Summary
Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.
Abstract
Apesar dos recentes avanços na caracterização do proteome mitocondrial da levedura, a localização subocondrial de um número significativo de proteínas permanece indescritível. Aqui, descrevemos um método robusto e eficaz para determinar a localização suborganellar das proteínas mitocondriais de levedura, que é considerada um passo fundamental durante a elucidação da função proteica mitocondrial. Este método envolve uma etapa inicial que consiste em obter mitocôndrias intactas altamente puras. Essas preparações mitocondriais são então submetidas a um protocolo de subfração composto por choque hipotônico (inchaço) e incubação com proteinase K (protease). Durante o inchaço, a membrana mitocondrial externa é seletivamente interrompida, permitindo que a proteinase K digerir proteínas do compartimento espacial intermembrano. Paralelamente, para obter informações sobre a topologia das proteínas da membrana, as preparações mitocondriais são inicialmente sônicas e, em seguida, submetidas à extração alcalina com carbonato de sódio. Finalmente, após a centrifugação, as frações de pelotas e supernasces desses diferentes tratamentos são analisadas por SDS-PAGE e mancha ocidental. A localização subocondrial, bem como a topologia da membrana da proteína de interesse, são obtidas comparando seu perfil de mancha ocidental com padrões conhecidos.
Introduction
Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas que desempenham papéis cruciais em bioenergésicos, metabolismo celular e caminhos de sinalização1. Para executar adequadamente essas tarefas, as mitocôndrias contam com um conjunto único de proteínas e lipídios responsáveis por sua estrutura e função. O fermento saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizado como um sistema modelo para investigações sobre processos mitocondriais, bem como para outras organelas2. Os códigos do genoma mitocondrial para apenas oito proteínas na levedura; a grande maioria das proteínas mitocondriais (~99%) são codificadas por genes nucleares, que são traduzidas em ribossomos citosóicos, e posteriormente importadas em seus compartimentos submitocondriais corretos por máquinas sofisticadas de importação de proteínas3,4,5. Assim, a biogênese mitocondrial depende da expressão coordenada dos genomas nucleares e mitocondriais6,7. Mutações genéticas que causam defeitos na biogênese mitocondrial estão associadas a doenças humanas8,9,10.
Nas últimas duas décadas, estudos proteômicos de alto rendimento direcionados a mitocôndrias altamente purificadas resultaram em uma caracterização abrangente do proteome mitocondrial de levedura, que foi estimado em pelo menos 900 proteínas11,12,13,14. Embora esses estudos tenham fornecido informações valiosas, a localização suborganellar de cada proteína nos quatro subcomentários mitocondriais, ou seja, a membrana externa (OM), o espaço intermembrano (IMS), a membrana interna (IM) e a matriz, ainda são necessários. Esta questão foi parcialmente abordada com estudos proteômicos dos dois subcoentamentos mitocondriais menores (OM e IMS)15,16. Mais recentemente, Vögtle e colaboradores fizeram um grande passo à frente, gerando um mapa global de alta qualidade de distribuição de proteínas subocondriais na levedura. Usando uma abordagem integrada que combina espectrometria quantitativa de massa baseada em SILAC, diferentes protocolos de fracionamento submitocondrial e o conjunto de dados dos proteomes OM e IMS, os autores atribuíram 818 proteínas nos quatro subcoentamentos mitocondriais13.
Apesar dos avanços alcançados por esses estudos proteômicos de alto rendimento, nosso conhecimento sobre a composição de proteome subocondrial está longe de ser completo. De fato, entre 986 proteínas relatadas por Vögtle e colaboradores como sendo localizadas em mitocôndrias de levedura, 168 não poderiam ser atribuídas em nenhum dos quatro compartimentos subocondriais13. Além disso, os autores não forneceram informações sobre a topologia da membrana das proteínas que se previu estar periféricamente ligada à periferia das membranas mitocondriais. Por exemplo, não é possível saber se uma proteína que foi atribuída como periféricamente ligada à membrana interna está voltada para a matriz ou o espaço intermembrano. Além desses dados perdidos dos estudos proteome-em toda, há informações conflitantes sobre a localização suborganellar de um número significativo de proteínas mitocondriais. Um exemplo é o prd1 protease, que foi atribuído como uma proteína espacial intermembrana nos bancos de dados comuns, como o Saccharomyces Genome Database (SGD) e o Uniprot. Surpreendentemente, usando um protocolo de subfração semelhante ao descrito aqui, Vögtle e colaboradores mostraram claramente que Prd1 é uma verdadeira proteína matricial13. Como mencionado acima, a localização subocondrial de muitas proteínas mitocondriais precisa ser elucidada ou reavaliada. Aqui, fornecemos um protocolo simples e confiável para determinar a localização suborganellar de proteínas mitocondriais de leveduras. Este protocolo foi desenvolvido e otimizado por diversos grupos de pesquisa e tem sido rotineiramente utilizado para determinar a localização subocondrial, bem como a topologia da membrana de muitas proteínas mitocondriais.
