Summary
最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。
Abstract
酵母ミトコンドリアプロテオームの特徴付けの最近の進歩にもかかわらず、かなりの数のタンパク質の局所的な局在は依然として不可解である。ここでは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられる酵母ミトコンドリアタンパク質の副組織化機能の局在を決定するための堅牢かつ効果的な方法について述べた。この方法は、非常に純粋な無傷のミトコンドリアを得ることを含む最初のステップを含む。これらのミトコンドリア製剤は、次に、低張性ショック(腫脹)およびプロテナーゼK(プロテアーゼ)によるインキュベーションからなる亜分画プロトコールを受ける。腫脹の間、外のミトコンドリア膜は選択的に破壊され、プロテイナーゼKが膜間空間コンパートメントのタンパク質を消化することを可能にする。並行して、膜タンパク質のトポロジーに関する情報を得るために、ミトコンドリア製剤は、最初に超音波処理され、次いで炭酸ナトリウムによるアルカリ抽出を行う。最後に、遠心分離後、これらの異なる治療からのペレットおよび上清画分は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析される。局所的局在化と、関心のあるタンパク質の膜トポロジーは、そのウェスタンブロットプロファイルを既知の標準と比較することによって得られる。
Introduction
ミトコンドリアは、生物エネルギー、細胞代謝、およびシグナル伝達経路において重要な役割を果たす真核細胞の重要なオルガネラである1。これらのタスクを適切に実行するために, ミトコンドリアは、その構造と機能を担当するタンパク質と脂質のユニークなセットに依存しています。.出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、ミトコンドリアプロセスおよび他のオルガネラ2の研究のためのモデルシステムとして広く使用されています。酵母の8つのタンパク質についてのミトコンドリアゲノムコード;ミトコンドリアタンパク質の大部分(99%)は、細胞質リボソームに翻訳された核遺伝子によってコード化され、その後、高度なタンパク質輸入機によって正しいサブコションコンパートメントに輸入されます3,4,5。したがって、ミトコンドリアの生生成は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の協調発現に依存する6,7。ミトコンドリア生検における欠損を引き起こす遺伝子変異は、ヒト疾患8,9,10と関連している。
過去20年間で、高精製ミトコンドリアを標的としたハイスループットプロテオミクス研究は、酵母ミトコンドリアプロテオームの包括的な特性化をもたらし、少なくとも900タンパク質11,12,13,14から構成されると推定されています。これらの研究は貴重な情報を提供したが、4つのミトコンドリアサブコンパートメントにおける各タンパク質のサブオーガネラの局在、すなわち、外膜(OM)、膜間空間(IMS)、内膜(IM)、およびマトリックスが依然として必要である。この質問は、2つの小さなミトコンドリアサブコンパートメント(OMおよびIMS)15,16のプロテオミオミ全体の研究で部分的に対処された。最近では、Vögtleと共同研究者は、酵母におけるサブコションドリアルタンパク質分布の高品質なグローバルマップを生成することで大きな前進を遂げた。著者らは、SILACベースの定量的質量分析、異なるサブコセンドローム分画プロトコル、およびOMおよびIMSプロテオームからのデータセットを組み合わせた統合アプローチを用いて、818タンパク質を4つのミトコンドリアサブコンパートメント13に割り当てた。
これらのハイスループットプロテオーム研究によって達成された進歩にもかかわらず、提出プロテオーム組成に関する我々の知識は決して完全ではないほどです。実際、Vögtleおよび共同研究者によって酵母ミトコンドリアに局在していると報告された986タンパク質のうち、168は4つのサブソキアドリアコンパートメント13のいずれにも割り当てることができなかった。さらに、ミトコンドリア膜の周囲に末梢に付着すると予測されたタンパク質の膜トポロジーに関する情報は提供しなかった。例えば、内膜に末梢に付着したタンパク質がマトリックスや膜間空間に向いているかどうかを知ることはできない。プロテオーム全体の研究からこれらの欠けているデータとは別に、かなりの数のミトコンドリアタンパク質のサブオーガネラの局在に関する矛盾する情報があります。その一例が、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGD)やユニプロットなどの一般的なデータベースで膜間空間タンパク質として割り当てられたプロテアーゼPrd1です。驚くべきことに、ここで説明したような亜分解析プロトコルを使用して、Vögtleと共同研究者は、Prd1が本物のマトリックスタンパク質13であることを明確に示した。前述のように、多くのミトコンドリアタンパク質の局所的な局在化を解明または再評価する必要があります。ここでは、酵母ミトコンドリアタンパク質の副オーガンエリアの局在を決定するための、シンプルで信頼性の高いプロトコルを提供します。このプロトコルは、様々な研究グループによって開発され、最適化され、多くのミトコンドリアタンパク質の膜トポロジーと同様に、サブソクオントリアル局在化を決定するために日常的に使用されてきました。
