Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

क्षय रोग के लिए मेजबान-निर्देशित उपचारों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण में उपयोग के लिए एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली

Published: August 16, 2021 doi: 10.3791/62838
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 2,3,4, 1, 1
1Department of Clinical Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, St. James's Hospital, Trinity College Dublin, The University of Dublin, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 3SFI Advanced Materials and Bioengineering Research (AMBER) Centre, RCSI & TCD, 4SFI Centre for Research in Medical Devices (CURAM), RCSI, Dublin and National University of Ireland

Summary

तपेदिक (टीबी) के खिलाफ बेहतर उपचारों को आगे बढ़ाने के लिए इंट्रासेल्युलर एम तपेदिक विकास का तेजी से और कुशल परिमाणीकरण महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल उम्मीदवार मेजबान-निर्देशित उपचारों के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज में एमटीबी वृद्धि को निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित तरल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके एक शोरबा-आधारित कलरमेट्रिक डिटेक्शन परख का वर्णन करता है।

Abstract

माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी), तपेदिक (टीबी) का प्रेरक एजेंट, कोविड-19 के आगमन तक विश्व स्तर पर सबसे महत्वपूर्ण संक्रामक रोग हत्यारा था। एमटीबी अपने इंट्रासेल्युलर वातावरण में बने रहने के लिए विकसित हुआ है, मेजबान सुरक्षा से बचता है, और कई एंटी-ट्यूबरकुलर दवाओं के लिए प्रतिरोध विकसित किया है। प्रतिरोध को हल करने के लिए एक दृष्टिकोण मौजूदा अनुमोदित दवाओं की पहचान कर रहा है जो एमटीबी के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देगा। इन दवाओं को उपचार के समय को कम करने और एंटीबायोटिक प्रतिरोध को दूर करने में मदद करने के लिए सहायक मेजबान-निर्देशित उपचार (एचडीटी) के रूप में पुन: उपयोग किया जा सकता है।

मैक्रोफेज में इंट्रासेल्युलर एमटीबी विकास का परिमाणीकरण संभावित एचडीटी का आकलन करने का एक महत्वपूर्ण पहलू है। एमटीबी विकास को मापने के लिए सोने का मानक आगर प्लेटों पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गिनती है। यह एक धीमी, श्रम-गहन परख है जो दवाओं की तेजी से जांच के लिए खुद को उधार नहीं देती है। इस प्रोटोकॉल में, एक स्वचालित, शोरबा-आधारित संस्कृति प्रणाली, जो आमतौर पर नैदानिक नमूनों में एमटीबी का पता लगाने के लिए उपयोग की जाती है, को मेजबान-निर्देशित उपचारों की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया गया है। एचडीटी के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज में इंट्रासेल्युलर एमटीबी वृद्धि की जांच करने के लिए तरल संस्कृति परख प्रणाली की क्षमता का मूल्यांकन किया गया था। एमटीबी विकास को रोकने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किए गए एचडीटी ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (एटीआरए) थे, जो पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए) माइक्रोपार्टिकल्स और इंटरफेरॉन-गामा और लाइनज़ोलिड के संयोजन में समाधान और समझाया गया था। सीएफयू विधि पर इस स्वचालित तरल संस्कृति-आधारित तकनीक के फायदों में सेटअप की सादगी, कम श्रम-गहन तैयारी और परिणामों के लिए तेजी से समय (एगर प्लेटों के लिए 21 दिनों या उससे अधिक की तुलना में 5-12 दिन) शामिल हैं।

Introduction

टीबी के प्रेरक एजेंट माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी), 2019 में विश्व स्तर पर सबसे महत्वपूर्ण संक्रामक रोगहत्यारा था। मेजबान सुरक्षा से बचने के लिए, एमटीबी मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) जैसी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की माइकोबैक्टीरिया गतिविधि को नष्ट कर देता है, जिससे यह इंट्रासेल्युलर रूप से बने रहने औरप्रतिकृति 2 की अनुमति देता है। वयस्क फुफ्फुसीय टीबी को रोकने के लिए एक प्रभावी टीके की कमी और दवा प्रतिरोधी उपभेदों के बढ़ते उद्भव ने नए उपचारों की तत्काल आवश्यकता को उजागर किया।

