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Immunology and Infection

बायोसेफ्टी लेवल 3 (बीएसएल-3) स्थितियों के तहत रोगजनक संक्रमण और एकल सेल अनुक्रमण के लिए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड को अनुकूलित करना

Published: September 10, 2021 doi: 10.3791/62857
Automatic Translation
1,2, 2,3,4
1Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University Hospital, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, 3Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University Hospital, 4Research Group “Cellular Polarity and Viral Infection”, German Cancer Research Center (DKFZ)

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNAseq) प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर मेजबान/रोगजनक इंटरैक्शन की विशेषता के लिए उनके एपिकल या बेसोलेटरल पक्ष से मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड को कैसे संक्रमित किया जाए ।

Abstract

मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के रोगजनक संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा सेलुलर मॉडल का गठन करते हैं। इन ऑर्गेनॉइड को जीआई ट्रैक्ट के सभी वर्गों (गैस्ट्रिक, जेजुनियम, डुओडेनम, इलियम, कोलन, मलाशय) से प्राप्त किया जा सकता है और भेदभाव पर, अधिकांश कोशिका प्रकार होते हैं जो स्वाभाविक रूप से प्रत्येक अनुभाग में पाए जाते हैं। उदाहरण के लिए, आंतों के ऑर्गेनॉइड में पोषक तत्वों को अवशोषित करने वाले आंत्रसिट, स्राविक कोशिकाएं (गोबलेट, पैनेथ, और एंटेरोमोक्राइन), स्टेम सेल, साथ ही सभी वंश-विशिष्ट विभेदन मध्यवर्ती (उदाहरण के लिए, प्रारंभिक या अपरिपक्व कोशिका प्रकार) होते हैं। संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने में सबसे बड़ा लाभ यह है कि किस कोशिका प्रकार को आंत्र रोगजनक द्वारा लक्षित किया जाता है और यह पता लगाने की संभावना है कि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के विभिन्न वर्ग और उनके विशिष्ट कोशिका प्रकार इसी तरह रोगजनक चुनौतियों का जवाब देते हैं या नहीं। पिछले वर्षों में, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल मॉडल, साथ ही अन्य ऊतकों से ऑर्गेनॉइड, वायरल ट्रोपिज्म और रोगजनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, अत्यधिक रोगजनक वायरस को नियोजित करते समय ऑर्गेनॉइड का उपयोग करने के सभी फायदों का उपयोग करना एक तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है और सख्त जैव सुरक्षा विचारों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, जैसा कि ऑर्गेनॉइड अक्सर तीन आयामों में उगाए जाते हैं, कोशिकाओं का बेसोटेरल पक्ष ऑर्गेनॉइड के बाहर का सामना कर रहा है जबकि उनका एपिकल साइड ऑर्गेनॉइड के अंदर (ल्यूमेन) का सामना कर रहा है। यह संगठन आंत्र रोगजनकों के लिए एक चुनौती बन गया है क्योंकि कई आंत्र संक्रमण घूस के बाद कोशिकाओं के एपिकल/ल्यूमिनल पक्ष से शुरू होते हैं । निम्नलिखित पांडुलिपि कोशिका-प्रकार-विशिष्ट मेजबान/रोगजनक इंटरैक्शन की विशेषता के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण करने के लिए संक्रमण पक्ष (एपिकल बनाम बसोलेटरल) पर विचार करके आंत्रप्रेन्योर के साथ संक्रमण के लिए मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करेगी। यह विधि ऑर्गेनॉइड की तैयारी के साथ-साथ जैवसेफ्टी स्तर 3 (बीएसएल-3) रोकथाम शर्तों के तहत इस काम को करने के लिए आवश्यक विचारों का विवरण देती है।

Introduction

मानव आंत्र वायरस के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रोपिज्म और सेल प्रकार-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन प्राथमिक मानव सेलुलर मॉडल की कमी के कारण ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। ऑर्गेनॉइड1के विकास के साथ अब यह सीमा आंशिक रूप से समाप्त हो गई है । गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के मामले में, मनुष्यों और कई अन्य प्रजातियों (जैसे, मुरीन, गोजातीय, बिल्ली के समान, चमगादड़)2,3, 4,5,6के लिए गैस्ट्रिक और आंतों के ऑर्गेनॉइड मॉडल विकसित किए गए हैं। आंतों के ऑर्गेनॉइड मानव आंतों के एपिथेलियम के संरचनात्मक वास्तुकला को पुन: उत्पन्न करते हैं और इसमें क्रिप्ट और विली जैसी संरचनाएं, कार्यात्मक आंतों की वंशावली होती हैं और यहां तक कि पहले से अज्ञात सेल वंश की पहचान करने के लिए भी उपयोग किया जाता है। आंतों के ऑर्गेनॉइड को विकसित करने के लिए दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। सबसे पहले, आंतों के उपजी कोशिकाओं में क्रिप्ट होते हैं जिन्हें ऊतक रिसेक्शन या बायोप्सी से अलग किया जाता है और विशिष्ट संस्कृति स्थितियों के तहत उगाया जाता है (उदाहरण के लिए, Wnt3A, आर-स्पॉन्डिन, नोगिन, और ईजीएफ) का विस्तार करने के लिए, और फिर स्टेम कोशिकाओं को सबसे आंतों के सेल वंश(जैसे, एंटोसाइट्स, पैनेथ कोशिकाओं, गोबलेट कोशिकाओं, आंत्रप्रेन्योर सेल)7में अंतर करें। यह विधि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट(जैसे,पेट, डुओडेनम, जेजुम, इलियम और कोलन) के सभी वर्गों से ऑर्गेनॉइड के अलगाव की अनुमति देती है। दूसरी विधि मानव-प्रेरित pluripotent या भ्रूणस्टेम कोशिकाओं पर निर्भर करती है, जिन्हें तब आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं में एक स्टेपवाइज प्रक्रिया में विभेदित किया जाता है8। इन प्रेरित स्टेम-सेल आधारित ऑर्गेनॉइड को अक्सर रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की तुलना में प्रकृति में अधिक भ्रूणीय होने के रूप में वर्णित किया जाता है। हालांकि ये सभी ऑर्गेनॉइड मॉडल आंतों के पथ बनाने के लिए आवश्यक विकासात्मक संकेतों को जानने के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं, संक्रामक रोग अनुसंधान में उनका उपयोग अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है।

एंटिक वायरस सभी वायरसों को कवर करने वाला एक व्यापक शब्द है, जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के माध्यम से संक्रमित होताहै,जैसे पिकोरनेरस (जैसे, ईवी-71), रीओवायरस (जैसे, रोटावायरस), और कैलिसिवायरस (जैसे, नोरोवायरस)9। आंत्र वायरस दूषित भोजन और पानी के घूस के माध्यम से अपने संक्रामक जीवन चक्र शुरू करते हैं, जो पर्यावरण में अनुपचारित कचरे के निर्वहन और संक्रमण10की शुरुआत के बाद चिकित्सा देखभाल की कमी के कारण विकासशील देशों में लोगों को उच्च जोखिम में छोड़ देता है । रोगजनक के प्रकार के आधार पर, संक्रमण आंतों की परत के रिसाव के कारण आंत्रशोथ, उल्टी, और/या पानी दस्त का कारण बन सकता है । मानव नोरोवायरस एक अत्यधिक प्रचलित और अत्यधिक संक्रामक आंत्र रोगजनक हैं, जोदुनियाभर में 11 मिलियन से अधिक संक्रमण और 15 मिलियन अस्पताल में भर्ती होते हैं। ऑर्गेनॉइड नोरोवायरस अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण रहे हैं क्योंकि वे मानव नोरोवायरस के संक्रमण और प्रतिकृति का समर्थन करते हैं, जो पहले मानक सेल संस्कृति मॉडल12में सुसंस्कृत होने में असमर्थ था।

पिछले दो दशकों में, कोरोनावायरस प्रमुख मानव रोगजनकों के रूप में उभरा है13। इस परिवार में अत्यधिक रोगजनक मर्स, सार्स-सीओवी-1 और सार्स-सीओवी-2 शामिल हैं, जिन्हें इन वायरसों पर शोध करते समय सख्त सुरक्षा स्तर पर रोकथाम की आवश्यकता होती है। दिलचस्प बात यह है कि जबकि इन रोगजनकों के सभी तीन ज्यादातर अपने प्रेरित श्वसन लक्षण और संकट के लिए पहचाने जाते हैं, अब यह स्पष्ट है कि इन वायरस केवल श्वसन तंत्र को संक्रमित नहीं है, लेकिन यह भी अंय अंगों । श्वसन संकट के अलावा सार्स-सीओवी-2 संक्रमित रोगियों में प्रेरित एक महत्वपूर्ण विकृति गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणों की उपस्थिति14है। सार्स-सीओवी-2 संक्रमित रोगियों का एक अंश बहुत हल्के से लेकर गंभीर दस्त तक के लक्षण प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, सार्स-सीओवी-2 जीनोम संक्रमित रोगियों के मल और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट बायोप्सी में पता लगाया जा सकता है15। महत्वपूर्ण बात यह है कि गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लक्षणों की उपस्थिति सार्स-सीओवी-2 तक सीमित नहीं है क्योंकि उन्हें मर्स और सार्स-सीओवी-1 संक्रमित रोगियों में भी देखा गया था। यह समझने के लिए कि सार्स-सीओवी-2 गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संकट को कैसे प्रेरित करता है और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में सार्स-सीओवी-2 के ट्रोपिज्म की ठीक पहचान करता है, मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड एक महत्वपूर्ण उपकरण रहे हैं और अब इस रोगजनक16, 17के लिए सेल प्रकार-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को जानने के लिए शोषण कियाजाताहै।

