vaske prøvene med PBS supplert med 5 mM MgCl2 (PBS* deretter). Vask tre ganger med en 10 min inkubasjon for hver vask.
- Permeabiliser plasmamembraner med 1 % Triton X-100 i PBS* (PBS*T deretter). Vask to ganger med en 5 min inkubasjon for hver vask.
- Vask prøven grundig med PBS*. Utfør fem endringer og inkuber i 5 min i hver endring.
- Slukk de restfrie aldehydgruppene med 20 mM glycin i PBS*, to ganger i 10 minutter hver.
- Blokker prøvene i 1 % BSA i PBS* i 30 minutter.
2. Klikkreaksjon
MERK: Denne prosedyren er endret fra en tidligere publisert protokoll19.
- Umiddelbart før bruk, klargjør Click-reaction mix for EdU-deteksjon: i et mikrosenterrør, bland 430 μL 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL 100 mM CuSO4, 1,2 μL biotin-azid (10 mM i DMSO) og 50 μL 0,5 M askorbinsyre. For kvalitetskontroll av replikeringsetiketten og Click-prosedyren på nivået av fluorescerende mikroskopi, kan biotin-azide erstattes av AlexaFluor 488-azide.
MERK: Rekkefølgen på tilsetning av komponenter i ovennevnte reaksjon er viktig. - Utfør klikkreaksjon i et fuktig kammer for å minimere fordampning og konsentrasjonsskift i reaksjonscocktailen. Forbered det fuktige kammeret ved å plassere et vått ark med filterpapir på bunnen av Petri-parabolen og dekk det med en parafinfilm. Legg dekslene på filmens overflate med cellene vendt opp og lag 50-100 μL av reaksjonscocktailen på dekslene. Reaksjonen tar 30 min ved romtemperatur.
- Stopp reaksjonen ved å vaske prøven i 0,1% Triton X-100 i PBS* (PBS * T), fem ganger i 5 minutter hver.
- Blokker i 1% BSA i PBS * T i 30 min ved romtemperatur.
- Forbered streptavidin-Nanogold-oppløsning med PBS* T som inneholder 1% BSA. Inkuber prøven med streptavidin, konjugert med 1,4 nm nanogoldpartikler (Nanoprober) i 1% BSA + PBS * T over natten ved +4 °C i det nylagde fuktige kammeret.
- Stopp reaksjonen og vask prøven i PBS* T, fem ganger i 10 minutter hver.
- Stabiliser biotin streptavidin kompleks ved å postfixing i 1% glutaraldehyd i PBS * i 30 min.
- Fjern glutaraldehyd ved intens vask med deionisert vann og vask prøven i PBS*, fem ganger i 20 min hver.
- Slukk frie aldehydgrupper med nytilberedt 1 mg/ml NaBH4 i vann, to ganger i 10 min hver. Under inkubasjon dannes bobler av H2 som kan løfte dekslene. Skyv dem forsiktig ned med pinsettene.
- Vask med deionisert vann fem ganger i 5 min hver.
MERK: For kvalitetskontroll på merketrinnet anbefales det å utføre kontrollmerking med fluorescerende merket streptavidin (figur 2). Dette vil gi et estimat av merkingsintensitet og bakgrunnsnivå før du bytter til kjedelige og artefaktutsatte påfølgende trinn.
3. Ag-forsterkning
MERK: Denne prosedyren er modifisert fra Gilerovitch et al., 1995 (se 20,21).
- Resuspend 50 g akaciapulver i 100 ml deionisert vann. Løs opp i 3 dager, degas og filtrer gjennom fire lag med osteklær. Oppbevar frosset i 5 ml aliquots i 50 ml rør. Tine umiddelbart før bruk.
- Tilsett 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) til 5 ml tint aliquot akaciapulveroppløsning for å lage 7 ml 0,28 M MES (pH = 6,1) i akaciapulveroppløsning. Bland ved å sakte gynge røret i 30 min. Vikle røret med folie for å beskytte mot lys.
- Samtidig med trinn 3.2., vasker deksler med vaskebuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sukrose), tre ganger i 10 minutter hver.
- Forbered den ferske løsningen av N-propylgallat (NPG). I et 15 ml rør oppløses 10 mg NPG i 250 μL 96% etanol, og justerer til 5 ml med deionisert vann.