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Protocol
1. Crescimento de células de levedura
- Isole colônias únicas da tensão de interesse, espalhando uma pequena porção das células de um estoque de glicerol de -80 °C em um YPD (extrato de levedura de 1%, 2% peptone, 2% glicose) placa de ágar. Incubar a placa a 30 °C durante 2-3 dias.
NOTA: A cepa S. cerevisiae utilizada neste protocolo é derivada de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Com exceção dos genes marcadores auxotróficos, esta cepa não contém nenhum gene excluído e não carrega nenhum plasmídeo. Assim, pode ser cultivada com sucesso em um meio rico, estimulando o crescimento celular vigoroso. Ao trabalhar com cepas transformadas com plasmídeos, use o meio mínimo apropriado para seleção plasmida. - Prepare uma cultura inicial inoculando 2-3 colônias individuais de YPD placa de ágar em 10-20 mL de meio YPGal (1% extrato de levedura, 2% pepton, 2% galactose) em um frasco de 100 mL Erlenmeyer. Incubar a 30 °C por 24 h com agitação vigorosa.
NOTA: A escolha do meio de crescimento depende da cepa de levedura utilizada no protocolo. Tanto o YPD quanto o YPGal contêm fontes de carbono fermentáveis, que permitem o crescimento de cepas que não realizam respiração mitocondrial. No entanto, uma vez que a glicose reprime a expressão de muitos genes mitocondriais, não é recomendável usar essa fonte de carbono, pois produzirá quantidades menores de mitocôndrias. Ao trabalhar com cepas respiratórias competentes que podem respirar, também é possível usar fontes de carbono como glicerol e etanol na tentativa de obter um maior rendimento de mitocôndrias. - Diluir a cultura inicial em 1 L de médio YPGal fresco para um OD600 menos de 0,1. Cultive as células a 30 °C com agitação vigorosa até que OD600 atinja 1-1,5.
NOTA: Determine a taxa de crescimento (tempo de duplicação) para cada cepa de levedura antes de realizar o experimento. Isso fornecerá uma estimativa precisa do tempo de incubação necessário para que a cultura atinja um OD600 de 1-1.5.
2. Isolamento de mitocôndrias altamente purificadas
NOTA: Este protocolo é adaptado a partir de 17, com pequenas modificações.
- Colher as células por centrifugação a 3.000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Lave as células com água destilada e colete-as por centrifugação a 3.000 x g por 5 min a temperatura ambiente.
- Determine o peso úmido das células.
NOTA: A maneira mais fácil de medir o peso da pelota celular a partir da etapa 2.2 é determinar o peso do tubo de centrífuga vazio pouco antes da coleta das células. Após a centrifugação, descarte o sobrenante e meça o peso do mesmo tubo com as células. O peso das células é a diferença entre as duas medidas. - Resuspenque as células no buffer DTT (2 mL por 1 g de células) usando uma pipeta Pasteur ou ponta P5000. Consulte a tabela 1 para composição do buffer DDT.
- Incubar as células a 30 °C por 20 min com agitação suave (~70 rpm).
- Centrifugar a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente para pelotar as células.
- Lave as células com tampão zymolyase sem a enzima (cerca de 7 mL por 1 g de células).
Consulte a tabela 1 para a composição do buffer Zymolyase. - Centrifugar a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente para pelotar as células.
- Resuspende as células no buffer sem Zymolyase (7 mL por 1 g de células).
- Transfira a suspensão celular para um frasco de 250 mL Erlenmeyer e adicione Zymolyase-20T (3 mg por g de peso molhado).
- Incubar as células a 30 °C por 30-40 min com agitação suave (~70 rpm). Verifique a eficiência deste processo comparando a turbidez da suspensão celular antes e depois do tratamento zymolyase.
NOTA: Nesta etapa, as células serão convertidas em esferoplastos devido à digestão da parede celular por Zymolyase.- Para isso, adicione 50 μL de cada suspensão celular a tubos de vidro separados contendo 2 mL de água. Depois de misturar vigorosamente, a turbidez da suspensão celular tratada com Zymolyase deve diminuir rapidamente devido à interrupção osmótica dos esferoplastos. Por outro lado, a turbidez da suspensão celular não tratada deve permanecer inalterada.
NOTA: Os efeitos da turbidez também podem ser monitorados por simples inspeção visual ou medindo o OD600 de ambas as amostras. No segundo caso, o OD600 da amostra tratada zymolyase deve ser de 10%-20% da amostra não tratada. Um método alternativo envolve a contagem das células em ambas as amostras usando microscopia leve. - Se o rendimento da formação de esferoplastos for baixo, adicione mais Zymolyase e incubar por mais 15 minutos.