एक सेल आबादी (थोक आरएनए अनुक्रमण) का ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइलिंग मानक अभ्यास रहा है जब अमर कोशिका लाइनों के साथ-साथ ऑर्गेनॉइड दोनों के रोगजनक संक्रमणों का मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि यह हमें रोगजनकों (जैसे, साइटोकिन्स के अपरेगुलेशन) के जवाब में वैश्विक परिवर्तनों को निर्धारित करने की अनुमति देता है, थोक आरएनएसेक हमें यह निर्धारित करने की अनुमति नहीं देता है कि जनसंख्या में विशिष्ट कोशिकाएं दूसरों की तुलना में संक्रमण से अधिक प्रवण क्यों हैं। एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNAseq) सेल वंश-विशिष्ट प्रतिलेखन कार्यक्रमों को जानने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है और यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि ये कार्यक्रम वायरस संक्रमण18,19का समर्थन या दमन कैसे करते हैं। scRNAseq का पहला वर्णन 2009 में था और इसका उपयोग माउस ब्लास्टोमेरे20में पाए जाने वाले विभिन्न कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। इन प्रौद्योगिकियों का अब विस्तार किया गया है और कई विभिन्न प्लेटफार्मों के माध्यम से लागू किया जा सकता है । इस तकनीक के प्रारंभिक संस्करणों ने अनुक्रमण के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टर (FACS) लागू किया, जो अक्सर 96-या 384-अच्छी प्लेटों तक सीमित था, जिससे प्रति नमूना21का विश्लेषण करने के लिए 300 व्यक्तिगत कोशिकाएं दी जाती हैं। इन तरीकों को अब एकल-कोशिका अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा उन्नत किया गया है, जो मोतियों वाले बारकोड के साथ व्यक्तिगत बूंदों में एकल कोशिकाओं को समाहित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करते हैं। यह तकनीक प्रति नमूना स्थिति पर कब्जा करने के लिए 10,000 कोशिकाओं को अनुमति देती है।

SCRNAseq के साथ ऑर्गेनॉइड तकनीक का संयोजन हमें यह अध्ययन करने की अनुमति देता है कि आंत्र रोगजनक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट को सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से कैसे प्रभावित करते हैं। हालांकि, कई तकनीकी और जैवसेफ्टी विचारों को लेने की जरूरत है । सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, शास्त्रीय ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों (3-आयामी (3 डी) ऑर्गेनॉइड, एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड) ऑर्गेनॉइड के बाहर एपिथेलियल कोशिकाओं के बेसोलेर्टल पक्ष का पर्दाफाश करते हैं। चूंकि आंत्र रोगजनक दूषित भोजन/पानी के घूस के माध्यम से अपने संक्रमण की शुरुआत करते हैं, संक्रमण अक्सर कोशिकाओं के एपिकल साइड से शुरू होता है, जो इन 3डी आंतों के ऑर्गेनॉइड में सुलभ नहीं है । इसलिए, ऑर्गेनॉइड को रोगजनक संक्रमण के लिए एपिकल साइड को 2डी सीडिंग के माध्यम से सुलभ बनाने के लिए तैयार रहने की आवश्यकता होती है, जिससे कोशिकाओं के एपिकल साइड, या माइक्रोइंजेक्शन22, 23के माध्यम से सीधे उजागर होता है। दूसरा, संक्रमित जैविक नमूनों के scRNAseq प्रदर्शन करने के लिए, यह उनके संक्रामक प्रकृति पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि कोशिकाओं को ठीक करने और बाद में आरएनसीक्यू के लिए एकल-कोशिका अलगाव से पहले रोगजनकों को निष्क्रिय करने के तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, इन तरीकों से अक्सर अनुक्रमण गुणवत्ता18में कमी आती है। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में संक्रमण पक्ष (एपिकल बनाम बेसोटेरल संक्रमण)(चित्रा 1)पर विचार करते हुए आंत्रप्रेन्योर वायरस के साथ आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित करने के लिए कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल में scRNAseq के लिए अत्यधिक रोगजनक वायरस से संक्रमित ऑर्गेनॉइड से एकल कोशिकाओं को अलग करने और अलग करने के लिए एक कार्यप्रवाह शामिल होगा। यह प्रोटोकॉल उन प्रमुख कदमों को उजागर करेगा जिन्हें एयरोसोल की पीढ़ी और संभावित संदूषण से बचने के लिए जैवसेफ्टी स्तर-3 (बीएसएल-3) रोकथाम शर्तों के तहत काम करते समय लागू करने की आवश्यकता है ।

Protocol

मानव ऊतक निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए विश्वविद्यालय अस्पताल हीडलबर्ग से पेट के रिसेक्शन या इलियम बायोप्सी से प्राप्त किया गया था। यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सभी विषयों से सूचित लिखित सहमति के साथ विश्वविद्यालय अस्पताल हीडलबर्ग की सिफारिशों के तहत किया गया था । सभी नमूने प्राप्त किए गए और अनाम तरीके से बनाए गए । प्रोटोकॉल एस-443/2017 के तहत यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल हीडलबर्ग के एथिक्स कमीशन ने प्रोटोकॉल को मंजूरी दी थी ।

1. आंतों और कोलन ऑर्गेनॉइड का रखरखाव और पासेजिंग

सावधानी: मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड मानव ऊतक से या प्रेरित pluripotent/भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, और इस प्रकार, नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता होती है । देश-विशिष्ट विनियमों का पालन किए जाने की आवश्यकता है । मानव सामग्री आम तौर पर परीक्षण नहीं किया जाता है और इसलिए अक्सर बीएसएल-2 सामग्री माना जाता है। जिस देश में प्रयोग होता है, उसमें उचित रोकथाम शर्तों की पुष्टि किए जाने की आवश्यकता है ।

  1. आंतों और कोलन ऑर्गेनॉइड को अलग-थलग ऊतकों और/या बायोप्सी से पहले वर्णित तरीकों का उपयोग करके तैयार करें2। इसके अतिरिक्त, रोगी-व्युत्पन्न सामग्री से या आईपीएससी से ऑर्गेनॉइड तैयार करने के बारे में अधिक तकनीकी विवरण लीज़ एट अल और माहे एट अलमेंपाए जा सकतेहैं।
  2. एक बार ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना होने के बाद, एंटिक रोगजनकों के साथ संक्रमण करने के लिए ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए नीचे वर्णित बंटवारे की दिनचर्या का पालन करें।
  3. बीज 20-100 ऑर्गेनॉइड 50 माइक्रोन में 100% ईसीएम समाधान के 24-अच्छी तरह से गैर ऊतक संस्कृति में प्लेटों का इलाज किया। विकास मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें(तालिका 1)प्रति अच्छी तरह से।
  4. पुराने मीडिया के 250 माइक्रोन को हटाकर और प्रत्येक कुएं में ताजा विकास मीडिया के 250 माइक्रोन जोड़कर हर 2 दिन में मीडिया को बदलें। मीडिया को बदलने से पहले कमरे के तापमान के लिए मीडिया गर्म ।
    सावधानी: कोल्ड मीडिया ऑर्गेनॉइड युक्त ईसीएम समाधान को तरलीकृत करेगा।
  5. प्रति सप्ताह एक बार ऑर्गेनॉइड को मार्ग करें जब इंटीरियर मृत कोशिकाओं के संचय के कारण अंधेरा होना शुरू हो जाता है। इसका एक उदाहरण चित्र 2में पाया जा सकता है ।
  6. बंटवारे के दिन, ईसीएम समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और बर्फ पर गल जाएं।
  7. नई खाली सेल संस्कृति प्लेट रखें जिसका उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस पर बंटवारे के बाद ऑर्गेनॉइड को बीज देने के लिए किया जाएगा (इसके लिए गर्म होने के लिए न्यूनतम 1 घंटे की आवश्यकता होती है और इसे रात भर गर्म किया जा सकता है)। कमरे के तापमान के लिए संस्कृति मीडिया गर्म ।
  8. एक P1000 पिपेट के साथ विकास मीडिया को हटा दें और 3 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन कोल्ड 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें ताकि आंशिक रूप से ईसीएम समाधान को तरल बनाया जा सके और प्लेट से अलग किया जा सके।
  9. ईसीएम समाधान का पूर्ण व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए, P1000 पिपेट (450 माइक्रोन पर सेट-अप) का उपयोग करें। पीबीएस, ईसीएम सॉल्यूशन और ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करने के लिए 10 बार पिपेट, पुनर्निर्युक्त ऑर्गेनॉइड को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
  10. एक ही शंकु नली में एक ही ऑर्गेनॉइड के कई कुओं को इकट्ठा करें।
  11. यदि एक ही समय में कई अलग-अलग ऑर्गेनॉइड (विभिन्न दानदाता, विभिन्न अनुभाग, विभिन्न पूर्व-उपचार आदि) विभाजित होते हैं, तो उन्हें विभिन्न शंकु ट्यूबों में एकत्र करें। इकट्ठा करते समय, बर्फ पर शंकु नलियों को बनाए रखें।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें। नीचे ऑर्गेनॉइड गोली को बनाए रखने के लिए पीबीएस को पिपेट से सावधानी से हटा दें।
  13. एक फिट पिपेट के साथ वैक्यूम अपशिष्ट प्रणाली का उपयोग करने से बचें क्योंकि ऑर्गेनॉइड का गोली बहुत ढीला होता है और पीबीएस को बहुत जल्दी हटाते समय आसानी से एस्पिरेटेड किया जा सकता है।
  14. शंकु नली में 0.05% ट्राइपसिन का 1 मिलियन जोड़ें और P1000 पिपेट के साथ 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ऑर्गेनॉइड को फिर से उठाया। 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्गेनॉइड युक्त शंकु नली को इनक्यूबेट करें।
  15. एक P1000 पिपेट के साथ 10 बार पाइपिंग करके ऑर्गेनॉइड को बाधित करने के लिए पाचन और resuspend को रोकने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त डीएमईएम/एफ12 मीडिया के 2 एमसीएल जोड़ें ।
  16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें। सेंट्रलाइज से शंकु नलियों को निकालकर बर्फ पर स्टोर करें।
  17. नीचे ऑर्गेनॉइड पेलेट को बनाए रखने के लिए 5 एमएल डिस्पोजेबल पिपेट के साथ मीडिया/ट्राइपसिन को सावधानी से हटा दें । मीडिया के लगभग 500 माइक्रोन छोड़ दें और इसे P1000 पिपेट के साथ हटा दें।
  18. एक बार मीडिया/ट्रिप्पसिन को सभी शंकु नलियों से हटा दिया गया है, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से 24-अच्छी तरह से गैर-सेल संस्कृति उपचारित प्लेट को हटा दें और इसे सेल कल्चर हुड के नीचे रखें।
  19. व्यक्तिगत दाता ऑर्गेनॉइड की वृद्धि की आदतों के आधार पर 1:3 से 1:5 अनुपात में विभाजन ऑर्गेनॉइड के साथ शंकु नली में 100% ईसीएम समाधान (बर्फ पर रखा) जोड़ें। (उदाहरण के लिए, यदि ईसीएम समाधान की 50 माइक्रोल ड्रॉप में 20-100 ऑर्गेनॉइड युक्त एक अच्छी तरह से पारित किया गया था, तो ऑर्गेनॉइड गोली को बर्फ-ठंडे ईसीएम समाधान के 150-250 माइक्रोन में फिर से खर्च करें।
  20. ईसीएम समाधान/ऑर्गेनॉइड मिश्रण के बीज 50 माइक्रोन 24-वेल गैर-सेल संस्कृति उपचारित प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-गर्म किया गया है।
    नोट: ईसीएम समाधान गर्म होने के बाद बहुत जल्दी बहुलक होगा। उपयोग के दौरान ईसीएम समाधान को हर समय (बर्फ पर संग्रहीत) ठंडा रखें। जब ऑर्गेनॉइड को फिर से निलंबित कर दिया गया हो, तो तुरंत एक नई प्लेट पर बीज। शुरुआती लोगों के लिए, सीडिंग के लिए अतिरिक्त समय की अनुमति देने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पिपेट युक्तियों का एक बॉक्स स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
  21. ईसीएम समाधान को बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24-अच्छी प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  22. पॉलीमराइजेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन ग्रोथ मीडिया(टेबल 1)26 जोड़ें और ऑर्गेनॉइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोपी द्वारा रोजाना ऑर्गेनॉइड की जांच करें। कदम 1.4 के रूप में हर 2 दिनों में मीडिया बदलें।