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Protocol
1. 酵母細胞の増殖
- 細胞の小さな部分を-80°CグリセロールストックからYPD(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)寒天プレートにストリークさせることにより、目的の株の単一コロニーを単一分離する。プレートを30°Cで2~3日間インキュベートします。
注:このプロトコルで使用されるS.セレビシエ株はBY4741(MATα;;彼の3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;ura3Δ0)。栄養マーカー遺伝子を除いて、この株は、任意の削除された遺伝子を含んでいないし、任意のプラスミドを運びません。これにより、豊かな培地での培養に成功し、活発な細胞増殖を刺激することができる。プラスミドで形質転換した株を使用する場合は、プラスミド選択に適切な最小培地を使用してください。 - 100 mL のエルレンマイヤーフラスコに YPGal 培地(1%酵母エキス、2% ペプトン、2%ガラクトース)の YPD 寒天プレートから 2-3 個のコロニーを接種してスターター培養を準備します。30°Cで24時間、激しく揺れ動く。
注:成長培地の選択は、プロトコルで使用される酵母株に依存します。YPDとYPGalの両方が発酵性炭素源を含み、ミトコンドリア呼吸を行わない株の増殖を可能にする。しかし、グルコースは多くのミトコンドリア遺伝子の発現を抑制するので、ミトコンドリアの量が少ないため、この炭素源を使用することは推奨されない。呼吸の有能な菌株を用いて呼吸を行う場合、グリセロールやエタノールなどの炭素源を用いて、ミトコンドリアの収率を高くする試みも可能である。 - スターター培養液を1Lの新鮮なYPGal培地に希釈し、0.1未満のOD600 にします。OD600が1-1.5に達するまで激しく揺れ、30 °Cで細胞を培養します。
注:実験を行う前に、酵母株ごとに成長率(倍率)を決定します。これは、培養が1-1.5のOD600 に到達するために必要なインキュベーションの時間の正確な推定値を提供します。
2. 高精製ミトコンドリアの分離
注: このプロトコルは、マイナーな変更で17から適応されています。
- 室温で5分間3,000xgで遠心分離して細胞を収穫します。
- 蒸留水で細胞を洗い、室温で5分間3,000 x g で遠心分離して回収します。
- 細胞のぬれた重量を決定します。
注: ステップ 2.2 から細胞ペレットの重量を測定する最も簡単な方法は、セルのコレクションの直前に空の遠心管の重量を決定することです。遠心分離後、上清を捨て、細胞と同じチューブの重量を測定します。細胞の重量は、2つの測定値の差です。 - パスツールピペットまたはP5000チップを使用して、DTTバッファー(細胞1 g当たり2 mL)の細胞を再懸濁します。DDT バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
- 穏やかな揺れ(〜70rpm)で20分間、30°Cで細胞をインキュベートします。
- 遠心分離機を室温で5分間3,000xgで細胞をペレット化する。
- 酵素を使わずにザイモリャーゼ緩衝液で細胞を洗浄する(細胞1g当たり約7mL)。
Zymolyase バッファーの組成については 、表 1 を参照してください。 - 遠心分離機を室温で5分間3,000xgで細胞をペレット化する。
- ジモリヤーゼ(細胞1g当たり7mL)を使用せずに、バッファー内の細胞を再懸濁させる。
- 細胞懸濁液を250 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、Zymolyase-20T(1gウェットウェイトあたり3mg)を加えます。
- 穏やかな揺れ(〜70 rpm)で30〜40分間、細胞を30°Cでインキュベートします。Zymolyase処理前後の細胞懸濁度を比較して、このプロセスの効率を確認してください。
注:このステップでは、細胞はZymolyaseによる細胞壁消化のために球体に変換されます。- このために、各セル懸濁液の50 μLを加える 2 mL の水を含むガラス管を別々に。激しく混合した後、ジモリャーゼで処理した細胞懸濁液の濁度は、球状体の浸透性破壊のために急速に減少するはずです。一方、非処理細胞懸濁液の濁度は変わらないべきである。
注:濁りの影響は、簡単な目視検査によって、または両方のサンプルのOD600 を測定することによっても監視することができます。第2の場合において、Zymolyase処理サンプルのOD600 は、非処理サンプルの10%〜20%であるべきである。別の方法は、光顕微鏡を使用して両方のサンプルの細胞を数える必要があります。 - 球形芽球形成の収率が低い場合は、さらにZymolyaseを加え、さらに15分間インキュベートします。
- このために、各セル懸濁液の50 μLを加える 2 mL の水を含むガラス管を別々に。激しく混合した後、ジモリャーゼで処理した細胞懸濁液の濁度は、球状体の浸透性破壊のために急速に減少するはずです。一方、非処理細胞懸濁液の濁度は変わらないべきである。