- Para isso, adicione 50 μL de cada suspensão celular a tubos de vidro separados contendo 2 mL de água. Depois de misturar vigorosamente, a turbidez da suspensão celular tratada com Zymolyase deve diminuir rapidamente devido à interrupção osmótica dos esferoplastos. Por outro lado, a turbidez da suspensão celular não tratada deve permanecer inalterada.
- Colher os esferoplastos por centrifugação a 2500 x g por 5 min a 4 °C.
NOTA: Todas as etapas adicionais devem ser realizadas rapidamente e no gelo ou a 4 °C para evitar a degradação da proteína por enzimas hidrolíticas. - Lave os esferoplastos duas vezes com tampão de homogeneização gelada (cerca de 6,5 mL por 1 g de células) e pelota por centrifugação a 2.500 x g por 5 min a 4 °C. Consulte a Tabela 1 para composição do buffer de homogeneização.
- Resuspenque os esferoplastos em tampão de homogeneização gelada (6,5 mL por 1 g de células) e transfira-o para um homogeneizador do Dounce de vidro pré-refrigerado. Use um grande homogeneizador de vidro de aproximadamente 30 mL.
- Homogeneize os esferoplastos com 15 golpes usando um pilão.
NOTA: O número de derrames deve ser ajustado dependendo do encaixe do pilão. Para pilão apertado, 15 golpes são suficientes. Por outro lado, se usar um pilão solto, recomenda-se realizar até 25 tacadas. - Transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga de 50 mL e adicione 1 volume de tampão de homogeneização gelada.
- Centrifugar o homogeneizar em baixa velocidade, 1.500 x g por 5 min a 4 °C para núcleos de pelotas, detritos celulares e células ininterruptas.
- Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 50 mL usando uma pipeta Pasteur ou uma ponta P5000 tomando cuidado para evitar interromper a pelota.
- Centrifugar a 4.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Transfira o supernatante para um tubo de centrífuga de alta velocidade, e centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para pelotar a fração de mitocôndrias brutas.
- Descarte o supernascimento e lave suavemente a pelota mitocondrial bruta em 20-30 mL tampão de homogeneização gelada por pipetação suave usando uma ponta P5000.
- Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 50 mL e centrífuga a 4.000 x g por 5 min a 4 °C para de pelotar os detritos celulares restantes.
- Transfira o supernatante para um tubo de centrífuga de alta velocidade, e centrífuga a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para pelotar a fração de mitocôndrias brutas.
- Descarte o supernatante e resuspenque suavemente a pelota mitocondrial bruta em um pequeno volume (tipicamente 1000 μL) de tampão SEM gelado por pipetação suave usando uma ponta P1000. Consulte a Tabela 1 para composição de buffer SEM.
NOTA: Embora esta fração mitocondrial bruta possa ser usada diretamente em algumas aplicações, como em ensaios de importação de proteína organello , ela contém quantidades substanciais de outros componentes celulares. Essas contaminações podem levar a interpretações erradas dos resultados ao determinar a localização subocondrial de uma proteína. Portanto, são necessárias mais etapas de purificação para obter uma preparação mitocondrial altamente purificada, conforme descrito abaixo. - Prepare soluções de sacarose no buffer EM em concentrações de 60%, 32%, 23% e 15% (w/v). Estas soluções são estáveis por até 1 mês a 4 °C. Consulte a tabela 1 para composição do buffer EM.
- Prepare um gradiente de sacarose de 4 passos em um tubo ultracentrífuga da seguinte forma: Coloque 1,5 mL de 60% (w/v) de sacarose na parte inferior do tubo de centrífuga. Em seguida, pipeta cuidadosamente stepwise: 4 mL de 32%, 1,5 mL de 23%, e 1,5 mL de 15% de sacarose (w/v). Tome cuidado para evitar interromper as fases.
- Carregue cuidadosamente a fração mitocondrial bruta em cima do gradiente de sacarose.
- Centrifugar por 1h a 134.000 x g a 4 °C em um rotor de balde balançando.
- Mantenha cuidadosamente a remoção da solução de sacarose até que a fração de mitocôndrias altamente purificada seja alcançada, que é representada por uma faixa marrom na interface de sacarose de 60%./32%.
- Recupere as mitocôndrias purificadas usando uma ponta de corte P1000 e coloque-a em um tubo de centrífuga de alta velocidade pré-refrigerado.
- Diluir as mitocôndrias recuperadas com 5-10 volumes de tampão SEM gelado.
- Centrifugar por 30 min a 12.000 x g a 4 °C.
- Resuspend as mitocôndrias puras em 500 μL de tampão SEM gelado por pipetação suave usando uma ponta de corte P1000.