सहायक मेजबान-निर्देशित उपचार (एचडीटी) उपचार के समय को कम कर सकते हैं और प्रतिरोध को दूर करने में मदद करसकते हैं। मैक्रोफेज के भीतर माइकोबैक्टीरियाकार गतिविधि निर्धारित करने के लिए विट्रो में एचडीटी उम्मीदवारों का प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन अक्सर ठोस एगर प्लेटों पर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) द्वारा एमटीबी विकास की मात्रा का परिमाणीकरण पर निर्भर करता है। यह एक धीमी, श्रम-गहन परख है जो दवाओं की तेजी से जांच के लिए खुद को उधार नहीं देती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित, शोरबा-आधारित माइक्रोबियल डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग आमतौर पर नैदानिक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं में नैदानिक नमूनों में एमटीबी और अन्य माइकोबैक्टीरियल प्रजातियों का पता लगाने और दवा संवेदनशीलता परीक्षण के लिए कियाजाता है। ये उपकरण अप्रत्यक्ष रूप से जीवाणु चयापचय गतिविधि के आधार पर विकास को मापते हैं जिससे समय5 के साथ निगरानी किए गए कल्चर मीडिया (सीओ2 या ओ2 स्तर या दबाव में परिवर्तन) में शारीरिक परिवर्तन होते हैं। रीडआउट टाइम टू पॉजिटिविटी (टीपीपी) है, जिसे पहले 6,7 उपचार के जवाब में टीबी रोगियों के थूक के नमूनों में एमटीबी सीएफयू के साथ सहसंबंधित दिखाया गया है और संक्रमित मुराइन फेफड़े और प्लीहा8 के लाइसेट में दिखाया गया है। इसके अलावा, तरल संस्कृति का पता लगाने वाली प्रणालियों का उपयोग एक्सनिक संस्कृति और सुसंस्कृत मैक्रोफेज 9,10 में माइकोबैक्टीरिया के विकास पर पारंपरिक रोगज़नक़-निर्देशित उपचारों के प्रभाव को मापने के लिए किया गया है। उपकरण का उपयोग एमटीबी11,12 के इंट्रासेल्युलर विकास को नियंत्रित करने के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं और वायुकोशीय मैक्रोफेज की जन्मजात क्षमता की जांच करने के लिए भी किया गया है। यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक तरल संस्कृति नैदानिक प्रणाली को सुसंस्कृत मैक्रोफेज में टीबी के लिए एचडीटी की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सीएफयू गणना की तुलना में, इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरियल विकास / अस्तित्व को निर्धारित करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक श्रम और समय को काफी कम कर देता है। यह तकनीक एक स्वचालित संस्कृति उपकरण तक पहुंच पर निर्भर करती है जिसका उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरियल अस्तित्व का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जो मेजबान प्रतिरक्षा को बढ़ावा देने के लिए सेलुलर कार्यों को लक्षित करने वाले औषधीय अभिकर्मकों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ इलाज किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोगों को एमटीबी के क्षीण एच 37 आरए स्ट्रेन का उपयोग करके किया गया था, जिसे कंटेनमेंट लेवल 2 प्रयोगशाला में संभाला जा सकता है। लाइव माइकोबैक्टीरिया के सभी जोड़तोड़ द्वितीय श्रेणी जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किए गए थे। एरोसोल की पीढ़ी को कम करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को डिज़ाइन किया गया था। यूकेरियोटिक सेल कल्चर (टीएचपी -1 कोशिकाएं) भी कक्षा द्वितीय बीएससी में किया गया था। प्रयोगशाला ने जोखिम मूल्यांकन किया और यह सुनिश्चित किया कि सभी प्रक्रियाएं संस्थागत और राष्ट्रीय जैविक सुरक्षा नियमों के अनुरूप की गईं। मानव मोनोसाइटिक टीएचपी -1 सेल लाइन का उपयोग विधि को करने के लिए किया गया था जैसा कि वर्णित है (चरण 1)। माइकोबैक्टीरिया के संक्रमण से पहले फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) के साथ उत्तेजना के बाद कोशिकाओं को मैक्रोफेज में विभेदित किया जाता है।

1. सेल संस्कृति

  1. मध्यब्रुक 7एच9 (एमबी) शोरबा में लॉग चरण में एच 37 आरए बीज स्टॉक का प्रचार करें, जो एल्बुमिन-डेक्सट्रोज-कैटालेज (एडीसी) संवर्धन (10%) और 0.05% पॉलीसोरबेट 80 के साथ पूरक है। H37Ra स्टॉक को 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 1 एमएल एलिकोट में स्टोर करें।
  2. Mtb-H37Ra की 1 mL शीशी को पिघलाएं और इसे योजनाबद्ध प्रयोग से लगभग 1 सप्ताह पहले 9 mL एमबी पूरक शोरबा युक्त फ़िल्टर कैप के साथ T25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। एक स्थिर इनक्यूबेटर में 5-7 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. आरपीएमआई -1640 में टीएचपी -1 कोशिकाओं को गैर-गर्मी के साथ पूरक 10% भ्रूण बछड़े के सीरम (पूर्ण (सी) आरपीएमआई) को सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 5% सीओ2/37 डिग्री सेल्सियस पर टी 75 फ्लास्क में मार दिया गया और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल से कम घनत्व बनाए रखने के लिए प्रति सप्ताह दो बार उपसंस्कृति को विकसितकिया गया।
  4. संक्रमण से 3 दिन पहले टीएचपी -1 कोशिकाओं को मैक्रोफेज में अलग करें, किसी भी झुरमुट को फैलाने के लिए टी 75 फ्लास्क में सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को कई बार धीरे-धीरे पाइप करके और उन्हें 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाएं, सतह पर तैरने वाले को हटा देती हैं, और धीरे से आरपीएमआई के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करती हैं। कोशिकाओं/एमएल का अनुमान लगाने के लिए सेल गणना करें।
  6. 72 घंटे के लिए 100 एनजी / एमएल पीएमए के साथ सीआरपीएमआई में 100,000 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 12-वेल टिशू कल्चर प्लेटों में टीएचपी -1 मैक्रोफेज का बीज 2 एमएल। कोशिकाओं से पीएमए युक्त माध्यम को हटा दें और एमटीबी संक्रमण से पहले ताजा सीआरपीएमआई के साथ फिर से भरें।
  7. आवश्यक प्रत्येक समय बिंदु के लिए अलग-अलग प्लेटें सेट करें।
  8. संक्रमण की बहुलता (एमओआई) निर्धारित करने के लिए 2-वेल ग्लास चैंबर स्लाइड में समान घनत्व (100,000 कोशिकाओं / एमएल) पर बीज कोशिकाएं।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए 5% सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें।