2. एपिकल संक्रमण के लिए दो आयामों (2D) में ऑर्गेनॉइड की तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल यह बताएगा कि आंतों के ऑर्गेनॉइड को कोशिका संस्कृति प्लेट में कोशिकाओं के मोनोलेयर के रूप में कैसे बीज दिया जाए ताकि आंतों की एपिथेलियम कोशिकाओं को उनके एपिकल साइड से संक्रमित किया जा सके। अनुक्रमण प्रयोगों के लिए 48-अच्छी तरह से प्लेट और इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का उपयोग करके संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड का उपयोग करें।

  1. धारा 1 में वर्णित ऑर्गेनॉइड को उगाएं और बनाए रखें।
  2. 2D में ऑर्गेनॉइड बोने से पहले, 48-वेल प्लेटों और 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड को 200 माइक्रोन के साथ 2.5% मानव कोलेजन पानी में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोट करें।
    नोट: आंतों ऑर्गेनॉइड 48-वेल प्लेटों में और 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड में सबसे अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त हैं। अनुभव से पता चला है कि वे ९६-अच्छी प्लेटों में अच्छी तरह से संक्रमित नहीं है । ट्रांसवेल आवेषण का उपयोग 2डी में एपिकल और बेसोटेरल संक्रमण दोनों के लिए अनुमति देने के लिए भी किया जा सकता है। यदि ट्रांसवेल का उपयोग किया जाता है, तो एक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर की पुष्टि करने के लिए संक्रमण से पहले ट्रांस-एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) की निगरानी करें। आम तौर पर, आंतों के ऑर्गेनॉइड में 450-600 ओम/सेमी2के टीयर के साथ एक तंग बाधा होती है ।
  3. बीज 100-150 ऑर्गेनॉइड एक ४८-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में या एक अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड के लिए ।
  4. ऑर्गेनॉइड की संख्या का अनुमान लगाने के लिए धारा 1 में तैयार 24-वेल प्लेट के ईसीएम सॉल्यूशन ड्रॉप के 50 माइक्रोन में मौजूद ऑर्गेनॉइड की संख्या गिनें। औसतन, 1-2 कुओं की जरूरत है, जो लगभग 15,000-30,000 कोशिकाओं को दे देंगे ।
  5. ईसीएम समाधान को बाधित करने और ऑर्गेनॉइड को ट्रिप्सिनाइज करने के लिए, चरण 1.8-1.17 का पालन करें।
  6. 48-अच्छी प्लेटों और 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड से मानव कोलेजन निकालें।
  7. विकास मीडिया/वेल के २५० माइक्रोन में शंकुदाता ट्यूब में ऑर्गेनॉइड गोली को फिर से खर्च करें और मिश्रण को कोलेजन-लेपित कुओं में जोड़ें । प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: प्रयोग करते समय, कई शर्तों की तुलना की जाती है (नकली बनाम संक्रमित +/-ब्याज का उपचार)। 2डी वरीयता प्राप्त ऑर्गेनॉइड के प्रत्येक कुएं के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, एक ही शंकु नली में आवश्यक ऑर्गेनॉइड की कुल संख्या एकत्र करें। 24-अच्छी प्लेट के 12 कुओं तक ऑर्गेनॉइड एकत्र करने से ट्राइप्सिन के 1 मिलियन और मीडिया को बेअसर करने के 2 एमसीएल का उपयोग किया जा सकता है। 12-24 कुओं का उपयोग करते समय, इसे ट्राइपसिन के 2 एमसीएल और मीडिया को बेअसर करने के 4 एमएल तक बढ़ाएं।
  8. 48 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और इसे सेल कल्चर हुड में रखें। विकास मीडिया को हटा दें और इसे भेदभाव मीडिया(तालिका 1)के प्रति अच्छी तरह से 250 माइक्रोल के साथ बदलें। इस मीडिया परिवर्तन 48 घंटे बाद दोहराएं।
  9. 48 घंटे के बाद, आरएनए निकालने के द्वारा भेदभाव (चार दिन बाद स्विच करने के लिए) की पुष्टि करें, आरएनए के २५० एनजी के साथ सीडीएनए बना रही है, और स्टेम सेल (OLFM4 और/या SMOC2), गोबलेट कोशिकाओं (MUC2), एंटरडोएंडोक्राइन कोशिकाओं (CHGA), और एंटोक्साइट्स (एसआई और/या CYP3A4)(चित्रा 3)के लिए प्राइमर का उपयोग करते हुए SYBR ग्रीन आधारित qPCR प्रदर्शन ।
    नोट: विकास मीडिया से भेदभाव मीडिया के लिए स्विचन पर, ऑर्गेनॉइड स्टेम सेल मार्कर (OLFM4 और/या SMOC2) की अपनी अभिव्यक्ति को कम करने और गोबलेट कोशिकाओं (MUC2), आंत्रप्रेन्योरेशन कोशिकाओं (CHGA), और एंटोसाइट्स (एसआई और/या CYP3A4) मार्कर की अभिव्यक्ति में वृद्धि होगी qPCR द्वारा । विकास बनाम भेदभाव मीडिया में प्रत्येक सेल-टाइप-विशिष्ट मार्कर के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करने के लिए एक अतिरिक्त अच्छी तरह से तैयार करें और विकास मीडिया के साथ बनाए रखें।
  10. विभेदन की पुष्टि होने पर, ऑर्गेनॉइड एपिकल संक्रमण के लिए तैयार होते हैं। ऑर्गेनॉइड को पसंद के रोगजनक के लिए आवश्यक जैवसेफ्टी स्तर रोकथाम में ले जाएं।
    सावधानी: बीएसएल-2 या बीएसएल-3 रोकथाम के तहत रोगजनकों को संभालते समय संस्थान के स्थानीय नियमों और मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं का उल्लेख करें।
  11. अपने एपिकल साइड से 2डी में उगाए गए आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित करने के लिए, एक P1000 पिपेट के साथ मीडिया को हटा दें और भेदभाव मीडिया में प्रयोग के लिए आवश्यक संक्रमण की बहुलता पर पतला रोगजनक जोड़ें (रोगजनक/मीडिया मिश्रण की न्यूनतम मात्रा 50 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से है और अधिकतम मात्रा 250 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से है)।
  12. संक्रमण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने दें या तो सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थित एक रॉकर टेबल के साथ या हर 15-20 मिनट में प्लेट को मैन्युअल रूप से कमाल करके। पसंद के रोगजनक के आधार पर इस बार अनुकूलन करें।
  13. 2 घंटे के बाद, एक P1000 पिपेट के साथ मीडिया को हटा दें और इसे ताजा भेदभाव मीडिया के प्रति अच्छी तरह से 250 μL के साथ बदलें। एकल कोशिका अनुक्रमण के समय बिंदु तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
  14. एकल कोशिका अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, धारा 4 पर आगे बढ़ें।