- Determine a concentração proteica da preparação mitocondrial altamente purificada usando o procedimento de Bradford seguindo as instruções do fabricante. Ajuste a concentração de proteínas para 10 mg de proteína/mL com tampão SEM gelado.
NOTA: Para o protocolo de fracionamento submitocondrial descrito abaixo, recomenda-se o uso de mitocôndrias recém-preparadas. No entanto, Vögtle e colaboradores realizaram uma análise detalhada de controle de qualidade da intactidade mitocondrial e mostraram que organelas congeladas também podem ser usadas neste protocolo13. Para isso, faça alíquotas de 40 μL e congele-as em nitrogênio líquido. Armazém a -80 °C.
3. Protocolo de fracionamento subocondrial
NOTA: Este protocolo é adaptado a partir de referência18 e é composto de duas etapas: (1) inchaço hipotônico na presença ou ausência de proteinase K, e (2) sonicação seguida de extração de carbonato. Realize todas as etapas de ambos os protocolos no gelo ou a 4 °C para evitar a degradação da proteína.
- Inchaço hipotônico na presença de proteinase K
- Transfira 40 μL de mitocôndrias altamente purificadas a 10 mg/mL (400 μg) em quatro tubos de microcentrifusagem pré-refrigerados de 1,5 mL.
- Adicione 360 μL de tampão SEM nos tubos 1 e 2.
- Adicione 360 μL de buffer EM nos tubos 3 e 4.
- Adicione 4 μL de proteinase K (10 mg/mL) nos tubos 2 e 4. Use o esquema de pipetação listado na Tabela 2 para evitar erros.
NOTA: Prepare uma solução de 10 mg/mL de proteinase K na água imediatamente antes de usar. A concentração final de proteinase K no experimento deve ser em torno de 50-100 μg/mL. Consulte a seção Discussão para obter mais detalhes. - Misture todos os tubos suavemente e incubar no gelo por 30 minutos com mistura ocasional.
- Adicione 4 μL de 200 mM PMSF a todos os quatro tubos para parar a atividade proteinase K.
ATENÇÃO: O PMSF é altamente tóxico. Use luvas ao trabalhar com soluções contendo PMSF. - Centrifugar a 20.000 x g por 30 min a 4 °C.
- Colete o supernatante e transfira-o para um novo tubo de microcentrifuge prefritado de 1,5 mL. Tome cuidado para evitar interromper a pelota.
NOTA: A pelota pode ser diretamente resuspengiada no buffer de amostra para análise adicional de SDS-PAGE e de manchas ocidentais. No entanto, os traços de proteinase K podem permanecer ativos mesmo após o tratamento do PMSF e eventualmente podem digerir algumas proteínas depois que a pelota foi dissolvida no tampão amostral contendo SDS. Para evitar esse problema, a proteinase K poderia ser completamente inativada pelo tratamento das amostras com ácido tricloroacético (TCA), conforme descrito abaixo.
ATENÇÃO: O TCA é altamente tóxico. Use luvas ao trabalhar com soluções que contenham TCA. - Resuspenda a pelota do passo 3.1.8 em 400 μL de tampão SEM gelado.
- Precipitar o supernante (da etapa 3.1.8) e a pelota resuspended (da etapa 3.1.9) com TCA a uma concentração final de 10% (w/v).
- Incubar todos os tubos no gelo por 10 minutos.
- Centrifugar as amostras tratadas com TCA por 10 min a 12.000 x g a 4 °C.
- Remova o supernatante e resuspense a pelota em 200 μL de tampão amostral.
NOTA: É possível que o indicador de pH azul bromofenol fique amarelo por causa do tratamento ácido. Se isso acontecer, adicione pequenas alíquotas (1-5 μL) de base de 1 M Tris até ficar azul. - Adicione 4 μL de 200 mM PMSF a todos os tubos.
- Armazene todas as amostras a -80 °C até uma análise posterior por SDS-PAGE e mancha ocidental.
- Extração de sônicos e carbonatos
NOTA: Neste protocolo, não é necessário usar mitocôndrias recém-preparadas uma vez que a sônica causa a ruptura das membranas mitocondriais.- Transfira 200 μL de mitocôndrias altamente purificadas a 10 mg/mL (proteína de 2 mg) em um tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 mL.
- Diluir mitocôndrias uma vez com o tampão SEM gelado.
- Mitocôndrias sonicatos para 3 x 30 s no gelo. Use um sonicator compatível para pequenos volumes.
- Centrifugar a amostra por 30 min a 100.000 x g a 4 °C.
- Colete o supernatante e transfira-o para um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 mL. Mantenha-o no gelo. Esta amostra será nomeada fração de proteína solúvel (S).
- Resuspenda a pelota da etapa 3.2.4 em 400 μL de tampão SEM gelado.