2. एमटीबी अपटेक का परिमाणीकरण

  1. मैक्रोफेज (एमओआई) द्वारा एमटीबी अपटेक का निर्धारण
    1. संक्रमण के दिन द्वितीय श्रेणी जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) की स्थापना करें और किसी भी रिसाव को पकड़ने के लिए टिशू पेपर की दो परतों पर काम करें। स्थानीय नियमों के अनुसार अपशिष्ट त्याग कंटेनर स्थापित करें।
    2. टी 25 फ्लास्क से 6-8 एमएल माइकोबैक्टीरियल कल्चर निकालें और इसे 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: छोटे प्रयोगों के लिए छोटी मात्रा ट्यूबों का उपयोग किया जा सकता है।
    3. कमरे के तापमान पर 2890 x g पर 10 मिनट के लिए बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. सेंट्रीफ्यूज से ट्यूब को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे जैविक सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। बैक्टीरिया को बसने की अनुमति देने के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें।
      1. सतह पर तैरने वाले को कीटाणुनाशक फेंकने वाले कंटेनर, रिकैप ट्यूब में डालें, और ट्यूब के किनारे टैप करके शेष माध्यम में बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें। बैक्टीरिया को बसने की अनुमति देने के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें।
    5. पूर्व-गर्म सीआरपीएमआई के 2 एमएल जोड़ें, धीरे से मिलाएं, और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. 25 ग्राम सुई और 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके माइकोबैक्टीरिया को बहुत सावधानी से पुन: निलंबित करें। पुन: निलंबन के लिए, माइकोबैक्टीरिया निलंबन को सिरिंज में खींचें और एरोसोल उत्पादन को कम करने के लिए ट्यूब के साइडवॉल के नीचे बहुत धीरे से बाहर निकलें। 6-8 बार दोहराएं।
      नोट: अत्यधिक सावधानी बरतें क्योंकि यह माइकोबैक्टीरिया की एक उच्च घनत्व संस्कृति है। सुई स्टिक की चोट के जोखिम से बचने के लिए, जहां संभव हो कुंद सुइयों का उपयोग करें, और ल्यूर लॉक सिरिंज।
    7. बीएससी में एक शार्प कंटेनर में सुई और सिरिंज का निपटान करें।
    8. निलंबन को 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (स्क्रू-ऑन कैप के साथ) और सेंट्रीफ्यूज में 3 मिनट के लिए 100 x g पर 3 मिनट के लिए स्थानांतरित करें ताकि किसी भी शेष झुरमुट को गोली मार दी जा सके। ट्यूब को सुरक्षा कैबिनेट में वापस करें और बैक्टीरिया को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें।
    9. सतह पर तैरने वाले शीर्ष 1-1.5 एमएल को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। कीटाणुनाशक युक्त अपशिष्ट बाल्टी में मूल ट्यूब को फेंक दें। अच्छी तरह से मिलाएं और 2-वेल ग्लास चैंबर स्लाइड्स में माइकोबैक्टीरियल सस्पेंशन (जैसे, 5, 25, 50, 150 μL) की विभिन्न मात्रा जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सीओ2 इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. एसिड फास्ट बैक्टीरिया (एएफबी) के लिए धुंधलापन
    नोट: 3 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, मैक्रोफेज को माइकोबैक्टीरिया को निष्क्रिय करने के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ धोया और तय किया जाता है। स्लाइड्स को तब प्रति सेल माइकोबैक्टीरिया फागोसाइटोसिस का अनुमान लगाने के लिए एक संशोधित ऑरामाइन ओ किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके दाग दिया जाता है। उनकी मोमी कोशिका भित्ति के कारण, माइकोबैक्टीरिया एसिड-अल्कोहल धोने के बाद ऑरामाइन डाई को बनाए रखता है। मैक्रोफेज नाभिक को तब होचस्ट के साथ प्रति-दाग दिया जाता है। यह विधि प्रति सेल फागोसाइटोस्ड बैक्टीरिया की संख्या को गिनने की अनुमति देती है और मैक्रोफेज के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाती है।
    1. तीन बार ऊपर और नीचे पाइप करने के बाद ग्लास चैंबर स्लाइड से माध्यम को हटा दें ताकि उन जीवाणुओं को हटाया जा सके जिन्हें फागोसाइटोसिस नहीं किया गया है।
    2. कमरे के तापमान पीबीएस के 2 एमएल के साथ एक बार धो लें।
    3. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के स्टॉक स्टोर करें, जिसे पीबीएस में 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में भंग कर दिया गया है। उपयोग से तुरंत पहले 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का एक एलिकोट पिघलाएं। पीबीएस के साथ 2% पैराफॉर्मलडिहाइड को पतला करें और प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ग्लास चैंबर स्लाइड को धुंधला करने के लिए इस स्तर पर सुरक्षा कैबिनेट से हटाया जा सकता है।
    5. नल के पानी की कोमल धारा के नीचे स्लाइड को धो लें।
    6. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को कवर करने के लिए स्लाइड पर पर्याप्त ऑरामाइन वितरित करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर)।
    7. अतिरिक्त डाई को नल के पानी से स्लाइड से धो लें और अंधेरे में 1 मिनट के लिए डिकलराइज़र / बुझाने वाला जोड़ें।
    8. नल के पानी से अतिरिक्त पानी धो लें और अंधेरे में होचस्ट 33342 (पीबीएस में 10 μg / mL) के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    9. नल के पानी के साथ होचस्ट दाग को धो लें, कक्षों को हटा दें, स्लाइड से अतिरिक्त पानी निकालें, एंटीफेड और कवरस्लिप की एक बूंद जोड़ें, और हवा को सूखा दें।
    10. 100x तेल उद्देश्य का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड की जांच करें। माइकोबैक्टीरिया एफआईटीसी फिल्टर के तहत हरे रंग से रंग जाएगा। डीएपीआई फिल्टर (चित्रा 1 सी) के तहत नाभिक नीले रंग का होता है।
    11. प्रति सेल माइकोबैक्टीरिया फागोसाइटोसिस की संख्या और संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करके एमओआई निर्धारित करें।
    12. प्लेट में एक कुएं के सतह क्षेत्र के आधार पर आवश्यक एमओआई प्राप्त करने के लिए आवश्यक माइकोबैक्टीरियल निलंबन की मात्रा की गणना करें; उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में उपयोग किए गए ग्लास चैंबर स्लाइड का सतह क्षेत्र 4 सेमी2 है। कम एमओआई (लगभग 1-2 बेसिली / सेल) कई दिनों (जैसे, 5 दिनों) में किए गए प्रयोगों के लिए वांछनीय है।
  3. मैक्रोफेज का संक्रमण
    1. माइकोबैक्टीरिया निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं और वांछित एमओआई प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित होने के बाद 12-वेल प्लेटों पर कोशिकाओं के लिए आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    2. माइकोबैक्टीरिया को फागोसाइटोसिस करने की अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. कई बार गर्म आरपीएमआई या एचबीएसएस के साथ कुओं को धोकर बाह्य बैक्टीरिया को हटा दें।
    4. मैक्रोफेज को एक कुएं (3 एच नमूना) में ले जाएं ताकि प्रारंभिक इनोकुलम (3 एच नमूना) के सकारात्मकता (टीटीपी) के प्रतिशत समय को निर्धारित किया जा सके जैसा कि नीचे चरण 3 में उल्लिखित है।
    5. शेष कुओं में ताजा सीआरपीएमआई और आवश्यक दवा खुराक या वाहन नियंत्रण जोड़ें, आवश्यक समय के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करते हैं लेकिन आमतौर पर 1 से 8 दिनों के बीच कई अंतराल पर)।