- 4°Cで5分間、2500 x g で遠心分離により球状体を収穫する。
注:加水分解酵素によるタンパク質の分解を避けるために、さらなるステップはすべて、氷上または4°Cで迅速に行う必要があります。 - 4°Cで5分間、氷冷均質化バッファー(細胞1gあたり約6.5mL)と2,500 x g の遠心分離機でペレットを2回洗浄します。 ホモジナイゼーション・バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
- 氷冷ホモジナイゼーションバッファー(細胞1g当たり6.5 mL)のスフェロプラストを再懸濁し、予冷ガラスDounceホモジナイザーに移します。約30mLの大型ガラスホモジナイザーを使用してください。
- 害虫を使用して15ストロークで球状体を均質化します。
注: ストロークの数は、害虫のフィッティングに応じて調整する必要があります。きつい害虫の場合は、15ストロークで十分です。一方、緩い害虫を使用する場合は、最大25ストロークを行うことをお勧めします。 - ホモゲン酸を50 mL遠心分離管に移し、氷冷均質化バッファーを1ボリューム加えます。
- ホモジェン酸を低速で遠心し、ペレット核、細胞デブリ、および切れ目のない細胞に4°Cで5分間1,500 x g 。
- ペレットを破壊しないように注意して、パスツールピペットまたはP5000チップを使用して新しい50 mL遠心分離チューブに上清を移します。
- 4°Cで5分間4,000 x g で遠心分離機。
- 上清を高速遠心管に移し、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間15分間、粗いミトコンドリア分率をペレットにします。
- 上清を捨て、P5000チップを使用して穏やかなピペット処理を行い、20〜30 mLの氷冷ホモジナイジングバッファーで粗ミトコンドリアペレットを穏やかに洗浄します。
- 懸濁液を50mL遠心分離管に移し、4000 x g で4°Cで5分間遠心分離機を動かして、残りの細胞デブリをペレットにします。
- 上清を高速遠心管に移し、遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間15分間、粗いミトコンドリア分率をペレットにします。
- 上清を捨て、P1000チップを使用して穏やかなピペット処理を行い、氷冷SEMバッファーの少量(通常は1000 μL)の粗ミトコンドリアペレットを穏やかに再懸濁します。SEM バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
注:この粗ミトコンドリア画分は 、オルガネロ タンパク質輸入アッセイなどの一部のアプリケーションで直接使用できますが、他の細胞成分のかなりの量が含まれています。これらの汚染は、タンパク質の局所的な局所的な局所化を決定する際に、結果の誤解を招く可能性があります。したがって、以下に説明するように、高度に精製されたミトコンドリア製剤を得るためにさらなる精製工程が必要である。 - 60%、32%、23%、および15%(w/v)の濃度で、EMバッファーにスクロース溶液を調製します。これらのソリューションは、4 °Cで最大1ヶ月間安定しています。 EM バッファー構成については 、表 1 を参照してください。
- 超遠心チューブに4ステップのスクロース勾配を用意します:遠心管の底に60%(w/v)のスクロースを1.5 mL置きます。次に、ピペットを慎重に段階的に:32%の4 mL、23%の1.5 mL、および15%スクロースの1.5 mL(w/v)。フェーズを中断しないように注意してください。
- 粗ミトコンドリア分画をショ糖勾配の上に慎重にロードします。
- 振るバケットローターで4°Cで134,000 x g で1時間の遠心分離機。
- 60%/32%のショ糖界面で茶色のバンドで表される高度に精製されたミトコンドリア分率に達するまで、慎重にスクロース溶液を取り除き続けてください。
- P1000カットチップを使用して精製ミトコンドリアを回収し、あらかじめ冷やされた高速遠心管に入れ。
- 回収したミトコンドリアを5~10分の氷冷SEMバッファーで希釈します。
- 遠心分離機は4°Cで12,000 x g で30分間
- P1000カットチップを使用して穏やかなピペット処理を行い、純粋なミトコンドリアを500 μLの氷冷SEMバッファーに再懸濁します。
- 製造者の指示に従ってブラッドフォードの手順を使用して、高度に精製されたミトコンドリア製剤のタンパク質濃度を決定します。氷冷SEMバッファーを使用してタンパク質濃度を10mgのタンパク質/mLに調整します。
注: 以下に説明する提出分画プロトコルでは、作りたてのミトコンドリアを使用することをお勧めします。しかし、Vögtleと共同研究者は、ミトコンドリア無傷の詳細な品質管理分析を行い、凍結されたオルガネラもこのプロトコル13で使用できることを示した。このために、40 μLのアリコートを作り、液体窒素で凍結します。-80°Cで保管してください。
3. サブソクオンドリアル分画議定書
注:このプロトコルはreference18 から適応され、(1)プロテイナーゼKの存在または不在における低血圧腫脹、および(2)超音波処理に続いて炭酸塩抽出の2つのステップで構成されています。タンパク質の分解を避けるために、氷上または4°Cで両方のプロトコルのすべてのステップを実行します。