- Pegue 100 μL da pelota resuspended a partir da etapa 3.2.6 e transfira-a para um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 mL. Mantenha-o no gelo. Esta amostra será nomeada fração de partículas subocondriais (SMP).
- Diluir os 300 μL restantes da etapa 3.2.6 uma dobra com carbonato de sódio de 200 mM recém-preparado.
- Incubar a amostra da etapa 3.2.8 no gelo por 30 minutos.
- Centrifugar a amostra por 30 min a 100.000 x g a 4 °C.
- Colete o supernatante e transfira-o para um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 mL. Mantenha-o no gelo. Esta amostra será nomeada fração de sobrenassalto carbonato (CS).
- Resuspenda a pelota a partir do passo 3.2.10 em 400 μL de sem tampão gelado. Esta amostra será nomeada fração precipitada de carbonato (CP).
- Precipitar todas as amostras (S, SMP, CS e CP) com TCA a uma concentração final de 10% (c/v).
- Incubar todos os tubos no gelo por 10 minutos.
- Centrifugar as amostras tratadas com TCA por 10 min a 12.000 x g a 4 °C.
- Remova o supernatante e resuspense cada pelota no tampão de amostra. Se o buffer de amostra ficar amarelo, adicione pequenas alíquotas (1-5 μL) de base de 1 M Tris até ficar azul.
- Adicione 1 μL de 200 mM PMSF a todos os tubos.
- Armazene todas as amostras a -80 °C até uma análise posterior por SDS-PAGE e mancha ocidental.
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Representative Results
O sucesso do protocolo de fracionamento subocondrial depende da obtenção de mitocôndrias intactas altamente purificadas. Para isso, é essencial que durante a lise celular da levedura, a intactidade das organelas permaneça quase totalmente preservada. Isso é conseguido usando um protocolo de lise celular que combina a digestão enzimática da parede celular seguida pela interrupção física da membrana plasmática usando um homogeneizador do Dounce. Os conteúdos mitocondriais são então coletados por centrifugação diferencial. Este fracionamento subcelular produz uma fração mitocondrial enriquecida, como confirmado pela presença de altos níveis de porína (Por1), uma proteína marcador mitocondrial (Figura 1, faixa 2). No entanto, esta é uma fração de mitocôndrias brutas, que contém quantidades substanciais de outros compartimentos celulares, incluindo réticulo endoplasmático, vacuole, citosol e endosomma (Figura 1, faixa 2). Essas contaminações podem introduzir artefatos em algumas aplicações, como experimentos de localização de proteínas subocondriais. Para diminuir a quantidade dessas contaminações, a fração mitocondrial bruta é purificada ainda mais na centrifugação gradiente de densidade de sacarose. Esta etapa adicional de purificação gera uma fração mitocondrial altamente pura, como evidenciado por uma redução significativa no conteúdo dos marcadores proteicos para outros compartimentos celulares (Figura 1, faixa 3).
A fim de determinar a localização subocondrial das proteínas, as mitocôndrias altamente purificadas são ainda mais fracionadas em seus subcomentamentos (Figura 2A). Este protocolo envolve a conversão de mitocôndrias em mitoplastos por choque osmótico hipotônico. Nesse processo, mitocôndrias intactas são incubadas em um tampão hipoosmótico resultando em inchaço da organela. Durante o inchaço, a membrana mitocondrial externa é seletivamente rompida pelo desequilíbrio osmótico e o teor de proteína espacial intermembrana é liberado no sobrenatante. Todo este procedimento é realizado na presença ou ausência de proteinase K. Como consequência da interrupção da membrana externa, a protease ganha acesso ao conteúdo de proteína espacial intermembrana e promove a degradação das proteínas correspondentes. Em contraste, o teor proteico da matriz mitocondrial permanece protegido do ataque da protease devido à integridade da membrana mitocondrial interna. Após esses tratamentos, o teor proteico das diferentes amostras é avaliado por análises de SDS-PAGE e western blot.
A conversão eficiente de mitocôndrias em mitoplastos por choque osmótico (inchaço) pode ser monitorada de duas maneiras: (1) desaparecimento da proteína solúvel do marcador espacial intermembrano (por exemplo, citocromo Cyt. b2) na fração de pelota de mitoplastos com sua aparência concomitante na fração supernante (Figura 2B, compare a faixa 3 com a faixa 7); (2) degradação seletiva da proteína marcador de membrana interna voltada para o espaço intermembrano (por exemplo, ScoI) por proteinase K apenas em mitoplastos (Figura 2B, pista 4). Além disso, a proteção dos marcadores Cyt. b2 e ScoI contra a degradação proteinase K na fração de pelotas de mitocôndrias são usados para confirmar a integridade da membrana mitocondrial externa (Figura 2B, faixa 2). Por outro lado, a integridade da membrana mitocondrial interna é confirmada pela proteção do marcador proteico solúvel da matriz α-KGD contra a degradação proteinase K (Figura 2B, faixa 4). Para determinar a localização subocondrial de uma proteína de interesse, basta comparar seu perfil de mancha ocidental com os perfis desses padrões com localização conhecida.