3. तरल संस्कृति का पता लगाने वाली प्रणाली के लिए कटाई नमूने

नोट: संक्रमण के दिन, बाह्य माइकोबैक्टीरिया को धोने से हटा दिया जाता है, और इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरिया को मैक्रोफेज (3 एच नमूना) के एक कुएं के लाइसिस द्वारा काटा जाता है ताकि संक्रमण के लिए बेसलाइन नियंत्रण के रूप में प्रारंभिक मात्रा फागोसाइटोसिस निर्धारित की जा सके। बाद के समय में माध्यम, सेल लाइसेट और वॉश दोनों को कुल माइकोबैक्टीरियल विकास को मापने के लिए जोड़ा जाता है। यदि वांछित हो तो बाह्य और इंट्रासेल्युलर विकास का भी अलग से मूल्यांकन किया जा सकता है।

  1. टीटीपी निर्धारित करने के लिए कटाई 3 घंटे का नमूना
    1. चरण 2.3.3 में उल्लिखित संक्रमण के प्रारंभिक 3 घंटे के बाद सभी कुओं से बाह्य माइकोबैक्टीरिया को धो लें। बाद के समय बिंदुओं के साथ लाइसेट वॉल्यूम को बराबर करने के लिए 3 घंटे के नियंत्रण में 1 एमएल ताजा मीडिया जोड़ें।
      नोट: यदि बाह्य माइकोबैक्टीरिया को विश्लेषण से बाहर रखा जाना है तो चरण 3.2.7 देखें।
  2. नमूना संग्रह
    1. गर्म एमबी शोरबा और इंस्ट्रूमेंट कल्चर बोतलों को कमरे के तापमान पर लाने के लिए।
    2. माध्यम को 12-वेल प्लेट से संबंधित लेबल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. बाँझ लाइसिस बफर के 500 μL (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 को बाँझ 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया) 10 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में जोड़ें।
    4. धीरे से एक बाँझ स्क्रैपर के साथ कुएं से कोशिकाओं को खुरचें और उचित शंक्वाकार ट्यूब में माध्यम के साथ मिलाएं।
    5. बाँझ पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कुएं को धोएं और उचित ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. झुरमुट को तोड़ने के लिए धीरे-धीरे प्रत्येक नमूने को सुई और सिरिंज (25 ग्राम) के माध्यम से 6-8 बार पास करें। एमबी शोरबा में पतला नमूने 1:10; 100 μL नमूना + 900 μL MB माध्यम.
    7. आवश्यक समय /दिनों (आमतौर पर 1 से 8 दिनों के बीच) पर, ऊपर दिए गए चरण 3.2.1-3.2.6 का पालन करके शेष नमूने काट लें।
      नोट: जांचकर्ता अपने विश्लेषण से बाह्य माइकोबैक्टीरिया को बाहर करना पसंद कर सकते हैं, इस मामले में, ऊपर चरण 3.2.2 में, प्रत्येक कुएं से माध्यम को छोड़ दिया जाता है, और मैक्रोफेज को लाइसिस बफर जोड़ने से पहले कई बार धोया जाता है।
  3. उपकरण संवर्धन बोतलों को इंजेक्ट करना और लोड करना
    नोट: तरल संस्कृति उपकरण और संबंधित उपभोग्य सामग्रियों का विवरण सामग्री की तालिका में प्रदान किया गया है।
    1. उपकरण संस्कृति की बोतल की रबर कैप को 70% अल्कोहल में भिगोए गए टिशू पेपर के साथ निष्फल करें और इसे हवा में सूखने दें।
      नोट: यह कदम बीएससी में किया जाना चाहिए।
    2. सभी नमूनों के लिए पर्याप्त पोषक तत्वों की खुराक को शंक्वाकार ट्यूब (0.5 एमएल / बोतल) में स्थानांतरित करके बोतलें तैयार करें। उपकरण संस्कृति बोतल में 0.5 एमएल पोषक तत्व पूरक इंजेक्ट करने के लिए सुई और सिरिंज का उपयोग करें।
