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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62838
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2,3,4, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St. James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 3SFI Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre, RCSI & TCD, 4SFI Centre for Research in Medical Devices (CURAM), RCSI, Dublin and National University of Ireland

Summary

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), war bis zum Aufkommen von COVID-19 der weltweit bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten. Mtb hat sich entwickelt, um in seiner intrazellulären Umgebung zu bestehen, die Abwehr des Wirts zu umgehen und hat Resistenzen gegen viele antituberkulöse Medikamente entwickelt. Ein Ansatz zur Lösung von Resistenzen besteht darin, bestehende zugelassene Medikamente zu identifizieren, die die Immunantwort des Wirts auf Mtb verstärken. Diese Medikamente könnten dann als adjunktive wirtsgerichtete Therapien (HDT) umfunktioniert werden, um die Behandlungszeit zu verkürzen und Antibiotikaresistenzen zu überwinden.

Die Quantifizierung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen ist ein entscheidender Aspekt bei der Beurteilung potenzieller HDT. Der Goldstandard zur Messung des Mtb-Wachstums ist das Zählen koloniebildender Einheiten (CFU) auf Agarplatten. Dies ist ein langsamer, arbeitsintensiver Assay, der sich nicht für ein schnelles Screening von Medikamenten eignet. In diesem Protokoll wurde ein automatisiertes, brühebasiertes Kultursystem, das häufiger zum Nachweis von Mtb in klinischen Proben verwendet wird, für das präklinische Screening wirtsgerichteter Therapien angepasst. Die Fähigkeit des Flüssigkultur-Assay-Systems zur Untersuchung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit HDT behandelt wurden, wurde bewertet. Die HDTs, die auf ihre Fähigkeit getestet wurden, das MTB-Wachstum zu hemmen, waren all-trans-Retinsäure (AtRA), sowohl in Lösung als auch in Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) -Mikropartikeln und der Kombination von Interferon-gamma und Linezolid. Zu den Vorteilen dieser automatisierten Flüssigkultur-basierten Technik gegenüber der CFU-Methode gehören die einfache Einrichtung, die weniger arbeitsintensive Vorbereitung und die schnellere Zeit bis zum Ergebnis (5-12 Tage im Vergleich zu 21 Tagen oder mehr für Agarplatten).

Introduction

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose, war 2019 weltweit der bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten1. Um der Abwehr des Wirts zu entgehen, untergräbt Mtb die mykobakterizide Aktivität von angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs), so dass es intrazellulär persistieren und replizierenkann 2. Das Fehlen eines wirksamen Impfstoffs zur Vorbeugung der Lungentuberkulose bei Erwachsenen und das zunehmende Auftreten arzneimittelresistenter Stämme unterstreichen den dringenden Bedarf an neuen Therapien.

Adjunktive wirtsgerichtete Therapien (HDT) könnten die Behandlungszeit verkürzen und helfen, Resistenzen zu überwinden3. Die präklinische Bewertung von HDT-Kandidaten in vitro zur Bestimmung der mykobakteriziden Aktivität in Makrophagen beruht häufig auf der Quantifizierung des Mtb-Wachstums durch koloniebildende Einheiten (CFU) auf festen Agarplatten. Dies ist ein langsamer, arbeitsintensiver Assay, der sich nicht für ein schnelles Screening von Medikamenten eignet. Kommerziell erhältliche automatisierte, brühebasierte mikrobielle Nachweissysteme werden häufiger in klinischen mikrobiologischen Laboratorien für den Nachweis und die Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mtb und anderen mykobakteriellen Spezies in klinischen Proben eingesetzt4. Diese Instrumente messen das Wachstum indirekt auf der Grundlage der bakteriellen Stoffwechselaktivität, die zu physikalischen Veränderungen in den Kulturmedien (Veränderung des CO2- oderO2-Spiegels oder-Drucks) führt, die im Laufe der Zeit überwachtwerden 5. Der Messwert ist Time to Positivity (TPP), von dem zuvor gezeigt wurde, dass sie mit der Mtb-CFU in Sputumproben von TB-Patienten als Reaktion auf Behandlung 6,7 und in Lysaten infizierter muriner Lunge und Milz8 korreliert. Darüber hinaus wurden Flüssigkultur-Detektionssysteme verwendet, um die Wirkung konventioneller pathogengesteuerter Therapien auf das Wachstum von Mykobakterien in axenischen Kulturen und kultivierten Makrophagen zu messen 9,10. Das Instrument wurde auch verwendet, um die angeborene Fähigkeit von dendritischen Zellen und von Alveolarmakrophagen zu untersuchen, das intrazelluläre Wachstum von Mtb11,12 zu kontrollieren. Dieses experimentelle Protokoll zeigt, dass ein Flüssigkultur-Diagnosesystem angepasst werden kann, um ein präklinisches Screening von HDT auf TB in kultivierten Makrophagen durchzuführen. Im Vergleich zur CFU-Aufzählung besteht der Hauptvorteil dieser Technik darin, dass sie den experimentellen Arbeitsaufwand und die Zeit, die zur Quantifizierung des intrazellulären mykobakteriellen Wachstums / Überlebens erforderlich sind, erheblich reduziert. Diese Technik beruht auf dem Zugang zu einem automatisierten Kulturinstrument, mit dem das Überleben intrazellulärer Mykobakterien in Immunzellen beurteilt werden kann, die mit einer breiten Palette pharmakologischer Reagenzien behandelt wurden, die auf zelluläre Funktionen abzielen, um die Immunität des Wirts zu stärken.