- プロテナーゼKの存在下での低血圧腫脹
- 高度に精製されたミトコンドリア40 μLを10 mg/mL(400 μg)で4つの1.5 mLの予冷標識マイクロ遠心チューブに移します。
- 360 μL の SEM バッファーをチューブ 1 と 2 に追加します。
- 360 μL の EM バッファをチューブ 3 と 4 に追加します。
- チューブ2と4に4μLのプロテイナーゼK(10mg/mL)を加えます。間違いを防ぐために 、表 2 に記載されているピペット方式を使用します。
注:使用前に、10 mg/mL溶液のプロテイナーゼKを水に入れ、準備してください。実験におけるプロテナーゼKの最終濃度は、約50〜100μg/mLである必要があります。詳細については 、「ディスカッション」 セクションを参照してください。 - すべてのチューブを穏やかに混ぜ、時折混合して30分間氷の上でインキュベートします。
- 4本のチューブに4μLの200mM PMSFを加えるため、プロテナーゼK活性を停止します。
注意:PMSFは非常に有毒です。PMSF を含むソリューションを使用する場合は、手袋を着用してください。 - 4°Cで30分間20,000xgで遠心分離機。
- 上清を収集し、新しい1.5 mLの事前冷蔵ラベル付きマイクロ遠心分離管に移します。ペレットを破壊しないように注意してください。
注:ペレットは、さらなるSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析のためにサンプルバッファに直接再懸濁させることができます。しかし、PMSF処理後もプロテナーゼKの痕跡は活性を保ち、最終的にはペレットがSDS含有サンプルバッファーに溶解した後に一部のタンパク質を消化することができる。この問題を回避するために、以下に説明するトリクロロ酢酸(TCA)による試料の処理により、プロテナーゼKを完全に不活性化することができる。
注意:TCAは非常に有毒です。TCA を含むソリューションを扱う場合は手袋を着用してください。 - ステップ3.1.8からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLで再懸濁します。
- 上清(ステップ3.1.8から)と再懸濁されたペレット(ステップ3.1.9から)をTCAで沈殿させ、最終濃度10%(w/v)にします。
- 氷上のすべてのチューブを10分間インキュベートします。
- TCA処理サンプルを10分間、4°Cで12,000 x g で遠心分離します。
- 上清を取り除き、サンプルバッファーの200 μL でペレットを再懸濁します。
注:酸処理のためにブロモフェノールブルーpHインジケータが黄色になる可能性があります。この場合は、青色になるまで 1 M トリス ベースの小さなアリコート (1 ~ 5 μL) を追加します。 - すべてのチューブに4μLの200 mM PMSFを加えます。
- SDS-PAGEとウェスタンブロットによる分析が終わるまで、すべてのサンプルを-80 °Cで保管してください。
- 超音波処理と炭酸塩抽出
注:このプロトコルでは、超音波処理がミトコンドリア膜の破裂を引き起こすと、作りたてのミトコンドリアを使用する必要はありません。- 高精製ミトコンドリア200 μLを10 mg/mL(2 mgタンパク質)で1.5mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。
- ミトコンドリアを氷冷SEMバッファーで1倍希釈します。
- 氷の上に3 x 30 sのためのソニック化ミトコンドリア。少量に対応したソシレーターを使用してください。
- サンプルを4°Cで100,000 x g で30分間遠心します。
- 上清を収集し、新しい1.5 mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは可溶性タンパク質画分(S)と名付けられます。
- ステップ3.2.4からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLに再懸濁します。
- ステップ3.2.6から再懸濁されたペレットを100μL取り、新しい1.5 mLの冷蔵マイクロ遠心分離管に移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは、サブセクション粒子画分(SMP)と呼ばれます。
- ステップ3.2.6から残りの300 μLを1倍に希釈し、200 mM炭酸ナトリウムを作り上げ、お使いください。
- ステップ3.2.8から氷の上でサンプルを30分間インキュベートします。
- サンプルを4°Cで100,000 x g で30分間遠心します。
- 上清を収集し、新しい1.5 mLの予冷マイクロ遠心チューブに移します。氷の上に置いておきなさい。このサンプルは炭酸上上清分画(CS)と呼ばれます。
- ステップ3.2.10からペレットを氷冷SEMバッファーの400 μLに再懸濁します。このサンプルは炭酸塩析出画分(CP)と呼ばれます。
- TCA を使用してすべてのサンプル (S、SMP、CS、および CP) を最終濃度 10% (w/v) に沈殿させます。
- 氷上のすべてのチューブを10分間インキュベートします。