3. एपिकल और बेसोटेरल संक्रमण के लिए तीन आयामों (3 डी) में ऑर्गेनॉइड की तैयारी

  1. ऑर्गेनॉइड उगाएं जैसा कि धारा 1 में वर्णित है 24 कुएं में, गैर-सेल संस्कृति का इलाज प्लेट।
  2. दो दिन के बाद passaging, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और एक सेल संस्कृति हुड में जगह है ।
  3. एक P1000 पिपेट के साथ विकास मीडिया को हटा दें, इसे ५०० μL/अच्छी तरह से भेदभाव मीडिया के साथ बदलें पूर्व कमरे के तापमान के लिए गरम और ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली जगह है ।
  4. 48 घंटे के बाद, ताजा विभेदन मीडिया (500 μL/
    नोट: संक्रमण से पहले कुल 4 दिनों के लिए विभेदन मीडिया में ऑर्गेनॉइड बनाए रखा जाता है।
  5. चरण 2.9 में वर्णित भेदभाव की पुष्टि करें।
  6. इस बात की पुष्टि होने पर कि भेदभाव हुआ है, ऑर्गेनॉइड संक्रमण के लिए तैयार हैं।
  7. बर्फ पर गल ईसीएम। कमरे के तापमान के लिए भेदभाव मीडिया गर्म और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 24 अच्छी तरह से थाली गर्म ।
  8. संक्रमण करने के लिए, ईसीएम समाधान से ऑर्गेनॉइड को हटा दें।
    नोट: जितना संभव हो उतना ईसीएम समाधान निकालें क्योंकि वायरस कोशिकाओं के बजाय ईसीएम समाधान से चिपके रहना पसंद करते हैं। यदि ऑर्गेनॉइड के आसपास बहुत अधिक ईसीएम समाधान शेष है, तो संक्रमितता गंभीर रूप से प्रभावित होगी।
  9. 500 माइक्रोन कोल्ड 1x पीबीएस जोड़कर और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके ईसीएम को बाधित करें। 10x ऊपर और नीचे पिपेट करने के लिए P1000 का उपयोग करें। एक ट्यूब में ऑर्गेनॉइड मिलाएं और 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। P1000 के साथ PBS निकालें।
    नोट: प्रत्येक संक्रमण की स्थिति के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के कई कुओं से आने वाले ऑर्गेनॉइड को एक ही शंकुदाता में मिलाएं। उदाहरण के लिए, यदि संक्रमण के लिए आठ शर्तों की आवश्यकता होती है, तो 24-अच्छी प्लेट (जिनमें से ~100 ऑर्गेनॉइड प्रत्येक) के आठ कुओं को संयुक्त किया जाएगा और बाद में सुई व्यवधान के बाद एक नई 24-अच्छी प्लेट के आठ कुओं में विभाजित किया जाएगा (चरण 3.12 देखें)।
  10. विभेदन मीडिया के 1 एमसीएल में ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करें। एपिकल और बेसोलेटेरल संक्रमण के लिए चरण 3.10.1 का पालन करें और बेसोटेरल संक्रमण के लिए केवल चरण 3.10.2 का पालन करें।
    1. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक 27 जी सुई संलग्न करें और अंगोणियों के व्यवधान की अनुमति देने के लिए और संक्रमण दोनों एपिकल और बेसोलेटरल पक्षों पर होने के लिए गोली को छह बार फिर से खर्च करें। 3.11 कदम आगे बढ़ें।
      नोट: ऑर्गेनॉइड एक अंधेरे केंद्र के साथ शास्त्रीय पुटी दिखने वाले और ऑक्टोपस-नवोदित ऑर्गेनॉइड होने चाहिए जब सुई व्यवधान से पहले मनाया जाता है। व्यवधान के बाद, ये ऑर्गेनॉइड कम से कम अंधेरे इंटीरियर के साथ छोटे दिखाई देंगे। संक्रमण प्रदर्शन करते समय, हमेशा न्यूनतम दो शर्तें (नकली और संक्रमण) होंगी, 24-अच्छी प्लेट के न्यूनतम दो कुओं को शुरू में सुई-आधारित व्यवधान के लिए 15 एमएल शंकु नली में जोड़ा जाएगा (यह समझाते हुए कि न्यूनतम 1 एमएल का उपयोग पुनःप्रेमी के लिए क्यों किया जाता है)। दो से अधिक शर्तों का प्रदर्शन करते समय, एक 15 एमएल शंकु नली में 24-अच्छी प्लेट के 10 कुओं को मिलाएं और सुई व्यवधान के लिए विभेदन मीडिया के 1 एमएल में रिसिपेंड करें। व्यवधान के बाद, प्रति एन + 1 में 500 माइक्रोन भेदभाव मीडिया जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि 10 कुओं का उपयोग कर रहे हैं, तो 5.5 एमएल कुल के लिए 4.5 एमएल के साथ टॉप करें)। यदि 10 से अधिक शर्तों की आवश्यकता है, तो कई शंकु नलियों का उपयोग करें। सिरिंज की इस मात्रा के साथ ऑर्गेनॉइड को बेहतर मानते हुए 1 एमएल सिरिंज की सिफारिश की जाती है। एक सिरिंज के लिए एक विकल्प के लिए एक अच्छी तरह से चपटा P1000 टिप रोजगार है ।
    2. प्रति अच्छी तरह से भेदभाव मीडिया के 500 माइक्रोन में ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करें। ऑर्गेनॉइड को बाधित न करें और सुनिश्चित करें कि एपिकल साइड सुलभ नहीं है। 3.11 कदम आगे बढ़ें।
  11. P1000 पिपेट का उपयोग करके 24-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में ऑर्गेनॉइड निलंबन के 500 माइक्रोन को स्थानांतरित करें और पसंद के रोगजनक के लिए आवश्यक जैवसंभ स्तर पर प्लेट को स्थानांतरित करें।
    सावधानी: बीएसएल-2 या बीएसएल-3 रोकथाम के तहत रोगजनकों को संभालते समय स्थानीय नियमों और संस्थान की मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं का उल्लेख करें। सुई के साथ संभावित दुर्घटनाओं से बचने के लिए हमेशा बीएसएल-3 के बाहर ऑर्गेनॉइड की सुई व्यवधान का प्रदर्शन करें। स्थानीय नियमों से बीएसएल-3 में सुइयों के इस्तेमाल पर भी रोक लग सकती है।
  12. प्रयोग के लिए आवश्यक संक्रमण की बहुलता तक पहुंचने के लिए भेदभाव मीडिया में पतला रोगजनक जोड़ें। 500 माइक्रोन की कुल मात्रा से अधिक न करें (24-अच्छी प्लेट में कुल 1 एमएल होना) ।
  13. संक्रमण को 2 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें (इस बार पसंद के रोगजनक के अनुकूल होने की आवश्यकता होगी) 37 डिग्री सेल्सियस पर या तो सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्थित एक घुमाव तालिका के साथ या मैन्युअल रूप से प्लेट को हर 15-20 मिनट में कमाल करके।
  14. 2 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, ऑर्गेनॉइड को प्रति स्थिति एक 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें।
  15. एक P1000 पिपेट के साथ रोगजनक युक्त मीडिया को हटा दें और इसे बर्फ पर स्टोर करें। पीबीएस के साथ एक बार ऑर्गेनॉइड गोली धोएं।
  16. 100% ईसीएम समाधान (जो पहले बर्फ पर गल गया था) के 50 माइक्रोन में ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करें, प्लेट को 24-अच्छी तरह से गैर-सेल संस्कृति में 37 डिग्री सेल्सियस तक प्री-गर्म किया गया और ईसीएम समाधान को बहुलक बनाने की अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24-अच्छी प्लेट को इनक्यूबेट किया जाए।
  17. बहुलीकरण के बाद, एकल कोशिका अनुक्रमण के लिए कटाई तक कमरे के तापमान पर प्रत्येक अच्छी तरह से 500 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि कटाई के लिए ४८ घंटे से अधिक के बाद बोने की जरूरत है, पुराने मीडिया को हटाने और ताजा भेदभाव मीडिया के ५०० μL के साथ बदल हर 2 दिन मीडिया बदल जाते हैं । हालांकि, अनुभव से पता चला है कि चूंकि ऑर्गेनॉइड भेदभाव मीडिया के तहत उगाए जाते हैं, इसलिए वे 48 घंटे से अधिक समय तक जीवित नहीं रहेंगे।

4. जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल-3) स्थितियों में एकल सेल समाधान तैयार करना और जेल मोतियों-इन-पायस (जीईएम) की तैयारी

नोट: निम्नलिखित चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक है कि बीएसएल-3 सुविधा के अंदर एकल सेल अनुक्रमण उपकरण(सामग्री की तालिका)और एक पीसीआर मशीन मौजूद है जो 100 माइक्रोएल प्रतिक्रियाओं को संभालने में सक्षम है। ऑर्गेनॉइड को धारा 1 में वर्णित किया जाता है और रोगजनक और प्रवेश मार्ग के आधार पर धारा 2-3 में वर्णित संक्रमित होते हैं। संक्रमण के बाद पूर्व निर्धारित समय पर, ऑर्गेनॉइड काटा जाता है। आंतों के ऑर्गेनॉइड को फसल करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि के नीचे वर्णित किया गया है।