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Protocol

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden mit dem abgeschwächten H37Ra-Stamm von Mtb durchgeführt, der in einem Containment Level 2-Labor gehandhabt werden kann. Alle Manipulationen an lebenden Mykobakterien wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden entwickelt, um die Erzeugung von Aerosolen zu minimieren. Eukaryotische Zellkultur (THP-1-Zellen) wurde ebenfalls in einer BSC der Klasse II durchgeführt. Das Labor führte eine Risikobewertung durch und stellte sicher, dass alle Verfahren in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen biologischen Sicherheitsvorschriften durchgeführt wurden. Die humane monozytäre THP-1-Zelllinie wurde verwendet, um die Methode wie beschrieben durchzuführen (Schritt 1). Die Zellen werden nach Stimulation mit Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) vor der Infektion mit Mykobakterien in Makrophagen differenziert.

1. Zellkultur

  1. Vermehrung von H37Ra-Samen in die Log-Phase in Middlebrook 7H9 (MB) Brühe, ergänzt mit Albumin-Dextrose-Katalase (ADC) Anreicherung (10%) und 0,05% Polysorbat 80. Lagern Sie H37Ra-Vorräte in 1 ml Aliquots in einem -80 °C Gefrierschrank für bis zu 1 Jahr.
  2. Eine 1-ml-Durchstechflasche mit Mtb-H37Ra auftauen und etwa 1 Woche vor dem geplanten Experiment in einen T25-Kolben mit einer Filterkappe mit 9 ml MB-ergänzter Brühe geben. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5-7 Tage in einem statischen Inkubator.
  3. THP-1-Zellen in RPMI-1640, ergänzt mit nicht hitzeabgetötetem 10% fetalem Kälberserum (vollständig (c)RPMI) in einem T75-Kolben in einemCO2-befeuchteten Inkubator bei 5% CO2/37 °C und Subkultur zweimal pro Woche, um eine Dichte von weniger als 1 x 106 Zellen/ml aufrechtzuerhalten.
  4. Differenzieren Sie THP-1-Zellen 3 Tage vor der Infektion in Makrophagen, indem Sie die Zellen mehrmals mit einer serologischen Pipette in T75-Kolben vorsichtig pipettieren, um Klumpen zu dispergieren und in ein 50-ml-konisches Röhrchen zu legen.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, dekantieren Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 2 ml RPMI. Führen Sie die Zellzählung durch, um die Zellen / ml zu schätzen.
  6. Saatgut 2 ml THP-1-Makrophagen in 12-Well-Gewebekulturplatten bei einer Dichte von 100.000 Zellen/ml in cRPMI mit 100 ng/ml PMA für 72 h. Entfernen Sie PMA-haltiges Medium aus den Zellen und füllen Sie es vor der MTB-Infektion mit frischem cRPMI auf.
  7. Richten Sie individuelle Platten für jeden gewünschten Zeitpunkt ein.
  8. Samenzellen mit der gleichen Dichte (100.000 Zellen / ml) in 2-Well-Glaskammerobjektträgern, um die Multiplizität der Infektion (MOI) zu bestimmen.
  9. In einen 5%CO2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage bei 37 °C geben.