- Sett 36 mg sølvlaktat i et folie-innpakket 15 ml rør.
- Etter trinn 3.2. ferdig, tilsett 1,5 ml NPG-oppløsning til akaciapulverblanding og berg i ytterligere 3 minutter.
MERK: Alle de påfølgende trinnene utføres i et mørkerom. Bruk ikke-aktinisk safelight (gul eller rød). - Likevekt prøven med vaskebuffer og fortsett til det mørke rommet. Tilsett samtidig 5 ml deionisert vann til sølvlaktat og oppløs ved kraftig risting i 1-2 min.
- Tilsett 1,5 ml sølvlaktatoppløsning til akaciapulverblanding, rock sakte i 1 min. Unngå bobledannelse, da oksygen i blandingen vil bremse reaksjonen.
- Tøm løsningen fra parabolen med deksler og hell 3 ml sølvlaktat-akaciapulverblanding på cellene. Rock parabolen flere ganger og inkuber i 2-5 min. Inkubasjonstiden avhenger av akaciapulver batch og temperaturen. Dette bør defineres eksperimentelt.
MERK: Lengre inkubasjonstid kan føre til uspesifisert sølvbinding. - For å stoppe reaksjonen, tøm reaksjonsblandingen og vask parabolen mye med tre til fem endringer av deionisert vann, etterfulgt av tre endringer i 5 min hver.
- Kontroller fargingen under brightfield-mikroskopet. God farging skal være lys til mørk brun med en veldig svak gulaktig bakgrunn.
MERK: Hvis fargingen ikke utvikler seg, er det mulig å gjenta umiddelbart med den allerede laget blandingen (blandingen er aktiv i ca. 15 min hvis den holdes i mørket). Imidlertid kan fargingen i dette tilfellet utvikle seg for fort.
4. Gull toning
MERK: For å beskytte sølv nanopartikler mot oppløsning av OsO4 oksidasjon i de påfølgende prosedyrene, brukes en impregnering med gull på dette trinnet (Sawada, Esaki, 1994)22.
- Skyll deksler med deionisert vann.
- For å beskytte sølv nanopartikler mot oppløsning av OsO4 oksidasjon, inkubere prøvene i 0,05% tetrakloraurinsyre i 2 min i mørket.
- Vask grundig med deionisert vann i 10 min.
MERK: På dette stadiet legges ytterligere kontrast til DNA-et som inneholder materiale. Fargen på prøven skal endres fra brun til svart.
5. ChromEM
MERK: Denne protokollen ble endret fra Ou et al., 201716.
- Inkuber dekslene og mette prøvene i 10 μM DRAQ5 i PBS i 10 minutter i mørket.
- Forbered 0,2% diaminobenzidin tetrahydrochloride (DAB) løsning i 50 mM Tris eller PBS:
oppløs DAB i 90% av det endelige volumet ved å røre kraftig i mørket, og juster deretter pH til 7,0-7,4 med NaOH. Juster volumet til 100% og filtrer gjennom et 0,22 μM filter, oppbevar innpakket i folie. - Tilsett DAB-oppløsning i celler (2 ml per 3 cm Petri-tallerken) og inkuber i 1 min.
- Flytt dekslene inn i glassbunnen Petri-parabolen og legg den til scenen i et invertert mikroskop. Bestråle prøven (flere synsfelt) på et invertert mikroskop med metallhalogenlyskilde og Cy5-filtersett (640 nm, 1 W/cm2 ved fokusplan) gjennom Plan Apo λ 40х (NA = 0,95) linse i 10 minutter.
MERK: En indikasjon på vellykket DAB-fotokonversjon er fullstendig DRAQ5 fotobleaching og mørk DAB-utfellingsdannelse i bestrålede kjerner. Sistnevnte er imidlertid ikke alltid tydelig over intenst EdU-sølvgullsignal (spesielt når utvidede EdU-pulser brukes). - Vask med deionisert vann tre ganger i 5 min hver.
6. Dehydrering og epoksyharpiks innebygging
- I et mikrocentrifugerør, forbered delvis redusert osmiumtetraoksidoppløsning ved å blande 2% vandig løsning av K4Fe (CN)6 med en lik mengde 2% vandig løsning av OsO4, for å få 1% endelig konsentrasjon av begge komponentene. Inkuber deksler i redusert OsO4 i 1 time og vask i deionisert vann tre ganger i 5 min hver.