    3. पतला नमूना (1: 10) के पिपेट 500 μL को 1 एमएल वी-बॉटम ट्यूब में बदलें।
    4. असाइन किए गए उपकरण संस्कृति बोतल में 500 μL नमूने को इंजेक्ट करने के लिए सुई और सिरिंज का उपयोग करें।
    5. उपकरण संस्कृति की बोतल की रबर कैप को 70% अल्कोहल में भिगोए गए टिशू पेपर के साथ निष्फल करें और इसे हवा में सूखने दें। बीएससी से हटाने से पहले बोतलों को 70% अल्कोहल में भिगोए गए टिशू पेपर से पोंछें।
    6. जैव सुरक्षा कैबिनेट से बोतलों को लोडिंग के लिए उपकरण तक सावधानीपूर्वक परिवहन करें।
    7. स्वचालित माइक्रोबियल डिटेक्शन सिस्टम पर लोडिंग बटन दबाएं।
    8. इंस्ट्रूमेंट कल्चर बोतलों पर बारकोड स्कैन करें और बोतलों को 42 दिनों तक 37 डिग्री सेल्सियस पर डिटेक्शन सिस्टम इनक्यूबेटर में रखें। इंस्ट्रूमेंट स्क्रीन से सकारात्मकता तक पहुंचने में लगने वाले समय को पढ़ें और रिकॉर्ड करें।
      नोट: बारकोड उपकरण को बोतल की पहचान करने और किसी विशेष बोतल के साथ प्रतिबिंब रीडिंग लिंक करने की अनुमति देता है।
    9. प्रारंभिक इंट्रासेल्युलर इनोकुलम (दिन 0) के टीटीपी की तुलना संकेतित समय के लिए संवर्धित मैक्रोफेज के टीटीपी से करके सकारात्मकता (टीटीपी) के प्रतिशत समय की गणना करें। प्रतिशत टीटीपी में सकारात्मक परिवर्तन का अर्थ है माइकोबैक्टीरियल विकास13.
      उदाहरण के लिए, दिन 3 के लिए:
      सकारात्मकता के समय में प्रतिशत परिवर्तन = Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला स्वचालित तरल संस्कृति उपकरण हर 10 मिनट में सीओ2 स्तरों की निगरानी करता है। उपकरण की बोतल के निचले भाग में सेंसर में एक रंग परिवर्तन को रंगीन रूप से मापा जाता है और परावर्तन इकाइयों के रूप में व्यक्त किया जाता है। उपकरण सॉफ्टवेयर तब सकारात्मकता (टीटीपी) के समय की गणना करने के लिए डिटेक्शन एल्गोरिदम लागू करता है, यानी, टीकाकरण से संस्कृतियों तक के दिनों की संख्या को सकारात्मक के रूप में चिह्नित किया जाता है (चित्रा 1 ए)। प्रारंभिक इनोकुलम में टीटीपी और लॉग10सीएफयू (एगर प्लेट विधि द्वारा निर्धारित) 12 के बीच एक विपरीत संबंध चित्र 1 बी में चित्रित किया गया है। जब फार्माकोलॉजिकल इनहिबिटर (चित्रा 1 सी) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एमओआई में मैक्रोफेज-संक्रमित मैक्रोफेज के भीतर एमटीबी वृद्धि की तुलना वर्णित स्वचालित संस्कृति विधि द्वारा या ठोस आगर पर कॉलोनियों की गणना द्वारा की गई थी, तो दोनों विधियों द्वारा प्राप्त परिणामों के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध था (चित्रा 1 डी)। एमटीबी विकास को ग्राफिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए, टीटीपी में प्रतिशत परिवर्तन की गणना मैक्रोफेज के संक्रमण के बाद 8 दिनों तक टीटीपी मूल्यों की तुलना प्रारंभिक टीटीपी मान12 से करके ऊपर दिए गए समीकरण के अनुसार की गई थी। परिणामों ने तरल संस्कृति और सीएफयू के बीच एक समान प्रवृत्ति का प्रदर्शन किया, जो समाधान में एटीआरए की उपस्थिति में मैक्रोफेज में एमटीबी वृद्धि के महत्वपूर्ण अवरोध को दर्शाता है या पीएलजीए माइक्रोपार्टिकल्स (एमपी) (चित्रा 2 ए, बी) में एटीआरए की समकक्ष खुराक को दर्शाता है।