2. Quantifizierung der MTB-Aufnahme

  1. Bestimmung der Mtb-Aufnahme durch Makrophagen (MOI)
    1. Richten Sie die biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) am Tag der Infektion ein und arbeiten Sie an zwei Schichten Seidenpapier, um verschüttete Flüssigkeiten aufzufangen. Stellen Sie Abfallentsorgungsbehälter gemäß den örtlichen Vorschriften auf.
    2. Aus dem T25-Kolben werden 6-8 ml Mykobakterienkultur entnommen und in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen überführt.
      HINWEIS: Röhrchen mit kleinerem Volumen können für kleinere Experimente verwendet werden.
    3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur für 10 min bei 2890 x g.
    4. Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und bringen Sie es in die biologische Sicherheitswerkbank. Warten Sie 1 Min., damit sich die Bakterien ansiedeln können.
      1. Gießen Sie den Überstand in den Desinfektionsmittel-Entsorgungsbehälter, verschließen Sie das Röhrchen und resuspendieren Sie die Bakterien im verbleibenden Medium, indem Sie auf die Seite des Röhrchens klopfen. Warten Sie 1 Min., damit sich die Bakterien ansiedeln können.
    5. Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes cRPMI hinzu, mischen Sie vorsichtig und geben Sie es in ein 50-ml-konisches Röhrchen.
    6. Resuspendieren Sie die Mykobakterien sehr vorsichtig mit einer 25 G Nadel und 5 ml Spritze. Um sie zu resuspendieren, ziehen Sie die Mykobakteriensuspension in die Spritze und werfen Sie sie sehr vorsichtig an der Seitenwand des Röhrchens aus, um die Aerosolproduktion zu minimieren. Wiederholen Sie 6-8 mal.
      HINWEIS: Seien Sie äußerste Vorsicht, da es sich um eine hochdichte Kultur von Mykobakterien handelt. Um das Risiko einer Nadelstichverletzung zu vermeiden, verwenden Sie, wenn möglich, stumpfe Nadeln und Luer-Lock-Spritzen.
    7. Entsorgen Sie die Nadel und die Spritze in einem scharfen Behälter im BSC.
    8. Die Suspension in ein 2-ml-Mikrofugenröhrchen (mit Schraubverschluss) geben und bei Raumtemperatur 3 min bei 100 x g zentrifugieren, um verbleibende Klumpen zu pelletieren. Bringen Sie das Röhrchen in die Sicherheitswerkbank zurück und warten Sie 1 Min., bis sich die Bakterien ansiedeln können.
    9. Übertragen Sie die oberen 1-1,5 mL des Überstands in ein neues Röhrchen. Entsorgen Sie das Originalrohr im Abfalleimer mit Desinfektionsmittel. Gut mischen und verschiedene Mengen der mykobakteriellen Suspension (z. B. 5, 25, 50, 150 μL) in die 2-Well-Glaskammerobjektträger geben und 3 h in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubieren.
  2. Färbung für säurefeste Bakterien (AFB)
    HINWEIS: Nach 3 h Inkubation werden die Makrophagen gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert, um Mykobakterien zu inaktivieren. Die Objektträger werden dann mit einem modifizierten Auramine O-Kit (siehe Materialtabelle) gefärbt, um die Phagozytosierung von Mykobakterien pro Zelle zu schätzen. Aufgrund ihrer wachsartigen Zellwand behalten Mykobakterien den Auramin-Farbstoff nach einer Säure-Alkohol-Wäsche. Die Makrophagenkerne werden dann mit Hoechst gegengefärbt. Diese Methode ermöglicht es, die Anzahl der phagozytierten Bakterien pro Zelle zu zählen und wird verwendet, um die Multiplizität der Infektion (MOI) der Makrophagen zu bestimmen.
    1. Entfernen Sie das Medium aus dem Glaskammerobjektträger, nachdem Sie dreimal auf und ab pipettiert haben, um Bakterien zu entfernen, die nicht phagozytiert wurden.
    2. Einmal mit 2 mL PBS bei Raumtemperatur waschen.
    3. Lagerbestände von 4% Paraformaldehyd, gelöst in PBS in Aliquoten bei -20 °C für bis zu 6 Monate. Ein Aliquot von 4% Paraformaldehyd unmittelbar vor Gebrauch auftauen. Mit PBS auf 2% Paraformaldehyd verdünnen und 2 ml pro Vertiefung hinzufügen.
    4. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Der Glaskammerobjektträger kann in dieser Phase zur Färbung aus der Sicherheitswerkbank entnommen werden.
    5. Waschen Sie die Rutsche unter einem sanften Leitungswasserstrahl.
    6. Geben Sie genügend Auramin auf den Objektträger, um die Zellen mit einer Kunststofftransferpipette abzudecken, und inkubieren Sie für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln (Abdeckung mit Aluminiumfolie).
    7. Waschen Sie überschüssigen Farbstoff mit Leitungswasser vom Objektträger und fügen Sie den Entfärbungsmittel / Quencher für 1 min im Dunkeln hinzu.
    8. Den Überschuss mit Leitungswasser abwaschen und 15 min bei Raumtemperatur mit Hoechst 33342 (10 μg/ml in PBS) im Dunkeln inkubieren.
    9. Den Hoechst-Fleck mit Leitungswasser abwaschen, die Kammern entfernen, überschüssiges Wasser vom Objektträger ablassen, einen Tropfen Antifade und Deckglas hinzufügen und an der Luft trocknen.
    10. Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop mit dem 100-fachen Ölobjektiv. Mykobakterien fluoreszieren unter dem FITC-Filter grün. Die Kerne fluoreszieren blau unter dem DAPI-Filter (Abbildung 1C).
    11. Bestimmen Sie das MOI, indem Sie die Anzahl der pro Zelle phagozytierten Mykobakterien und den Prozentsatz der infizierten Zellen zählen.
    12. Berechnen Sie das Volumen der mykobakteriellen Suspension, die benötigt wird, um die erforderliche MOI basierend auf der Oberfläche einer Vertiefung in der Platte zu erreichen. Zum Beispiel beträgt die Oberfläche der in diesem Experiment verwendeten Glaskammerobjektträger 4 cm2. Ein niedriger MOI (ca. 1-2 Bazillen/Zelle) ist wünschenswert für Experimente, die über mehrere Tage (z.B. 5 Tage) durchgeführt werden.
  3. Infektion von Makrophagen
    1. Mischen Sie die Mykobakteriensuspension gut und fügen Sie den Zellen die benötigte Menge auf 12-Well-Platten hinzu, sobald das Volumen bestimmt wurde, das erforderlich ist, um den gewünschten MOI zu erreichen.
    2. Bei 37 °C für 3 h inkubieren, damit Mykobakterien phagozytiert werden können.
    3. Entfernen Sie extrazelluläre Bakterien, indem Sie die Vertiefungen mehrmals mit warmem RPMI oder HBSS waschen.
    4. Lysieren Sie die Makrophagen in einer Vertiefung (3-Stunden-Probe), um die prozentuale Zeit bis zur Positivität (TTP) des ursprünglichen Inokulums (3-Stunden-Probe) zu bestimmen, wie in Schritt 3 unten beschrieben.
    5. Frisches cRPMI und die erforderlichen Medikamentendosen oder Vehikelkontrolle in die verbleibenden Vertiefungen geben, die Platten imCO2-Inkubator bei 37 °C für die erforderliche Zeit inkubieren (abhängig vom Versuchsplan, aber in der Regel in mehreren Abständen zwischen 1 und 8 Tagen).