MERK: På dette stadiet reagerer den reduserte osmiumforbindelsen med DAB-avsetninger og øker kontrasten til DNA.
FORSIKTIG: Osmium er giftig, arbeid under en avtrekkshette og håndter avfall i henhold til lokale sikkerhetsforskrifter. - Dehydrer prøvene i en rekke graderte etanolløsninger i økende prosentandeler: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
- For infiltrasjon og innebygging, bruk harpiksformelen med komponenten volumetrisk forhold som følger: epoksyharpiks monomer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Denne formelen er blandbar med etanol.
- Inkuber dekslene i etanolharpiksblandingen (3 deler 100% EtOH: 1 del epoksyharpiks) i 30 min.
- Inkuber dekslene i etanolharpiksblandingen (1 del 100% EtOH: 1 del epoksyharpiks) i 2 timer.
- Inkuber dekslene i etanolharpiksblandingen (1 del 100% EtOH: 3 deler epoksyharpiks) over natten.
- Erstatt etanolharpiksblanding med nylaget ren harpiks. Inkuber i ren harpiksblanding i 8 timer. Åpne parabolen for å la rester av etanol fordampe.
- Overfør deksler til en ny tallerken med ren harpiks og inkuber i 2 timer ved 37-42 °C.
- Fyll en silisiumform med nylaget harpiks. Plasser dekslene med cellene vendt ned på passende silisiumform fylt med epoksyharpiks. Herd harpiksen i 24 timer ved 37 °C, deretter ved 60 °C i minst 2 dager.
FORSIKTIG: Komponenter av epoksyharpiksblanding er potensielle kreftfremkallende stoffer. Bruk hansker og arbeid under avtrekkshetten.
- Fjern harpiksplaten fra formen, rengjør overflaten av dekslene med skalpell- eller barberbladet. For å fjerne dekslene, slipp dekslene i flytende nitrogen og overfør deretter platen til kokende vann. Gjenta om nødvendig.
- Finn det bestrålede området under et stereomikroskop og klipp det ut fra platen med en hacksaw eller et annet egnet instrument. Forvarm platen ved 70 °C på en varm plate om nødvendig.
- Fest utskjæringen til en ultramikrotom prøveholder for endelig blokktrimming. Bruk barberhøvelen til å forberede den pyramideformede prøven. Monter holderen med pyramide på ultramikrotomet og installer kniven.
- Trim blokken slik at de bestrålede cellene som bærer EdU-etiketten er inkludert. Forbered en halvtynn seksjon (250 nm tykkelse) egnet for elektrontomografi.
MERK: Seksjonstykkelsen kan justeres slik at den passer til de eksperimentelle kravene.
- Trim blokken slik at de bestrålede cellene som bærer EdU-etiketten er inkludert. Forbered en halvtynn seksjon (250 nm tykkelse) egnet for elektrontomografi.
- Løsne delen fra knivens kant og plasser dem på enkeltsporsgitteret. For elektrontomografi plukkes 250 nm seksjoner på 1 mm enkeltsporsgitter, og etter tørking kan disse seksjonene karbonbelegges fra begge sider. Ingen ekstra kontrast er nødvendig.
MERK: Siden seksjonene allerede inneholder au-ag-partikler med høy kontrast, er det ikke nødvendig å legge til fiducial gullpartikler på overflaten av delen. - Undersøk gitteret i et transmisjonselektronmikroskop ved lav forstørrelse (ca. 600x) for å finne cellene med passende replikeringsmønstre.
MERK: Denne protokollen genererer merketetthet som er høy nok til enkel påvisning av replikeringsfokus selv ved lav forstørrelse. Det anbefales først å lage et kart over seksjonen for etterfølgende navigasjon og vinkelprojeksjonssamling for tomografi. Bytt til høyere forstørrelse og ta bilder med høy oppløsning.
7. Elektrontomografi
- Sett gitteret inn i transmisjonselektronmikroskopet med en høy vippeholder. Last prøven inn i elektronmikroskopet og finn interesseområdet.
- Juster mikroskopet i EFTEM-modus i nær parallell belysningsmodus. Juster energifilteret med 20 eV energivalgsspalte plassert på null tapstopp.