- TCA処理サンプルを10分間、4°Cで12,000 x g で遠心分離します。
- 上清を取り除き、サンプルバッファー内の各ペレットを再び懸濁します。サンプルバッファーが黄色になった場合は、青色になるまで 1 M トリスベースの小さなアリコート (1 ~ 5 μL) を加えます。
- 200 mM PMSF の 1 μL をすべてのチューブに追加します。
- SDS-PAGEとウェスタンブロットによる分析が終わるまで、すべてのサンプルを-80 °Cで保管してください。
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Representative Results
提出分画プロトコルの成功は、高度に精製された無傷のミトコンドリアを得るにかかっています。このために、酵母細胞のリシスの間、オルガネラの無傷性はほぼ完全に保存されたままである必要があります。これは、Dounceホモジナイザーを使用して、細胞壁の酵素消化とそれに続く細胞膜の物理的破壊を組み合わせた細胞ライシスプロトコルを使用することによって達成される。ミトコンドリア内容物は、次いで、差動遠心によって収集される。この細胞内分画は、高レベルのポリン(Por1)、ミトコンドリアマーカータンパク質(図1、レーン2)の存在によって確認されるように、富化されたミトコンドリア画分をもたらす。しかし、これは粗いミトコンドリア画分であり、小胞体、液胞、細胞質ゾル、およびエンドソームを含む他の細胞コンパートメントの相当量を含む(図1、レーン2)。これらの汚染は、提出タンパク質の局在化実験などの一部のアプリケーションでアーティファクトを導入する可能性があります。これらの汚染の量を減少させるために、粗ミトコンドリア画分は、さらにショ糖密度勾配遠心分離に精製される。この追加精製工程は、他の細胞コンパートメントのタンパク質マーカーの内容物の有意な減少によって証明されるように、非常に純粋なミトコンドリア画分を生成する(図1、レーン3)。
タンパク質の局所的な局所化を決定するために、高精製ミトコンドリアは、さらにそのサブコンパートメントに分画される(図2A)。このプロトコルは、低張性浸透圧ショックによるミトコンドリアのミトプラストへの変換を伴う。このプロセスでは、無傷のミトコンドリアは、小器官の腫脹をもたらす低浸透性緩衝液中でインキュベートされる。腫脹の間、外のミトコンドリア膜は浸透性アンバランスによって選択的に破裂し、膜間空間タンパク質の含有量が上清に放出される。この手順はすべて、プロテナーゼKの存在下または存在しない場合に行われる。外膜破壊の結果として、プロテアーゼは膜間空間タンパク質含有量へのアクセスを得て、対応するタンパク質の分解を促進する。対照的に、ミトコンドリアマトリックスのタンパク質含有量は、内側ミトコンドリア膜の完全性によるプロテアーゼの攻撃から保護されたままである。これらの処理の後、異なるサンプルのタンパク質含有量はSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析によって評価される。
浸透性ショック(腫脹)によるミトコンドリアからミトプラストへの効率的な変換は、(1)可溶性膜間空間マーカータンパク質(例えば、シトクロムシト)の消失という2つの方法で監視することができる。b2)上清分分で同じ外観を有するミトプラストからのペレット分数(図2B、レーン3とレーン7を比較)。(2)膜間空間に面した内膜マーカータンパク質の選択的分解(例えば、ScoI)によるプロテアーゼKによるミトプラスト(図2B、レーン4)。また、マーカーCytの保護。ミトコンドリアからのペレット画分におけるプロテナーゼK分解に対するb2およびScoIは、外ミトコンドリア膜の完全性を確認するために使用される(図2B、レーン2)。一方、内ミトコンドリア膜の完全性は、プロテイナーゼK分解に対するマトリックス可溶性タンパク質マーカー α-KGDの保護によって確認される(図2B、レーン4)。関心のあるタンパク質の局所的な局所的な局在を決定するには、単に既知の局在化とこれらの標準のプロファイルと、そのウェスタンブロットプロファイルを比較します。
図2B(Prx1)に示すタンパク質の場合、そのウェスタンブロットプロファイルは、ミトコンドリアの二重局在化を有するタンパク質(膜間空間およびマトリックス)を示す。一見すると、その分画プロファイルはα-KGDに似ています。しかし、その上清の上清における存在はまた、膜間空間の局在化を示す。上述したタンパク質マーカーの分画プロファイルは、ミトコンドリア製剤の完全性に関連する可能性のあるアーティファクトを排除し、Prx119の二重局在化を裏付ける。