3. Entnahme von Proben für das Flüssigkultur-Detektionssystem

HINWEIS: Am Tag der Infektion werden extrazelluläre Mykobakterien durch Waschen entfernt, und intrazelluläre Mykobakterien werden durch Lyse einer Vertiefung von Makrophagen (3 h Probe) geerntet, um die anfängliche Menge zu bestimmen, die als Ausgangskontrolle für die Infektion phagozytiert wird. Zu folgenden Zeiten werden sowohl das Medium, das Zelllysat als auch die Waschungen kombiniert, um das gesamte mykobakterielle Wachstum zu messen. Extrazelluläres und intrazelluläres Wachstum können auf Wunsch auch getrennt beurteilt werden.

  1. Entnahme einer 3-stündigen Probe zur Bestimmung der TTP
    1. Nach den ersten 3 Stunden der Infektion werden extrazelluläre Mykobakterien aus allen Vertiefungen abgewaschen, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben. Fügen Sie 1 ml frische Medien in die 3-Stunden-Kontrollmulde hinzu, um das Lysatvolumen mit denen späterer Zeitpunkte auszugleichen.
      HINWEIS: Siehe Schritt 3.2.7, wenn extrazelluläre Mykobakterien von der Analyse ausgeschlossen werden sollen.
  2. Musterkollektion
    1. Warme MB-Brühe und Instrumentenkulturflaschen, um sie auf Raumtemperatur zu bringen.
    2. Überführen Sie das Medium von der 12-Well-Platte in die entsprechenden beschrifteten konischen Rohre.
    3. 500 μL steriler Lysepuffer (0,1% Triton x-100 in PBS, gefiltert durch einen sterilen 0,2 μm Filter) für 10 min in jede Vertiefung geben.
    4. Die Zellen vorsichtig mit einem sterilen Schaber aus dem Vertiefung abkratzen und mit dem Medium im entsprechenden konischen Röhrchen verbinden.
    5. Waschen Sie die Vertiefung mit 0,5 ml sterilem PBS und geben Sie sie in das entsprechende Röhrchen.
    6. Führen Sie jede Probe 6-8 Mal vorsichtig durch eine Nadel und Spritze (25 G), um die Klumpen aufzubrechen. Verdünnte Proben 1:10 in MB-Brühe; 100 μL Probe + 900 μL MB Medium.
    7. Zu den erforderlichen Zeiten/Tagen (in der Regel zwischen 1 und 8 Tagen) werden die restlichen Proben mit den Schritten 3.2.1-3.2.6 entnommen.
      HINWEIS: Forscher ziehen es möglicherweise vor, extrazelluläre Mykobakterien von ihrer Analyse auszuschließen, in diesem Fall wird in Schritt 3.2.2 oben das Medium aus jeder Vertiefung verworfen und Makrophagen werden mehrmals gewaschen, bevor Lysepuffer hinzugefügt wird.
  3. Beimpfung und Beladung von Instrumentenkulturflaschen
    HINWEIS: Details zum Flüssigkulturgerät und den zugehörigen Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle.
    1. Sterilisieren Sie den Gummiverschluss der Instrumentenkulturflasche mit Seidenpapier, das mit 70% Alkohol getränkt ist, und lassen Sie es an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Dieser Schritt muss im BSC durchgeführt werden.
    2. Bereiten Sie die Flaschen vor, indem Sie genügend Nährstoffergänzungen für alle Proben in ein konisches Röhrchen (0,5 ml / Flasche) geben. Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um 0,5 ml Nährstoffergänzung in die Instrumentenkulturflasche zu injizieren.
    3. 500 μL der verdünnten Probe (1:10) werden in ein 1 ml V-Bodenröhrchen pipettiert.
    4. Verwenden Sie eine Nadel und eine Spritze, um die 500 μL Probe in die zugewiesene Instrumentenkulturflasche zu injizieren.
    5. Sterilisieren Sie den Gummiverschluss der Instrumentenkulturflasche mit Seidenpapier, das mit 70% Alkohol getränkt ist, und lassen Sie es an der Luft trocknen. Wischen Sie die Flaschen mit Seidenpapier ab, das mit 70% Alkohol getränkt ist, bevor Sie sie aus dem BSC entfernen.
    6. Transportieren Sie die Flaschen vorsichtig von der Biosicherheitswerkbank zum Beladungsinstrument.
    7. Drücken Sie die Ladetaste am automatisierten mikrobiellen Detektionssystem.
    8. Scannen Sie die Barcodes auf Instrumentenkulturflaschen und legen Sie die Flaschen bis zu 42 Tage lang bei 37 °C in den Inkubator des Detektionssystems. Lesen und notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um eine Positivität vom Instrumentenbildschirm aus zu erreichen.
      HINWEIS: Der Barcode ermöglicht es dem Gerät, die Flasche zu identifizieren und Reflexionswerte mit einer bestimmten Flasche zu verknüpfen.
    9. Berechnen Sie die prozentuale Zeit bis zur Positivität (TTP), indem Sie die TTP des anfänglichen intrazellulären Inokulums (Tag 0) mit der von Makrophagen vergleichen, die für die angegebenen Zeiten kultiviert wurden. Eine positive Veränderung des prozentualen TTP bedeutet mykobakterielles Wachstum13.
      Zum Beispiel für Tag 3:
      Prozentuale Veränderung der Zeit bis zur Positivität = Equation 1