No caso da proteína retratada na Figura 2B (Prx1), seu perfil de mancha ocidental é indicativo de uma proteína com localização mitocondrial dupla: espaço intermembrano e matriz. À primeira vista, seu perfil de fracionamento é semelhante ao α-KGD, indicando uma localização matricial. No entanto, sua presença no sobrenatante de mitoplastos também indica uma localização espacial intermembrana. Os perfis de fracionamento dos marcadores proteicos descritos acima eliminam os possíveis artefatos associados à integridade da preparação mitocondrial e corroboram a dupla localização de Prx119.
Para investigar a topologia das proteínas nas membranas mitocondriais, as mitocôndrias são submetidas a dois tratamentos adicionais: sonicação e extração de carbonato (Figura 3A). Enquanto a sônica libera apenas proteínas solúveis na fração supernaca13, a extração alcalina com carbonato de sódio solubiliza proteínas periféricamente associadas à membrana13,20. Em ambos os tratamentos, as proteínas de membrana integral permanecem na fração de pelota13. Essas suposições são confirmadas pela análise ocidental das frações de pelotas e supernasciantes de ambos os tratamentos (Figura 3B). Espera-se que uma proteína de membrana mitocondrial integral (por exemplo, porin Por1) seja encontrada totalmente na fração de pelota, mesmo após o tratamento alcalino com carbonato de sódio (Figura 3B, faixas 3 e 5). Por outro lado, espera-se que uma proteína matriz solúvel (por exemplo, α-KGD) seja completamente solubilizada em ambos os tratamentos (Figura 3B, faixas 2 e 4). A retenção significativa de α-KGD na pelota de sônica (Figura 3B, faixa 3, fração de SMP) pode ser devido a pequenas variações nos parâmetros de sonicação que podem afetar a formação das chamadas partículas subocondriais, que são eficientemente sedimentadas pela ultracentrifugação. O comportamento dessas proteínas com perfis conhecidos de solubilidade são então usados para determinar a solubilidade mitocondrial de uma proteína de interesse. No caso do Prx1, seu perfil de mancha ocidental é sugestivo de uma proteína associada à periferia da membrana e o tratamento alcalino induz sua solubilização (Figura 3B, faixa 4).
Figura 1: Isolamento de mitocôndrias altamente purificadas. Análise de manchas ocidentais da fração total de lise (pista 1), uma fração mitocondrial bruta (pista 2) e fração mitocondrial altamente purificada (pista 3). As frações foram separadas por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida de 12%, transferido para nitrocelulose e sondado com anticorpos levantados contra marcadores para compartimentos celulares distintos, como descrito no lado direito do gel. Este valor foi modificado a partir de referência19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Protocolo de fracionamento subocondrial por inchaço hipotônico na presença de proteinase K. (A) Representação esquemática do protocolo de fracionamento subocondrial. Mitocôndrias altamente purificadas são separadamente submetidas a tratamentos isotônicos ou hipotônicos (inchaço) na presença (+) ou ausência (-) de proteinase K. Após o tratamento, a atividade da proteinase K é inibida pela adição de PMSF, e mitocôndrias e mitoplastos são recuperados por centrifugação. O teor proteico das frações resultantes de pelotas e supernantes é precipitado pelo TCA e, em seguida, analisado por SDS-PAGE e mancha ocidental. As esferas coloridas representam marcadores de proteína submitocondrial para: uma proteína espacial intermembrana solúvel (verde), uma proteína de membrana interna que enfrenta o espaço intermembrano (rosa) e uma proteína de matriz solúvel (azul claro). (B) Análise ocidental de manchas de pelotas e frações supernantes do protocolo de fracionamento subocondrial. As frações foram separadas por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida de 12%, transferido para nitrocelulose e sondado com anticorpos levantados contra marcadores para compartimentos subocondriais distintos, como retratado em A. Consulte texto para mais detalhes. Este número foi modificado a partir de 19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Protocolo de fracionamento subocondrial por sônicação e extração de carbonato. (A) Representação esquemática do protocolo utilizado para determinar a solubilidade e topologia da membrana das proteínas mitocondriais. Mitocôndrias são inicialmente sonicadas e centrifugadas, resultando em uma fração de proteína solúvel (S), e o produto membranous compartimentalizado, chamado