दूसरी पंक्ति के एंटीबायोटिक लाइनज़ोलिड के संयोजन में एक और एचडीटी, आईएफएन, जिसका उपयोग बहु-दवा प्रतिरोधी टीबी14 के इलाज के लिए किया गया है, की प्रभावकारिता की भी जांच की गई थी। एक खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग पहली बार संक्रमित टीएचपी -1 कोशिकाओं में किया गया था ताकि 0.6-5.0 μg / mL (चित्रा 2 सी) से लेकर सांद्रता पर अकेले लाइनज़ोलिड की प्रभावकारिता निर्धारित की जा सके, इससे पहले कि एक उप-खुराक (1.25 μg / mL) और IFN पर लाइनज़ोलिड के संयोजन का परीक्षण किया गया था: दवाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं थी (चित्रा 2 डी)।

Figure 1
चित्र 1: स्वचालित तरल संस्कृति और ठोस माध्यम पर एमटीबी विकास का परिमाणीकरण। एमटीबी एच 37 आरए को मिडिलब्रुक शोरबा में कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला (1: 2 से 1: 100,000) पर पतला किया गया था। प्रत्येक तनुकरण का 300 μL एलिकोट डुप्लिकेट इंस्ट्रूमेंट कल्चर बोतलों में इंजेक्ट किया गया था, तरल संस्कृति उपकरण पर इनक्यूबेट किया गया था, और उनकी वृद्धि की निगरानी की गई थी। इसके साथ ही, सीएफयू गणना के लिए तीन प्रतियों में 0.5% ग्लिसरॉल और 10% ओएडीसी (ओलिक एसिड, एल्बुमिन, डेक्सट्रोज, कैटालेज पूरक) युक्त एमबी एगर प्लेटों पर एक एलिकोट (10 μL) फैलाया गया था, जैसा कि पहले प्रकाशितकिया गया था। (ए) प्रत्येक कमजोर पड़ने की तरल संस्कृति प्रणाली से डेटा बिंदुओं को परावर्तनीयता इकाइयों बनाम समय15 के रूप में प्लॉट किया जाता है। नमूनों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए, पृष्ठभूमि को प्रत्येक नमूने के लिए 9 घंटे प्रतिबिंब पढ़ने के लिए सामान्यीकृत किया गया था। विकास की निगरानी कुल मिलाकर 42 दिनों के लिए की गई थी (पहले 21 दिन ग्राफ पर दिखाए गए हैं), सकारात्मकता का समय (टीटीपी) 3.83 से 11.1 दिनों तक था। (बी) पतला नमूनों से टीटीपी को लॉग10 सीएफयू अनुमान के खिलाफ प्लॉट किया गया था; प्रत्येक डेटा बिंदु एक प्रयोग से दो प्रतिकृतियों के मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है और दो अलग-अलग प्रयोगों का वर्णन करता है। सबसे अच्छा फिट और प्रतिगमन गुणांक (आर2) की रेखा दिखाई गई है। (सी) टीएचपी -1 मैक्रोफेज में इंट्रासेल्युलर एमटीबी एच 37 आरए के एएफबी धुंधला होने का उदाहरण ऑरामाइन (हरा) जिसका उपयोग संक्रमण की बहुलता की गणना करने के लिए किया जाता है, नाभिक को होचस्ट 333258 (नीले) के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है। छवियों को 100x (संख्यात्मक एपर्चर [NA], 1.3) तेल उद्देश्य के साथ एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। स्केल बार युग्मित टीटीपी (तरल संस्कृति) के सहसंबंध विश्लेषण (पियर्सन) और कई प्रयोगों (एन = 23) से टीएचपी -1 मैक्रोफेज लाइसेट में एमटीबी एच 37 आरए वृद्धि का सीएफयू अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है, औषधीय अभिकर्मकों के साथ या बिना इलाज किया जाता है और एमओआई में 1-2 से 5-10 बेसिली / संक्रमित मैक्रोफेज तक संक्रमित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक स्वचालित तरल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके टीबी के लिए मेजबान-निर्देशित उपचारों का मूल्यांकन। टीएचपी -1 मैक्रोफेज को 3 घंटे के लिए एमटीबी एच 37 आरए से संक्रमित किया गया था, बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया को हटा दिया गया था, और कोशिकाओं को 192 घंटे तक उम्मीदवार मेजबान-निर्देशित उपचारों के साथ इलाज किया गया था। (बी) एटीआरए समाधान या एटीआरए पीएलजीए एमपी के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज में (सकारात्मकता टीटीपी के समय) में % परिवर्तन। सीआरपीएमआई में 0.1% डीएमएसओ में संवर्धित संक्रमित टीएचपी 1 कोशिकाओं को अनुपचारित नियंत्रण के रूप में नामित किया गया था। (ग) मैक्रोफेज का इलाज लाइनज़ोलिड समाधान (0.6 μg/mL से 5 μg/mL) की बढ़ती सांद्रता के साथ किया गया था, टीटीपी में % परिवर्तन एक स्वचालित तरल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके संक्रमण के 24 और 72 घंटे बाद निर्धारित किया गया था। (डी) एमटीबी एच 37 आरए से संक्रमित मैक्रोफेज को अकेले लाइनज़ोलिड (1.25 μg / mL) या लाइनज़ोलिड + IFN (5 ng / mL) के साथ 72 घंटे तक इलाज किया गया था, टीटीपी में % परिवर्तन की गणना की गई थी। अनुपचारित नियंत्रणों में संकेतित समय के लिए अकेले सीआरपीएमआई में संवर्धित संक्रमित टीएचपी 1 कोशिकाएं शामिल थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

लेखकों ने इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरल संस्कृति विधि का उपयोग मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और वायुकोशीय मैक्रोफेज और टीएचपी -1 कोशिकाओं में एमटीबी वृद्धि की निगरानी के लिए किया है जो पीएमए 11,16,17 के साथ विभेदित हैं। इस तकनीक को गैर-अनुयायी कोशिकाओं12 के साथ उपयोग के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। हाल ही में, उपकरण का उपयोग प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में टीबी17 के लिए एचडीटी के रूप में इनहेल्ड ऑल-ट्रांस रेटिनोइक एसिड (एटीआरए) का मूल्यांकन करने के लिए भी किया गया था। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में (1) दवा पूर्व-उपचार के कारण अंतर फागोसाइटोसिस जैसे कारकों को कम करने के लिए एएफबी धुंधला द्वारा एमटीबी के उत्थान को नियंत्रित करना और सेल मृत्यु को कम करना शामिल है जो कम एमओआई पर होने की संभावना कम है, (2) एमओआई के आधार पर, परख की गतिशील सीमा को अधिकतम करने के लिए सेल लाइसेट को पतला करने की आवश्यकता हो सकती है। लगभग 5-12 दिनों के टीटीपी का लक्ष्य रखने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त हुए हैं।

इस प्रोटोकॉल में, एटेन्यूएटेड एमटीबी एच 37 आरए का उपयोग विषाक्त एमटीबी के लिए सरोगेट के रूप में किया गया है, लेकिन इस विधि को उचित संशोधन के साथ कंटेनमेंट लेवल 3 सुविधा में वायरल प्रयोगशाला और नैदानिक उपभेदों के खिलाफ दवा प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। वायरल टीबी के माउस मॉडल में इन परिणामों की पुष्टि, जिससे पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड (पीएलजीए) माइक्रोपार्टिकल्स (एमपी) में समाधान और एनकैप्सुलेटेड दोनों में इनहेल्ड एटीआरए ने पैथोलॉजी को कम करते हुए फेफड़ों से एमटीबी-एच 37 आरवी की निकासी में काफी सुधार किया है, यह इंगित करता है कि एच 37 आरएइन अध्ययनों में वायरल एमटीबी के लिए एक सहायक सरोगेट है।