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Representative Results

Das in dieser Studie verwendete automatisierte Flüssigkulturgerät überwacht alle 10 min den CO2 -Gehalt. Eine Farbänderung im Sensor am Boden der Instrumentenflasche wird farbmetrisch gemessen und als Reflexionseinheiten ausgedrückt. Die Gerätesoftware wendet dann Detektionsalgorithmen an, um die Zeit bis zur Positivität (TTP) zu berechnen, d. H. Die Anzahl der Tage von der Inokulation bis zur Markierung der Kulturen als positiv (Abbildung 1A). Eine umgekehrte Beziehung zwischen TTP und log10KBE (bestimmt nach der Agarplattenmethode)12 im Anfangsinokulum ist in Abbildung 1B dargestellt. Wenn das Mtb-Wachstum innerhalb von MOI-infizierten Makrophagen im Bereich von 1-2 bis 5-10 in Gegenwart oder Abwesenheit von pharmakologischen Inhibitoren (Abbildung 1C) durch die beschriebene automatisierte Kulturmethode oder durch Zählung von Kolonien auf festem Agar verglichen wurde, gab es eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen, die mit beiden Methoden erzielt wurden (Abbildung 1D). Um das MTB-Wachstum grafisch darzustellen, wurde die prozentuale Veränderung der TTP gemäß der obigen Gleichung berechnet, indem die TTP-Werte für bis zu 8 Tage nach Infektion von Makrophagen mit dem ursprünglichen TTP-Wert12 verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigten einen ähnlichen Trend zwischen Flüssigkultur und KBE und zeigten eine signifikante Hemmung des Mtb-Wachstums in Makrophagen in Gegenwart von AtRA in Lösung oder der Äquivalentdosis von AtRA, die in PLGA-Mikropartikeln (MP) verkapselt ist (Abbildung 2A, B).

Die Wirksamkeit eines anderen HDT, IFNγ, das zur Behandlung von multiresistenter TB14 in Kombination mit dem Zweitlinien-Antibiotikum Linezolid eingesetzt wurde, wurde ebenfalls untersucht. Ein Dosis-Wirkungs-Experiment wurde zunächst in infizierten THP-1-Zellen durchgeführt, um die Wirksamkeit von Linezolid allein bei Konzentrationen im Bereich von 0,6-5,0 μg/ml zu bestimmen (Abbildung 2C), bevor die Kombination von Linezolid in einer suboptimalen Dosis (1,25 μg/ml) und IFNγ getestet wurde: Es gab keine signifikante Wechselwirkung zwischen den Medikamenten (Abbildung 2D).