- Pre-bestråle tomografi oppkjøpsområdet med en dose på 40 e/Å2/s i minst 1,5-2 min, noe som tilsvarer den totale dosen minst 3000 e/Å2.
- Juster eusentrisk høyde med automatisk oppgave i SerialEM. Kontroller autofokusoppgaven for å sikre at den fungerer som den skal ved null vippevinkel og -0,8 m km for måldefokus.
- Vipp prøveholderen til -60° med Walk-Up-oppgaven.
- Sett opp tomografianskaffelsen fra -60 til +60° med trinn 2,0°. Eksponeringen bør stilles inn avhengig av vippevinkelen for å holde den gjennomsnittlige intensiteten på kameraet. Begrens bildeskiftet i tilfelle det forårsaker et energiskift og dermed spalte feiljustering. Tomografidataene bør lagres som MRC-fil.
- Importer MRC-filen til IMOD-programvare for gjenoppbygging av tomografi. Fjern de ytterste pikselverdiene på grunn av røntgenbilder.
- Juster vippeserien. Utfør innledende krysskorrelasjon, og merk deretter manuelt 10-12 gullpartikler som fiducials. Spor den fiduciale modellen og inspiser at hver fiducial spores riktig gjennom vippeserien. Lag eksempeltomogrammer (stykker) og merk de tynne inndelingskantene manuelt for å hindre mulig helling av den rekonstruerte tettheten inne i volumet. Den gjennomsnittlige restfeilen for finjustering var mindre enn 1,2 pix.
- Rekonstruer tomogrammet med en filtrert bakprojeksjonsalgoritme, og trim deretter utgangen for å passe interesseområdet inn i det endelige volumet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Replikasjonsfokus i pattedyrcellekjerner viser tydelige distribusjonsmønstre i kjernen avhengig av S-faseprogresjon. Disse mønstrene korrelerer med transkripsjonsaktiviteten til loci som blir replikert. Siden metoden som presenteres her bruker en ganske sterkfixasjonsprosedyre, er det ganske greit å bruke replikerende pulsmerking for spesifikk deteksjon av kromatin loci i ulike transkripsjonstilstander, selv under forhold som tilbyr best strukturell bevaring av kromatin oppnådd ved romtemperatur kjemisk fiksering.
Kvalitetskontrolltrinn er ment å sikre vellykket fullføring av nøkkelprosedyrene i denne protokollen. I utgangspunktet bør vellykket EdU-merking bekreftes av Click-reaksjon med fluorescerende merket azide, som demonstrerer typiske replikasjonsmønstre hvis heterogen cellepopulasjon brukes (figur 2). Det andre viktige trinnet er streptavidin merking, som kan sterkt påvirkes av glutaraldehydfiksering. For evaluering av streptavidinbindingseffektivitet, bruk AlexaFluor-488-konjugert streptavidin under samme forhold som streptavidin-Nanogold (figur 3). På dette tidspunktet forventes noe bakgrunn hovedsakelig på grunn av glutaraldehyd autofluorescence samt ufullstendig streptavidin-utvasking. Hvis signal-til-støy-forholdet er uakseptabelt, kan du prøve å øke antall og varighet av vasketrinn i trinn 2.6. Alternativt kan du legge til glutaraldehydslukking med NaBH4 (trinn 2.9-2.10) etter trinn 1.5.
Sølvforbedringsprosedyren gir ofte inkonsekvente resultater og krever optimalisering. For det første varierer reaksjonshastigheten dramatisk avhengig av akaciapulveroppløsningsbunken. Viskositeten til løsningen er omvendt proporsjonal med tidspunktet for sølvfargingsutviklingen. Det er lurt å ha flere aliquots av samme batch og teste dem på kontrollprøvene for å bestemme optimal reaksjonstid. Ettersom temperaturen på reagensene og miljøet også har en betydelig innvirkning på reaksjonshastigheten, prøv å utføre reaksjonen ved nøyaktig samme temperatur. Hvis du behandler mer enn tre prøver samtidig, er det praktisk å starte reaksjonen med 30 sekunders intervaller for å ha nok tid til vasketrinn.