चूंकि एचडीटी को पारंपरिक चिकित्सा विज्ञान के सहायक के रूप में उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, इसलिए संभावित दवा इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए एंटी-ट्यूबरकुलर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संयोजन में विट्रो मेंउनकी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना आवश्यक है। एक औसत दर्जे का टीटीपी प्राप्त करने के लिए, एंटीबायोटिक्स - विशेष रूप से उच्च इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता वाले - मैक्रोफेज में एचडीटी / एंटीबायोटिक संयोजनों का मूल्यांकन करने से पहले सबसे पहले उप-मानक सांद्रता (न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता से नीचे) में टाइट किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2 सी, डी) में दिखाए गए उदाहरण में, आईएफएन-γ के साथ संयोजन में मूल्यांकन किए जाने से पहले अकेले लाइनज़ोलिड को पहले टाइटरेट किया गया था। एक अन्य उदाहरण में, एच 37 आरए-संक्रमित टीएचपी -1 मैक्रोफेज के लाइसेट 0.6 μg / mL पर या उससे ऊपर रिफैम्पिसिन के साथ इलाज किया जाता है, तरल संस्कृति प्रणाली17 में मज़बूती से सकारात्मक नहीं होते हैं। इसलिए, मैक्रोफेज में इस एंटीबायोटिक के साथ संयुक्त किसी भी एचडीटी का मूल्यांकन करने के लिए रिफैम्पिसिन की कम सांद्रता की आवश्यकता होती है।

समुच्चय बनाने के लिए एमटीबी की प्रवृत्ति के कारण, प्रत्येक प्रयोग में सुसंस्कृत मैक्रोफेज के कई कुओं में माइकोबैक्टीरिया के समान एलिकोटिंग प्राप्त करने के लिए एकल कोशिका निलंबन प्रदान करने के लिए झुरमुट को तोड़ना आवश्यक है। इसी तरह, विकास का सटीक अनुमान प्रदान करने के लिए मैक्रोफेज को लाइस किए जाने के बाद इस विघटन चरण को दोहराया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, माइकोबैक्टीरिया को एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करने के लिए सिरिंज का उपयोग करके 25 ग्राम सुई के माध्यम से पारित किया जाता है। अन्य फैलाव विधियों में माइकोबैक्टीरियल सस्पेंशन का सोनिकेशन एक सोनिकिंग वाटर बाथ में या ग्लास बीड्स19 के साथ भंवर शामिल है। हालांकि, ये दोनों तकनीकें एमटीबी20,21 के बाहरी कैप्सूल की संरचना को बदल सकती हैं और मैक्रोफेज 21 द्वारा फागोसाइटोसिस को बांधने को प्रभावित कर सकती हैं।

औषधीय यौगिक माइकोबैक्टीरिया के उत्थान को प्रभावित कर सकते हैं यदि उन्हें संक्रमण से पहले या दौरान मैक्रोफेज के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इसके अलावा, प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के साथ प्रयोग करते समय, दाताओं के बीच माइकोबैक्टीरिया के फागोसाइटोसिस में भिन्नता हो सकती है। इन परिस्थितियों में, माइकोबैक्टीरिया के एक निश्चित अनुपात का उपयोग करके: मैक्रोफेज 3 घंटे की संक्रमण अवधि के दौरान अपटेक में अंतर पैदा करेगा। इससे यौगिकों की प्रभावकारिता के बारे में गलत धारणाएं हो सकती हैं। प्रत्येक एचडीटी की उपस्थिति में यहां वर्णित ऑरामाइन विधि (या एक अन्य एएफबी दाग) का उपयोग करके एसिड फास्ट बेसिली (एएफबी) के लिए धुंधला करने और तदनुसार प्रारंभिक इनोकुलम को समायोजित करके इससे बचा जा सकताहै। इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरिया19 से बाह्य कोशिकीय को अलग करने में कठिनाई के कारण एक निश्चित मात्रा में त्रुटि का खतरा होता है और संभावना है कि छोटे झुरमुट अभी भी मौजूद हैं, एएफबी धुंधला प्रक्रिया प्रत्येक उपचार के लिए इंट्रासेल्युलर संक्रमण के प्रारंभिक स्तर को बराबर करने में मदद करती है।

इस प्रोटोकॉल में, प्रारंभिक 3 एच संक्रमण नमूने के अलावा कई बार एकत्र किए गए नमूनों के लिए, लाइसेट और सुपरनैटेंट को इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरिया और उन लोगों को एकत्र करने के लिए जोड़ा जाता है जिन्हें बाह्य रूप से जारी किया गया है। इसका कारण यह है कि, चूंकि मैक्रोफेज को एमटीबी के साथ शुरुआती 3 घंटे इनक्यूबेशन के बाद धोया गया है, इसलिए मौजूद बाह्य माइकोबैक्टीरिया को नेक्रोटिक मैक्रोफेज द्वारा जारी किए जाने की संभावना है। दूसरी ओर, यदि जांचकर्ता शेष इंट्रासेल्युलर माइकोबैक्टीरिया की कटाई करना पसंद करते हैं और बाह्य माइकोबैक्टीरिया को बाहर करते हैं, तो यह विधि आसानी से ऐसा करने के लिए अनुकूलित होती है।