Figure 1
Abbildung 1: Quantifizierung des Mtb-Wachstums durch automatisierte Flüssigkultur und auf festem Medium. Mtb H37Ra wurde in Middlebrook-Brühe über eine Reihe von Verdünnungen (1:2 bis 1:100.000) verdünnt. Ein Aliquot von 300 μL jeder Verdünnung wurde in doppelte Instrumentenkulturflaschen injiziert, auf dem Flüssigkulturinstrument inkubiert und ihr Wachstum wurde überwacht. Gleichzeitig wurde ein Aliquot (10 μL) auf MB-Agarplatten verteilt, die 0,5% Glycerin und 10% OADC (Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase-Ergänzung) in dreifacher Ausfertigung enthielten, zur KBE-Zählung wie zuvor veröffentlicht12. (A) Datenpunkte aus dem Flüssigkultursystem jeder Verdünnung werden als Reflexionseinheiten über Zeit15 dargestellt. Um Vergleiche zwischen den Proben zu ermöglichen, wurde der Hintergrund auf den 9-Stunden-Reflexionswert für jede Probe normalisiert. Das Wachstum wurde insgesamt 42 Tage lang überwacht (die ersten 21 Tage sind in der Grafik dargestellt), die Zeit bis zur Positivität (TTP) lag zwischen 3,83 und 11,1 Tagen. (B) TTP aus verdünnten Proben wurde gegen log10 KBE-Schätzung aufgetragen; Jeder Datenpunkt stellt die Werte für zwei Replikate aus einem Experiment dar und beschreibt zwei separate Experimente. Die Linie der besten Anpassung und der Regressionskoeffizient (r2) sind dargestellt. (C) Beispiel für AFB-Färbung von intrazellulärem Mtb H37Ra in THP-1-Makrophagen mit Auramin (grün), das zur Berechnung der Infektionsvielfalt verwendet wird, Kerne werden mit Hoechst 333258 (blau) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 100-fachen Ölobjektiv (numerische Apertur [NA], 1,3) erzeugt. Der Maßstabsbalken stellt 2 μm dar. (D) Korrelationsanalyse (Pearson) von gepaarten TTP (Flüssigkultur) und CFU-Schätzung des Mtb H37Ra-Wachstums in THP-1-Makrophagenlysaten aus mehreren Experimenten (n = 23), behandelt mit/ohne pharmakologische Reagenzien und infiziert bei MOI im Bereich von 1-2 bis 5-10 Bazillen/infizierten Makrophagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bewertung wirtsgerichteter Therapien für TB mit einem automatisierten Flüssigkultursystem. THP-1-Makrophagen wurden 3 h lang mit Mtb H37Ra infiziert, extrazelluläre Bakterien wurden entfernt und Zellen wurden mit Wirtstherapiekandidaten für bis zu 192 h behandelt. (A) CFU-Schätzung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit AtRA-Lösung (Sol) oder 2 μM AtRA-Mikropartikeln (MP) (10-20 μg/ml) behandelt wurden. (B) % Veränderung (Zeit bis zur Positivität TTP) in Makrophagen, die mit AtRA-Lösung oder AtRA PLGA MP behandelt wurden. Infizierte THP1-Zellen, die in 0,1% DMSO in cRPMI kultiviert wurden, wurden als unbehandelte Kontrollen bezeichnet. (C) Makrophagen wurden mit steigenden Konzentrationen von Linezolid-Lösung (0,6 μg/ml bis 5 μg/ml) behandelt, eine prozentuale Veränderung der TTP wurde 24 und 72 h nach der Infektion mit einem automatisierten Flüssigkultursystem bestimmt. (D) Makrophagen, die mit Mtb H37Ra infiziert waren, wurden mit Linezolid allein (1,25 μg/ml) oder Linezolid + IFNγ (5 ng/ml) bis zu 72 h behandelt, eine prozentuale Veränderung der TTP wurde berechnet. Unbehandelte Kontrollen bestanden aus infizierten THP1-Zellen, die in cRPMI allein für die angegebenen Zeiten kultiviert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Autoren haben die in diesem Protokoll beschriebene Flüssigkulturmethode verwendet, um das Mtb-Wachstum in Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und Alveolarmakrophagen und THP-1-Zellen zu überwachen, die mit PMA11,16,17 differenziert sind. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit nicht adhärenten Zellenmodifiziert werden 12. In jüngerer Zeit wurde das Instrument auch in präklinischen Studien verwendet, um inhalative all-trans-Retinsäure (AtRA) als HDT für TB17 zu bewerten. Kritische Schritte im Protokoll umfassen (1) die Kontrolle der Aufnahme von Mtb durch AFB-Färbung, um Faktoren wie differentielle Phagozytose aufgrund einer medikamentösen Vorbehandlung zu mildern und den Zelltod zu minimieren, der bei niedrigerem MOI weniger wahrscheinlich ist, (2) abhängig vom MOI müssen Zelllysate möglicherweise verdünnt werden, um den dynamischen Bereich des Assays zu maximieren. Das Streben nach einer TTP von etwa 5-12 Tagen hat zu reproduzierbaren Ergebnissen geführt.