  1. संक्रमित ऑर्गेनॉइड की कटाई से पहले, सिंगल सेल जेल मोतियों(सामग्री की तालिका)को -80 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और कमरे के तापमान (कम से कम 30 मिनट पहले) गर्म करें।
  2. इसके अतिरिक्त, आरटी रिएजेंट को बराबर करें, एजेंट बी और आरटी एंजाइम सी को कम करें (सभी -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) कमरे के तापमान में। निर्माता के निर्देशों में वर्णित टेम्पलेट स्विच ओलिगो को फिर से खर्च करें।
    नोट: विचार रोगजनक के लिए स्थापित मानक परिचालन प्रक्रिया के बाद स्थानीय जैवसेफ्टी नियमों के संबंध में सभी निम्नलिखित कदम ों को पूरा करने की आवश्यकता है। बीएसएल-3 के काम के लिए अंगूठे के नियम के रूप में, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि सेल कल्चर हुड से बाहर निकलने वाले सभी जहाजों (प्लेटें, ट्यूब, आदि) के बाहरी हिस्से को ठीक से कीटाणुरहित किया जाए। प्रयोग करने वाले व्यक्ति के हाथों/दस्ताने के लिए भी यही लागू होता है ।
  3. 2डी (सेक्शन 2) में वरीयता प्राप्त ऑर्गेनॉइड पर संक्रमण करने के लिए 4.4 चरण के लिए आगे बढ़ें। 3 डी ऑर्गेनॉइड (सेक्शन 3) पर संक्रमण करने के लिए सेक्शन 4.5 पर आगे बढ़ें।
  4. 2डी ऑर्गेनॉइड के संक्रमण के लिए, सेल कल्चर प्लेट को हुड में लाएं और P1000 पिपेट के साथ भेदभाव मीडिया को हटा दें।
    1. प्रत्येक कुएं में कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के 250 μL जोड़ें।
    2. PBS को पी1000 पिपेट के साथ निकालें और 48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 250 माइक्रोन रूम तापमान वियोजन एंजाइम (उदाहरण के लिए, ट्रिप्ले एक्सप्रेस) जोड़ें। दस्ताने बदलें, प्लेट को साफ करें, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वियोजन एंजाइम के साथ रखें।
    3. हर 5 मिनट में माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल वियोजन का निरीक्षण करें।
      नोट: लगभग, 2डी में सुसंस्कृत आंतों के ऑर्गेनॉइड को एकल कोशिकाओं में अलग करने में 15 मिनट लगते हैं। इस समय को समायोजित करने की आवश्यकता होगी क्योंकि यह इस बात पर निर्भर करेगा कि शुरू में कितने ऑर्गेनॉइड वरीयता प्राप्त और संक्रमित थे और साथ ही रोगजनक पर भी कुछ रोगजनक अधिक साइटोपैथिक होते हैं और ऑर्गेनॉइड को दूसरों की तुलना में बहुत तेजी से अलग करते हैं।
    4. एक स्पष्ट एकल सेल निलंबन की पुष्टि के बाद, प्लेट को सेल कल्चर हुड में वापस लाएं और डीएमईएम/एफ12 मीडिया के 250 माइक्रोन जोड़कर पाचन को रोकें जिसमें 48-वेल प्लेट के प्रति 10% एफबीएस शामिल हैं।
    5. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर एक 15 एमएल शंकु नली में कोशिकाओं को ले लीजिए।
    6. दस्ताने बदलें, ट्यूब को साफ करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें।
    7. नीचे सेल पेलेट को बनाए रखने के लिए मीडिया/वियोजन एंजाइम को P1000 से सावधानी से हटा दें । 0.1% बीएसए वाले पीबीएस की न्यूनतम मात्रा में एकल कोशिकाओं को फिर से रीसुस्पेंड करें। आंतों के ऑर्गेनॉइड के लिए, 48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए 250 माइक्रोन में पुनर्सेर्ल करें।
    8. किसी भी बड़े झुरमुट को हटाने और बर्फ पर कोशिकाओं युक्त FACS ट्यूब जगह करने के लिए एक फिल्टर के साथ एक FACS ट्यूब में सेल निलंबन पास।
    9. सेल गिनती और मास्टर मिश्रण की तैयारी के साथ जारी रखने के लिए 4.6 कदम आगे बढ़ें।
  5. 3डी ऑर्गेनॉइड के संक्रमण के लिए, प्लेट को इनक्यूबेटर से हटा दें और इसे सेल कल्चर हुड में रखें।
    1. एक P1000 पिपेट के साथ 24-अच्छी थाली के प्रत्येक कुएं से भेदभाव मीडिया को हटा दें। प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ-ठंड 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन जोड़ें और बर्फ पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. ईसीएम समाधान का पूर्ण व्यवधान सुनिश्चित करने के लिए, P1000 पिपेट (450 माइक्रोन तक सेट) का उपयोग करें। पीबीएस, ईसीएम समाधान और ऑर्गेनॉइड को फिर से खर्च करने के लिए 10 बार पिपेट ऊपर और नीचे; पुनर्नक्षित ऑर्गेनॉइड को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें। अपने स्वयं के 15 एमएल शंकु नली में प्रत्येक संक्रमण की स्थिति को इकट्ठा करें।
      नोट: 15 एमएल शंकु नली का उपयोग करना 50 एमएल शंकु नली या 1.5 एमएल ट्यूब की तुलना में एक बेहतर, अधिक अलग सेल पेलेट देता है।
    3. दस्ताने बदलें और सेल संस्कृति हुड से ट्यूब को हटा दें। ट्यूब के बाहर साफ करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें।
    5. ट्यूब को वापस सेल कल्चर हुड में ले जाएं और ट्यूब के नीचे से ऑर्गेनॉइड गोली को फिर से खर्च करने से बचने के लिए पीबीएस को पी1000 पिपेट के साथ हटा दें।
    6. डिसोसिएशन एंजाइम (जैसे, ट्रिप्ले एक्सप्रेस) के 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें। दस्ताने बदलें, ट्यूब को साफ करें, और नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. 30 मिनट के लिए हर 10 मिनट, ट्यूब को सेल कल्चर हुड में वापस ले जाएं और ऑर्गेनॉइड को 10 बार P1000 पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से खर्च करें।
      नोट: आम तौर पर, आंतों के ऑर्गेनॉइड को 3डी में संक्रमित होने पर एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए लगभग 30 मिनट की आवश्यकता होती है।
    8. यह निर्धारित करने के लिए कि ऑर्गेनॉइड को एकल कोशिकाओं से कब अलग किया जाता है, तो पी10 पिपेट का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड सस्पेंशन का 10 माइक्रोल लें।
    9. निलंबन को डिस्पोजेबल प्लास्टिक सेल काउंटर स्लाइड में रखें। स्पष्ट टेप के साथ नमूना इनपुट पोर्ट सील।
    10. दस्ताने बदलें और सेल काउंटर के बाहर साफ करें। यह निर्धारित करने के लिए एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि एकल सेल निलंबन किया जाता है या नहीं।
    11. एक एकल सेल निलंबन की पुष्टि के बाद, डीएमईएम/एफ12 मीडिया के 1 मिलील जोड़कर पाचन को रोकें जिसमें 10% एफबीएस और पिपेट ऊपर और नीचे 10 बार P1000 पिपेट के साथ होता है।
    12. दस्ताने बदलें, ट्यूब को साफ करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर नमूनों को स्पिन करें।
    13. ध्यान से एक P1000 पिपेट के साथ मीडिया/वियोजन एंजाइम को हटा दें ताकि ट्यूब के नीचे से सेल पेलेट को फिर से खर्च करने से बचा जा सके ।
    14. 0.1% बीएसए वाले पीबीएस की न्यूनतम मात्रा में एकल कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। आंतों के ऑर्गेनॉइड के लिए 250 माइक्रोन में पुनर्संस्रित होता है।
    15. किसी भी बड़े झुरमुट को हटाने और बर्फ पर कोशिकाओं युक्त FACS ट्यूब जगह करने के लिए एक फिल्टर के साथ एक FACS ट्यूब में सेल निलंबन पास करें।
    16. सेल गिनती और मास्टर मिश्रण की तैयारी के साथ जारी रखने के लिए 4.6 कदम आगे बढ़ें।
  6. एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक सेल गिनती कक्ष में सेल निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़कर प्रति μL कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें।
  7. सेल कल्चर हुड से नमूना हटाने से पहले स्पष्ट टेप के साथ नमूना इनपुट पोर्ट को सील करें, क्योंकि इस स्तर पर, सेल निलंबन अभी भी संक्रामक है।
  8. दस्ताने बदलें, सेल गिनने वाले कक्ष को साफ करें, और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल नंबर गिनें।
  9. सेल कल्चर हुड के अंदर, प्रयोग में नमूनों की संख्या के आधार पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1.5 एमएल ट्यूब में आरटी रिएजेंट, टेम्पलेट स्विच ओलिगो, कम करने वाले एजेंट बी और आरटी एंजाइम सी का मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक नमूने के लिए, एक पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 33.4 μL और बर्फ पर स्टोर aliquot।
  10. निर्माता के निर्देशों में वर्णित लक्ष्य सेल संख्या के अनुसार मास्टर मिश्रण में कोशिकाओं और पानी को जोड़ें।
    नोट: 50%-60% कोशिकाओं को सामान्य रूप से बरामद किया जाता है (यानी, चिप पर 10,000 कोशिकाओं को लोड करते समय, विश्लेषण के लिए 5,000-6,000 कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है)। इसलिए, हमेशा 10,000 कोशिकाओं को लोड करें। यदि कोशिका घनत्व इसकी अनुमति नहीं देता है, तो कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें और कम मात्रा में रीसुस्पेंड करें। ध्यान रखें कि चिप को ओवरलोड न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप चिप की क्लोजिंग होगी। इसके अतिरिक्त, यदि कोशिकाओं को ठीक से अलग नहीं किया जाता है, तो प्रति मनका कई कोशिकाओं को प्राप्त करने का खतरा बढ़ जाएगा, जिसे डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्रसंस्करण में हटाने की आवश्यकता होगी।
  11. दस्ताने बदलें, सेल कल्चर हुड में एकल-सेल नियंत्रक को स्थानांतरित करें, और चिप तैयार करें क्योंकि चिप केवल एक गैसकेट से ढकी हुई है जो सील नहीं है।
    नोट: मशीन को संक्रमित सेल निलंबन और संभावित एयरोसोल के संपर्क को रोकने के लिए हुड के अंदर होने की जरूरत है।
  12. चिप होल्डर में सिंगल सेल चिप डालें और अप्रयुक्त गलियों को 50% ग्लाइसरोल से भरें।
  13. निर्माता के निर्देशों के अनुसार नमूनों के लिए उपयोग की जाने वाली गलियों में मास्टर मिक्स, मोती और विभाजन तेल जोड़ें।
  14. चिप को गैसकेट से कवर करें, चिप को कंट्रोलर में लोड करें, और प्रोग्राम शुरू करें।
    नोट: यह केवल आठ लेन के छह लोड करने की सिफारिश की है । अनुचित पायस के साथ मुद्दे अक्सर एक और आठ गलियों में होते हैं । कंपनी का कहना है कि सभी लेन स्वतंत्र हैं, और यह नहीं होना चाहिए; हालांकि, यदि संभव हो, तो इन दो लेन से बचें और आठ नमूनों की आवश्यकता होने पर दो चिप्स चलाएं।
  15. कार्यक्रम के पूरा होने पर, चिप और गैसकेट को हटा दें।
  16. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और पायस के 100 माइक्रोन को एक साफ पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में एक समान सफेद रंग है जो एक पूर्ण पायस का संकेत देता है।
  17. दस्ताने बदलें, ट्यूबों को साफ करें, और पीसीआर ट्यूब को पीसीआर मशीन में स्थानांतरित करें जो 100 माइक्रोल प्रतिक्रियाओं का समर्थन कर सकती है। कार्यक्रम चलाएं: 45 मिनट के लिए 53 डिग्री सेल्सियस; 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस।
  18. पूरा होने पर, नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस बिंदु पर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिक्रिया को संसाधित करें या 1 सप्ताह के लिए 3 दिनों या -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  19. 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के बाद, अधिकांश छा वायरस निष्क्रिय हो जाएंगे, सामान्य ऑपरेटिंग प्रक्रिया के अनुसार बीएसएल-3 से सीडीएनए को हटा दें और बीएसएल-1 प्रयोगशाला में पुस्तकालय की तैयारी को अंजाम दें।
    नोट: इस प्रयोग को तीन जैविक प्रतिकृति (उदाहरण के लिए, तीन अलग-अलग दिनों पर) के रूप में किया जाना चाहिए क्योंकि प्रत्येक कोशिका प्रकार के भेदभाव की सीमा प्रत्येक प्रयोग के बीच थोड़ी भिन्न हो सकती है। जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रमण पुस्तकालयों को अलग-अलग अनुक्रमित किया जा सकता है और एक अनुक्रमण रन में एक साथ अनुक्रमित किया जा सकता है।