Et godt resultat av sølvforbedringsprosedyren er den mørkebrune fargingen av noen (ikke alle) kjerner med svært svak gulaktig cytoplasmatisk farging (figur 4). Dette betyr at gjennomsnittsstørrelsen på sølvpartikler er ca. 20 nm, som er egnet for enkel etikettdeteksjon i et bredt forstørrelsesområde på TEM over kromatintellerne. For tomografieksperimenter bør størrelsen på partiklene reduseres til ca. 10 nm ved å forkorte reaksjonstiden. Fargen i dette tilfellet skal være lysebrun eller rødaktig. Fargen på sølvfarging bør kontrolleres før gull toning.
DAB fotokonversjon og osmifisering utføres etter gull toning for å beskytte sølvskjell mot oppløsning. Ved utilstrekkelig gullimpregnering blir sølvnanopartikler erodert og får uregelmessig form, men forblir fortsatt synlige under TEM. Kvaliteten på DAB-fotokonversjon overvåkes først av DRAQ5 bleking (i fluorescensmodus), deretter i brightfield-modus, når cellekjernene i et bestrålet felt blir mørkebrune (figur 5). DAB-fargeintensiteten bør ikke være veldig høy, slik at Ag-Au-farging forblir godt oppdaget for å tillate valg av celler med nødvendig replikeringstid for seksjonering.
Ultratynne eller halvtynne seksjoner krever ikke ekstra farging og kan ses direkte under TEM. Riktig merking resulterer vanligvis i veldefinerte klynger av Ag nanopartikler som avgrenser replikeringssteder (figur 6), mens bakgrunnsmerking er begrenset til noen få nanopartikler per kvadratmikrometer. Halvtynne seksjoner er klare for tomografi og krever ikke tilsetning av gull nanopartikler til seksjonsoverflaten, da Ag nanopartikler tilstede i en seksjon kan brukes som fiducial merker (figur 7). I denne figuren vises effekten av langvarig merketid: individuell replikasjonsfoci-sikring i fiberlignende strukturer, avgrenser høyere ordens kromatindomener.
Figur 1. Oversikt over metoden. Celler dyrket på deksler er merket med EdU, festet med 2,5% glutaraldehyd, permeabilisert, og Click-reaksjon utføres med biotinylert azide. Alternativt brukes fluorescerende merkede azider i lett mikroskopisk observasjon. Steder for biotin inkorporering er merket med Nanogold-streptavidin (eller fluorescerende merket streptavidin som en kontroll), sølv forbedret, og etter gull toning utsatt for DRAQ5-mediert DAB fotokonversjon og osmifisering. Prøvene er innebygd i epoksyharpiks, seksjonert, undersøkt i TEM, og utsatt for elektrontomografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Replikasjonsmønstre i pattedyrceller avslørt av EdU-merking og Klikkreaksjon (grønn). S-faseprogresjon fra tidlig til sen S-fase (fra venstre til høyre) manifesteres av en ordnet endring i replikeringsmønstre: A, B - tidlig S-fase, C - midt S-fase, D, E - sen S-fase. DNA er farget med DAPI (rød). Skala bar = 10 um. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Replikasjonsmønstre i pattedyrceller avslørt av EdU-merking og to-trinns Click-biotin og streptavidin-AlexaFluor 488 farging etter glutaraldehydfiksering. Kontrollprøve merket med streptavidin-AlexaFluor 488 viser optimal merkingseffektivitet og S/N-forhold etter glutaraldehydfiksering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Representativt bilde av celler etter sølvforbedringsprosedyren (trinn 3). Ulike replikeringsmønstre (tidlig S-fase, piler; midt S-fase, pilspiss; sene, doble piler) er lett synlige i en lyskopimodus i lysfelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Et typisk resultat av DRAQ5-mediert DAB-fotokonvertering. (A) DRAQ5 farging (stiplet sirkel indikerer bestrålet område). Legg merke til sterk DRAQ5 bleking inne i sirkelen. (B) Det samme området sett i brightfield light mikroskop. Legg merke til sterkere DAB-nedbør i kjernene i bestrålet område. Innsett: Piler indikerer tidlige S-fasekjerner der replikeringsmønstre merket med Ag-Au fortsatt er lett å oppdage på bakgrunn av DRAQ5-fotooksiderte DAB-flekker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Replikasjonsfokus i pattedyrcellekjerner avslørt av EdU-merking og to-trinns Click-biotin og streptavidin-Nanogold farging etter glutaraldehydfiksering. Tynne 90 nm-deler av en S-fasecelle som viser klynger av Ag-Au nanopartikler ved replikasjonsfokus (A, røde sirkler). Bakgrunnsnivået kan verdsettes i en ikke-S-fase celle (B). Pilspisser indikerer kromatinfibre av forskjellig skala. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. 0°-tilt projeksjon av 250 nm seksjon. (A) og virtuell tomografisk seksjon. (B) av en cellekjerne merket med EdU i 2 timer. Se individuelle replikasjonsfokus smeltet sammen til fiberlignende strukturer (pilspisser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som er beskrevet her har flere fordeler i forhold til tidligere publiserte protokoller. For det første eliminerer bruken av Click-kjemi for merking av replikert DNA nødvendigheten av DNA-denatureringsforutsetning for BrdU-deteksjon med antistoffer, og dermed bedre bevare kromatin ultrastruktur.