partícula submitocondrial (SMP). A pelota da etapa de sônica é posteriormente submetida a um tratamento alcalino com carbonato de sódio (Na2CO3) e centrífugas, resultando em frações supernascedoras de carbonato (CS) e de carbonato precipitados (CP). (B) Análise ocidental de manchas de pelotas e frações sobrenanantes do protocolo de sônica e extração de carbonato. As frações foram separadas por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida de 12%, transferido para nitrocelulose e sondado com anticorpos levantados contra marcadores proteicos mostrando níveis distintos de solubilidade. Consulte texto para mais detalhes. Este número foi modificado a partir de 19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Componentes | Comentários | |
| Meio YPD | Extrato de levedura de 1% (w/v), 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glicose | Dissolva 10 g extrato de levedura Bacto, 20 g Bacto Peptone e 20 g de glicose em 900 m de água destilada adicionada. Encha até 1000 ml e esterilize por autoclaving. | |
| Meio YPGal | Extrato de levedura de 1% (w/v), 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) galactose | Dissolva 10 g extrato de levedura Bacto, 20 g Bacto Peptone e 20 g de galactose em 900 m de água destilada adicionada. Encha até 1000 ml e esterilize por autoclaving. | |
| Tampão DTT | 100 mM Tris-H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol (DTT) | Para fazer 15 ml: misture 1,5 ml de 1 M Tris-H2SO4, pH 9.4 com 150 μL de 1M DTT pré-armado a 30 °C. Volume para 15 ml com ddH2O Prepare-se recém-antes do uso |
|
| Tampão zymolyase | Tampão fosfato de potássio de 20 mM (pH 7.4), 1,2 M de sorbitol | Para fazer 100 ml: misture 2 ml de tampão fosfato de potássio de 1 M (pH 7.4) com 60 ml de sorbitol de 2 M Volume para 15 ml com ddH2O Dissolva o pó (3 mg por grama de peso molhado) de Zymolyase-20T de Arthrobacter luteus (MP Biomedicals, Irvine, CA) no buffer pouco antes do uso |
|
| Tampão de homogeneização | 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w/v) flâmula de soro bovino (BSA), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonyl (PMSF) | Para fazer 250 ml: misture 2,5 ml de tampão 1 M Tris-HCl (pH 7.4) com 75 ml de sorbitol de 2 M, 500 μL de 500 mM EDTA e 0,5 g de BSA (essencialmente livre de ácidos graxos) Volume de 250 ml com ddH2O Pré-frio a 4°C Adicione PMSF e BSA no buffer pouco antes do uso |
|
| Tampão SEM | 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA | Para fazer 250 ml: misture 2,5 ml de 1 M M MOPS-KOH tampão (pH 7.2) com 31,25 ml de 2 M de sacarose e 500 μL de 500 mM EDTA Volume de 250 ml com ddH2O Pré-esfriar a 4°C antes de usar. |
|
| Tampão EM | 10 mM MOPS-KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA | Para fazer 250 ml: misture 2,5 ml de 1 M de tampão MOPS-KOH (pH 7.2) com 500 μL de 500 mM EDTA Volume de 250 ml com ddH2O Pré-esfriar a 4°C pouco antes de usar |
|
| tampão de amostra | 2% (w/v) dodecylsulfate de sódio (SDS), 50 mM DTT, 10% (v/v) glicerol, 0,02% bromofenol azul, 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), |
||
Tabela 1: Mídia, soluções e buffers.
| Reagente | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Mitocôndrias (10 mg/mL) | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | |
| Tampão SEM | 360 μL | 360 μL | - | - | |
| Tampão EM | - | - | 360 μL | 360 μL | |
| Proteinase K (10 mg/mL) | - | 4 μL | - | 4 μL | |
Tabela 2: Esquema de pipetação para realizar inchaço hipotônico.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado tem sido utilizado com sucesso e continuamente otimizado por um longo tempo para determinar a localização da proteína nos compartimentos subocondriais13,14,18,21,22,23. A confiabilidade e a reprodutibilidade deste protocolo dependem fortemente da pureza e integridade das preparações mitocondriais18. Ambos os requisitos são alcançados adicionando uma etapa adicional de purificação (centrifugação gradiente de densidade de sacarose) às preparações mitocondriais brutas13,24,25 (Figura 1). Além de eliminar contaminantes não-imtocondriais indesejados, essa etapa adicional de purificação também elimina mitocôndrias e mitoplastias quebradas que podem surgir das inúmeras manipulações físicas da amostra durante o protocolo18. Assim, apesar de aumentar o tempo do procedimento, essa etapa de purificação do gradiente de sacarose gera mitocôndrias intactas altamente purificadas, consideradas essenciais para o sucesso do protocolo de fracionamento subocondrial18,22.