In diesem Protokoll wurde abgeschwächtes Mtb H37Ra als Ersatz für virulentes Mtb verwendet, aber die Methode kann auch angewendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten gegen virulente Labor- und klinische Stämme in einer Containment Level 3-Einrichtung mit entsprechender Modifikation zu untersuchen. Die Bestätigung dieser Ergebnisse in einem Mausmodell für virulente TB, bei dem inhalatives AtRA, sowohl in Lösung als auch in Poly(lactic-co-glycolic acid (PLGA)-Mikropartikeln (MP), die Clearance von Mtb-H37Rv aus der Lunge signifikant verbesserte und gleichzeitig die Pathologie reduzierte, zeigt, dass H37Ra in diesen Studien ein hilfreicher Ersatz für virulentes Mtb ist17.

Da HDTs als Ergänzung zu herkömmlichen Therapeutika konzipiert sind, ist es wichtig, ihre Wirksamkeit in vitro in Kombination mit antituberkulösen Antibiotika zu bewerten, um mögliche Arzneimittelwechselwirkungen zu analysieren18. Um eine messbare TTP zu erhalten, müssen Antibiotika - insbesondere solche mit hoher intrazellulärer Wirksamkeit - zunächst auf suboptimale Konzentrationen (unterhalb der minimalen Hemmkonzentration) titriert werden, bevor HDT/Antibiotika-Kombinationen in Makrophagen bewertet werden. In dem in diesem Protokoll gezeigten Beispiel (Abbildung 2C,D) wurde Linezolid allein zunächst titriert, bevor es in Kombination mit IFN-γ evaluiert wurde. In einem anderen Beispiel werden Lysate von H37Ra-infizierten THP-1-Makrophagen, die mit Rifampicin bei oder über 0,6 μg/ml behandelt wurden, im Flüssigkultursystem nicht zuverlässig positiv17. Daher ist eine niedrigere Konzentration von Rifampicin erforderlich, um HDT in Kombination mit diesem Antibiotikum in Makrophagen zu bewerten.

Aufgrund der Tendenz von Mtb, Aggregate zu bilden, ist es notwendig, Klumpen aufzubrechen, um eine Einzelzellsuspension bereitzustellen, um eine gleichmäßige Aliquotierung von Mykobakterien in mehrere Vertiefungen kultivierter Makrophagen in jedem Experiment zu erreichen. In ähnlicher Weise wird dieser Disaggregationsschritt wiederholt, nachdem Makrophagen lysiert wurden, um eine genaue Schätzung des Wachstums zu ermöglichen. Im vorliegenden Protokoll werden die Mykobakterien mit einer Spritze durch eine 25-G-Nadel geleitet, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Andere Dispergierverfahren umfassen die Beschallung der mykobakteriellen Suspension in einem Ultraschallwasserbad oder das Vortexen mit Glasperlen19. Beide Techniken können jedoch die Zusammensetzung der äußeren Kapsel von Mtb 20,21 verändern und die Bindung an und Phagozytose durch Makrophagen21 beeinflussen.

Pharmakologische Verbindungen können die Aufnahme von Mykobakterien beeinflussen, wenn sie vor oder während der Infektion mit Makrophagen inkubiert werden. Darüber hinaus kann es bei Experimenten mit primären menschlichen Makrophagen zu Variationen in der Phagozytose von Mykobakterien zwischen den Spendern kommen. Unter diesen Umständen würde die Verwendung eines festen Verhältnisses von Mykobakterien: Makrophagen zu Unterschieden in der Aufnahme während der 3-stündigen Infektionsperiode führen. Dies kann zu falschen Annahmen über die Wirksamkeit von Verbindungen führen. Dies kann vermieden werden, indem eine Färbung für säurefeste Bazillen (AFB) unter Verwendung der hier beschriebenen Auraminmethode (oder einer anderen AFB-Färbung) in Gegenwart jedes HDT durchgeführt und das initiale Inokulum entsprechend angepasstwird 22. Während das AFB-Färbeverfahren aufgrund der Schwierigkeit, extrazelluläre von intrazellulären Mykobakterien zu unterscheiden19 und der Wahrscheinlichkeit, dass noch kleine Klumpen vorhanden sind, anfällig für eine gewisse Fehlermenge ist, hilft es, das anfängliche Niveau der intrazellulären Infektion für jede Behandlung auszugleichen.