Representative Results

एकल कोशिका अनुक्रमण के लिए ऑर्गेनॉइड की तैयारी
एकल कोशिका अनुक्रमण परिणाम अच्छी गुणवत्ता वाली कोशिकाओं का उपयोग करने पर अत्यधिक निर्भर हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऑर्गेनॉइड अच्छी गुणवत्ता के हैं, उन्हें दैनिक आधार पर ठीक से बनाए रखा जाना चाहिए और यह निर्धारित करने के लिए मनाया जाना चाहिए कि वे कब विभाजित होने के लिए तैयार हैं(चित्रा 2)। बंटवारे ऑर्गेनॉइड का समय दाता-निर्भर है; कुछ दानदाताओं और अधिक तेजी से बढ़ने और हर 5 दिनों में विभाजित होने की जरूरत है, जबकि दूसरों को धीमी कर रहे है और हर 10 दिनों में विभाजित होने की जरूरत है । औसतन, ऑर्गेनॉइड प्रति सप्ताह एक बार विभाजित होते हैं जब केंद्र अंधेरा होजाते हैं (चित्रा 2B)। यदि ऑर्गेनॉइड को बहुत बड़ा बनने की अनुमति है और केंद्र में बहुत अधिक मृत कोशिकाएं जमा होती हैं, तो ऑर्गेनॉइड मर जाएगा।

ऑर्गेनॉइड को एक मीडिया में बनाए रखा जाता है जिसमें Wnt3A की उच्च मात्रा होती है। यह स्टेम सेल आला का समर्थन करता है और बढ़ने और पैदा करने के लिए जारी रखने के लिए ऑर्गेनॉइड को बढ़ावा देता है। इन विकास स्थितियों के तहत, ऑर्गेनॉइड में स्टेम सेल और ट्रांजिट-एम्पलीविंग कोशिकाओं की उच्च मात्रा होती है और परिपक्व आंत्रसाइट्स, गोबलेट कोशिकाओं और आंत्रप्रेन्योरल कोशिकाओं जैसे विभेदित कोशिका आबादी की कम मात्रा होती है। हालांकि, मानव आंत के भीतर पाए जाने वाले सेलुलर जटिलता की नकल करने के लिए, कोशिका भेदभाव को धक्का देना और इन कोशिकाओं का अधिक उत्पादन करना महत्वपूर्ण है। यह मीडिया की स्थिति को बदलने और Wnt3A को हटाने, और आर-स्पॉन्डिन और नोगिन(तालिका 1)को कम करके पूरा किया जाता है। आम तौर पर, आंत्रसाइट्स, गोबलेट कोशिकाओं और आंत्रप्रेन्योर कोशिकाओं की ओर सेलुलर भेदभाव के लिए 4 दिनों के विभेदन मीडिया(चित्रा 3)की आवश्यकता होती है। यह एक अच्छा भेदभाव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है; अन्यथा, रोगजनक ट्रोपिज्म और सेल प्रकार-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करना मुश्किल हो जाएगा।

बीएसएल-3 रोगजनक निष्क्रियता की पुष्टि
पूर्ण निष्क्रियता पसंद के रोगजनक के साथ पुष्टि की जानी चाहिए और मान्य है कि बीएसएल-3 से सीडीएनए को हटाना सुरक्षित है। सार्स-सीओवी-2 के लिए सार्स-सीओवी-2 के 100 माइक्रोन लेकर और इसे 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पीसीआर मशीन में इनक्यूब करने से वायरस की पूरी निष्क्रियता को मान्य किया गया। वायरस तो भोली Vero कोशिकाओं को वापस जोड़ा गया था, और वायरस संक्रमण गैर गर्मी का इलाज वायरस की तुलना में इम्यूनोफ्लोरेसेंस और पट्टिका पर कहते है 24 घंटे, ४८ एच, और ७२ घंटे के बाद संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कणों अब संक्रामक थे । इन परिणामों को स्थानीय नियामक एजेंसी को भेजा गया था, और उनके अनुमोदन पर एकल सेल प्रयोग और सीडीएनए प्रसंस्करण किया गया था।

एकल सेल अनुक्रमण परिणाम
यह मूल्यांकन करने के लिए कि सार्स-सीओवी-2 मानव कोलन और इलियम ऑर्गेनॉइड को कैसे संक्रमित करता है, एकल-कोशिका अनुक्रमण किया गया था। ऑर्गेनॉइड को ऊपर वर्णित और 2D प्रारूप में संक्रमित के रूप में तैयार किया गया था ताकि सार्स-सीओवी-2 द्वारा एपिकल संक्रमण की अनुमति दी जा सके। संक्रमित कोशिकाओं को 12 घंटे और 24 घंटे के बाद संक्रमण पर काटा गया था और ऊपर वर्णित एकल कोशिका अनुक्रमण के लिए संसाधित किया गया था । एकल कोशिका अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण ने हमें यह निर्धारित करने की अनुमति दी कि मानव आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं की केवल एक उप-जनसंख्या (अपरिपक्व आंत्रसाइट 2) ने सार्स-सीओवी-2(चित्रा 4)के संक्रमण का समर्थन किया। इसके अतिरिक्त, जैसा कि आबादी में सभी कोशिकाएं संक्रमित नहीं थीं, संक्रमित कोशिकाओं और गैर-संक्रमित दर्शक कोशिकाओं दोनों का विश्लेषण किया गया(चित्र 5)। इन परिणामों से पता चला है कि सार्स-CoV-2 संक्रमित कोशिकाओं में एक समर्थक भड़काऊ संकेत झरना प्रेरित है जबकि गैर संक्रमित दर्शक कोशिकाओं को एक इंटरफेरॉन मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दिखाई । इसके अतिरिक्त, scRNA-Seq से पता चला है कि संक्रमित कोशिकाओं को वायरस के कारण इंटरफेरॉन भावना में असमर्थ थे मार्ग के मध्यस्थता रुकावट(चित्रा 5)। बल्क आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करते समय यह जानकारी प्राप्त करना संभव नहीं था।