ミトコンドリア膜上のタンパク質のトポロジを調べるため、ミトコンドリアは超音波処理と炭酸塩抽出の2つの追加治療に提出されます(図3A)。超音波処理は上清画分13に可溶性タンパク質のみを放出する一方、炭酸ナトリウムによるアルカリ抽出は、末梢膜関連タンパク質13,20を更に可溶化する。いずれの治療においても、一体性膜タンパク質はペレット画分13に残る。これらの仮定は、両方の処置からペレットおよび上清画分のウェスタンブロット分析によって確認される(図3B)。一体型ミトコンドリア膜タンパク質(例えば、ポリンPor1)は、炭酸ナトリウムによるアルカリ処理後も、ペレット画分に完全に見られると予想される(図3B、レーン3および5)。一方、可溶性マトリックスタンパク質(例えば、α-KGD)は、両方の処理で完全に可溶化することが予想される(図3B、レーン2および4)。超音波処理(図3B、レーン3、SMP画分)からのペレット中のα-KGDの有意な保持は、超遠心分離によって効率的に沈降するいわゆるサブセクオンドリア粒子の形成に影響を与える超音波処理パラメータのわずかな変動による可能性があります。既知の溶解性プロファイルを持つこれらのタンパク質の挙動は、その後、目的のタンパク質のミトコンドリア溶解度を決定するために使用されます。Prx1の場合、そのウェスタンブロットプロファイルは、膜周囲に関連するタンパク質を示唆し、アルカリ性処理がその可溶化を誘導する(図3B、レーン4)。
図1:高精製ミトコンドリアの単離 全リセート画分(レーン1)のウェスタンブロット分析、粗ミトコンドリア画分(レーン2)、および高精製ミトコンドリア画分(レーン3)を用いた。分画は、12%ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEによって分離され、ニトロセルロースに移され、ゲルの右側に記載されているように、明確な細胞コンパートメントのマーカーに対して上昇した抗体でプローブされた。この図は、reference19 から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロテナーゼK.(A)提出分画プロトコルの概略表現における低血圧腫脹によるサブソキア式分画プロトコル。高度に精製されたミトコンドリアは、プロテナーゼKの存在下(+)または不在(-)でアイソトニックまたは低調性の治療(腫脹)を個別に受ける。治療後、PMSFの添加によりプロテナーゼKの活性が阻害され、ミトコンドリアおよびミトプラストは遠心分離によって回収される。得られたペレットおよび上清分画分からのタンパク質含有量をTCAによって沈殿させ、次いでSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析する。色球は、可溶性膜間空間タンパク質(緑色)、膜間空間に面する内膜タンパク質(ピンク)、および可溶性マトリックスタンパク質(水色)のサブセプションドリアルタンパク質マーカーを表します。(B)サブセクオンドリア分画議によるペレット及び上清分のウェスタンブロット分析。画分は、12%ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEによって分離され、ニトロセルロースに移され、Aに示すように、明確なサブコションコンパートメントのマーカーに対して上昇した抗体でプローブされた。詳細については、テキストを参照してください。この図は19から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:超音波処理および炭酸塩抽出によるサブソキアの分画プロトコル.(A)ミトコンドリアタンパク質の溶解度および膜トポロジーを決定するために使用されるプロトコルの模式的表現。ミトコンドリアは、最初は超音波処理され、遠心分離され、可溶性タンパク質画分(S)、およびサブションオンドリアル粒子(SMP)と呼ばれる区分化された膜状物が生成されます。超音波処理工程からのペレットは、炭酸ナトリウム(Na2CO3)と遠心分離でアルカリ処理に提出され、炭酸塩上清(CS)および炭酸沈殿画分(CP)が生じる。(B)超音波処理および炭酸塩抽出プロトコルからのペレットおよび上清画分のウェスタンブロット分析。画分は、12%ポリアクリルアミドゲル上のSDS-PAGEによって分離され、ニトロセルロースに移され、溶解度の明確なレベルを示すタンパク質マーカーに対して上昇した抗体でプローブされた。詳細については、テキストを参照してください。この図は19から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | コンポーネント | コメント | |
| YPD培地 | 1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、2%(w/v)グルコース | 10gのバクト酵母エキス、20gのバクトペプトン及び20gのグルコースを900mの蒸留水に溶かします。最大1000mlを充填し、オートクレーブ処理で滅菌します。 | |
| YPGal培地 | 1%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、2%(w/v)ガラクトース | 10gのバクト酵母エキス、20gバクトペプトン、20gガラクトースを900mの蒸留水に溶かします。最大1000mlを充填し、オートクレーブ処理で滅菌します。 | |
| DTT バッファ | 100 mM トリス H2SO4 (pH 9.4), 10 mM ジチオスレイトール (DTT) | 15 mlを作るために:1 MトリスH2SO4の1.5 ml、pH 9.4を1M DTTの150 μLで30°Cで温める。 ddH2O で 15 ml までのボリューム 使用前に新しく準備する |
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| ジモリヤーゼバッファー | 20 mM リン酸カリウムバッファー (pH 7.4), 1.2 M ソルビトール | 100 mlを作る: 2 M のリン酸カリウム バッファー (pH 7.4) の 2 ml を 2 M ソルビトールの 60 ml と混合します。 ddH2O で 15 ml までのボリューム 使用直前に、 ジルバクタールテウス (MPバイオメディカル、アーバイン、カリフォルニア州)からジモリヤーゼ-20Tの粉末(1グラムウェット重量あたり3mg)をバッファーに溶解します。 |
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| 均質化バッファー | 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.6 M ソルビトール, 1 mM EDTA, 0.2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA), 1 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF) | 250 mlを作るために:2.5 mlの1 Mトリス-HClバッファー(pH 7.4)と2Mソルビトールの75 ml、500 mM EDTAの500 μLおよび0.5 g BSA(本質的に脂肪酸を含まない) ddH2O で 250 ml までの容積 4°Cで予冷 使用直前に、PMSF と BSA をバッファーに追加する |
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| SEM バッファ | 10 mM モップス-コー (pH 7.2), 250 mM スクロース, 1 mM EDTA | 250 mlを作るために:2.5 mlの1 M MOPS-KOHバッファー(pH 7.2)と31.25 mlの2Mスクロースと500 mM EDTAの500 μLを混ぜる ddH2O で 250 ml までの容積 使用直前の4°Cで予冷してください。 |
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| EMバッファ | 10 mM モップス-コー (pH 7.2), 1 mM EDTA | 250 mlを作るために:500 mM EDTAの500 μLの1 M MOPS-KOHバッファー(pH 7.2)の2.5 mlを混合する ddH2O で 250 ml までの容積 使用直前の4°Cで予冷 |
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| サンプル バッファー | 2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50 mM DTT、10%(v/v)グリセロール、0.02%ブロモフェノール 青、60 mMトリス-HCl(pH 6.8) |
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表 1: メディア、ソリューション、およびバッファー
| 試薬 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| ミトコンドリア (10 mg/mL) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| SEM バッファ | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| EMバッファ | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| プロテイナーゼ K (10 mg/mL) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
表2:低張性腫脹を行うピペッティングスキーム。
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Discussion
ここに示すプロトコルは、送信コンパートメント13、14、18、21、22、23におけるタンパク質の局在を決定するために、長い間使用され、継続的に最適化されています。このプロトコルの信頼性と再現性は、ミトコンドリア製剤の純度と完全性に強く依存します 18.これらの要件は、粗ミトコンドリア製剤13,24,25(図1)に精製工程(ショ糖密度勾配遠心分離)を追加することで達成されます。望ましくない非ミトコンドリア汚染物質を排除することに加えて、この追加の精製ステップはまた、プロトコル18の間にサンプルの多数の物理的操作から生じる可能性のある壊れたミトコンドリアおよびミトプラストを排除する。従って、手順の時間を増加させるにもかかわらず、このショ糖勾配精製工程は、非常に精製された無傷のミトコンドリアを生成し、これは、サブソキアリア分画プロトコル18,22の成功に不可欠であると考えられる。
Vögtleと共同研究者は、凍結されたオルガネラ(-80°C)も提出分画13にうまく使用できると報告した。しかし、新鮮なミトコンドリア製剤を使用することをお勧めします。選択の独立して、精製されたミトコンドリアの無傷性は、外部に添加されたプロテイナーゼKに対する膜間空間タンパク質の感受性を確認することによって確認することができる。オルガネラが無傷であれば、Cytのようなこのコンパートメントのタンパク質。b2およびSco1は、外膜によって設けられたバリアによるタンパク質分解から保護され続けるべきである(図2B、レーン2)。これに対して、小器官が低浸透性緩衝液にインキュベートされると、浸透性ショック(腫脹)による外膜の破裂により、これらのタンパク質はプロテアーゼ分解を起こしやすい(図2B、レーン4)。一方、α-KGDなどのマトリックスコンパートメントに存在するタンパク質は、内膜の完全性のためにミトコンドリアとミトプラストの両方で分解から保護され続けるべきである(図2B、レーン2および4)。したがって、これらのよく研究されたミトコンドリアマーカータンパク質のプロファイルは、ミトコンドリア製剤の完全性または分画プロトコルの成功を評価するために使用することができる。さらに、目的のタンパク質の局所的な局在は、その分画プロファイルとマーカータンパク質18,22(図2B)の分画プロファイルを比較しただけで得られます。重要なことに、ミトコンドリアマーカータンパク質が上記のものとは異なる行動を示す場合、オルガネラの完全性が損なわれる可能性が高く、したがって、ミトコンドリア製剤はこのプロトコルの目的に使用されるべきではない。
低調性ショックは膜間空間タンパク質とマトリックスを区別する信頼できる方法であることが証明されているが、この方法は、マトリックスタンパク質がミトコンドリア内膜に可溶性であるか、または結合しているかの情報を提供しない。この情報は、ミトコンドリアを超音波処理に続けて炭酸ナトリウムによるアルカリ抽出を行うことで達成できます(図3)。可溶性マトリックスタンパク質は超音波処理時に上清分に放出されると予想されるが、膜に関連するタンパク質は沈殿13に含まれる傾向がある。一方、炭酸ナトリウムを用いたアルカリ抽出は、膜に末梢接着するタンパク質を効率的に可溶化するが、膜内タンパク質13,20は含まれていない。したがって、タンパク質が膨潤後のプロテアーゼ分解に対して耐性であるがアルカリ処理によって上清に放出される場合、おそらくマトリックスコンパートメントに面した末梢に付着した内膜タンパク質である。プロテアーゼ感受性アッセイの成功は、消化に使用されるプロテアーゼに対する目的のタンパク質の感受性に大きく依存していることを覚えておいてください。一部のミトコンドリアタンパク質は、通常、分極制御プロトコルで用いられる標準プロテイナーゼK濃度(0.1mg/mL)でのタンパク質分解に対して耐性があるようです(図2B、レーン8)19。タンパク質分解酵素K濃度(0.2mg/mL)の倍増は、完全なタンパク質分解を可能にするのに十分なようです。しかし、より高濃度のプロテアーゼは、外ミトコンドリア膜を不安定化させ、最終的にプロトコルの有効性を損なう可能性があることを覚えておいてください。
ミトコンドリアタンパク質の機能を解明するためには、その細胞の局所的局在を決定することが不可欠であることは間違いありません。この点に関して、このプロトコルはミトコンドリアを研究し始めている研究者のための強力なツールを表しています。酵母に向けられているにもかかわらず、その原理の多くは他の生物に簡単に適用できる。実際、ミトコンドリア精製ステップを除いて、プロトコルの残りの部分は、他の生物26,27,28について報告されたものと非常によく似ています。このプロトコルのもう一つの重要な貢献は、変化したミトコンドリア生物形成を示すS.セレビシエの変異体の研究におけるその適用性である。ミトコンドリアタンパク質輸入機械の酵母変異体は、ミトコンドリアタンパク質の分布の変化を示す5,29と広く報告されている。したがって、このプロトコルは、ミトコンドリアの生合成を変えることができる突然変異によって引き起こされるミトコンドリアタンパク質分布の結果を調査するために日常的に使用することができる。最後に、このプロトコルは、ミトコンドリアの二重局在化を示すタンパク質の調査に特に有用であり得る19,30。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
サブションドリアルマーカータンパク質Cytに対して抗体を提供してくれたA.ツァゴロフ博士(コロンビア大学)に感謝します。 b2、αKGD、およびスコ1。また、この議定書の確立に際して、マリオ・エンリケ・デ・バロス博士(サンパウロ大学)の有益な議論とコメントに感謝します。
この研究は、プンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)(助成金2013/07937-8)からの研究助成金によって支えられました。
フェルナンド・ゴメスとヘレナ・トゥラーノもFAPESP、助成金2017/09443-3と2017/23839-7によってサポートされています。アンジェリカ・ラモスは、コルデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スーペリア(CAPES)の支援も受けます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al.
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N.
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M.
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