In diesem Protokoll werden für Proben, die zu anderen Zeitpunkten als der ursprünglichen 3-stündigen Infektionsprobe entnommen wurden, das Lysat und der Überstand kombiniert, um intrazelluläre Mykobakterien und solche, die extrazellulär freigesetzt wurden, zu sammeln. Der Grund dafür ist, dass, da die Makrophagen nach der ersten 3-stündigen Inkubation mit Mtb gewaschen wurden, extrazelluläre Mykobakterien wahrscheinlich von nekrotischen Makrophagen freigesetzt wurden. Auf der anderen Seite, wenn Forscher es vorziehen, die verbleibenden intrazellulären Mykobakterien zu ernten und extrazelluläre Mykobakterien auszuschließen, ist diese Methode leicht daran anzupassen.

Vorteile automatisierter Flüssigkultur-basierter Instrumente im Vergleich zum festen Medium sind die einfache Einrichtung, ein effizienterer experimenteller Arbeitsablauf, da die Analyse serieller Verdünnungen nicht erforderlich ist, eine genaue Anzeige im Vergleich zur subjektiveren manuellen Zählung von Kolonien, schnellere Zeit bis zum Ergebnis (ca. 5-12 Tage im Vergleich zu 21 oder mehr für Agarplatten), und höhere Empfindlichkeit5. Nachteile sind (1) die Abhängigkeit von Forschern, die Zugang zu einem geeigneten Instrument haben, (2) der Kauf von Instrumentenflaschen kann die Kosten pro Probe erheblich erhöhen. Darüber hinaus (3) hängt der Nachweis des Wachstums von der bazillären Replikation ab: Subpopulationen von nicht replizierenden ruhenden Mykobakterien geben kein Signal23,24. Dieser Nachteil gilt jedoch auch für das Wachstum auf festen Datenträgern, und eine längere Inkubation in flüssigen Medien kann das Wachstum dieser Subpopulationen wiederherstellen25,26. Darüber hinaus (4) erfordert die Verwendung dieser flüssigen Brühekulturmethode die manuelle Ernte von Lysaten und wäre nicht für Arbeitsabläufe mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die zum Screening von Compound-Bibliotheken erforderlich sind. In solchen Fällen sind automatisierte Bildgebungssysteme eine praktischere Option27. Aber auch in Hochdurchsatzexperimenten ist es wichtig, die antimikrobielle Aktivität von Hits mit einer Methode zu bestätigen, die das Wachstum direktmisst 28. In Zukunft planen die Autoren, diese Methode zu verwenden, um die bakteriziden Wirkungen von Autophagie-induzierenden Medikamenten in Kombination mit herkömmlichen antituberkulösen Medikamenten auf das Mtb-Überleben in Makrophagen zu bewerten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Science Foundation Ireland (SFI 08/RFP/BMT1689), dem Health Research Board in Irland [HRA-POR/2012/4 und HRA-POR-2015-1145] und dem Royal City of Dublin Hospital Trust finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IX51 Fluorescent Microscope Olympus, Japan N/A AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile Sarstedt, North Carolina, USA 72.694.006 Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock BD Biosciences, San Jose, CA, USA SZR-150-031K Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile Sarstedt, North Carolina, USA 62.547.254 Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) Sigma Aldrich, Missouri, USA R2625 Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System Biomerieux ( Hampshire, UK) 247001 Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement Biomerieux ( Hampshire, UK) 414997 Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles Biomerieux ( Hampshire, UK) 419744 Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0553 Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0678 Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm Sarstedt, North Carolina, USA 83.1830 Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm Corning Incorporated, Germany 431219 Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness VWR International Limited 631 - 0147
Cycloheximide, from microbial Sigma Aldrich, Missouri, USA C7698 Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium Agilent Technologies Ireland Limited S3023 Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich, Missouri, USA D8537 Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco Thermo Fisher, Massachusetts, USA 10270106 Macrophage cell culture
Glycerol, Difco BD Biosciences, San Jose, CA, USA 228220 Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma Aldrich, Missouri, USA B2261 Nuclear stain
IFNγ, recombinant human R&D Systems Inc, Minnesota, USA 285-IF Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc Thermo Fisher, Massachusetts, USA TKT-210-150R Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous Sigma Aldrich, Missouri, USA A4159 Colony Forming Units
Linezolid Sigma Aldrich, Missouri, USA PZ0014 Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G BD Biosciences, San Jose, CA, USA 300400 Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0303 Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0178 Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer Scientific Device Laboratory, IL, USA 345-250 AFB stain
Paraformaldehyde Sigma Aldrich, Missouri, USA 158127 Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) Sarstedt, North Carolina, USA 82.1473.001 Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich, Missouri, USA P8139 Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco BD Biosciences, San Jose, CA, USA 231181 Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco Thermo Fisher, Massachusetts, USA 52400025 Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA RB-44103 Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc Thermo Fisher, Massachusetts, USA 156367 Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line ATCC, Virginia, USA ATCC TIB-202 Macrophage cell culture

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 174
Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose
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