Figure 1
चित्रा 1:आंत्र रोगजनकों के साथ संक्रमण के लिए मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का चित्रण योजनाबद्ध। एपिकल संक्रमण 2डी में आंतों के ऑर्गेनॉइड बोने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। 3डी ऑर्गेनॉइड को बाधित करके एक एपिकल और बेसोटेरल संक्रमण किया जा सकता है। अंत में, बरकरार 3 डी आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित करके एक बेसोटेरल केवल संक्रमण किया जा सकता है। इन तरीकों में से प्रत्येक एकल सेल अनुक्रमण के लिए नमूने उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:ऑर्गेनॉइड रखरखाव योजनाबद्ध और प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। (ए)मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड के रखरखाव और पासिंग के लिए योजनाबद्ध। (ख)1, 3, 5, और 7 के बाद बंटवारे के दिन के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां । दिन 7 तक ऑर्गेनॉइड मृत कोशिकाओं के संचय के कारण बड़े और अंधेरे हो जाते हैं और विभाजित होने के लिए तैयार होते हैं। स्केल बार 25 माइक्रोन इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड के प्रतिनिधि क्यूपीसीआर भेदभाव मीडिया पर स्विच करने के 4 दिन बाद। आंतों के ऑर्गेनॉइड को विकास मीडिया में बनाए रखा गया था या 4 दिनों के लिए भेदभाव मीडिया में बंद कर दिया गया था। आरएनए को काटा गया था और स्टेम सेल (OLFM4), पैनेथ सेल (LYZ), गोबलेट कोशिकाओं (MUC2), और एंटोसाइट्स (एसआई) के मार्कर के लिए क्यूपीसीआर किया गया था। एन = 5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:सार्स-सीओवी-2 से संक्रमित सेल आबादी की पहचान। मानव कोलन और इलियम व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड सार्स-सीओवी-2 से संक्रमित थे। 12 और 24 घंटे के बाद संक्रमण कोशिकाओं काटा गया और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के अधीन करने की पहचान करने के लिए जो सेल आबादी सार्स-CoV-2 संक्रमण का समर्थन किया । वायरस संक्रमण समय के साथ वृद्धि करने के लिए और मुख्य रूप से अपरिपक्व आंत्रप्रेन्योर 2 संक्रमित पाया गया था । इस आंकड़े को त्रियाना एट अलसेसंशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:आंतरिक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का निर्धारण। मानव पेट व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड सार्स-सीओवी-2 से संक्रमित थे। 12 और 24 घंटे के बाद संक्रमण कोशिकाओं को काटा गया और वायरल संक्रमित और गैर-संक्रमित दर्शक कोशिकाओं दोनों में आंतरिक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के अधीन किया गया। सार्स-CoV-2 संक्रमित कोशिकाओं ने एक मजबूत समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रदर्शित की जबकि गैर-संक्रमित दर्शक कोशिकाओं ने एक इंटरफेरॉन-मध्यस्थता प्रतिक्रिया प्रदर्शित की। चित्रा त्रिना एट अल से संशोधित19। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ग्रोथ मीडिया
यौगिक अंतिम एकाग्रता
विज्ञापन DMEM/F12 ग्लूटामैक्स (1X)
+ग्लूटामैक्स हेपेस 1 mM
+ हेप्स पेन 10 यू/एमएल
+P/S स्ट्रेप 10 μg/mL
एल-WRN मात्रा से 50%
B27 01:50
एन-एसिटिल-सिस्टीन 1 mm
ईजीएफ 50 एनजी/एमएल
A83-01 500 एनएम
आईजीएफ-1 100 एनजी/एमएल
एफजीएफ बेसिक 50 एनजी/एमएल
गैस्ट्रिन 10 mm
भेदभाव मीडिया
यौगिक अंतिम एकाग्रता
विज्ञापन DMEM/F12 ग्लूटामैक्स (1x)
+ग्लूटामैक्स हेपेस 1 mM
+ हेप्स पेन 10 यू/एमएल
+P/S स्ट्रेप 10 μg/mL
B27 01:50
एन-एसिटिल-सिस्टीन 1 mm
आर-स्पॉन्डिन मात्रा से 5%
नोगिन 50 एनजी/एमएल
ईजीएफ 50 एनजी/एमएल
गैस्ट्रिन 10 mm
A83-01 500 एनएम

तालिका 1: विकास और भेदभाव मीडिया के लिए मीडिया संरचना।

Discussion

एंटिक रोगजनक अक्सर आंत के ल्यूमेन का सामना करते हुए आंतों की एपिथेलियल कोशिकाओं को संक्रमित करके अपने जीवनचक्र की शुरुआत करते हैं। जबकि ऑर्गेनॉइड को आंतों के एपिथेलियम की सेलुलर जटिलता और संगठन को पुन: पेश करने के लिए एक अच्छा मॉडल माना जाता है, त्रि-आयामी के रूप में उनका संगठन, बंद संरचनाएं रोगजनक के लिए उनकी एपिकल झिल्ली को दुर्गम बनाती हैं। इस प्रोटोकॉल में आंतों के ऑर्गेनॉइड को उनके एपिकल साइड से संक्रमित करने, उनके बेसोटेरल साइड, या बीएलएस-3 रोगजनकों दोनों के साथ दोनों को संक्रमित करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। इन प्रोटोकॉल को नीचे हाइलाइट किए गए कुछ महत्वपूर्ण चरणों का पालन करके बीएसएल-2 या बीएलएस-3 रोकथाम या किसी अन्य ऑर्गेनॉइड मॉडल के तहत किसी भी आंत्रप्रेन्योजन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि जर्मनी में नियमों के अनुसार एकल-कोशिका बूंदों के अलगाव और तैयारी के लिए है। एक अस्वीकरण के रूप में, यह प्रोटोकॉल जैवसेफ्टी हैंडलिंग उपायों (मानक परिचालन प्रक्रियाओं) का वर्णन नहीं करता है जिन्हें बीएसएल-3 शर्तों के तहत काम करते समय लिया जाना चाहिए। इस बात पर भी जोर देना जरूरी है कि अन्य देशों में विनियम भिन्न हो सकते हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए स्थानीय प्राधिकारियों से संपर्क किया जाना चाहिए कि सभी स्थानीय विनियमों का सम्मान किया जाए ।

एपिकल संक्रमण के लिए दो आयामों में ऑर्गेनॉइड बोने में महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह नियंत्रित कर रहा है कि शास्त्रीय त्रि-आयामी ऑर्गेनॉइड के रूप में उगाए जाने पर कोशिकाएं इसी तरह अंतर करेंगी। आंत्र रोगजनक के आधार पर, ट्रोपिज्म को बहुत दुर्लभ कोशिकाओं या कोशिकाओं तक सीमित किया जा सकता है जिन्हें अत्यधिक विभेदित करने की आवश्यकता होती है। इस मामले में, एक दो आयामी ऑर्गेनॉइड का उपयोग करना जो पूरी तरह से अंतर नहीं करता था, गलत कल्पना में परिणाम दे सकता है कि यह आंत्र रोगजनक आंतों के ऑर्गेनॉइड को संक्रमित नहीं कर सकता है। यदि संभव हो तो यह सुझाव दिया जाता है कि इस प्रोटोकॉल के तीन विन्यासों का उपयोग करके संक्रमण किया जाए: केवल एपिकल संक्रमण (धारा 2) के लिए 2D ऑर्गेनॉइड, एपिकल और बेसोलाटेरल संक्रमण (धारा 3) के लिए खुले 3डी ऑर्गेनॉइड फटा, और केवल बेसोलाटैरल संक्रमण के लिए पूर्ण 3D ऑर्गेनॉइड (धारा 3)। यह दृष्टिकोण रोगजनक (एपिकल बनाम बसोलेटरल) के प्रवेश मार्ग को समझने में मदद करेगा और यह भी नियंत्रित करेगा कि भेदभाव का एक समान स्तर हासिल किया गया है। 2डी एपिकल संक्रमण के लिए एक विकल्प माइक्रोइंजेक्शन है, जो 3डी ऑर्गेनॉइड का उपयोग करेगा लेकिन रोगजनक को सीधे एपिकल साइड में वितरित करेगा (विवरण के लिए बार्टफेल्ड एट अल27 देखें)। इस विधि के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए एक कुशल इंजेक्टर की आवश्यकता होती है कि रोगजनक ठीक से रखा गया है, और ऑर्गेनॉइड बरकरार रहते हैं। माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर बीएसएल-2 रोकथाम में प्रयोग किया जाता है और बीएसएल-3 रोकथाम के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।

2डी वरीयता प्राप्त ऑर्गेनॉइड में संक्रमण प्रयोग करते समय एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विचार अंतिम कोशिका घनत्व है। जैसा कि चरण 2.3 में उल्लेख किया गया है, 100-150 ऑर्गेनॉइड को 48-अच्छी प्लेट या 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड के एक कुएं में वरीयता दी जाएगी। ऑर्गेनॉइड लाइन के आधार पर और ऑर्गेनॉइड को संभालने वाले व्यक्ति पर, इन ऑर्गेनॉइड का आकार काफी अलग हो सकता है। यह 48-अच्छी तरह से प्लेट या 8-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम चैंबर स्लाइड में बहुत अलग सेल घनत्व में परिणाम दे सकता है। आंत्र वायरस के आधार पर, कुछ वायरस अधिक विरल कोशिकाओं को पसंद करते हैं, जबकि अन्य भी कन्फ्लेंट कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम होंगे। विभिन्न कोशिका संगमों के लिए संक्रमितता में इस तरह के अंतर की आणविक उत्पत्ति स्पष्ट नहीं है; इसलिए, पसंद के आंत्र रोगजनक के लिए सबसे अच्छा सेल घनत्व खोजने के उद्देश्य से पायलट प्रयोगों को आगे डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन करने से पहले किया जाना चाहिए।