Vögtle e colaboradores relataram que organelas congeladas (a -80 °C) também poderiam ser utilizadas com sucesso para fracionamento subocondrial13; no entanto, recomendamos o uso de preparação mitocondrial fresca. Independentemente da escolha, a intactidade das mitocôndrias purificadas pode ser confirmada verificando a sensibilidade das proteínas espaciais intermembranas contra a proteína adicionada externamente K. Se as organelas estiverem intactas, proteínas deste compartimento como Cyt. b2 e Sco1 devem permanecer protegidos contra a degradação proteolítica devido à barreira fornecida pela membrana externa (Figura 2B, faixa 2). Em contraste, quando as organelas são incubadas em um tampão hipoosmótico, a ruptura da membrana externa devido ao choque osmótico (inchaço) torna essas proteínas propensas à degradação da protease (Figura 2B, faixa 4). Por outro lado, as proteínas presentes no compartimento matricial, como α-KGD, devem permanecer protegidas contra a degradação tanto nas mitocôndrias quanto nos mitoplastos devido à integridade da membrana interna (Figura 2B, faixas 2 e 4). Assim, os perfis dessas proteínas de marcador mitocondrial bem estudadas podem ser usados tanto para avaliar a integridade das preparações mitocondriais quanto para o sucesso do protocolo de fracionamento. Além disso, a localização subocondrial de uma proteína de interesse é obtida simplesmente pela comparação de seu perfil de fracionamento com os das proteínas marcadoras18,22 (Figura 2B). É importante ressaltar que, se as proteínas do marcador mitocondrial apresentarem um comportamento distinto do descrito acima, a integridade das organelas provavelmente está comprometida e, portanto, a preparação mitocondrial não deve ser usada para o propósito deste protocolo.
Embora o choque hipotônico tenha provado ser um método confiável para distinguir entre proteínas espaciais intermembranas versus matriz, este método não fornece informações se uma proteína matricial é solúvel ou ligada à membrana interior mitocondrial. Essas informações podem ser obtidas submetendo mitocôndrias à sônica, seguida da extração alcalina com carbonato de sódio (Figura 3). Enquanto as proteínas matrizes solúveis devem ser liberadas na fração supernaca após a sônica, proteínas associadas a membranas tendem a estar no precipitado13. Por outro lado, a extração alcalina com carbonato de sódio solubiliza eficientemente proteínas periféricas ligadas a membranas, mas não proteínas de membrana integral13,20. Assim, se uma proteína é resistente contra a degradação da protease após o inchaço, mas é liberada no sobrenante pelo tratamento alcalino, provavelmente é uma proteína periféricamente ligada à membrana interna voltada para o compartimento da matriz. É importante ter em mente que o sucesso do ensaio de sensibilidade protease depende notavelmente da sensibilidade da proteína de interesse contra a protease usada para digestão. Algumas proteínas mitocondriais parecem ser resistentes à degradação proteolítica na concentração padrão de proteinase K (0,1 mg/mL) geralmente empregadas em protocolos de subfração (Figura 2B, faixa 8)19. Dobrar a concentração de proteínasE K (0,2 mg/mL) parece ser suficiente para permitir uma degradação proteolítica completa. No entanto, tenha em mente que maiores concentrações de protease podem desestabilizar a membrana mitocondrial externa e eventualmente comprometer a eficácia do protocolo.
Não há dúvida de que, para elucidar a função das proteínas mitocondriais, é essencial determinar sua localização subocondrial. Nesse sentido, este protocolo representa uma ferramenta poderosa para pesquisadores que estão começando a estudar mitocôndrias. Apesar de serem direcionados à levedura, muitos de seus princípios poderiam ser facilmente aplicáveis a outros organismos. De fato, com exceção das etapas de purificação mitocondrial, o resto do protocolo é muito semelhante ao relatado para outros organismos26,27,28. Outra contribuição importante deste protocolo é sua aplicabilidade no estudo de mutantes de S. cerevisiae que mostram biogênese mitocondrial alterada. Tem sido amplamente relatado que os mutantes de levedura para máquinas de importação de proteína mitocondrial mostram uma distribuição alterada de proteínas mitocondriais5,29. Assim, este protocolo pode ser usado rotineiramente para investigar as consequências na distribuição de proteínas mitocondriais causadas por mutações que podem alterar a biogênese mitocondrial. Finalmente, o protocolo pode ser particularmente útil para investigar proteínas que mostram a localização mitocondrial dupla19,30.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. A. Tzagoloff (Universidade de Columbia) por fornecer anticorpos levantados contra proteínas marcadores subocondriais Cyt. b2, αKGD e Sco1. Agradecemos também ao Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) pela discussão e comentários úteis durante a criação deste protocolo.
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (bolsa 2013/07937-8).
Fernando Gomes e Helena Turano também são apoiados pela FAPESP, bolsas 2017/09443-3 e 2017/23839-7, respectivamente. Angélica Ramos também conta com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
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