For det andre minimerer utnyttelse av biotin som sekundær ligand som genereres etter glutaraldehydfiksering og riktig slukking av ubundne aldehydgrupper kjemisk modifikasjon av målet, og forbedrer dermed merkingseffektiviteten samtidig som bakgrunnen reduseres på grunn av endogen biotin. Biotin-streptavidin legger også til allsidighet da bruk av fluorescerende merket streptavidin gir enkel kvalitetskontroll i det tidlige stadiet av prosedyren. Protokollen kan forenkles ytterligere ved innføring av FluoroNanogold-merket streptavidin, men i våre hender ga disse reagensene noe høyere bakgrunn sammenlignet med Nanogold-streptavidin, kanskje på grunn av større størrelse på sondene.
For det tredje gir en kombinasjon av små sonder, streptavidin-Nanogold som den største komponenten på ca 5 nm, veldig god penetrasjon i selv glutaraldehyd-krysskoblede celler. Dette gjør teknikken egnet for forhåndsinnbygging av merking av optimalt ultrastrukturerte bevarte celler og lett kompatibel med ulike 3D-elektronmikroskopiteknikker, inkludert seriell seksjonsrekonstruksjon, matrisetomografi, elektrontomografi, serieblokk ansiktsavbildning og FIB-SEM.
Sølvforbedring er det mest kritiske trinnet, som krever presis kontroll av reagensdiffusjon og vasketrinn, noe som er lettere å utføre med tilhengerceller. På den annen side, siden sterk krysskobling med glutaraldehyd også kan påvirke sølvforbedringen, bør fikseringsbetingelsene finjusteres for å balansere kromatinstrukturbevaring og sølvforbedringseffektivitet. Av denne grunn kan det hende at kryofikserings-/kryoerstatningsteknikker, som krever utvidet og dårlig kontrollert etterfiksering, selv om de tillater enda bedre bevaring av strukturen, kanskje ikke er fullt kompatibel med den foreslåtte merkingsstrategien23. Teknikken kan forbedres ytterligere ved å bruke Au-forsterkning i stedet for sølvforbedring24. Denne modifikasjonen gjør det mulig å hoppe over gull toning trinnet, men i våre hender gir det betydelig høyere bakgrunn.
Til slutt tillater forhåndsinnbyggingsmerking forhåndsvalg av målceller for ChromEM og seksjonering basert på replikeringsmønsteret som kan oppdages under brightfield eller fluorescerende mikroskop. Videre kan metoden enkelt utvides til CLEM, inkludert ulike superoppløsningsteknikker. Dette åpner nye horisonter i studier av kromatin høyere orden struktur og dynamikk i ulike fysiologiske tilstander. Tilnærmingen vi beskrev her kan brukes til studier av kromatinorganisering på replikeringssteder, for analyse av postreplikativ omorganisering av kromatin, inkludert høyoppløselig avbildning av kromatinsegregering i interfase, og for replikering av stor kromosomale domener og studier av høyere orden kromatinfolding av spesifikke fraksjoner av genomet (eukromatatin eller heterokromatin, merket basert på replikasjon). Denne typen avbildningsteknikker er også viktige som referansepunkt for dataene som genereres av alternative tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av RSF (tilskudd #17-15-01290) og RFBR (tilskudd #19-015-00273). Forfatterne takker Lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) og Nikon Center of Excellence i korrelativ bildebehandling ved Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology for tilgang til bildeinstrumentering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
References
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C.
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