अक्सर एकल सेल बूंद पायस प्रदर्शन करने से पहले FACS छंटाई की जाती है। इस चरण का उपयोग अक्सर जीवित कोशिकाओं और एकल कोशिकाओं से डबल्स से मृत को अलग करने के लिए किया जाता है। बीएसएल-3 रोगजनकों के साथ काम करते समय, इसके लिए आवश्यक है कि सुविधा एक उपयुक्त FACS सॉर्टर से लैस है, जो अक्सर मामला नहीं होता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड में सभी कोशिकाओं का आकार समान नहीं होता है, और अक्सर डबल या बड़े सेल के बीच भेदभाव करना मुश्किल होता है, जिससे एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के खिलाफ नकारात्मक चयन का जोखिम होता है। इसके अलावा, इस क्षेत्र में अभी भी चर्चा है कि क्या प्रत्येक नमूने के लिए 5000-10,000 के बीच छंटाई के लिए आवश्यक समय व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्ट प्रोफाइल का एक महत्वपूर्ण संशोधन में परिणाम सकता है । जबकि सेल निर्धारण के तरीकों को एकल-कोशिका अनुक्रमण (जैसे, मेथनॉल और आरएनएसिस्ट) के साथ संगत किया गया है, यह देखा गया कि इससे अनुक्रमण18की गुणवत्ता में कमी आती है। अंत में, यह संदेह है कि सेल डेथ मार्कर का उपयोग करके कोशिकाओं को छांटने से भी पूर्वाग्रह पैदा हो सकता है। तहखाना-विली धुरी के माध्यम से कोशिकाओं के दिशात्मक प्रसार और भेदभाव को देखते हुए, सबसे विभेदित कोशिकाएं, जो बहाने और जारी होने जा रही हैं, विली की नोक पर स्थित हैं। ये कोशिकाएं अक्सर सेल डेथ पाथवे(जैसे, एपोप्टोसिस, नेक्रोसिस और नेक्रोटोसिस) के विभिन्न मार्कर के लिए सकारात्मक होती हैं; हालांकि, जब माउस आंत के रोटावायरस संक्रमण को देखते हुए, विली की नोक सबसे संक्रमित क्षेत्र28है . इस प्रकार, उन कोशिकाओं को फ़िल्टर करना जो मृत्यु मार्कर के लिए सकारात्मक लग सकती हैं, इसके परिणामस्वरूप संक्रमित कोशिकाओं का नकारात्मक चयन होगा जो शारीरिक संक्रमण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। वर्तमान में, एकल कोशिका अनुक्रमण से पहले ऑर्गेनॉइड को छांटने और ठीक करने के लिए कोई अच्छा समाधान नहीं है। लाइव, अनसुलझे कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि उपयुक्त वैकल्पिक प्रोटोकॉल खोजने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है।

एकल-कोशिका अनुक्रमण ने इस बात में क्रांति ला दी है कि सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन कैसे किया जा सकता है। यह तकनीक बेसल स्थितियों और रोगजनक संक्रमणों के तहत सेल वंश-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की पहचान के लिए अनुमति देती है। इस विधि ने कई क्षेत्रों में दरवाजे खोले हैं जो पहले थोक रीडआउट द्वारा सीमित थे। जबकि यह विधि बहुत शक्तिशाली है, इसकी अपनी सीमाएं हैं। एक प्रमुख सीमा व्यापक जैव सूचना विश्लेषण है जो अनुक्रमण के डाउनस्ट्रीम की आवश्यकता है। ऊतकों का विश्लेषण करते समय और सेल प्रकारों को निर्दिष्ट करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां वर्तमान में कोई एनोटेशन नहीं है। सभी एकल-कोशिका अध्ययनों का समर्थन करने के लिए एक कुशल बायोइन्फॉर्मेटिक्स होना आवश्यक है।

यह प्रोटोकॉल मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड को बीज और संभालने, उन्हें आंत्र रोगजनकों से संक्रमित करने और scRNAseq प्रदर्शन करने का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को अन्य अंगों के अनुकूल बनाना अब संभव है, क्योंकि अधिकांश अंगों के लिए ऑर्गेनॉइड मॉडल सिस्टम विकसित किए गए हैं। फेफड़े और जिगर ऑर्गेनॉइड इसी तरह आंतों के ऑर्गेनॉइड की तुलना में आयोजित किए जाते हैं, और इस प्रकार, एक अनुरूप दृष्टिकोण का उपयोग करके इन ऑर्गेनॉइड को स्थानांतरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण नियंत्रण यह मान्य करना होगा कि जब दो आयामों में उगाया जाता है या खुला फटा जाता है, तो ये ऑर्गेनॉइड अपने 3 डी ऑर्गेनॉइड समकक्षों के रूप में समान भेदभाव प्राप्त करते हैं। विशिष्ट विशेषताएं और जीन जो एक विभेदित स्थिति को परिभाषित करते हैं, प्रत्येक अंग मॉडल के लिए विशिष्ट हैं। गुर्दे और संवहनी ऑर्गेनॉइड, बड़ी घने संरचनाओं जैसे अन्य ऑर्गेनॉइड मॉडल को इन संरचनाओं को एकल कोशिकाओं में क्रमिक रूप से अलग करने के लिए अतिरिक्त तरीकों की आवश्यकता होगी।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

मेगन स्टैनिफर और स्टीव बोल्डेंट को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमिन्सचैफ्ट (डीएफजी) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: (परियोजना संख्या 240245660, 278001972, 415089553, और 272983813 Steeve Boulant और मेगन स्टैनिफर के लिए 416072091), Baden-Wuertemberg और Bundesministerium für Bildung und Forschung BF 01KI20239B के लिए एमएस और 01KI20198A और (NUM-COVID 19, के राज्य ऑर्गेनो-स्ट्रैट 01KX2021) से एसबी स्कीमेटिक्स को बायोडरेर में बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Recombinant mouse noggin Peprotech Cat#250-38
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich Cat# G9145
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fischer Scientific Cat#25300054
24-well non-cell culture treated plate Corning Cat#3738
8-well glass bottom chamber slide iBIDI Cart#80827
A83-01 Tocris Cat#2939
Advanced DMEM/F12 Thermo Fischer Scientific Cat# 12634010
B27 Thermo Fischer Scientific Cat#17504-044
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics Cat#1000202 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X Genomics Cat #1000127 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 10X Genomics Cat#1000268 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Collagen from human placenta Sigma Aldrich Cat#C5533-5MG
CYP34A forward Eurofins GATGGCTCTCATCCCAGACTT Primers used to check for differentiation
CYP3A4 reverse Eurofins AGTCCATGTGAATGGGTTCC Primers used to check for differentiation
DMEM/F12 Thermo Fischer Scientific Cat#11320074
EDTA Sigma Aldrich Car#E9884
Fast Read 102 counting slides Biosigma Cat# BVS100
Fetal Bovein Serum (FBS) Capricorn Cat#FBS-12A
GlutaMAX Thermo Fischer Scientific Cat# 35050061
HEPES Thermo Fischer Scientific Cat3 15630080
L-WRN cells ATCC CRL-3276 This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site.
MatriGel. GFR, LDEV free Corning Cat#354230
MUC-2 forward Eurofins TGTAGGCATCGCTCTTCTCA Primers used to check for differentiation
MUC-2 reverse Eurofins GACACCATCTACCTCACCCG Primers used to check for differentiation
N-acetyl-cysteine Sigma Aldrich Cat# A9165
OLMF4 forward Eurofins ACCTTTCCCGTGGACAGAGT Primers used to check for differentiation
OLMF4 reverse Eurofins TGGACATATTCCCTCACTTTGGA Primers used to check for differentiation
Penicillin/Streptomycin Thermo Fischer Scientific Cat#15140122
Recombinant human FGF basic Peprotech Cat#100-18B
Recombinant human IGF-1 BioLegend Cat#590904
Recombinant mouse EGF Thermo Fischer Scientific Cat# PMG8043
SI forward Eurofins AATCCTTTTGGCATCCAGATT Primers used to check for differentiation
SI reverse Eurofins GCAGCCAAGAATCCCAAT Primers used to check for differentiation
TrypLE Express Thermo Fischer Scientific Cat#12605036
Y-27632 Caymann Chemicals Cat#10005583

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 175 मानव आंतों के ऑर्गेनॉइड एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण जैवसेफ्टी स्तर 3 ऑर्गेनॉइड संक्रमण आंत्र रोगजनकों एपिकल और बेसोलेटरल संक्रमण
बायोसेफ्टी लेवल 3 (बीएसएल-3) स्थितियों के तहत रोगजनक संक्रमण और एकल सेल अनुक्रमण के लिए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऑर्गेनॉइड को अनुकूलित करना
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Stanifer, M. L., Boulant, S.… More

Stanifer, M. L., Boulant, S. Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions. J. Vis. Exp. (175), e62857, doi:10.3791/62857 (2021).

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