ठोस माध्यम की तुलना में स्वचालित तरल संस्कृति-आधारित उपकरणों के लाभ सेट अप की सादगी है, एक अधिक कुशल प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो क्योंकि सीरियल कमजोर पड़ने का विश्लेषण अनावश्यक है, कॉलोनियों की अधिक व्यक्तिपरक मैनुअल गिनती की तुलना में एक सटीक रीडआउट प्राप्त किया जाता है, परिणामों के लिए तेज समय (आगर प्लेटों के लिए 21 या अधिक की तुलना में लगभग 5-12 दिन), और उच्च संवेदनशीलता5. नुकसान में शामिल हैं (1) एक उपयुक्त उपकरण तक पहुंच रखने वाले शोधकर्ताओं पर निर्भरता, (2) उपकरण की बोतलों की खरीद प्रति नमूने लागत में काफी वृद्धि कर सकती है। इसके अलावा, (3) विकास का पता लगाना बेसिलरी प्रतिकृति पर निर्भर करता है: गैर-प्रतिकृति निष्क्रिय माइकोबैक्टीरिया की उप-आबादी23,24 संकेत नहीं देगी। हालांकि, यह दोष ठोस मीडिया पर विकास पर भी लागू होता है और तरल मीडिया में लंबे समय तक इनक्यूबेशन इन उप-आबादी25,26 के विकास को बहाल कर सकता है। इसके अलावा, (4) इस तरल शोरबा संस्कृति विधि का उपयोग करने के लिए लाइसेट की मैन्युअल कटाई की आवश्यकता होती है और यौगिक पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए आवश्यक मध्यम से उच्च थ्रूपुट वर्कफ़्लो के लिए उपयुक्त नहीं होगा। ऐसे मामलों में, स्वचालित इमेजिंग सिस्टम एक अधिकव्यावहारिक विकल्प हैं। हालांकि, उच्च थ्रूपुट प्रयोगों में भी, एक विधि का उपयोग करके हिट की रोगाणुरोधी गतिविधि की पुष्टि करना आवश्यक है जो सीधे28 विकास को मापता है। भविष्य में, लेखक मैक्रोफेज में एमटीबी अस्तित्व पर पारंपरिक एंटी-ट्यूबरकुलर दवाओं के संयोजन में ऑटोफैगी-उत्प्रेरण दवाओं के जीवाणुनाशक प्रभावों का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को साइंस फाउंडेशन आयरलैंड (एसएफआई 08/ आरएफपी / बीएमटी 1689), आयरलैंड में स्वास्थ्य अनुसंधान बोर्ड [एचआरए-पीओआर / 2012/4 और एचआरए-पीओआर -2015-1145] और डबलिन अस्पताल ट्रस्ट के रॉयल सिटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IX51 Fluorescent Microscope Olympus, Japan N/A AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile Sarstedt, North Carolina, USA 72.694.006 Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock BD Biosciences, San Jose, CA, USA SZR-150-031K Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile Sarstedt, North Carolina, USA 62.547.254 Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC) Sigma Aldrich, Missouri, USA R2625 Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System Biomerieux ( Hampshire, UK) 247001 Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement Biomerieux ( Hampshire, UK) 414997 Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles Biomerieux ( Hampshire, UK) 419744 Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0553 Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0678 Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm Sarstedt, North Carolina, USA 83.1830 Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm Corning Incorporated, Germany 431219 Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness VWR International Limited 631 - 0147
Cycloheximide, from microbial Sigma Aldrich, Missouri, USA C7698 Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium Agilent Technologies Ireland Limited S3023 Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich, Missouri, USA D8537 Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco Thermo Fisher, Massachusetts, USA 10270106 Macrophage cell culture
Glycerol, Difco BD Biosciences, San Jose, CA, USA 228220 Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) Sigma Aldrich, Missouri, USA B2261 Nuclear stain
IFNγ, recombinant human R&D Systems Inc, Minnesota, USA 285-IF Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc Thermo Fisher, Massachusetts, USA TKT-210-150R Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous Sigma Aldrich, Missouri, USA A4159 Colony Forming Units
Linezolid Sigma Aldrich, Missouri, USA PZ0014 Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G BD Biosciences, San Jose, CA, USA 300400 Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0303 Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base BD Biosciences, San Jose, CA, USA M0178 Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer Scientific Device Laboratory, IL, USA 345-250 AFB stain
Paraformaldehyde Sigma Aldrich, Missouri, USA 158127 Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag) Sarstedt, North Carolina, USA 82.1473.001 Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich, Missouri, USA P8139 Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco BD Biosciences, San Jose, CA, USA 231181 Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco Thermo Fisher, Massachusetts, USA 52400025 Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA RB-44103 Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc Thermo Fisher, Massachusetts, USA 156367 Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line ATCC, Virginia, USA ATCC TIB-202 Macrophage cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global Tuberculosis Report. World Health Organization. , Geneva. (2020).
  2. Russell, D. G. Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection. Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).
  3. Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis. Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).
  4. Angeby, K. A., et al. Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).
  5. Asmar, S., Drancourt, M. Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries. Frontiers in Microbiology. 6, 1184 (2015).
  6. Diacon, A. H., et al. Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents. Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).
  7. Diacon, A. H., et al. Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens. Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).
  8. O'Sullivan, D. M., et al. Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models. Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).
  9. Heinrichs, M., et al. Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs. International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).
  10. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).
  11. O'Leary, S. M., et al. Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).
  12. Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells. BMC Microbiology. 11, 237 (2011).
  13. Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages. The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).
  14. Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review. International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).
  15. Thorpe, T. C., et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).
  16. Gleeson, L. E., et al. Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication. The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).
  17. O'Connor, G., et al. Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).
  18. O'Connor, G., et al. Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).
  19. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
  20. Ortalo-Magne, A., et al. Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).
  21. Stokes, R. W., et al. The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages. Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).
  22. O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).
  23. Cheon, S. H., et al. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).
  24. Nathan, C., Barry, C. E. TB drug development: immunology at the table. Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).
  25. Bowness, R., et al. The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).
  26. Basu Roy, R., et al. An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes. Frontiers in Pediatrics. 7, 151 (2019).
  27. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645 (2009).
  28. Franzblau, S. G., et al. Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 174
क्षय रोग के लिए मेजबान-निर्देशित उपचारों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण में उपयोग के लिए एक स्वचालित संस्कृति प्रणाली
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O’Leary, S., Bahlool, A. Z.,… More

O’Leary, S., Bahlool, A. Z., O’Connor, G., Cryan, S. A., Keane, J. M., O’Sullivan, M. P. An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis. J. Vis. Exp. (174), e62838, doi:10.3791/62838 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter